專利名稱：復(fù)合生物素化殼聚糖膜的制法及在牙周組織再生中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種復(fù)合生物素化殼聚糖膜的制備及其在牙周組織再生中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
牙周病是人類口腔兩大類主要疾病之一，在我國和世界范圍均有較高的患 病率，己成為成年人拔牙的首要原因。隨著我國和世界人口老齡化，牙周病將 會(huì)有更突出的問題，嚴(yán)重影響人的生存質(zhì)量和身體健康，人們對(duì)牙周治療的要 求將明顯增加。牙周病的治療一直是臨床重點(diǎn)研究領(lǐng)域之一。牙周病的治療不僅在于炎癥 消除，更重要的是在于使已破壞的牙周組織再生和形成牙周新附著 (new-attachments如何獲得牙周組織完全再生，是至今尚未解決的難題，也 是牙周病研究領(lǐng)域中的重要課題和突破點(diǎn)。弓l導(dǎo)牙周組織再生(periodontal guided tissue regeneration, GTR)技 術(shù)是近年來根據(jù)Melcher提出的牙周組織再生潛能理論發(fā)展起來的牙周病治療 新方法，被認(rèn)為是目前最先進(jìn)的牙周治療方法。它是將屏障膜置于牙齦瓣和處 理過的根面之間，阻擋牙齦上皮和結(jié)締組織與根面先接觸，保證牙周前體細(xì)胞 優(yōu)先占據(jù)牙根面，依靠牙周前體細(xì)胞遷移、分化、增殖，重新形成牙周組織，一 建立牙周新附著。目前，GTR屏障膜有多種，總體可分為三類(1) 不可吸收膜以膨體聚四氟乙烯(e-PTEE)為主要代表，已較廣泛用 于實(shí)驗(yàn)研究和臨床治療。但此類膜需二次手術(shù)取出，且取出時(shí)間難以掌握，放 置時(shí)間過長會(huì)影響牙周組織再生和增加感染機(jī)會(huì)。(2) 可吸收性膜主要有聚合膠原膜、聚乳酸膜、乳酸一乙酸共聚體膜等。 此類膜的優(yōu)點(diǎn)是能在體內(nèi)逐漸降解，避免二次手術(shù)，減少了創(chuàng)傷。(3) 生物素化屏障膜上述兩類GTR屏障膜均為單純性屏障膜，僅能提供 物理性屏障作用，治療后很難達(dá)到牙周組織完全再生，因此生物素化屏障膜逐 漸成為目前研究的趨勢。生物素化屏障膜的含義是屏障膜不僅具備上述膜的作 用，還具有一定的生物活性，主動(dòng)引導(dǎo)牙周組織前體細(xì)胞生長、分化、增殖。目前釆用的生物素化屏障膜設(shè)計(jì)模式是把可吸收性屏障膜材料、生物活性 因子和緩釋載體三者復(fù)合起來。研究證實(shí)生物素化屏障膜的牙周治療效果優(yōu)于 單純性屏障膜。但是，目前生物素化屏障膜的研究還處于探索階段，缺乏系統(tǒng) 性。如何解決生物活性因子的載體問題及如何充分利用和調(diào)動(dòng)GTR屏障膜材料、 生物活性因子、緩釋載體的綜合效應(yīng)，是今后牙周病治療和GTR技術(shù)發(fā)展的方 向。牙周組織的再生依賴于牙周前體細(xì)胞在多種生長因子的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控作用下， 完成分化、增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的生物合成。如何正確選用和組合生長因子一直 是研究中的難題。人們在研究中發(fā)現(xiàn)，人重組骨形成蛋白-2(rhBMP2)和堿性成纖 維細(xì)胞生長因子(bFGF)在生物學(xué)功能上有良好的互補(bǔ)性，共同參與骨和軟骨 的生長代謝調(diào)節(jié)。