抗腫瘤小分子干擾rna及其用途的制作方法

專利名稱：抗腫瘤小分子干擾rna及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及高效的抗腫瘤小分子干擾RNA (siRM)的結構及其用途。具體地說涉及凋亡 抑制基因survivin的高效的抗腫瘤小分子干擾RNA (siRNA)的結構及其用途。
背景技術：
腫瘤的治療是長期困擾醫學界的世界性難題，盡管各種的治療方法不斷出現，但目前還 沒有找到真正有效的根治方法，因此這也迫使科研工作者不斷尋找新的技術和方法，試圖從 根本上攻克癌癥。RNA干擾技術是近幾年興起的生物技術，用小分子干擾RNA干擾特定基因 的表達是基因治療的重要組成部分。
凋亡抑制基因survivin是1997年發現的一種重要的腫瘤相關基因，該基因是Ambrosini 等(.NatureMed, 1997， 3 (8): 917-921 )在人類基因組文庫中篩選克隆到的，它定位于17q25, 該基因具有兩個突出的特點①幾乎在所有種類的腫瘤組織中特異性地表達，而正常組織幾乎 沒有表達；②具有抗腫瘤細胞凋亡、促進有絲分裂、調節細胞周期、參與血管形成和放化療 耐受多種功能于一體，而引起了國內外學者的廣泛關注，成為IAP家族中最令人矚目的一員。 有研究者(.Lab Invest, 1999， 79 (11): 1327-1333; Am J Pathol, 1998， 152 (1): 43—49 )對 正常增殖細胞中survivin基因的潛在分布進行研究發現包括皮膚表面的角化細胞、腸道的 上皮細胞和正常的骨髓細胞在內，在各種有絲分裂細胞系中均沒有檢測到survivin基因的表 達；成人體內只有胸腺、生殖腺中有微量表達，但在14-21 wk的胎兒不同部位組織中均可以 明顯檢測到survivin表達。當這些組織發育成熟后，就很難檢測到survivin的表達。這表 明survivin參與了正常胚胎組織的發育過程，具體的機制目前尚不明確。同時也充分證實， 在絕大多數正常成人組織中survivin基因并不表達。因此，針對survivin基因的靶向性治
療的毒副作用也可能降到最低。
有研究證實(.Ub Invest, 1999, 79 (11): 1327-1333 ; Cancer Res， 1998, 58 (23): 5315-5320 ), survivin基因是腫瘤組織中表達上調最為普遍的基因之一。在大多數腫瘤組織 中，如肺癌、肝癌、白血病、結直腸癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、胃癌和50%以上的高 分化淋巴瘤中survivin基因的表達水平異常升高，且與個體發育和組織分化平衡有關(Cel 1 Death Differ, 2002, 9 (12): 1334—1342; Arch Pathol Lab Med， 2004, 128 (1): 39—43; Acta Neuro pathol (Berl), 2002, 104 ( 1 ): 105—109; J Cancer Res CI in Oncol， 2002, 128
(6): 302-306 )。這些現象顯示survivin基因在癌癥中可能處于失控的表達狀態。
survivin基因主要有以下功能抑制細胞凋亡、參與細胞周期調節、參與血管形成、參 與腫瘤對放化療的耐受。
