專利名稱：：一種重組人血管內(nèi)皮抑制素緩釋微球的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及重組人血管內(nèi)皮抑制素緩釋微球的制備方法，尤其涉及一種具有高包封率的重組人血管內(nèi)皮抑制素緩釋微球的制備方法。技術(shù)背景20世紀(jì)60年代，美國(guó)哈佛醫(yī)學(xué)院的Folkman博士提出"腫瘤生長(zhǎng)依賴血管生長(zhǎng)"這一假設(shè)，并于1971年提出"餓死腫瘤療法"理論。今天，在分子生物學(xué)技術(shù)的推動(dòng)下，運(yùn)用基因工程技術(shù)研發(fā)出了抗癌蛋白質(zhì)一恩度。中國(guó)專利CN1237072C羅永章等在天然Endostatin的N末端添加了9個(gè)氨基酸，不僅使Endostatin穩(wěn)定性提高，半衰期延長(zhǎng)，而且生物活性增加，蛋白的復(fù)性率也高于一般生產(chǎn)方法。該藥物已正式上市，命名為恩度，其活性成份為一基因工程蛋白——重組人血管內(nèi)皮抑制素Endostar，Endostar是以重組DNA技術(shù)生產(chǎn)，以大腸桿菌為表達(dá)系統(tǒng)，其表達(dá)出的Endostar與先前的Endostatin相比較，表達(dá)水平更高，療效更強(qiáng)。它通過阻斷腫瘤新生血管生成，從而阻斷腫瘤的營(yíng)養(yǎng)供給，逐步減小腫瘤體積，達(dá)到抗腫瘤作用。所生產(chǎn)的重組人內(nèi)皮抑制素由192個(gè)氨基酸構(gòu)成，其氨基酸序列為(M)GGSHHHHHHSHRDFQPVLHLVALNSPLSGGMRGIRGADFQCF②ARAVGLGQSAASCHHAYIVLCIENSFMTASK,其中當(dāng)由大腸桿菌表達(dá)時(shí)其N末端的Met有時(shí)會(huì)被部分刪除(其序列分別為SEQIDNO.l和SEQIDN0.2)。蛋白與多肽在很多治療方面都是理想的藥物，然而這些有益的效用最終可能受限于傳遞蛋白的困難。在口服和透皮給藥中，其生物利用度通常很低，并且半衰期短。將蛋白和多肽類藥物制備成微球制劑可以減少注射頻率，提高患者的順應(yīng)性。對(duì)蛋白和多肽類藥物，微球是相當(dāng)理想的載藥系統(tǒng)。目前有多種蛋白、多肽類藥物的緩控釋微球處于研發(fā)階段，包括促黃體生成素釋放激素拮抗物(LXT-101),重組人胰島素樣生長(zhǎng)激素(rhIGF-I)以及干擾素a2-b(IFNarb)等。此外，一些微球制劑已獲FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床，如日本Takeda公司的亮丙瑞林微球LupronDepot,瑞士Debiopharm公司的曲普瑞林微球TrelstarDepot和瑞士Novartis公司的奧曲肽微球SandostatinDepot等。微球是指藥物溶解或分散在高分子材料基質(zhì)中形成的微小球狀實(shí)體，屬于基質(zhì)型骨架微粒。微球的粒徑通常在l^-300罔之間，藥物被制成微球制劑后，有著靶向性、緩釋性、安全性等特點(diǎn)。有多種材料可制備微球，近年來可生物降解高分子材料作為微球的基質(zhì)受到了越來越多的重視，并廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究。乳酸-羥基乙酸共聚物(polylactide-co-glycolide,PLGA)是一弁生物相容性良好的可降解高分子材料，其主鏈含有不穩(wěn)定的酯鍵，在體內(nèi)降解后的終產(chǎn)物為水和二氧化碳。并獲FDA批準(zhǔn)作為醫(yī)用材料。目前大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道的制備蛋白質(zhì)微球的方法為水包油包水復(fù)乳溶劑揮發(fā)法，該方法存在最大的缺陷是內(nèi)水相中的藥物在制備中極易通過微球中的孔隙滲漏至外水相，使包封率不高。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種重組人血管內(nèi)皮抑制素載藥量高、突釋量合適且緩釋周期較長(zhǎng)的緩釋微球制劑的制備方法。