專利名稱：用鈣調蛋白激酶ii抑制劑治療結構性心臟病中的心肌功能障礙的制作方法
用鈣調蛋白激醉n抑制劑治療結構性心臟病中的心肌功能障礙本申請是申請日為2002年10月1日的中國專利申請02824101. 0 "用鈣調蛋白激睞II抑制刑治療結構性心臟病中的心肌功能陣礙"的 分案申請.本發明要求2001年10月1日提交、序列號為60/326, 576和2001 年10月8日提交、序列號為60/328, 010的美國臨時申請的優先權. 此處將60/326， 576和60/328, 010臨時申請全文引入作為參考.本發明是在美國國家衛生部的HL03727和HL62494經費資助下， 得到政府的支持完成的.政府享有本發明中的某些權利.扶術領域本發明涉及鈣調蛋白激睞II (CaMKII)的抑制.更具體而言， CaMKII的抑制可以治療或預防結構性心臟病，例如，心肌梗塞后出現 的收縮功能陣礙，或者擴張性心肌病.背景抹術心肌梗塞是美國及全世界其它許多國家中具有顯著性的殘疾和死 亡的主要原因，并且也是約2/3心力襲竭病例的原因.7某些引起疾病的亊件(如心肌梗塞、未經治療的高血壓、收縮蛋 白的先天性突變)可以導致包括心腔室擴張在內的常見心臟病表型， 并減弱收縮功能(即減少心臟收縮期間由每個心室的射血分數)從而 導致心力襲竭的臨床綜合征.7擴張性心肌病包括兩種獨特的疾病實 體.此處所用的擴張性心肌病包括缺血性心肌病，該病是以左心室擴 張與收縮功能減弱為特征的疾病實體.當心肌梗塞后存活的未梗塞心 肌的正常代償性肥厚不足時，便可能出現該病癥.7 "擴張性心肌病" 也可以包括在沒有心肌梗塞的情況下，由于心肌蛋白的遣傳異常而導 致的心肌重量增加，收縮功能減弱.7擴張性心肌病受試者是由于心室 擴張而導致心臟收縮性降低的受試者.因此，與存活的未梗塞心肌肥 厚以補償梗塞心肌的受試者相比，擴張性心肌病和收縮功能陣礙受試 者的功能陣礙是不同且更為嚴重的.此外，擴張性心肌病和收縮功能 陣礙受試者所患疾病不同于包括異常松弛在內的其它心臟病(即心臟 舒張功能障礙和心律失常).可用于心力衰竭的療法不足，因而需要新的治療方法.心臟對梗 塞的反應是通過殘存心肌的肥厚以盡量維持正常收縮.然而，當肥厚 不足以補償時，結果是擴張性心肌病和減弱的收縮功能將導致心力襲 竭和死亡."盡管醫學療法在防止心肌梗塞后的心臟功能障礙和心力襲 竭方面已取得重大進展，"這些問趙卻仍然是一個重要且未解決的公共 衛生難趙.沒有一種針對擴張性心肌病的藥理學療法是有效或令人滿意的， 許多受試者死亡或者在特定病例中需要進行心臟移植.目前，用于緩 解心力衰竭受試者的心臟功能陣礙并降低其死亡率的可利用藥理學療法可以被分為三個主要種類血管緊張素轉化酶(ACE)抑制劑、p腎 上腺素能受體(PAR)拮抗刑和搭固擁拮抗劑.盡管死亡率降低了，與 無心力衰竭的同年齡對照受試者相比，經過這些藥物治療的受試者所 承受的死亡風險仍然是顯著增加了. ACE抑制刑、"pAR拮抗劑'和(至 少一種類型的)醛固嗣受體拮抗劑"均可以顯著降低心肌梗塞后心臟 功能陣礙和心力袞竭的發病率并減輕發病程度.其它可利用的藥理學療法包括硝酸甘油、利尿刑、正性變力刑(強心刑)，以及腦利尿鈉 肽(BNP).后幾種藥刑可以緩解癥狀，但與心力衰竭受試者死亡率的 降低無關.ACE抑制刑與IOS受試者出現的咳嗽現象有關，并且可以在雙側腎 動脈狹窄或其它嚴重腎病的穩定期間導致腎衰竭.7PAR拮抗刑則與陽 痿和抑郁癥有關，并且忌用于津喘受試者；此外，在PAR拮抗劑的起 始作用下，受試者可能進一步出現惡化的心力衰竭、低血壓、心動過 緩、心傳導阻滯，以及疲勞.7醛固稱受體拮抗刑則會引發IOX男性受 試者顯著的高血鐘癥和令人痛苦的男性乳房發育癥.711未被證實有利 于降低死亡率的藥刑也與諸多難趙有關；最值得注意的是不斷發現許 多強心劑雖然改善了癥狀，但實際上卻很可能通過引發致命的心律失 常而提高了死亡率.7與之相比，目前已知的是，CaMKII抑制可以減少 動物棋型的心律失常現象，"'"因而代表了一種可以增強心臟功能卻不 加重心律失常的新方法.目前可利用的藥理學療法無效且受限于其顯
著的有害副作用，因此具有改良功效且較少嚴重財作用的新療法的進 展便成為一個重要的公共衛生目標.鈣調蛋白激酶II是存在于心臟中，當心臟細胞內的Ca"濃度提高 時便被激活，并與結合了 Ca"的蛋白質鈣調蛋白結合的一種蘇JCaMUI 活性在嚴重心肌病受試者體內可能提高，但CaMKII卻從未引起心力衰 竭情況中的擴張性心肌病或收縮退化.本發明提供了通過抑制CaMKII改善(提高)心肌收縮功能，以治 療擴張性心肌病和心力衰竭的方法.本發明進一步提供了通過選擇性 CaMKII抑制肽AC3-I的轉基因過表達，實現針對心臟的CaMUI抑制 的小鼠模型.因此，該AC3-I轉基因小鼠是一種新的可以檢驗心臟疾 病中慢性CaMKII抑制效果的重要工具.發明內容本發明提供了一種治療或預防受試者心肌梗塞后的心肌功能障礙 的方法，該方法包括給予受試者有效量的鈣調蛋白激醉II (CaMKII) 抑制劑，給予該抑制刑可以改善受試者心肌梗塞后的心肌收縮功能.本發明提供了一種在被診斷患有擴張性心肌病或其它結構性心臟 病的受試者中，治療或預防出現在擴張性心肌病或其它結構性心臟病 (如末期心辦膜疾病)中的心肌功能陣礙的方法，該方法包括給予受 試者有效量的CaMII抑制劑，給予該抑制劑可以治療或預防受試者的 擴張性心肌病或其它結構性心臟病.本發明提供了一種在被診斷患有擴張性心肌病的受試者中，治療 或預防出現在擴張性心肌病中的心肌功能陣礙的方法，該方法包括給 予受試者有效量的CaMKII抑制刑，給予該抑制劑可以治療或預防受試 者的擴張性心肌病或其它結構性心臟病.本發明提供了一種在被診斷患有擴張性心肌病的受試者中，提高 其心肌收縮性的方法，該方法包括給予受試者有效量的CaMUI抑制 劑，給予該抑制劑可以提高受試者的心肌收縮性.本發明進一步提供了一種在被診斷患有心肌梗塞后的心功能陣礙 和/或收縮性降低的受試者中，提高其心肌收縮性的方法，該方法包括 給予受試者有效量的CaMKII抑制刑，給予該抑制劑可以提高受試者的 心肌收縮性.