體外實驗表明，(1) survivin可以通過其唯一的BIR結構域與細胞凋亡效應蛋白酶 caspase-3和caspase-7結合，抑制他們的活性，并抑制由Fas, Bax、抗癌藥物誘導的細胞 凋亡(Cancer Res, 1998, 58 (23): 5315-5320 )。 survivin抑制細胞凋亡的另 一作用機制 可能是survivin在細胞核內與Cdk4形成復合物，使p21在Rb蛋白磷酸化過程中釋放出來， 釋放出來的p21易位到線粒體內，并以N—末端的氨基酸序列與caspase-3前體形成復合物， 使caspase-3前體不能活化，從而抑制由Fas介導的細胞凋亡(Oncogene, 2000， 19 (10): 1346-1353 )。 ( 2 ) BIR結構可以直接同線粒體活化因子Smac/DIABLO相作用間接抑制 Caspases的級聯反應，阻斷線粒體依賴的凋亡途徑(Cel 1, 2000,102 (1): 33-42 )。 ( 3 ) Cdc2 可以使survivin磷酸化后再同微管與紡錘體結合，抑制Caspase-9的活化和Caspase-3對微 管結構蛋白的水解，維持了微管與紡錘體結構的穩定性(Cell, 2000,102 (1): 33-42; Nature, 1998, 396 (6711): 580-584 )。 (4)由線粒體釋放出來的凋亡誘導 因子AIF可以直接進入細胞核中，導致染色體濃縮、斷裂，其作用不依賴caspase。 survivin 可以抑制AIF的核轉位，從而抑制AIF的促凋亡作用(Oncogene, 2004, 23 (1): 39-48)。 (5) survivin可以通過抑制Caspase對Mdm2的剪切在翻譯后水平調節Mdm2，使其降解減少，從 而使Mdm2對p53的降解相對增加(Oncogene, 2004,23 (49): 8146-8153)。因此，survivin可 以負向調節P53的表達，也是其抗凋亡的機理之一。
survivin在G2/M期通過細胞周期調控的方式表達并可能抑制有絲分裂期細胞的凋亡。 免疫熒光顯示survivin在Y-tubulin周圍形成短放射狀的"殼"，著色于中心體旁，與Y -tubulin共定位于紡錘體中心(Nat Struct Biol， 2000,7 (7): 602-608)。在體外分別將HeLa 細胞阻斷在G1期、S期、G2/M期，檢測細胞內源性survivin mRNA的表達，發現在Gl期檢 測不到survivin的表達，在S期增加6—7倍，在G2/M期，其表達上調40倍(Nature, 1998, 396 (6711): 580—584)。 Skoufias等(Cell Biol, 2000, 10 (7): 1575-1582)在質粒轉染的HeLa 細胞系中發現，survivin參與了有絲分裂，調控微管組織中心及紡錘體的形成，是調控細胞 增殖與死亡之間平衡的重要分子。有絲分裂初期，在微管動力作用下，survivin與紡錘體中 的微管相結合而抑制凋亡，與微管分離可使其抗凋亡作用喪失，并增強caspase-3的活性， 這是有絲分裂時細胞死亡的機制。survivin在癌細胞中的過表達可以克服這些凋亡關卡，使
細胞加快向S期轉換，抑制G1期靜止，從而促進細胞增殖。研究表明，無survivin表達的 細胞可形成卵裂溝和收縮環，但不能完成正常的細胞質流動過程，因此導致多核細胞的形成。 survivin和INCEN (inner centromere protein在微管組裝、卵裂溝的形成、細胞質流動等 協同事件中有重要作用；并可通過與CDK4/p 16(IM4a)和CDK2/cycline E復合體活化的竟 爭性作用，導致Rb蛋白磷酸化，以啟動細胞有絲分裂(Oncogene, 2000， 19 (29): 3225-3234)。
血管形成過程取決于血管內皮細胞生存和凋亡的平衡。正常情況下，血管內皮細胞中很 難檢測到survivin。在血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)的 刺激下，靜止的血管內皮表達survivin的能力約可增強4倍，VEGF的許多抗凋亡活性都是 通過誘導內皮細胞表達survivin來實現的(Am J Pathol， 2001, 158 (5): 1757-1765)。血管 生成素一 l(angiopoietin-l， Ang-l)是胚胎血管形成過程中維持血管穩定性和管腔形成的關 鍵因子。它沒有促進內皮細胞生長，而只促進了血管網的穩定和分枝血管的形成。