本發(fā)明的目的是通過下列技術(shù)措施實(shí)現(xiàn)的一種重組人血管內(nèi)皮抑制素緩釋微球的制備方法，該方法包括下列步驟(1)將重組人血管內(nèi)皮抑制素溶解于含有蛋白穩(wěn)定劑的緩沖液中，得到內(nèi)水相；(2)再將乳酸-羥基乙酸共聚物溶解于混合有機(jī)溶劑中得到內(nèi)油相；(3)以每分鐘1000-30000轉(zhuǎn)高速分散內(nèi)水相及內(nèi)油相的混合溶液，內(nèi)水相內(nèi)油相的體積比為1:21:20，得到初乳；(4)將所得初乳置于盛有含乳化劑的植物油或礦物油的攪拌容器中，在060'C和每分鐘100-2000轉(zhuǎn)的速度攪拌形成油包油包水型復(fù)乳；(5)持續(xù)攪拌揮發(fā)內(nèi)油相中的混合有機(jī)溶劑，待微球固化后用微孔濾膜過濾分離，用溶劑洗滌微球表面殘留的植物油或礦物油，真空干燥后得到微球成品。所述的制備方法，其中所述重組人血管內(nèi)皮抑制素為重組人血管內(nèi)皮抑制素Endostar，其在緩沖液中的濃度為l~500mg/ml。所述的制備方法，其中所述的蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑包括明膠、硫酸軟骨素、山梨醇、木糖醇、甘露醇、海藻糖、碳酸鋅、白蛋白、泊洛沙姆中的一種或多種，優(yōu)選硫酸軟骨素；穩(wěn)定劑在內(nèi)水相中的濃度按重量體積百分比計(jì)為0.1%~20%。所述的制備方法，其中所述的緩沖液為pH-37的醋酸鈉溶液或pH-511的磷酸鹽溶液，優(yōu)選pH=5.5的醋酸鈉溶液或pH=7.4的磷酸鹽溶液。所述的制備方法，其中所述共聚物為乳酸-羥基乙酸共聚物，乳酸-羥基乙酸分子量大小為5000~150000，其單體組成比例乳酸羥基乙酸為99:150:50,其在泡合有機(jī)溶劑中的濃度為10~500mg/ml。所述的制備方法，其中步驟(2)中所述混合有機(jī)溶劑為二氯甲烷和乙腈，或二氯甲烷和醋酸，或二氯甲烷和丙酮，或乙酸乙酯和丙酮，或乙酸乙酯和乙腈，二者比例為1:99:1;或者所述混合有機(jī)溶劑為二氯甲烷和乙腈和乙酸乙酯，或二氯甲烷和丙酮和乙酸乙酯，或乙酸乙酯和乙腈和丙酮，三者比例為3:0.01:0.010.01:3:0.010.01:0.01:3。所述的制備方法，其中步驟(4)所述植物油為大豆油、玉米油、棉籽油、花生油、茶油的一種或多種；所述礦物油為液體石蠟或二甲基硅油。所述的制備方法，其中步驟(4)所述植物油的乳化劑為卵磷脂、蔗糖酯的一種或多種，加入量按重量體積百分比計(jì)為植物油的0.1~10%，所述礦物油的乳化劑為司盤-80、司盤-60、蔗糖酯的一種或多種，加入量按重量體積百分比計(jì)為礦物油的0.1~10%。所述的制備方法，其中步驟(5)所述的微孔濾膜過濾為過濾微球的技術(shù)手段，采用的膜為有機(jī)膜，孔徑范圍0.2pm2nm。所述的制備方法，其中步驟(5)所述洗滌微球的溶劑為正己垸、環(huán)己垸、j下庚垸、石油醚的一種或多種。本發(fā)明的有益效果第一，在有機(jī)相的溶劑系統(tǒng)中，按一定比例混合多種溶劑，使內(nèi)油相既不與內(nèi)水相相溶(保持藥物活性)，也不與外油相相溶(使初乳的液滴圓整)，因此在制備中可以形成穩(wěn)定的復(fù)乳，內(nèi)水相中不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)藥物不與內(nèi)油相接觸，外油相又可以起到懸浮穩(wěn)定的作用，使形成的微球形態(tài)圓整，粒徑均一。新開發(fā)的多溶劑混合溶劑系統(tǒng)制備的微球粒子更圓整，粒徑分布范圍更窄，包封率更高。第二，采用了新的穩(wěn)定蛋白質(zhì)手段將蛋白穩(wěn)定劑(優(yōu)選硫酸軟骨素)與Endostar結(jié)合(說明書給出的蛋白穩(wěn)定劑不限于硫酸軟骨素)，利用新型蛋白穩(wěn)定劑-Endostar(特別是硫酸軟骨素-Endostar)的復(fù)合物來制備微球，這一技術(shù)顯著減少了微球中Endostar的活性損失。第三，使用乳化劑，特別是蔗糖酯配合傳統(tǒng)乳化劑卵磷脂、司盤用于復(fù)乳的乳化過程，提高了乳化效率，穩(wěn)定了外油相中初乳的微小液滴，不僅使制備的微球表面光滑，并且粒徑隨加入乳化劑的量不同，可制備出平均粒徑lpm30(^m的微球。