體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，兩者聯(lián)合應(yīng)用對(duì)牙周膜細(xì)胞的增殖有協(xié)同作 用。但它們在體內(nèi)易被迅速彌散和降解，必須頻繁給藥，且應(yīng)用效果較差。這 就需要將rhBMP2和bFGF加入到合適的載體/控釋系統(tǒng)中，使其免受蛋白水解， 在需要的地方長時(shí)間可控釋放，并保持生長因子的活性。殼聚糖(chitosan)是甲殼素(chitin)的脫乙?；a(chǎn)物，是自然界第二 大類天然多糖，廣泛存在于昆蟲、甲殼類動(dòng)物的外殼和真菌細(xì)胞壁中，無毒、 無免疫原性，具有良好的組織相容性、生物可降解性，被廣泛應(yīng)用生物醫(yī)學(xué)和 藥學(xué)的實(shí)驗(yàn)和臨床研究。殼聚糖作為一種新型藥用載體在緩釋給藥系統(tǒng)，特別 是在微球系統(tǒng)中的應(yīng)用已引起人們廣泛的關(guān)注。殼聚糖微球(chitosan microsphere, CM)有如下作用特點(diǎn)①控制釋放，CM包封藥物后具有明顯的控 釋和延長藥效的作用。②增加藥物的靶向性。③提高疏水性藥物通過細(xì)胞膜， 殼聚糖微球可以改變膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，增加藥物對(duì)生物膜的通透性。④增加藥物的 穩(wěn)定性。(D減少給藥劑量，降低毒副反應(yīng)，提高藥物療效。目前，還沒有將殼聚糖微球包封生長因子應(yīng)用于牙周組織再生中的報(bào)道； 也沒有關(guān)于殼聚糖微球包封bFGF或rhBMP2的研究；及含殼聚糖微球的生物素化 殼聚糖膜的研究。發(fā)明內(nèi)容為了能夠較長時(shí)間控制釋放rhBMP2和bFGF,保護(hù)生長因子在牙周再生中發(fā) 揮更好的作用，以實(shí)現(xiàn)牙周組織完全再生，恢復(fù)牙周功能，本發(fā)明的目的是提供 一種復(fù)合生物素化殼聚糖膜的制備及其在牙周組織再生中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的一種復(fù)合生物素化殼聚糖膜，其特征在于它包含人重組骨形成蛋白-2
(rhBMP2)和堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)，所述人重組骨形成蛋白-2和堿 性成纖維細(xì)胞生長因子均由殼聚糖微球包裹；人重組骨形成蛋白-2殼聚糖微球 和堿性成纖維細(xì)胞生長因子殼聚糖微球均被包裹于復(fù)合生物素化殼聚糖膜中。上述一種復(fù)合生物素化殼聚糖膜的制法，包括以下步驟1) 以殼聚糖微球包裹人重組骨形成蛋白-2，制成人重組骨形成蛋白-2殼 聚糖微球；2) 以殼聚糖微球包裹堿性成纖維細(xì)胞生長因子，制成堿性成纖維細(xì)胞生 長因子殼聚糖微球；3) 分別將人重組骨形成蛋白-2殼聚糖微球和堿性成纖維細(xì)胞生長因子殼 聚糖微球加入殼聚糖醋酸溶液中，干燥，制成復(fù)合生物素化殼聚糖膜。干燥時(shí)， 應(yīng)在4'C條件下。上述一種復(fù)合生物素化殼聚糖膜在牙周組織再生中的應(yīng)用。又一種復(fù)合生物素化殼聚糖膜，其特征在于它包括人重組骨形成蛋白-2， 所述人重組骨形成蛋白-2由殼聚糖微球包裹；人重組骨形成蛋白-2殼聚糖微球 被包裹于生物素化殼聚糖膜中。