研究發現， Ang-l可以促進內皮細胞中survivin表達，通過Akt (或蛋白激酶B)途徑激活survivin的抗 凋亡活性，從而阻止內皮細胞凋亡，在體內血管形成過程中穩定血管結構(J Biol Chem， 2000,275 (3): 9102-9105)。新血管生成是腫瘤生長和轉移的必要因素，因此抑制survivin的 表達可能對防止腫瘤細胞的浸潤、遷移起重要作用。己有多項動物實驗證明，反義survivin RNA或survivin突變體可以有效抑制實體瘤的血管形成和腫瘤的侵襲增殖。
腫瘤的難治還在于腫瘤的天然耐藥以及后期治療時產生的耐受。腫瘤本身高表達 survivin能保護化療藥和放射線對腫瘤的殺傷相反，不足量的化療藥或放射線也能誘導 survivin的表達，產生對治療的繼發耐受。研究表明，survivin能抑制某些化療藥物、IL-3 ， TNF-a, X射線誘導的Fas, Caspase, Bax等參與的凋亡信號通路(Cancer Res, 1998, 58 (23): 5315-5320; J Cancer Res, 2000， 91 (11): 1204-1209)。但假如其唯一的BIR區發生C84A的 突變，survivin也就喪失對抗化療藥物Taxol誘導的凋亡的抵抗作用。
因此以survivin基因為靶點的抗腫瘤治療可以同時從以上四個方面提高腫瘤治療的效 果。正因為如此，survivin基因可以作為腫瘤治療的新靶點和腫瘤研究中的明星分子。
RNA干擾技術(RNAi)是近幾年發展起來的被認為是研究功能基因組最有力工具之一。這 種新興的生物技術為腫瘤分子水平的基因治療提供了新的技術和方法。RNA干擾(RM interference, RNAi)是由雙鏈RNA( double stranded RNA , dsRNA) dsRNA)介導的轉錄后 的基因沉默(post-transcriptional gene silencing, PTGS)現象。通過在多種生物細胞內 導入外源或內源的dsRNA可以使內源性mRNA發生特異性降解，從而引起相應基因轉錄的阻抑。
RNAi已作為一種簡單有效的基因敲除的技術，廣泛地應用于功能基因組學研究以及抗病毒、 抗腫瘤治療的研究中。最早的針對survivin的RNAi研究報導于2003年，Carvalho等用小 分子干擾RNA (small interfering腿,siRNA)轉染HeLa細胞，60h后蛋白印跡結果顯示治 療組中己檢測不到survivin的表達，細胞增殖明顯受抑，部分細胞有絲分裂受到阻滯，出現 凋亡(J Cell Sci,2003, 1 16 (14): 2987-2998)。隨著RNAi技術的不斷完善，由原來直接導 入外源的siRNA，發展到真核表達載體轉錄產生siRNA,以及用于RNAi的病毒載體的出現， 大大提高了轉染效率和干擾效率。Cheng等用靶向survivin基因的RNAi真核載體轉染肝細 胞癌HepG2細胞，發現轉染細胞中幾乎沒有survivin基因的表達，轉染細胞自發的凋亡增加， G2/M期細胞比例減少，細胞增殖減慢(World J Gastroenterol 2005,11 (5): 756-759)。目 前針對survivin的RNAi研究進展迅速，體外實驗顯示了良好的效果，相信不遠的將來會有 更為豐富和完善的研究結果出現。
應用RNA干擾技術，以小分子RNA作為靶向藥物，有針對性地對survivin基因的轉錄后 表達進行干擾，從而誘導腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞的有絲分裂，抑制腫瘤轉移時的血管 形成和降低腫瘤細胞放化療的耐受性，多層次，多途徑對腫瘤進行抑制，這可能成為了一種 新的腫瘤治療策略。而且survivin基因選擇性地表達在幾乎所有種類的腫瘤組織中，而正常 組織幾乎不表達，則可使這種基因治療對正常組織和細胞的毒副作用降到最低，應用RNAi特 異地抑制survivin等腫瘤相關基因的表達有望成為 一種新的腫瘤基因治療方式。