第四，W/0/0乳化溶劑揮發(fā)法避免了常見的W/0/W復(fù)乳溶劑揮發(fā)法對(duì)水溶性藥物包封率不高的缺陷，其使用植物油或礦物油作為外油相，有效的阻止了蛋白質(zhì)在制備中向外滲漏，提高了微球的包封率(達(dá)到90%以上)。第五，該方法制備的微球含水量極低(干燥前約6%)。用傳統(tǒng)的液中噴霧干燥法或W/0/W復(fù)乳溶劑揮發(fā)法制備的微球含水量很高(干燥前約24%)，在真空冷凍干燥的過程中，微球內(nèi)部的水形成大的冰晶后升華，這一過程擴(kuò)大了微球內(nèi)部和表面的孔洞，損害微球內(nèi)部結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致微球突釋增大。而用油包油包水乳化溶劑揮發(fā)法制備的微球在冷凍干燥前和冷凍干燥后，突釋量無顯著改變。第六，該方法得到的微球可調(diào)控微球內(nèi)藥物的釋放時(shí)間，通過改變?nèi)樗?羥基乙酸的分子量和單體比例，可方便調(diào)節(jié)微球的裂解速率，使微球在體內(nèi)的釋放時(shí)間在10天~180天內(nèi)。第七，該方法穩(wěn)定了微球中包裹的重組人血管內(nèi)皮抑制素，特別是Endostar這一蛋白質(zhì)生物大分子，通過在內(nèi)水相添加不同濃度的明膠、山梨醇、木糖醇、甘露醇、海藻糖、碳酸鋅、白蛋白，使微球中Endostar的活性保持在80%以上。其中，山梨醇、木糖醇、甘露醇、海藻糖可以減少Endostar與聚合物相互結(jié)合；明膠不僅可以保持Endostar在冷凍干燥過程中的活性，作為一種蛋白質(zhì)，明膠也發(fā)揮了其表面活性性質(zhì)，在制備初乳時(shí)迅速增大的油水界面會(huì)極大的破壞Endostar的三級(jí)結(jié)構(gòu)，明膠比Endostar更易于分布在油水界上。在內(nèi)水相添加入明膠后，明膠會(huì)優(yōu)先于Endostar分散于油水界面上，減少Endostar與有機(jī)相接觸的面積，保護(hù)了Endostar的三級(jí)結(jié)構(gòu)不被破壞。第八，該方法得到的微球能緩慢的釋放藥物，穩(wěn)定的血藥濃度更有利于Endostar持續(xù)發(fā)揮其抗癌藥效。本發(fā)明使用油包油包水乳化溶劑揮發(fā)法，當(dāng)藥物被聚合物包裹后，能穩(wěn)定的存在于初乳中，不會(huì)向外滲漏，從而獲得高載藥量，高包封率的微球。圖IPLGA(Mw=20000，75:25)Endostar微球的體外釋放曲線。圖2PLGA(Mw=20000，50:50)Endostar微球的體外釋放曲線。圖3顯示的是常規(guī)釋放液中Endostar的非還原性SDS-PAGE鑒定。圖中18分別對(duì)應(yīng)1、分子量分別為14400，20100，31000，43000，66200,97400的標(biāo)準(zhǔn)蛋白(marker);2、Endostar原液；3、釋放4h;4、釋放第Id;5、釋放第5d;6、釋放第10d;7、釋7放第20d;8、釋放第30d。圖4Endostar制成微球前后抗內(nèi)皮細(xì)胞增殖活性。圖5Endostar微球體內(nèi)釋放行為曲線。具體實(shí)施方式'以下通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但不是對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。實(shí)施例1:精密稱取400mgEndostar溶于lmlPH7.4的PBS緩沖液中(內(nèi)含3%明膠)，形成內(nèi)水相。將PLGA(Mw=20000,75:25)400mg溶于8ml二氯甲烷和乙腈(l:l)的混合溶劑中，成為內(nèi)油相。將上述內(nèi)水相加至內(nèi)油相中，4000rpm高速分散乳化，形成W/0初乳，然后將此初乳傾倒至含有0.3%卵磷脂與0.1%蔗糖酯的大豆油中，機(jī)械攪拌揮發(fā)溶劑(500rptn)4小時(shí)，使用0.8pm的有機(jī)微孔濾膜過濾得到微球，并用石油醚洗滌三次，最后冷凍干燥得到微球成品。將微球成品用二氯甲烷溶解，以PH=7.4的PBS溶液萃取藥物，將萃取后的溶液用HPLC的方法測(cè)定其中的蛋白濃度，得到微球的包封率。