本發明進一步提供了一種在被診斷患有心肌梗塞后的心肌收縮性 降低的受試者中，提高其心肌收縮性的方法，該方法包括給予受試者有效量的CaMKII抑制劑，給予該抑制刑可以提高受試者的心肌收縮 性.本發明提供了鑒定可以治療結構性心臟病的化合物的方法，該方 法包括.'a)測定患有結構性心臟病的動物的心臟收縮性；b)將該化合 物給予步驟a)中的動物；c)測定步驟b)中動物的心臟收縮性；并檢測 與步錄a)中動物的心臟收縮性相比，步槺b)中動物的心臟收縮性的增 加，對心臟收縮性増加的檢測姿定出可以治療結構性心臟病的化合 物.本發明提供了一種治療受試者結構性心臟病的方法，該方法包括 給予受試者有效童的通過本發明方法鑒定的化合物.本發明提供了一種表達編碼CaMUI抑制劑的核酸的轉基因動物.本發明也提供了一種表達編碼一種肽的核酸的轉基因動物，該肽 包括被稱為AC3-C的SEQ ID NO: 8的肽.本發明進一步提供了一種雙重轉基因動物，該動物可以表達編碼 CaMUI抑制刑的核酸，并表達編碼鈣調褲酸醃的核酸.附困說明
圖1. CaMI、 II和IV,以及針對本研究工程化的AC3-I和AC3-C 轉基因小鼠體內表達的CaMHI抑制肽和對照肽的結構域結構困示. CaMUI和IV均具有一個由CaM-結合區和自抑制(AI)區構成的調節 域(陰影矩形) CaMKII的CaM結合區(296-309，根據CaMUI編號， 并由斜體字標記)與CaMKIV中的CaM結合區非常相似(相同的氨基酸 下有劃線)，并且針對CaMKII中的CaM結合序列的抑制肽同樣地抑制 CaMKIV的活化作用".AC3-I是根據以Thr286 (標有箭頭)為中心的 CaMKII的AI區建立的，并且CaMKII和CaMKIV中的AI區是不同的， CaMKI的CaM結合區或AI區均不與CaMKII或IV同源，但是，與AI 區形成對比的是，針對CaMKII或IV的CaM結合區的抑制肽仍然可以 抑制CaMKI，因為CaM結合城通常共有一個螺旋結構，卻往往缺乏一級序列同源性."困2. A-E. AC3-I小鼠具有正常心臟大小和收縮功能.A和B困中，在AC3-1小鼠和野生型UT)同窩出生小鼠對照之間，心臟舒張 期(A)或收縮期(B)的超聲心動閨左心室尺寸無明顯差異.C和D 困中，在AC3-C小鼠和WT同窩出生小鼠對照之間，心臟舒張期(C) 或收縮期(D)的室間隔厚度無差異.E困中，AC3-I和基線的WT同 窩出生小鼠對照之間，左心室的射血分數縮短無差異.所有田示中， 空白柱為WT，陰影柱為AC3-I轉基因(TG).所有困示中，各個種舉 編號(標注于田E中)中對應的研究小鼠數量(n)均相同.閨3A-B.與野生型(WT)同窩出生小鼠對照相比，AC3-I小鼠具 有顯著降低的心臟CaMKII活性(A),以及在心肌梗塞外科手術后顯 著較好的左心室射血分數縮短(B) . CaMKII活性測定獲得自完整心 臟組織勻漿物.困4.通過GFP蛋白質印跡法確定AC3-I和AC3-C小鼠體內的轉 基因表達.括號中標示的種系編號表示蛋白質印跡和相應的定重磷光 體成像結杲中的特性(根據AC3-I 5系標準化數據).所有轉基因小 鼠的遣傳特性均通過DNA印跡分析而得以證實，但AC3-I種系3則不 表達轉基因，閨5A-C. AC3-C轉基因小鼠(來自種系1)出現了擴張性心肌病. 心臟舒張期間，AC3-C (B)的左心室內徑(LVID)明顯大于AC3-I小 鼠(B, "P〈0. 01，來自種系4)，表明了擴張的表型.心臟收縮期間， AC3-C (B)體內的LVID縮短明顯少于AC3-I U， "*P<0. 001)小鼠， 表明了降低的心室功能.與LVID相比，心臟舒張或收縮期間，AC3-I 和AC3-C小鼠的室間隔UVS)和左心室后壁(LVPW)均無顯著差異， C.與AC3-I小鼠(P<0. 001)相比，左心室射血分數縮短在AC3-C體 內有顯著降低.D.在AC3-I和AC3-C小鼠之間沒有心率上的差異.困6A-B.與AC3-C小鼠和野生型(WT)同窩出生小鼠相比，AC3-I 來源的心室勻漿物的總CaMKII活性有顯著降低.A.總CaMKII活性. B. CaMKII活性中不依賴Ca2+的部分.困7A-D. CaMKII抑制作用改善了心肌梗塞外科手術后的心臟收縮 功能.對心肌梗塞外科手術后3周未麻醉小鼠的超聲心動困測量的結 果表明CaMKII抑制作用顯著保護了小鼠的左心室功能.A.與野生型同 窩出生小鼠對照(WT )或者經由無活性KN-93同源物KN-92( 30jimol/Kg 體重)每日處理過的WT小鼠相比，經由CaMKII抑制刑KN-93 (以1和10nmol/Kg體重刑重海日處理過的小鼠，和具有轉基因把定CaMKI1 抑制作用的AC3-I小鼠的左心室(LV)射血分數縮短均有顯著增加. 通過方差分析(ANOVA)的P<0. 