發明內容
本發明公開了一種高效的針對survivin基因的廣譜的小分子干擾RNA (siRNA)抗腫瘤 藥物，由具有下述核苷酸序列的正義鏈和反義鏈組成 正義鏈 5' -AGCAUUCGUCCGGUUGCGCX-3', 反義鏈5'- GCGCAACCGGACGAAUGCUX -3' 其中X代表tt、 TT或UU。 t代表脫氧胸腺嘧啶dT。 X優選代表tt。
本發明的小分子干擾RNA是主要針對survivin基因開放閱讀框(0RF )的功能保守區設 計的雙鏈siRNA,藥理試驗證明本發明的小分子干擾RNA具有廣譜的抗腫瘤作用，對肺癌、 肝癌、白血病、胃癌、宮頸癌、口腔上皮癌等在體外均有抑制作用，該序列的正義鏈與survivin 基因的mRM結合，干擾survivin基因mRNA的翻譯，從而誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞
分裂、降低腫瘤的細胞的耐藥性、抑制腫瘤血管的生成，達到治療腫瘤的目的。本發明是一 種全新作用機制的抗腫瘤新型藥物，可能為腫瘤的治療帶來了新的希望。
本發明所述的腫瘤疾病包括肺癌、肝癌、白血病、胃癌、宮頸癌、口腔上皮癌、結直腸 癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌等，其中優選肺癌、肝癌和白血病。
本發明也可制作藥用組合物，其含有至少一種上述雙鏈RM作為活性劑和一種藥用載體, 該組合物人體醫學上用診斷必治療用途，為用于診斷或治療，該組合物可以是溶液，形式如 可注射溶液，乳膏、軟膏、片劑、懸液等，可用適當方法施用，例注射、口服、局部、鼻、 直腸給藥等，載體可以是任何合適的藥用載體，優選施用方法是注射。
在臨床使用中，可以將本發明小分子干擾RNA (簡稱CPUsiRNA3)溶于不含RNA酶的無 菌水中，輕輕混勻，建議CPUsiRNA3為10微克/微升。取適量CPUsiRNA3與小分子干擾RNA 轉染試劑RNAi-Mate混合，在室溫溫育30分鐘，以形成CPUsiRNA3-RNAi-Mate復合物。將制 備好的CPUsiRNA3-RNAi-Mate復合物按5-500nmol/kg靜脈給藥， 一天一次，20天左右一個 療程。


圖l是本發明小分子干擾RNA作用后的癌細胞A549，HepG2和HL60圖
圖2是MTT法測得本發明小分子干擾RNA對肺癌細胞株A549、肝癌細胞株HepG2和白血
病細胞株HL60的抑制率
圖3是MTT法測得順銷對肺癌細胞株A549、肝癌細胞株H印G2和白血病細胞株HL60的
抑制率
圖4是PCR檢測本發明小分子干擾RNA對肺癌細胞株A549、肝癌細胞株HepG2和白血病 細胞株HL60survivin基因的mRNA水平的抑制
圖5是Western blot檢測本發明小分子干擾RNA對肺癌細胞株A549、肝癌細胞株HepG2 和白血病細胞株HL60的Survivin蛋白質的抑制
圖6是流式細胞儀檢測本發明小分子干擾RNA對肺癌細胞株AM9、肝癌細胞株HepG2和 白血病細胞株HL60的誘導細胞凋亡
具體實施例方式
實施例1
siRM的設計與合成
儀器 OligoPilot II DNA/RNA Synthesizer (瑞典Pharmacia公司)，HP-1100型高效 液相色譜儀(美國惠普公司)，DU 2640紫外分光光度計(美國Backman公司)。
材料和試劑合成柱(6. 3mL),分子篩(3A Sigma), 30HL載體(批號256723), RNA Pac PA 100分析柱(美國Dionex公司)，5種核苷酸單體(A，U,C,G, dT)，乙腈，二氯乙酸，四 唑，N 2甲基咪唑，除注明廠家外，其余為瑞典Pharmacia公司產品。