又一種復(fù)合生物素化殼聚糖膜的制法，包括以下步驟1) 以殼聚糖微球包裹人重組骨形成蛋白-2，制成人重組骨形成蛋白-2殼 聚糖微球；2) 將人重組骨形成蛋白-2殼聚糖微球加入殼聚糖醋酸溶液中，干燥，制 成復(fù)合生物素化殼聚糖膜。干燥時(shí)，應(yīng)在4'C條件下。又一種復(fù)合生物素化殼聚糖膜在牙周組織再生中的應(yīng)用。再一種復(fù)合生物素化殼聚糖膜，其特征在于它包括堿性成纖維細(xì)胞生長 因子，所述堿性成纖維細(xì)胞生長因子由殼聚糖微球包裹；堿性成纖維細(xì)胞生長 因子殼聚糖微球包裹于生物素化殼聚糖膜中。再一種復(fù)合生物素化殼聚糖膜的制法，包括以下步驟1)以殼聚糖微球包裹堿性成纖維細(xì)胞生長因子，制成堿性成纖維細(xì)胞生 長因子殼聚糖微球；2)將堿性成纖維細(xì)胞生長因子殼聚糖微球加入殼聚糖醋酸溶液中，干燥， 制成復(fù)合生物素化殼聚糖膜。干燥時(shí)，應(yīng)在4'C條件下。再一種復(fù)合生物素化殼聚糖膜在牙周組織再生中的應(yīng)用。 本發(fā)明利用rhBMP2和bFGF生物學(xué)功能及殼聚糖特點(diǎn)，以組織相容性良好的 殼聚糖微球作為rhBMP2和bFGF的載體/控釋系統(tǒng),制成一種載rhBMP2或載bFGF 或載rhBMP2和bFGF兩種生長因子殼聚糖微球的新型GTR殼聚糖膜——復(fù)合生物 素化殼聚糖膜，為牙周病的治愈提供一種有效的方法，也為實(shí)現(xiàn)牙周組織完全再 生提供一種新的途徑。本發(fā)明利用rhBMP2和bFGF生物學(xué)功能和殼聚糖微球的作用特點(diǎn)，通過 Berthold等的沉淀/凝聚法制成殼聚糖微球，用殼聚糖微球包封rhBMP2和bFGF， 形成rhBMP2和bFGF殼聚糖微球。將該微球均勻散布于殼聚糖醋酸溶液中，在一 定條件下成膜，從而制成生物素化屏障膜。因該膜中含有rhBMP2和bFGF殼聚糖 微球，能夠較長時(shí)間控制釋放rhBMP2和bFGF，保護(hù)生長因子在牙周再生中發(fā)揮 更好的作用。以實(shí)現(xiàn)牙周組織完全再生，恢復(fù)牙周功能。本發(fā)明必將為廣大牙 周病患者造福，其社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益很大。
附圖是本發(fā)明中第一實(shí)施例中復(fù)合生物素化殼聚糖膜的制法示意圖。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1一種復(fù)合生物素化殼聚糖膜，它包括人重組骨形成蛋白-2 (rhBMP2)和堿 性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)，人重組骨形成蛋白-2和堿性成纖維細(xì)胞生長 因子均由殼聚糖微球包裹；人重組骨形成蛋白-2殼聚糖微球和堿性成纖維細(xì)胞 生長因子殼聚糖微球均被包裹于復(fù)合生物素化殼聚糖膜中。上述一種復(fù)合生物素化殼聚糖膜的制法，包括以下步驟1) 以殼聚糖微球包裹人重組骨形成蛋白-2，制成人重組骨形成蛋白-2殼 聚糖微球；2) 以殼聚糖微球包裹堿性成纖維細(xì)胞生長因子，制成堿性成纖維細(xì)胞生 長因子殼聚糖微球；3)分別將人重組骨形成蛋白-2殼聚糖微球和堿性成纖維細(xì)胞生長因子殼聚 糖微球加入殼聚糖醋酸溶液中，在4'C條件下干燥，制成復(fù)合生物素化殼聚糖膜。 上述一種復(fù)合生物素化殼聚糖膜在牙周組織再生中的應(yīng)用。 