001和星號表示采用Bonf erroni-校正t 檢驗與WT相比的顯著差異.B.心臟舒張期間的LV內徑(LVID)是LV 心室擴張的指標.心臟舒張期間的各組LVID無顯著差異.C.心臟舒張 期間的LV后壁(LVPW)壁厚度是衡量未梗塞壁的LV肥厚的指標.心 臟舒張期間的各組LVPW無顯著差異.D.具有轉基因靶定CaMKII抑制 作用的AC3-I小鼠的心率顯著地慢于其它所有組的小鼠.困8.在擴張性心肌病情況中，CaMKII抑制作用緩解了左心室擴 張，也改善了左心室收縮功能.與CAN+轉基因小鼠相比，雙重轉基因 小鼠(AC3-I+/CAN+)的左心室(LV)擴張得到援解，LV射血分數縮 短也改善了 ."對未麻醉的鈣調辨酸蘇(CAN+)轉基因小鼠和雜種繁殖 的雙重轉基因人03-1+/0人^小鼠進行超聲心動田測量的結果顯示與 CAN+小鼠相比，AC3-I+/CAN小鼠的心臟舒張期間，LV內徑(LVID) 顯著減小，室間隔(IVS)和LV后壁(LVPW)則增厚，這表明通過轉 基因把定的CaMKII抑制作用可以部分援解擴張性心肌病的表型.前4 幅圖中的測量參數一致左心室內徑(LVID),室間隔(IVS)，左心 室后壁(LVPW) 與CAN+小鼠相比，雙重轉基因AC3-I+ZCAN+小鼠的 左心室收縮功能顯著提高了，表明通過轉基因靶定心臟的CaMII抑制 作用可以改善心臟的收縮功能.與之相比，AC3-I+ZCAN+和CAN+轉基 因動物的心率之間無顯著差異.所有小鼠均為4~8周齡.困9A-B.雜種繁殖AC3-I或AC3-C小鼠和鈣調磷酸醉(CAN )轉 基因小鼠的方法.A.方框表示育種對.主要對照是在CAN陽性小鼠之 間進行，也顯示了可選對照(提供的數據如困8所示) B.PCR結果表 明AC3-I與CAN小鼠之間的雜種繁殖是成功的，并且雙重轉基因小鼠 可以通過標準PCR方法得以鑒定.具體實施方式
應當指出，如果上下文沒有明確地另外指明，本說明書及所附權利要求中所用的單數形式"一種"、"一個"和"該"包括復數對象. 因此，例如，提到的"一種抑制刑"包括該抑制劑的多重拷貝，也可 以包括超過一個特定種類的抑制刑.
本發明提供了一種在被診斷患有心肌梗塞后心肌收縮功能陣礙的 受試者中，治療或預防心肌梗塞后心肌收縮功能陣礙的方法，該方法
包括給予受試者有效量的鈣調蛋白激蘇II (CaMKII)抑制刑，給予該 抑制刑可以治療或預防受試者心肌梗塞后的心肌收縮功能陣礙.通 常，抑制刑的"有效重"指獲得預期一種或多種理想結果所需要的量.
"心肌梗塞"意指心臟的局部缺血性損傷，其中心臟的部分心肌(心 臟肌肉)壞死或凋亡，即細胞程序性死亡."局部缺血性損傷"意指 由于流向器官或組織的血液中斷，即局部缺血事件而導致對器官或組 織的損害或潛在損害.貫穿全文所用的"受試者"意指個體.因此，
"受試者"可以包括家養的動物，如貓、狗等，家畜(如牛、馬、豬、 綿羊、山羊等)，實驗動物(如小鼠、兔、大鼠、豚鼠等)以及烏類.
優選的受試者為哺乳動物，如靈長類動物，更為優選的是人類.
該受試者可以是被診斷為患有心肌梗塞的病人.該受試者可以是 被診斷為患有梗塞后心臟功能障礙的病人.該受試者可以是被診斷為 已患有心肌梗塞的病人，該病人因而具有出現梗塞后心臟功能陣礙的 高度危險性.此外，該受試者可以是被診斷為患有擴張性心肌病或者 具有心力襲竭癥狀的病人，其中該心力衰竭癥狀由任何與心室腔擴張 表型及心肌收縮功能降低相關導致.該受試者可以是被診斷為心肌收 縮性降低的病人.診斷心肌梗塞、梗塞后心臟功能陣礙、心肌收縮性 降低和擴張性心肌病的方法是本領域技術人員所熟知的.區分患有梗 塞后收縮功能陣礙或擴張性心肌病受試者與患有心肌梗塞或心肌肥厚 的受試者的方法也是本領域技術人員所熟知的.應當認識到，被診斷 患有心肌梗塞、心律失常或心肌肥厚的受試者并不一定患有擴張性心 肌病或心肌收縮性降低.
CaMKII的抑制刑可以是任何抑制CaMUI活性或表達(如數重或 致病效果)的化合物、組合物或藥刑.該化合物可以是肽或非肽藥刑， 包括例如，編碼了肽抑制刑的核酸.此外，該藥刑可以是抑制心臟中 CaMKII表達的反義核酸(見GenBank,編號為L13407, Hochetal., Circ Res 1999，其說明書中困9所示的異構體83和82 ) 5."抑制" 意指限制、阻止或減低.因此，抑制劑是可以，例如減低酶活性和/或 酶表達量的藥劑.抑制作用可以是可逆或不可逆的.受試者體內的 CaMUI活性或CaMKII總量可根據對其功能反應的檢測或測量而容易
地確定，例如，通過超聲心動閨或其它臨床參數進行確定.此文提供
了測定非人類的動物模型體內CaMKII活性的特定方法.因此，對抑制 CaMHI的化合物的鑒定是常規實驗.
CaMKII抑制刑的一個實例是一種肽，包含SEQ ID NO: 2的肽， 此文也稱其為AC3-I.本發明的該抑制劑可以由SEQ ID NO: 2的肽構 成.