siRNA的設計根據survivin基因開放閱讀框(ORF)的序列，設計小分子干擾RNA CPUsiRNA3和1對負對照siRNA,將他們的序列在人類EST數據庫中比對，確定沒有與他們相 同的其它基因序列。CPUsi隨3正義鏈5， -AGCA而CGUCCGGUUGCGCdTdT-3，，反義鏈5， -GCGCAACCGGACGAAUGCUdTdT-3，。負對照siRNA的正義鏈5， -UUCUCCGAAC GUGUCACGUdTdT-3', 反義鏈5， -ACGUGACACGU UCGGAGAAdTdT-3， 。 siRNA的設計后送上海吉馬公司合成。
siRNA的化學合成用乙腈將5種單體(A,U，C,G， dT )配制成0. 2 mol/L溶液，分別將 5種單體、乙腈、二氯乙酸、四唑安裝到合成儀相應位置，其中單體、乙腈、四唑應加入適 當分子篩。合成步驟(1)利用二氯乙酸處理結合于固相載體的核苷酸或寡核苷酸，脫去其 5'羥基官能團上的二甲氧基三苯甲基(DMT )保護基團，露出反應性的5'端；(2)偶聯 反應由四唑催化完成，形成3， —5'磷酸酯鏈；(3)封閉反應將未反應5'羥基在N2甲基 咪唑催化下由乙酸酐來完成。RNA合成儀按照設計好的程序合成出CPUsiRNA3和負對照siRNA 的單鏈RNA。應用紫外分光光度計檢測D 260 nm值，并計算產量。
合成粗產品的HPLC色譜分析色譜柱DNA 2Pac PA 2100 (4mm x 250mm );樣品20 OD/m L ,進樣的量20uL;流動相A: 25畫1/L Tris， 1 mmol/LEDTA , 10%乙腈,pH 8;流 動相B: 25 mmol/L Tris, 1 mmol/L EDTA , 3 mol/L NH4C1, pH 8;洗脫梯度流動相B在 40 min內從10%到70%;流速1 mL/min;檢測波長260 nm;柱溫50 。C。
合成的單鏈RNA的正義鏈和反義鏈后，退火成雙鏈的CPUsiRNA3和負對照siRNA，之后 進行HPLC純化的純度大于97%的雙鏈CPUsiRNA3和負對照siRNA。
實施例2
抗腫瘤藥效學試驗 材料和方法
腫瘤細胞株A549、 HepG2和HL60由本實驗室保存，轉染試劑Lipofectamin TM 2000購自
Invitrogen公司，Taq DNA聚合酶，dNTP 、 DNA Marker和蛋白質Marker購于Takara公司。
Survivin蛋白的兔抗人抗體，HRP-羊抗兔IgG抗體、DAB顯色試劑盒購于武漢博士德公司。
細胞培養腫瘤細胞株A549、 HepG2和HL60在含10。/。胎牛血清的RPMI1640培養液中，37°C, 5%0)2的培養箱中培養。
MTT法將2.5 xl(T/L細胞接種于96孔板，每孔180ul，每組平行3孔，并設立空白， 陰性藥對照.44 h后，棄去上清，每孔加20pL新配制的5 g/L MTT,孵育4 h,棄去上清液， 加150pL DMSO溶解，混勾后用Bio-Rad型號的酶標儀490nm波長測定。
RT-PCR:按Trizol說明書進行培養細胞總RNA抽提RT采用說明書M-MLV逆轉錄酶體系， PCR擴增采用20juL反應體系。PCR擴增條件為94'C變性5min, 94。C變性30s, 58。C退火30s, 72'C延伸lmin， 25個循環。
Western blot檢測干擾效應轉染后48h取出六孔板，吸干RPMI-1640培養液，加入500 yL胰酶的溶液，待細胞消化后加入l mL PBS溶液，反復吹打將細胞沖下來，把細胞懸液轉 入1.5mLEP管中，1000 r/min離心5min收集細胞沉淀,加入60)jL預冷的細胞裂解液，反 復吹打將細胞充分混勻，冰浴中放置40min, 10000 r/min4。C離心10min，取上清置于-70 。C 保存。