本實(shí)施例中，(1) 以殼聚糖微球作為的載體/控釋系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)rhBMP2和bFGF能夠緩釋， 保護(hù)rhBMP2和bFGF不被蛋白水解之目的，(2) 在殼聚糖膜加入載rhBMP2和bFGF殼聚糖微球，制成復(fù)合生物素化殼 聚糖膜。實(shí)施例2又一種復(fù)合生物素化殼聚糖膜，它包括人重組骨形成蛋白-2，所述人重組 骨形成蛋白-2由殼聚糖微球包裹；人重組骨形成蛋白-2殼聚糖微球被包裹于生 物素化殼聚糖膜中。又一種復(fù)合生物素化殼聚糖膜的制法，包括以下步驟1) 以殼聚糖微球包裹人重組骨形成蛋白-2，制成人重組骨形成蛋白-2殼 聚糖微球；2) 將人重組骨形成蛋白-2殼聚糖微球加入殼聚糖醋酸溶液中，4t:條件下 干燥，制成復(fù)合生物素化殼聚糖膜。又一種復(fù)合生物素化殼聚糖膜在牙周組織再生中的應(yīng)用。 實(shí)施例3再一種復(fù)合生物素化殼聚糖膜，它包括堿性成纖維細(xì)胞生長因子，所述堿 性成纖維細(xì)胞生長因子由殼聚糖微球包裹；在堿性成纖維細(xì)胞生長因子殼聚糖 微球外包裹生物素化殼聚糖膜。再一種復(fù)合生物素化殼聚糖膜的制法，包括以下步驟1) 以殼聚糖微球包裹堿性成纖維細(xì)胞生長因子，制成堿性成纖維細(xì)胞生 長因子殼聚糖微球；2) 將堿性成纖維細(xì)胞生長因子殼聚糖微球加入殼聚糖醋酸溶液中，在4 。C條件下，干燥、制成復(fù)合生物素化殼聚糖膜。再一種復(fù)合生物素化殼聚糖膜在牙周組織再生中的應(yīng)用。 以下具體描述制備方法 rhBM&和bFGF殼聚糖微球的制備如下釆用Berthold等的沉淀/凝聚法制成殼聚糖微球，該方法不用有機(jī)溶劑和 成二醛。在0. 25%殼聚糖醋酸溶液中，加入分散劑吐溫將20%硫酸鈉溶液滴入攪拌的 殼聚糖溶液中，經(jīng)過超聲、離心分離、洗滌純化和冷凍干燥得殼聚糖微球。取 一定量的殼聚糖微球加入殼聚糖醋酸溶液中，分別加一定量的rhBMP2， 4'C條件 下磁力攪拌，離心沉淀，洗滌純化，冷凍干燥即得rhBMP2殼聚糖微球。將離心 液、洗滌液收集合并，稱為"合并液"。同法制成bFGF殼聚糖微球。將rhBMP2殼聚糖微球和bFGF殼聚糖微球加入2%殼聚糖醋酸溶液中，低溫 磁力攪拌均勻，灌入模具，4'C干燥成膜，即制成復(fù)合生物素化殼聚糖膜。同法 制得分別含rhBMP2殼聚糖微球和bFGF殼聚糖微球的生物素殼聚糖膜及空白殼聚 糖微球膜，共制取得到如下四種膜1、 含rhBMP2殼聚糖微球生物素化殼聚糖膜；2、 含bFGF殼聚糖微球生物素化殼聚糖膜；3、 含有rhBMP2殼聚糖微球和bFGF殼聚糖微球的復(fù)合生物素化殼聚糖膜；4、 含空白殼聚糖微球的殼聚糖膜。在光學(xué)顯微鏡下觀察，所得的空白殼聚糖微球表面光滑，大小較均勻，在 生理鹽水中分散性好，粒徑范圍1. 2 3. 8陶。rhBMP2殼聚糖微球和bFGF殼聚糖微球載藥量及包封率測定如下根據(jù)rhBM^和bFGF酶聯(lián)免疫測試劑盒提供的方法，用DG3022酶聯(lián)免疫檢 測儀，于492nm處測定吸光度(A)值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，同法測定"合并液"A492 值。按下式計(jì)算殼聚糖微球載藥量和包封率載藥量(用藥量一合并液中藥物量)/微球重量X100鬼包封率=(用藥量一合并液中藥物量)/用藥量xiocm體外釋藥實(shí)驗(yàn)用動(dòng)態(tài)透析法進(jìn)行殼聚糖微球體外釋藥試驗(yàn)，取rhBMP2殼聚糖微球和bFGF 殼聚糖微球，混懸于磷酸鹽緩沖液中，37'C溫磁力攪拌，每間隔一段時(shí)間取樣離 心，取上清液，按一定比例稀釋，測定rhBMP2和bFGF濃度。