CaMKII抑制刑的另一個實例是一種肽，包含SEQ ID NO: 4的肽， 即CaM-UIN.該抑制刑可以是全長CaM-KIIN (SEQ ID NO: 4)和/或 該全長肽的一個片段；該片段被稱為CaM-UINtide (SEQIDNO: 6). Chang et al. PNAS (USA) 1998 95: 10890-10895中描迷了 CaMKIIN 和CaM-KIINtide，此處將其完整引入作為參考.
由于這些肽均顯示可以抑制CaMUI，因此可以預期含有這些肽之 外還包括非必需氨基酸的其它肽和多肽也將具有類似活性.非必需氨 基酸是不影響該肽的功能或該肽完成其功能的途徑的氨基酸(如其二 級結構或該肽活性的最終結果).本發明非必需氨基酸的實例包括但 不僅限于含有GFP，即一種可標記并識別蛋白質或肽以進行純化的肽標 記的氨基酸.
本發明考慮到CaMUI有其它多種抑制劑，其中之一為KN-93. W098/33491中描述了 KN-93這種CaMKII的非肽抑制刑，此處將其完 整引入以參考其關于0-93和CaMKII抑制刑的學說.
本發明進一步提供了一種治療或預防受試者心肌梗塞后心臟功能 陣礙的方法，該方法包括給予受試者有效量的CaMKII抑制刑，給予該
抑制刑可以治療或預防受試者的心臟功能陣礙."心臟功能陣礙"意 指血液泵壓室的收縮功能減低，該情況可導致心力襲竭的臨床狀況.
診斷受試者心肌梗塞后心臟功能陣礙的方法是本領域技術人貝所熟知 的.
在治療或預防受試者心肌梗塞后心臟功能陣礙的方法中，該 CaMKII抑制劑可以是一種肽，例如該肽包含SEQ ID NO: 2的肽，或 由SEQ ID NO: 2的肽組成.該CaMICH抑制刑可以是一種肽，它包含 SEQ ID NO: 4的肽，或由SEQ ID NO: 4的肽所組成.此外，該抑制 劑可以是一種肽，它包含SEQ ID NO: 6的肽，或由SEQ ID NO: 6的 肽所組成.該抑制劑可以是非肽抑制刑，例如，含有KN-93活性區的
抑制刑，或者其本身就是KN-93.
本發明也提供了一種治療或預防受試者的擴張性心肌病或任一原 因導致的、具有心臟腔室擴張表型的任何心臟疾病的方法，該方法包 括給予受試者有效量的CaMKII抑制刑，給予該抑制刑可以治療受試者 的擴張性心肌病或減少心室擴張.診斷擴張性心肌病受試者的方法是 本領域技術人員所熟知的.
在治療或預防擴張性心肌病的方法中，該CaMKII抑制劑可以是一 種肽，例如它包含SEQ ID NO: 2的肽，或由SEQ ID NO: 2的肽所組 成.該CaMKII抑制劑可以是一種肽，它包含SEQ ID NO: 4的肽，或 由SEQ ID NO: 4的肽所組成.此外，該抑制刑可以是一種肽，它包含 SEQ ID NO: 6的肚，或由SEQ ID NO: 6的肽所組成.該抑制刑可以 是非肽抑制劑，例如，含有KN-93活性區的抑制劑，或者其本身就是 KN-93,
本發明提供了一種在被診斷患有擴張性心肌病，或任一原罔導致 的、具有心臟腔室擴張或收縮功能降低表型的任何心臟疾病受試者 中，提高其心肌收縮性的方法，該方法包括給予受試者有效量的CaMKII 抑制劑，給予該抑制劑可以改善受試者的心肌收縮性.測量心臟收縮 性的技術，例如超聲心動困、放射性核素血管造影術，以及磁共振成 像均是本領域技術人員所熟知的.此處所用"心肌收縮性"指一個衡 量心肌收縮，更具體而言，是衡量左心室收縮的尺度.如困7所示， AC3-I和O-93提高了心肌收縮性(正性肌力作用)而未引起心臟肥厚.
此外，本發明還提供了一種在被診斷患有心肌梗塞的受試者中提 高其心肌收縮性的方法，該方法包括給予受試者有效量的CaMII抑制
劑，給予該抑制劑可以提高受試者的心肌收縮性.
本發明也提供了 一種在被診斷患有心肌梗塞后心臟功能陣礙的受 試者中，提髙其心肌收縮性的方法，該方法包括給予受試者有效量的 CaMKII抑制刑，給予該抑制刑可以改善受試者的心肌收縮性.
在提高心肌收縮性的方法中，CaMKII抑制刑可以是一種肽，例如 它包含SBQ ID NO: 2的肽，或者是由SEQ ID NO: 2的肽所組成.該 CaMKII抑制刑可以是一種肽，它包含SEQ ID NO: 4的肽，或者是由 SEQ ID NO: 4的肽所組成.此外，該抑制刑也可以是一種肽，它包含
SEQ ID NO: 6的肽，或者是由SEQ ID NO: 6的肽所組成.該抑制刑 可以是非肽抑制刑，例如，含有KN-93活性區的抑制刑，或者其本身 就是0-93,
CaMKII抑制劑可以被用于提高心肌的收縮性，而不引起心肌肥 厚，因而可以治療被診斷患有心肌梗塞、心肌梗塞后的心臟功能陣礙， 和/或擴張性心肌病的受試者.
本發明提供了一種鑒定可治療結構性心臟病的化合物的方法，該 方法包括a)測定患有結構性心臟病的動物的心臟收縮性；b)將該化 合物給予步驟a)中的動物；c)測定步驟b)中動物的心臟收縮性；d) 確定與步猓a)中動物的心臟收縮性相比，步稞b)中動物的心臟收縮性 的增加，檢測該心臟收縮性的增加便可鑒定出可以治療結構性心臟病 的化合物.本發明的該方法中，患有結構性心臟病的動物可以是表達 AC3-C的轉基罔動物.測定心臟收縮性的方法是本領域技術人員所熟知 的，包括但不僅限于超聲心動困.測定方法包括放射性核素血管造影 術、磁共振成像，以及左心室血管造影術.