包封率為91.5%，平均粒徑30pm。稱取100mg微球，置于至截留分子量為30000,直徑為l厘米的透析袋中。再將透析袋置于含有10ml磷酸緩沖液(0.1MpH7.0)的燒杯中，并用磁力攪拌器不斷攪拌。每R取燒杯中緩沖液lml，同時(shí)補(bǔ)充同體積新鮮的磷酸緩沖液。樣品中Endostar的含量用HPLC法測(cè)定。用藥物的累計(jì)釋放百分率與釋藥時(shí)間作圖。第1天釋放20.0%，第IO天釋放53.19%，第20天釋放92.81%。(圖l)實(shí)施例2:精密稱取2000mgEndostar與200mg硫酸軟骨素溶于IOmlTris(10MmPH7.4)，調(diào)整該溶液的pH值至6.58.3，測(cè)量其zeta電位位于0—48mv時(shí)，形成硫酸軟骨素-Endostar復(fù)合物。取0.5ml復(fù)合物溶液作為內(nèi)水相。將PLGA(Mw=20000，50:50)400mg溶于8ml二氯甲烷和乙腈和乙酸乙酯(0.5:l:0.5)的混合溶劑中，成為內(nèi)油相。將上述內(nèi)水相加至內(nèi)油相中，4000rpm高速分散乳化，形成W/0初乳，然后將此初乳傾倒至含有0.8%司盤-80和0.35%蔗糖酯的液體石蠟中，機(jī)械攪拌揮發(fā)溶劑(500rpm)4小時(shí)，使用0.8,的有機(jī)微孔濾膜過濾得到微球，并用石油醚洗滌三次，最后冷凍干燥得到微球成品。將微球成品用二氯甲垸溶解，以PH-7.4的PBS溶液萃取藥物，將萃取后的溶液用HPLC的方法測(cè)定其中的蛋白濃度，得到微球的包封率。包封率為96.3%，平均粒徑24pm。稱取100mg微球，置于至截留分子量為30000，直徑為1厘米的透析袋中。再將透析袋置于含有10ml磷酸緩沖液(0.1MpH7.0)的燒杯中，并用磁力攪拌器不斷攪拌。每日取燒杯中緩沖液lml，同時(shí)補(bǔ)充同體積新鮮的磷酸緩沖液。樣品中Endostar的含量用HPLC法測(cè)定。用藥物的累計(jì)釋放百分率與釋藥時(shí)間作圖。第1天釋放10.0%，第IO天釋放64.2%，第20天釋放92.55°/。。(圖2)實(shí)施例3:.'精密稱取400mgEndostar溶于lmlPH=5.5的醋酸鈉溶液中(內(nèi)含5%牛血清白蛋白)，形成內(nèi)水相。分別將PLGA(A:Mw=12000，50:50)、(B:Mw=20000，50:50)、(C:Mw=40000，50:50)、(D:Mw=80000,100:0)、(E:Mw=20000,75:25)、(F:Mw=130000，75:25)400mg溶于8ml二氯甲烷和乙腈和乙酸乙酯(0.5:1:0.5)的混合溶劑中，成為內(nèi)油相。將上述內(nèi)水相分別加至上述內(nèi)油相中，4000rpm高速分散乳化，形成W/0初乳，然后將此初乳傾倒至含有0.5%卵磷脂和0.2%蔗糖酯的大豆油中，機(jī)械攪拌揮發(fā)溶劑(500rpm)4小時(shí)，使用0.8pm的有機(jī)微孔濾膜過濾得到微球，并用石油醚洗滌三次，最后冷凍干燥得到微球成品。將微球成品用二氯甲烷溶解，以PH二7.4的PBS溶液萃取藥物，將萃取后的溶液用HPLC的方法測(cè)定其中的蛋白濃度，得到微球的包封率。具體包封率見表l。表1不同分子量與單體比例的PLGA所得微球的包封率<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實(shí)施例4:精密稱取400mgEndostar溶于lmlPH=5.5的醋酸鈉溶液中(內(nèi)含5%甘露醇)，形成內(nèi)水相。將PLGA(Mw=30000，50:50)400mg溶于8ml二氯甲烷和乙腈和乙酸乙酯(0.5:1:0.5)的混合溶劑中，成為內(nèi)油相。將上述內(nèi)水相加至內(nèi)油相中，4000rpm高速分散乳化，形成W/0初乳，然后將此初乳傾倒至含有0.8%司盤-80和0.15%蔗糖酯的液體石蠟中，機(jī)械攪拌揮發(fā)溶劑(500rpm)4小時(shí)，使用0.8網(wǎng)的有機(jī)微孔濾膜過濾得到微球，并用石油醚洗滌三次，最后冷凍干燥得到微球成品。將微球成品用二氯甲烷溶解，以PH=7.4的PBS溶液萃取藥物，將萃取后的溶液用HPLC的方法測(cè)定其中的蛋白濃度，得到微球的包封率。包封率為93.2%，平均粒徑22^m。