蛋白的分離釆用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE), 12%的分離膠和5%的濃縮膠， 細胞蛋白釆用稀釋的5x蛋白質的上樣緩沖溶液，經10(TC 4min變性后加樣，上樣量均為20 pL,恒壓120V至溴酸藍遷移至凝膠底部，取下凝膠，置轉膜緩沖液中平衡10min,覆蓋經處 理的PVDF膜，釆用半干轉移系統，按l亳安/每平方厘米恒流轉移3 h將蛋白轉移至膜上，將 PVDF膜置于含1(W小牛血清的1 xPBS溶液中4 。C封閉l小時，取出PVDF膜后在適當位置剪開 (根據目的蛋白和對照蛋白大致的電泳位置)，分別加入用含O. 1%小牛血清白蛋白l xPBST溶 液作l : 1000稀釋Survivin蛋白的一抗室溫振蕩孵育10h,用大量的PBST溶液洗滌三次，每 次IO min,再加入用含10。/。小牛血清的1 xPBST溶液作l : 1000稀釋的Survivin蛋白的二抗， 室溫振蕩孵育l h，用大量的PBST洗滌三次，每次IO min。吸干膜上的溶液，加入DAB顯色 液，顯色5 min。
流式細胞術檢測細胞凋亡轉染方法同前，轉染干擾載體化h后，細胞用胰蛋白酶消化 后linin， PBS洗兩遍，加入lmL乙醇固定過夜，去乙醇，PBS洗兩遍，加入100yL濃度為 10|ug/mL的P I,混勻后室溫避光孵育30 min,在反應管中加400 pL PBS,上機檢測細胞凋 亡。
統計學處理統計結果以.x ±s表示，用SPSS13. 0統計學軟件進行分析，數據兩兩比 較釆用配對資料t檢驗，多組之間比較用ANOVA進行。
結果
細胞形態
本發明的siRNA作用后的腫瘤細胞株A549、 HepG2和HL60形態發生明顯變化，表現為 細胞體積變小、形態不規則、細胞皺縮、核固縮，而在各對照組中細胞形態基本正常，貼壁 生長良好，見圖1，圖1中1是正常的肺癌A549細胞的圖；2是加了 200nM負對照siRNA的 肺癌細胞A549的圖；3， 4, 5, 6是分別加了 50nM, 100nM, 150nM， 200nM的本發明小分子干 擾RNA (以下簡稱CPUsiRNA3)的肺癌細胞A549的圖；7是正常的肝癌細胞HepG2的圖；8 是加了 200nM負對照siRNA的肝癌細胞HepG2圖；9,10， 11， 12是分別加了 50nM, 100nM, 150nM 200nM的CPUsiRNA3的肝癌細胞HepG2的圖；13是正常的白血病細胞HL60的圖；14是加了 200nM負對照siRNA的白血病細胞HL60的圖;15， 16,17， 18是分別加了 50nM, 100nM， 150nM, 200nM的CPUsiRNA3的白血病細胞HL60的圖。
細胞的增殖
本發明的小分子干擾RNA作用后的腫瘤細胞株A549、 HepG2和HL60的分裂明顯減少、細胞 的生長也受到明顯抑制，小分子干擾RNA CPUsiRNA3在12. 5nM至400nM對腫瘤細胞株A549 、 HepG2和HL60的抑制作用逐漸增強,CPUsiRNA3作用48小時后，MTT法檢測的對腫瘤細胞的抑 制率結果，見圖2。用臨床上常用的抗腫瘤的順鉑作為CPUsiRM3的藥效對照藥物，順鉑在5 luM至80pM對腫瘤細胞株A549、 HepG2和HL60的抑制作用逐漸增強,作用48小時后，MTT法檢 測的對腫瘤細胞的抑制率結果，見圖3。
RT-PCR檢測survivin基因的mRNA的轉錄
見圖4,圖中第1， 3， 5泳道分別是沒加藥的腫瘤A549、 HepG2和HL60細胞的RT-PCR檢 測結果，第2,4，6泳道是分別是加了有效的本發明的小分干擾RNA siRNAl 100nM "小時的 月中瘤A549、HepG2和HL60細胞的RT-PCR檢測結果。雖然它們都能擴增出450 bp survivin基 因的帶，但2,4，6泳道的條帶明顯更淡，這表明survivin基因在mRNA的轉錄受到了一定 的抑制。