本發明提供了一種鑒定可治療結構性心臟病的化合物的方法，該 方法包括a)測定患有結構性心臟病的動物的腦利尿鈉肽；b)將該化 合物給予步稞a)中的動物；c)測定步槺b)中動物的腦利尿鈉肽；d) 確定與步驟a)中動物的腦利尿鈉肽相比，步緣b)中動物的腦利尿鈉肽 的增加，檢測該腦利尿鈉肽的增加便鑒定出該可以治療結構性心臟病 的化合物.本發明的該方法中，患有結構性心臟病的動物可以是表達 AC3-C的轉基因動物.
心力衰竭是一種臨床綜合征，包括由于心臟收縮和組織氣合的減 低導致的運動耐受力降低，7因此通過腳踏車或自行車ergonometry進 行的運動測試、降低的組織氣攝取、或升高的血漿腦利尿鈉肽水平均 為心力襲竭嚴重程度的標志.指示心肌收縮極度和中度損傷、運動能 力、最大耗氣量以及循環腦利尿鈉肽水平的數值均于治療心力衰竭領 域內有所描述并被技術人員所熟知.7結構性心臟病的實例包括但不僅 限于心肌梗塞、心肌梗塞后的心臟功能障礙、心肌收縮性降低，以及 擴張性心肌病.
本發明提供了 一種治療受試者心肌梗塞、心肌梗塞后心臟功能陣 礙和/或擴張性心肌病的方法，該方法包括給予受試者有效重的一種通
過上述方法鑒定的化合物，該化合物的給予可以治療患有心肌梗塞后 心臟功能陣礙和/或擴張性心肌病的受試者，或者是具有心力襲竭、心 臟腔室擴張及左心室收縮性降低等癥狀的病人.本發明提供了表達編碼CaMKII抑制劑的核酸的轉基因動物."轉 基因動物"指其身體的所有細胞均含有一種外源核酸的動物.本發明 轉基因動物的一個實例中，該轉基因特異表達于心肌細胞中，并由心 臟細胞特異啟動子啟動.該小鼠是采用心臟特異a肌球蛋白重鏈啟動 子(GenBank編號U71441)進行設計的.制備轉基因動物的方法是本 領域技術人員所熟知的，并于此文得以具體例證.本發明的轉基因動物體內表達的CaMKII抑制刑可以是一種肽，它 包含SEQ ID N0: 2的肽.此外，本發明的轉基因動物可以表達由SEQ ID NO: 2的肽所組成的肽.最近的報導發現在心臟中至少有4種不同 的CaMKII8異構體，5并且由于靶定的調節域的保守性，AC3-I(SEQID N0: 2)可以抑制所有的CaMHI異構體.3CaMKII內的AC3-I靶定的 域與其它CaMK類型(即CaMU和CaMKIV，困l)中的類似功能域不同， 并且實際上缺乏針對蛋白質激醉A和C的活性.3本發明的轉基因動物體內表達的CaMUI抑制劑可以是一種肽，它 包含SEQ ID NO: 4的肽.此外，本發明的該轉基因動物可以表達由 SEQ ID NO: 4的肽所組成的肽.本發明進一步提供了于心肌細胞中表達編碼一種肽的核酸的轉基 罔動物，該肽包含SEQ ID NO: 8、也被稱為AC3-C的肽.如困4和5 所示，AC3-I和AC3-C小鼠具有相似的轉基因表達，但是AC3-C小鼠 表現出心肌病，而具有CaMUI抑制作用的AC3-I小鼠則表現正常.如 困6所示，與患有心肌病的病人中所觀察到的結杲一樣，AC3-C小鼠具 有高的總CaMUI活性.因此，該轉基因動物可以被應用于鑒定一種可 以治療結構性心臟病的化合物的本發明方法中.由于AC3-C被認為是 無活性的，因此這些結杲可能需要通過AC3-C-GFP轉基因的綠色熒光 蛋白(GFP)部分的作用來解釋.'這種小鼠是連照制備AC3-I轉基因小鼠的基礎方法獲得的.本發明也提供了一種于心肌細胞中表達編碼AC3-I的核酸，和編 碼鈣調褲脧醉的核酸的雙重轉基因動物(AC3-I+/CAN+).該鈣調磷酸 酶(CAN+)轉基因小鼠是公認患有嚴重擴張性心肌病的模型."巳知CAN拮抗劑可以'挽救，多種小鼠模型中出現的心肌病表型，"但CaMKII 抑制卻從未被預期可以改善這些或任何其它心肌病模型的心臟功能或 結構，如困8所例證的，除CAN之外還表達CaMKII抑制刑的該雙重轉 基因動物的左心室功能得到改善，并且與CAN+動物模型比較時，顯示 出左心室擴張和肥厚的癥狀也得到援解.因此，這種動物體內的CaMKII 抑制可以治療擴張性心肌病.本發明的方法中，可以通過已知途徑給予CaMKII抑制刑. 一個特 定實例中，肽抑制劑被制成細胞膜滲透性的.細胞"膜滲透"意指可 以通過膜上的開口或間隙".該方法采用了被添加到抑制肽中的肽序 列，但豆蔻酰基化是使肽通過細胞膜的另一種方法.本發明的組合物也可以被包含在藥學可接受栽體中被給予進體 內."藥學可接受"意指一種符合生物學或其它方面需要的材料，即 該材料可連同組分被給予受試者，而不引起任何不希望發生的生物效 應，或者不會以有害的方式與包含其的藥物組合物的任何其它組分相 互作用.正如本領域技術人員所熟知的，該栽體應當可以使有效成分 的任何降解程度最小化，并最小化受試者體內有害副作用的發生 盡管局部鼻內給藥或通過吸入給藥是典型優選的給藥方式，仍然可以通過口服、腸胃外(如靜脈內注射、肌肉內注射、鞘內注射、動 脈內注射和腹膜內注射)、經皮、體外、局部等方式給予該組合物. 此處所用的"局部鼻內給藥"意指經由一個或兩個券孔將該組合物送 遂至鼻孔和鼻遣內，可以包括通過噴霧器或滴液器，或者通過霧化治 療刑實現的送遞 該組合物的送遞也可以是通過插管直接到下呼吸道 的任意部位(如氣管、支氣管和肺).根據受試者的人種、年齡、體 重和全身狀態、所治療狀況的嚴重程度、所用的特定組合物、其給藥 模式等，不同受試者所需組合物的準確量均不相同.因此，不可能指 定每種組合物的準確量.不過，可以通過本領域一種普通技術，僅利 用此處所提供方法的常規實驗便可確定合適量.如杲采用腸胃外給予該組合物，其給藥特征通常為注射.可以將 可注射物制備成常規形式，如液體溶液或懸液，適用于注射前在液體 中溶解成懸液的固體形式或乳刑.最近修訂的腸胃外給藥方法涉及緩 釋或持續釋放體系的應用，可以維持恒定刑重.見例如U. S. Patent No. 3, 610, 795，此處引入了該文獻以作參考.