將上述制備的微球精密稱取100mg置于5mlPH7.4的磷酸鹽緩沖液中，25'C振搖，于4h、ld、5d、10d、20d、30d離心取200pl上清液，并向其中補(bǔ)充200|il新鮮磷酸鹽緩沖液。取上清液進(jìn)行非還原性SDS—PAGE鑒定，考察藥物從微球中釋放后的活性保留情況。(圖3)實(shí)施例5:取實(shí)施例2制備的微球進(jìn)行Endostar微球的生物活性測(cè)定1、HUVEC細(xì)胞用添加FBS、ECGS、P/OSolution的ECM培養(yǎng)基于37°C，5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞狀態(tài)良好并進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后進(jìn)行接種。2、細(xì)胞用0.25%胰酶消化，1000rpm離心5min，棄上清，用培養(yǎng)基重新混懸，顯微鏡下用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)活細(xì)胞。調(diào)細(xì)胞密度為5000個(gè)/ml，每孔加入160^1細(xì)胞懸液，置37'C5。/。C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3、將Endostar原液和Endostar微球第30d釋放液用pH7.4的磷酸鹽緩沖液預(yù)稀釋至2.5mg/ml，按孔中終濃度為500、250、125、62.5、31.25、15.625嗎/ml，每孔加入40pl藥物體積，每個(gè)梯度設(shè)3個(gè)平行，37°C5。/。C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96h。4、加入5mg/mlMTT工作液，每孔20pl，置37°C5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h，棄去細(xì)胞上清，每孔加入DMSO200nl。放置10min，使用酶標(biāo)儀490nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值。5、根據(jù)OD值求出細(xì)胞抑制率，計(jì)算公式為抑制率(IR)-(對(duì)照組OD值均數(shù)-實(shí)驗(yàn)組OD值均數(shù))/(對(duì)照組OD值均數(shù)-空白OD值均數(shù))。(圖4)實(shí)施例6:精密稱取800mgEndostar溶于lmlPH=5.5的醋酸鈉溶液中(內(nèi)含5%甘露醇)，形成內(nèi)水相。將PLGA(Mw=70000，75:25)400mg分別溶于4ml混合溶劑(混合溶劑和比例見表2)中，成為內(nèi)油相。將上述內(nèi)水相加至內(nèi)油相中，4000rpm高速分散乳化，形成W/0初乳，然后將此初乳傾倒至含有0.8%司盤-80和0.35%蔗糖酯的液體石蠟中，機(jī)械攪拌揮發(fā)溶劑(500rpm)4小時(shí)，使用0.8pim的有機(jī)微孔濾膜過濾得到微球，并用石油醚洗滌三次，最后冷凍干燥得到微球成品。將微球成品用二氯甲烷溶解，以PP^7.4的PBS溶液萃取藥物，將萃取后的溶液用HPLC的方法測(cè)定其中的蛋白濃度，得到微球的包封率。包封率均達(dá)到90%以上。具體包封率見表2。表2不同混合溶劑系統(tǒng)對(duì)包封率的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>實(shí)施例7:精密稱取200mgEndostar溶于lmlPH7.4的PBS緩沖液中(內(nèi)含3%明膠)，形成內(nèi)水相。將PLGA(Mw=6000，50:50)400mg溶于8ml二氯甲垸和丙酮和乙酸乙酯(0.3:1,2:0.5)的混合溶劑中，成為內(nèi)油相。將上述內(nèi)水相加至內(nèi)油相中，4000rpm高速分散乳化，形成W/O初乳，然后將此初乳傾倒至含有0.8%司盤-80和0.35%蔗糖酯的液體石蠟中，機(jī)械攪拌揮發(fā)溶劑(500卬m)4小時(shí)，使用0.8pm的有機(jī)微孔濾膜過濾得到微球，并用石油醚洗滌三次，最后冷凍干燥得到微球成品。