Western blot檢測小分干擾RNA對survivin表達的抑制情況 見圖5，圖中第1, 3, 5泳道分別是沒加藥的腫瘤A549、H印G2和HL60細胞的Western blot 檢測結果，第2， 4， 6泳道是分別是加了本發明小分干擾RNA siRNAl lOOnM 48小時的腫瘤A"9、 HepG2和HL60細胞的Western blot檢測結果。雖然它們都能印出15 kD的Survivin蛋白 的帶，但2，4，6泳道的條帶明顯更淡，這表明survivin基因在蛋白質的翻譯受到了一定的抑 制。
流式細胞儀檢測細胞凋亡的實驗結果
圖6中，1，3，5分別是沒加藥的腫瘤A549、 HepG2和HL60細胞的流式細胞儀檢測細胞凋亡的 實驗結果，2, 4， 6泳道是分別是加了本發明的小分干擾RNA siRNAl 1 OOnM 48小時的腫瘤A549、 HepG2和HL60細胞的流式細胞儀檢測細胞凋亡的實驗結果。轉染的小分干擾RNA CPUs iRNA3 lOOnM 48小時后，用流式細胞儀檢測細胞凋亡明顯發生了凋亡。
序歹1」表
〈210〉 1 〈211〉 21 〈212〉 RNA 〈213〉人工序列 〈400〉
AGCAUUCGUCCGGUUGCGCtt
〈210〉 2 〈211> 21 〈212〉 RNA 〈213〉人工序列 〈400〉
GCGCAACCGGACGAAUGCUtt 〈210〉 3 〈211> 21 〈212〉 RNA 〈213〉人工序列 〈400 〉
AGCAUUCGUCCGGUUGCGCTT 〈210〉 4 〈211〉 21 〈212〉 RNA 〈213>人工序列
〈400〉
GCGCAACCGGACGAAUGCUTT 〈210〉 5 〈211〉 21 〈212〉隨 〈213〉人工序列 〈400 〉
AGCAimCGUCCGGUUGCGCUU 〈210〉 6 〈211〉 21 〈212〉 RNA 〈213〉人工序列 〈400〉
GCGCAACCGGACGAAUGCUUU
權利要求
1、抗腫瘤小分子干擾RNA為雙鏈小分子干擾RNA，其特征是由具有下述核苷酸序列的正義鏈和反義鏈組成正義鏈 5′-AGCAUUCGUCCGGUUGCGCX-3′，反義鏈 5′-GCGCAACCGGACGAAUGCUX-3′，其中X代表tt、TT或UU，t代表脫氧胸腺嘧啶。
2、 如權利要求1所述的抗腫瘤小分子干擾RNA,其中X代表t t。
3、 如權利要求1所述的抗腫瘤小分子干擾RNA，其中X代表TT。
4、 如權利要求1所述的抗腫瘤小分子干擾RNA，其中X代表UU。
5、 如權利要求1-4之一所述的抗腫瘤小分子干擾RNA在制備抗腫瘤藥物中的用途。
6、 如權利要求5所述的抗腫瘤小分子干擾RNA在制備抗腫瘤藥物中的用途，其中腫瘤 是肺癌、肝癌、白血病、胃癌、宮頸癌、口腔上皮癌、結直腸癌、胰腺癌、前列腺癌或乳腺 癌。
7、 如權利要求6所述的抗腫瘤小分子干擾RNA在制備抗腫瘤藥物中的用途，其中腫瘤 是肺癌、肝癌、白血病。
8、 如權利要求5所述的抗腫瘤小分子干擾RNA在制備抗腫瘤藥物中的用途，其是將小 分子干擾RNA溶于不含RNA酶的無菌水中制成溶液作針劑應用。
全文摘要
本發明涉及抗腫瘤小分子干擾RNA及其用途，其是由具有下述核苷酸序列的正義鏈和反義鏈組成正義鏈5′-AGCAUUCGUCCGGUUGCGCX-3′，反義鏈5′-GCGCAACCGGACGAAUGCUX-3′，其中X代表tt、TT或UU，t代表脫氧胸腺嘧啶。一種靶向凋亡抑制基因survivin的小分子干擾RNA(siRNA)的結構及其抗腫瘤用途。具有高效廣譜的siRNA抗腫瘤作用，對肺癌、肝癌、白血病、胃癌、宮頸癌、口腔上皮癌等在體外都有良好的抑制作用。CPUsiRNA3干擾它的轉錄后翻譯，從而誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞分裂、降低腫瘤的細胞的耐藥性、抑制腫瘤血管的生成，達到抑制腫瘤的目的。
文檔編號A61K48/00GK101113447SQ20071013740
公開日2008年1月30日 申請日期2007年7月10日 優先權日2007年4月17日
發明者呂美云, 周秀玲, 濤 奚, 瓊 姜, 新 張, 陸云華 申請人:宜春學院