該物質可以溶于溶液、懸液(例如被摻入微粒、脂質體或細胞) 中.借助于抗體、受體或受體配體可以將這些物質靶定到特定細胞類 型上.下述文獻是利用該技術將特定蛋白質靶定到腫瘤組織上的實例(Senter， et al., Biocon iugate Chem., 2: 447-451， (1991); Bagshawe， K. D., Br. J. Cancer, 60: 275-281* ( 1989 ) ; Bagshawe， et al.， Br. J. Cancer, 58:700-703, ( 1988 ) ; Senter, et al., Bioconjugate Chem., 4: 3-9, ( 1993 ) ; Battelli, et al., Gancer Immunol. Immunother., 35: 421-425， ( 1992 ) ; Pietersz and McKenzie， Immunolog. Reviews, 129: 57-80, ( 1992 ); and Roffler, et al., Biochem. Pharmacol, 42: 2062-2065, ( 1991 ) ) 栽體如"隱形"脂質體及其它偶聯抗體的脂質體(包括介導治療結腸癌藥物 的脂質)，經由細胞特異配體介導DNA靶定的受體，靶定腫瘤的淋巴 細胞，及靶定鼠科動物體內神經膠質瘸細胞的高特異治療性逆轉錄病 毒.下述文獻是利用該技術將特定蛋白質靶定到腫瘤組織上的實例(Hughes et al., Cancer Research, 49: 621"220， ( 1989 ) ; and Litzinger and Huang, Biochimica et Biophysica Acta, 1104: 179-187， ( 1992 )).通常，受體被組成型或由配體誘導地包 含在胞呑作用途徑.網格蛋白包被的小窩中的這些受體簇，借助于網 格蛋白包被的小囊泡進入細胞中，經過酸化的內涵體，在該酸化內體 中受體被分類，繼而或者再循環至細胞表面，被儲存在細胞內，或者 在溶酶體中被降解.內化途徑具有多種功能，如營養的攝取、活化蛋 白質的移除、大分子的清除、病毒及毒素的機會性入使、配體的分離 和降解，以及受體水平的調節.許多受體參與超過一個的細胞內途徑， 這取決于該細胞類型、受體濃度、配體類型、配體價及配體濃度.受 體介導的胞呑作用的分子和細胞機理已有評述(Brown and Greene, DNA and Cell Biology 10:6, 399-409 (1991)),本發明的組合物可以包括編碼一種抑制劑的核酸，或者可以包括 CaMKII反義核酸.可通過多種途徑將該公開組合物送遞至目標細胞. 例如，可通過電穿孔、脂轉染，或者磷酸鈣沉淀方法送遞該組合物. 所選擇的送遞機理部分地根據目標細胞的類型，以及該送遂是否發 生，例如于體內或體外.因此，除了所公開的組合物或栽體以外，該組合物還可以含有例
如，諸如脂質體，如陽離子脂質體(如D0TMA、 D0PE、 DC-膽固醇)或 陰離子脂質體的脂類.如必要，脂質體可以進一步含有蛋白質，以利 于靶定特定細胞.組合物的給藥包括將化合物和陽離子脂質體給藥至 血液中，以送遞至目標器官，或者將其吸入進呼吸道內，以送遞至呼 吸道的目標細胞.關于脂質體，見例如Brigha邁et al. Am. J. Resp. Cell. Mol. Biol. 1: 95-100 ( 1989 ) ^ Feigner et al Proc. Natl. Acad. Sci USA 84: 7413-7417 ( 1987 ) ; U.S. Pat. No. 4， 897, 355. 此外，可以將該化合物作為一種微膠囊的組分給藥，該微膠囊可以被 靶定到特定細胞類型上，如巨噬細胞，或者將該化合物從該橄膠囊中 的擴散或送遞設計成特定速率或刑量.上述包括給予外源DNA并將其送遂至受試者細胞內的方法(即基 因轉導或轉染)中，可借助于多種機理將該組合物送遞至細胞.其中 一個實例是借助于脂質體送遞組合物，即采用商業可利用的脂質體制 劑，如LIPOFECTIN、LIPOFECTAMINE(GIBCO-BRL，Inc., Gaithersburg, MD) 、 SUPERFECT (Qiagen, Inc. Hilden, Germany)和TRANSFECTAM (Promega Biotec， Inc., Madison, WI ),以及其它根據本領域的 搮作標準研發的脂質體.另外，通過電穿孔可以體內送遞本發明的核 酸或栽體，可采用Genetronics， Inc. (San Diego, CA)的方法， 并通過S0N0P0RATI0N機械途徑(ImaRx Pharmaceutical Corp., Tucson, AZ)應用該技術，被送遞至細胞，并將被整合進宿主細胞基因組內的核酸典型地含 有整合序列.這些序列通常為病毒相關序列，尤其是當采用基于病毒 的體系時.這些病毒整合體系也可以被整合進有待于采用非基于核 酸，如脂質體的送遞體系被送遞的核酸中，從而使得該送遞體系中包 含的核酸可以被整合進宿主基因組中.此處所用"核酸"包括單鏈或 雙鏈分子，即可能是由核苷酸堿基A、 T、 C、 G組成的DNA，或者由堿 基A、 U(替代T)、 C和G組成的RNA.該核酸可以代表編碼鏈或其互 補鏈.該核酸的序列可能與自然存在的序列的一部分相同，或者可能 包括可選密碼子，這些密碼子編碼了與自然存在序列中所發現氨基酸 相同的氨基酸.此外，如本領域技術人員所熟知的，核酸可以包括代 表氨基酸保守取代的密碼子.用于整合進宿主基因組的其它通用技術包括，例如設計為可以促進與宿主基因組進行同源性重組的體系.這些體系典型地依賴待表達 核酸的側翼序列，該序列與宿主細胞基因組內的目標序列充分同源， 發生了栽體核酸與目標核酸的重組，并導致送遞的核酸被整合進宿主 基因組內.本領域技術人員已知這些體系和方法對促進同源重組而言 是必需的.