以測定rhBMP2殼聚糖微球和bFGF殼聚糖微球體外釋放特征。體外rhBMP2殼聚糖微球和bFGF殼聚糖微球?qū)θ搜乐苣ぜ?xì)胞增殖的影響在體外培養(yǎng)人第5代人牙周膜細(xì)胞培養(yǎng)液中加入rhBMP2殼聚糖微球和bFGF 殼聚糖微球，共同孵育，定期觀察人牙周膜細(xì)胞的增殖、粘附情況，來鑒定微 球的增殖活性，同法設(shè)立rhBMP2殼聚糖微球組和bFGF殼聚糖微球組，空白殼聚 糖微球組作為對(duì)照。通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察復(fù)合生物素化殼聚糖膜在牙周組織再生中的作用。將制得的膜分別植入狗牙周病模型中，以相同的時(shí)間間隔處死動(dòng)物取材， 通過組織形態(tài)學(xué)、骨定量分析、X片等觀察方法，比較各組牙周組織再生情況， 明確生物素化殼聚糖膜能夠有效地誘導(dǎo)牙周組織再生，恢復(fù)牙周功能。對(duì)rhBMP2殼聚糖微球和bFGF殼聚糖微球載藥量、包封率及體外控制釋放 作用測定。殼聚糖微球中bFGF含量為7.81mg/g或4. 68X 104u/mg。包封率為 93. 7%。殼聚糖微球中rhBMP-2含量為91. 8rag/g或9.18xl(fu/g。包封率為91. 8%。bFGF殼聚糖微球體外釋放特征初期釋藥較快，第20天累計(jì)釋放度約61. 5%。rhBMP2殼聚糖微球體外釋放特征第20天累計(jì)釋放度約64. 4% 。 在體外培養(yǎng)人第5代人牙周膜細(xì)胞培養(yǎng)液中分別加入rhBMP2殼聚糖微球和 bFGF殼聚糖微球，共同孵育，定期觀察人牙周膜細(xì)胞的增殖、粘附情況，可明 顯促進(jìn)牙周膜細(xì)胞的增殖。完成了 rhBMP2殼聚糖微球和bFGF殼聚糖微球活性鑒 定。通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察生物素化殼聚糖膜在牙周組織再生中的作用① 含rhBMP2殼聚糖微球生物素化殼聚糖膜緩釋bFGF殼聚糖膜(實(shí)驗(yàn)組) 新生牙槽骨、牙骨質(zhì)、牙周纖維明顯多于對(duì)照組(P<0.01)，且較成熟， 形態(tài)較規(guī)則，與正常牙周韌帶結(jié)構(gòu)相似。② 含bFGF殼聚糖微球生物素化殼聚糖膜實(shí)驗(yàn)組新生牙槽骨、牙骨質(zhì)、 牙周纖維明顯多于對(duì)照組(P<0.01)。③ 含有rhBMP2殼聚糖微球和bFGF殼聚糖微球的復(fù)合生物素化殼聚糖膜 新生牙槽骨、牙骨質(zhì)、牙周纖維明顯多于對(duì)照各組。本發(fā)明將生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)、藥劑學(xué)和牙周病學(xué)交叉結(jié)合起來，研制一種新 型引導(dǎo)牙周組織再生殼聚糖膜——生物素化殼聚糖膜。該膜中含有一種獨(dú)特的rhBMP2和bFGF載體/控釋系統(tǒng)——?dú)ぞ厶俏⑶?，殼聚糖微球能夠穩(wěn)定地控釋其中 的rhBMPa和bFGF，使它們能在足夠的時(shí)間誘導(dǎo)牙周組織再生，以實(shí)現(xiàn)牙周組織 的完全再生。
權(quán)利要求