如上所述，可以借助于藥學可接受栽體給予該組合物，并且通過本領域技術人員所熟知的多種機理(如棵NDA的攝取、脂質體融合、 借助于基因槍的DNA肌肉內注射、胞呑作用等)以體內和/或體外方式 將該組合物送遞至受試者細胞中.如果應用的是體外方法，可以根據 本領域技術人員所熟知的標準操作方法將細胞或組織移出并維持在體 外.借助于任何基因轉移機理，例如辨酸鈣介導的基因送遞、電穿孔、 微注射或蛋白褲脂體法，均可以將該組合物導入細胞中.繼而可以根 據細胞或組織類型經由標準方法將該轉導細胞注入(如在藥學可接受 栽體中)或等位移植回受試者體內.將多種細胞移植或注入受試者體 內的標準方法是已知的.該抑制刑可以任意有效抑制CaMKII活性或重的刑重給藥.如上文 所指出的，對CaMKII活性或量的減少的檢測在從業醫師的技能范圍 內.更具體而言，該抑制劑的給藥劑量為每公斤體重大約0，05mg到大 約5. Omg.可選的，該抑制刑的給藥劑量為每公斤體重大約0. 3mg到 大約3. Omg,下述實施例的描述是為本領域普通技術人員提供了完整的公開內 容，以及如何制備并評定此處要求保護的組合物和/或方法的說明書， 這些實施例僅為本發明的例證，并未對本發明者所認定的本發明范疇 構成限制.發明者已努力確保數字(如數重、溫度等)的準確性，但 仍然存在某些誤差和偏差.下述實施例中更為具體地描述了本發明， 由于其中出現的多處改動及變化對本領域技術人員而言將是顯而易使 的，因此這些實施例僅具有說明性.實施例AC3-I轉基因小鼠該AC3-I小鼠是以用于AC3-I的肽序列為基 礎進行的小基因合成而得以制備的(閨1) 編碼AC3-I (KKALHRQEAVDCL )的'小基因，、'CaMKII抑制肽均是采用這些互補
寡核苷酸構建的(SEQEDNO:l)GATCAAAAAAGCCCTTCACCGCCAGGAGGCAGTTGACTGCCTTGCTTTTTTC GGGAAGTGGCGGTCCTCCOTCAACTGACGGAACGCTAG,同樣采用下列互補寡核苦酸構建用于相關無活性對照肽AC3-C UKALHAQERVDCL )的小基因(SEQ ID NO:7)GATCAAAAAAGCCCTTCACGCACAGGAGCGCGTTGACTGCCTTGC TTTTTTCGGGAAGTGCGTGTCCTCGCGCAACTGACGGAACGCTAG將該小基因與EGFP框內插入在pEGFP-Cl (Clontech)的BspEI 位點，使得EGFP位于該肽的N末端.該AC3-I小基因包括Kozak共有 序列翻譯起始位點.繼而進行測序并在HEK293細胞中表達，顯示出綠 色熒光.早前的研究指出AC3-I-GST-MTS融合肽保留了對合成CaMKII 底物(AC3-I-GST-MTS IC5。=0. 4|iM; AC3-I IC" 0. 5|iM)的全部CaMKII 抑制效力，表明AC3-I-GFP蛋白質也保留了 CaMKII抑制活性.繼而采 用PCR擴增800bp AC3-I-GFP序列，對擴增產物進行純化并將其亞克 隆進含有a-MHC啟動子栽體(GenBank編號U71441)和人類生長激素 (HGH)多聚腺苷酸尾部(由Dr. J. Robbins研發)的pBluescript 栽體的Sail位點.通過測序及在鼠科動物心房腫瘸細胞系(HL1)中 表達并顯示出綠色熒光便可驗證該構建體.在 Vanderbilt轉基因 小鼠核心設施內將鼠科動物胚胎干細胞連同線性化的DNA (2ng/ml) 注射并移植進B6D2偽孕雌性小鼠體內.當于顯微鏡下檢視組織切片時，AC3-I與綠色熒光蛋白(GFP)相 連可以顯示出遍及心臟的同源表達.這些AC3-I小鼠是存活的，并且 具有正常的基礎心臟尺寸和功能(困2) 不過，這些小鼠的心臟所具 有的總心臟CaMKII活性顯著降低(困3(A) ) 了，并且與野生型同 窩出生小鼠對照相比，在心肌梗塞實驗之后，這些小鼠的心臟功能損 傷顯著地較少(困3 (B) ) 這些發現表明CaMKII活性是心肌梗塞 后心臟功能陣礙的一個新信號，并且也是我們要求保護的通過抑制
CaMKII治療心肌梗塞受試者的方法的基礎.AC3-I+ZCAN+轉基因小鼠采用困9所示方法步稞雜交繁殖雙重轉 基因小鼠.為了對第一代進行基因分型，于小鼠3周齡時進行尾部活 檢，并于551C,在含有0. 5Mg/ml蛋白醉K、 50mM Tris (pH8. 0)、 100mMEDTA和0. 5 tSDS的溶液中培養過夜.在采用苯盼/氯仿/異戊醇 (25: 24: 1 )進行兩次提取后，采用等體積的異丙醇沉淀基因組DNA. 于50jil含有2.5ngRNA醉A的l/10TE (pH8. 0)溶液中溶解DNA.采 用EcoRI完全消化15jig的基因組DNA，并于lxTAE中，采用0. 8X瓊 脂糖凝膠分離已消化的DNA.電泳后，于0. 25N HC1中溫育凝膠30分 鐘，于0. 5M NaOH-1.5M NaCl中進行15分鐘的中和反應兩次，并于 0.5M Tris-1.5M NaCl中平衡兩次各15分鐘.在MSI尼龍轉移膜 (Micron separations Inc. Westborought， MA)上使凝膠印跡過 夜，并對該濾膜進行紫外交聯.由隨機寡核苷酸所引發(Stratagene， La Jolla, CA)的"P標記的GFP-AC3I或GFP-AC3C DNA片段作為探 針,在50X甲酰胺、5xSSPE、 5xDenhardt溶液、0. 1XSDS和100|ig/ml 變性、破碎的鮭魚精子DNA存在的條件下，于42TC進行雜交過夜.于 651C，在0. 5xSSC-0. 1XSDS中洗滌濾膜30分鐘，繼而于65TC，在 0. 1XSSC-0. 1XSDS中洗涂20分鐘兩次.將該濾膜膝光到Kodak放射自 顯影底片上并使其顯影.對笫一代之后的轉基因小鼠的常規篩選是通過PCR進行的(見困 9).有兩個引物適用于擴增位于人類生長激素(hGH)基因3，末端的 442-bp區.這兩個引物的序列為5，-Hgh (5，- ( SEQ ID NO: 9 ) GTCTATTCGGGAACCAAGCT-3，)和3，-Hgh ( 5，- ( SEQ ID NO: 10 ) ACAGGCATCTACTGAGTGGACC-3，).將lOOng的已純化基因組DNA與200pM 的每種引物混合，并根據下述步稞進行擴增95TC下5分鐘，繼而進 行30個包括95TC下45秒、501C下45秒、72"下1分鐘的循環，最 后于721C下進行最后7分鐘的延伸.在0. 5|ig/nil溴化乙錠存在條件 下，將所有樣品上樣于1. 5X瓊脂糖凝膠上進行電泳，并于紫外光照射 下目測染色的DNA條帶.新的引物組是針對雜種繁殖的雙重轉基因小 鼠(圍9)研發的，并且可用于區分雙重和羊一轉基因動物.超聲心動困超聲心動困是采用Hewlett Packard Sonos5500 (完 全針對鼠科動物的研究)以及特別研制的12MHz探針進行的.心臟尺 寸獲得自2維導向的M模式困像，并采用前沿方法，通過封閉、獨立 讀數器取短軸和胸骨長軸面離線讀數.采用戊巴比妥(15邁g/Kg, i.p.)便可容易地使動物鎮靜；不過也可以無需麻醉地進行測量，其 中小鼠需要經歷一個短暫的'訓練，期以適應整個過程.可以將大約 90X的小鼠訓練得可以承受超聲心動困研究，而不產生麻醉的心臟抑制 效應.將來自LV后壁(LVPW)、室間隔(IVS)和LV內徑(LVID)的 3次連續搏動進行平均獲得測定值.射血分數縮短(FS )被用于評估心 臟收縮功能，并且可以根據公式FS- (LVID心臟舒張期-LVID心臟收 縮期)/LHD舒張期xlOO計算出來.心肌梗塞外科手術該外科手術是在Vanderbilt小鼠生理學核心 實驗室中進行的，并且與其它已發表的報導基本一致"'."簡言之， 麻醉小鼠(戊巴比妥33fig/g和氣胺嗣33jig/g， i.p.),將其置于嚙 齒類動物呼吸器(潮氣容積0.5ml，速率120次呼吸/分鐘)上，采用 左胸骨旁開胸術將其胸腔打開，并采用8-0縫合線將左前降枝動脈中 部區域縫合.閉合胸腔(5-0縫合線)，并將該動物斷離呼吸器.通過 增加的肺部濕千重可以確定野生型小鼠典型地出現心力衰竭.假手術 省略結扎步稞.大約75%的存活動物通過外科手術成功地具有了梗塞的 前壁.CaMUI活性分析CaMKII活性是采用我們之前公開的方法、在 AC3-I小鼠和同窩出生小鼠對照中，采用具有對CaMKII比對CaMKIV 超過約50倍選擇性的syntide 2這種合成底物，從完整心臟(心室)勻漿物中進行分析獲得的.擴張性心肌病在通過抑制CaMKII對擴張性心肌病進行的預防中 獲得了引人注目的數據，制備了表達與AC3-C(AC3-I的一種無活性同 源物)相連的GFP的對照轉基因小鼠.該小鼠便出現了在AC3-I-GFP 小鼠中不存在的相當嚴重的擴張性心肌病，并具有非常高水平的 CaMKII活性(困5).貫穿本申請，參考了多種出版物.為了更為完整地描述本發明所屬領域的狀況，此文將這些出版物的公開內容完整引入該申請中，作 為參考.對本領域技術人員而言，應當清楚的是本發明可以進行多種改動 和變化，并不偏離本發明的范疇和實質.考慮到本發明此處所公開的
說明書及實踐，本發明的其它實施方案對本領域的技術人員而言將是 顯而易懂的.該說明書和實施例僅為例證，本發明的真實范疇及實質 由下述權利要求指明，參考文獻1. Anderson M" Braun A" Wu Y.， Lu T., Schulman H., Sung R, KN-93, an inhibitor of multiftmctional Ca++/calmodulin-dependent protein kinase, decreases early afterdepolarizations in rabbit heart. J Pharm Exp Ther 1998;287:996-1006.2. Bravm A., Schulman H. A non-selective cation current activated via the multifunctional Ca(2+)-calmodulin-dependent protein kinase in human epithelial cells, J Physiol 1995;488:37-55.3. Braun A., Schul咖n H. The multifunctional calcium/palmodulin~depetuieTvt protein kinase: from form to function, Ann Rev Physiol 1995;57:417-445.4. Gottlieb S., McCarter R., Vogel R. Effect of beta-Wockade on mortality among high-risk and low-risk patients after myocardial infarction, [see comments]. New Eng〗加d Journal of Medicine 1998;339:489 497.5. Hoch B" Meyer R., Hetzer R., Krause E.， Karczewski P. 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權利要求
1.CaMKII抑制劑在制備用于治療或預防受試者心臟的局部缺血性損傷的藥物中的用途。
2. CaMKII抑制劑在制備用于治療或預防受試者中血流中斷后對 心臟的損害或潛在損害的藥物中的用途.
全文摘要
本發明涉及用鈣調蛋白激酶II抑制劑治療結構性心臟病中的心肌功能障礙。本發明提供了一種治療受試者結構性心臟病的方法，該方法包括給予受試者有效量的一種CaMKII抑制劑，通過該抑制劑的給藥可以治療受試者的結構性心臟病。本發明也提供了用于治療結構性心臟病的轉基因動物模型。本發明進一步提供了篩選可以治療結構性心臟病的化合物的途徑。
文檔編號A61K31/18GK101130069SQ20071014697
公開日2008年2月27日 申請日期2002年10月1日 優先權日2001年10月1日
發明者M·安德森 申請人:范德比爾特大學