1、一種復(fù)合生物素化殼聚糖膜，其特征在于它包含人重組骨形成蛋白-2和堿性成纖維細(xì)胞生長因子，所述人重組骨形成蛋白-2和堿性成纖維細(xì)胞生長因子均由殼聚糖微球包裹；人重組骨形成蛋白-2殼聚糖微球和堿性成纖維細(xì)胞生長因子殼聚糖微球均被包裹于復(fù)合生物素化殼聚糖膜中。
2、 一種權(quán)利要求1所述復(fù)合生物素化殼聚糖膜的制法，包括以下步驟1) 以殼聚糖微球包裹人重組骨形成蛋白-2，制成人重組骨形成蛋白-2殼 聚糖微球；2) 以殼聚糖微球包裹堿性成纖維細(xì)胞生長因子，制成堿性成纖維細(xì)胞生 長因子殼聚糖微球；3) 分別將人重組骨形成蛋白-2殼聚糖微球和堿性成纖維細(xì)胞生長因子殼 聚糖微球加入殼聚糖醋酸溶液中，干燥，制成復(fù)合生物素化殼聚糖膜。
3、 一種權(quán)利要求1所述復(fù)合生物素化殼聚糖膜在牙周組織再生中的應(yīng)用。
4、 一種復(fù)合生物素化殼聚糖膜，其特征在于它包含人重組骨形成蛋白 -2，所述人重組骨形成蛋白-2由殼聚糖微球包裹；人重組骨形成蛋白-2殼聚糖 微球被包裹于生物素化殼聚糖膜中。
5、 一種權(quán)利要求4所述復(fù)合生物素化殼聚糖膜的制法，包括以下步驟1) 以殼聚糖微球包裹人重組骨形成蛋白-2，制成人重組骨形成蛋白-2殼 聚糖微球；2) 將人重組骨形成蛋白-2殼聚糖微球加入殼聚糖醋酸溶液中，干燥，制 成復(fù)合生物素化殼聚糖膜。
6、 一種權(quán)利要求4所述復(fù)合生物素化殼聚糖膜在牙周組織再生中的應(yīng)用。
7、 一種復(fù)合生物素化殼聚糖膜，其特征在于它包含堿性成纖維細(xì)胞生 長因子，所述堿性成纖維細(xì)胞生長因子由殼聚糖微球包裹；在堿性成纖維細(xì)胞 生長因子殼聚糖微球被包裹于生物素化殼聚糖膜中。
8、 一種權(quán)利要求7所述復(fù)合生物素化殼聚糖膜的制法，包括以下步驟1) 以殼聚糖微球包裹堿性成纖維細(xì)胞生長因子，制成堿性成纖維細(xì)胞生長因子殼聚糖微球；2) 將堿性成纖維細(xì)胞生長因子殼聚糖微球加入殼聚糖醋酸溶液中，干燥， 制成復(fù)合生物素化殼聚糖膜。
9、 一種權(quán)利要求7所述復(fù)合生物素化殼聚糖膜在牙周組織再生中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種復(fù)合生物素化殼聚糖膜的制法及其在牙周組織再生中的應(yīng)用，復(fù)合生物素化殼聚糖膜中包含載人重組骨形成蛋白-2(rhBMP<sub>2</sub>)殼聚糖微球和載堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)殼聚糖微球，rhBMP<sub>2</sub>和bFGF均由殼聚糖微球包裹；rhBMP<sub>2</sub>殼聚糖微球和bFGF殼聚糖微球均被包裹于復(fù)合生物素化殼聚糖膜中。也可以是rhBMP<sub>2</sub>殼聚糖和bFGF殼聚糖中的任意一種殼聚糖微球被包裹于復(fù)合生物素化殼聚糖膜中。本發(fā)明能夠較長時(shí)間控制釋放rhBMP<sub>2</sub>和bFGF，保護(hù)生長因子在牙周再生中發(fā)揮更好的作用，以實(shí)現(xiàn)牙周組織完全再生，恢復(fù)牙周功能。
文檔編號(hào)A61K38/18GK101152564SQ200710132648
公開日2008年4月2日 申請日期2007年9月18日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月18日
發(fā)明者卜壽山, 許金菊, 金頌良 申請人:江蘇省人民醫(yī)院