將微球成品用二氯甲垸溶解，以PH=7.4的PBS溶液萃取藥物，將萃取后的溶液用HPLC的方法測(cè)定其中的蛋白濃度，得到微球的包封率。包封率為94.3%，平均粒徑27pm。將上述微球用適宜的混懸介質(zhì)混懸均勻后，設(shè)定劑量給予大鼠皮下注射，取其血清，用ELISA測(cè)試劑盒檢測(cè)一個(gè)月內(nèi)Endostar微球的體內(nèi)釋放行為。(圖5)序列表〈110〉江蘇先聲藥物研究有限公司〈120〉一種重組人血管內(nèi)皮抑制素緩釋微球的制備方法〈160〉2<210〉1〈211〉192〈212〉PRT〈213〉人工序列<220〉<223>大腸桿菌表達(dá)的重組人內(nèi)皮抑制素<400>1MetGly1GinProGlyMetAlaArgSerArgAlsiAlaSerTrpGlyAlaProThrGlyArgAlaProLeuLeuLeuCysGlyValArgAlaLeuValGluArgTrpArgSerGlylieSerHis5LeuHis20Glylie35ValGly50GinAsp65Prolie80AlaLeu95liePhe110ProGin125LeuThr140AlaThr155GinSer170GluAsn185HisLeuArgLeuLeuValPheSerLysGluGlyAlaSerHisValGlyAlaTyrAsnSerPheSerSerGinAlaPheHisAlaAlaGlySerLeuGlyAspValTyrAlaSerMetHisLeuAspThrlieLysSerGlyTrpCysSerCysThrHis10Asn25Phe40Phe55Val70Asp85Glu100Lys115His130Glu145Ser160His175Ala190SerSerGinArgArgGluGlyAspGlyThrLeuHisSerHisArgProLeuCysPheAlaPheArgAlaLeuLeuProLeuValLeuSerAspTrpArgLeuGlyAlaTyrLysAspPhe15SerGly30GinGin45leuSer60AspArg75PhePro90LysPro105ArgHis120ProAsn135ThrGlu150GlyArg165lieVal180〈210〉2<211〉191〈212〉PRT<213>人工序列〈220〉〈223〉大腸桿菌表達(dá)的重組人內(nèi)皮抑制素〈400〉2GlyGlySerHisHisHisHisHisHis15ProValLeuHisLeuValAlaLeuAsn20MetArgGlylieArgGlyAlaAspPhe35ArgAlaValGlyLeuAlaGlyThrPhe50ArgLeuGinAspLeuTyrSerlieVal65AlaValProlieValAsnLeuLysAsp80TrpGluAlaLeuPheSerGlySerGlu95AlaArgliePheSerPheAspGlyLys110ThrTrpProGinLysSerValTrpHis125ArgArgL>euThrGluSerTyrCysGlu140ProSerAlaThrGlyGinAlaSerSer155LeuGlyGinSerAlaAlaSerCysHis170CyslieGluAsnSerPheMetThrAla185SerHisArgAspPheGin1015SerProLeuSerGlyGly2530GinCysPheGinGinAla4045ArgAlaPheLeuSerSer5560ArgArgAlaAspArgAla7075GluLeuLeuPheProSer8590GlyProLeuLysProGly100105AspValLeuArgHisPro115120GlySerAspProAsnGly130135ThrTrpArgThrGluAla145150LeuLeuGlyGlyArgLeu160165HisAlaTyrlieValUu175180SerLys190權(quán)利要求1、一種重組人血管內(nèi)皮抑制素緩釋微球的制備方法，其特征在于該方法包括下列步驟(1)將重組人血管內(nèi)皮抑制素溶解于含有蛋白穩(wěn)定劑的緩沖液中，得到內(nèi)水相；(2)再將乳酸-羥基乙酸共聚物溶解于混合有機(jī)溶劑中得到內(nèi)油相；(3)以每分鐘1000-30000轉(zhuǎn)高速分散內(nèi)水相及內(nèi)油相的混合溶液，內(nèi)水相內(nèi)油相的體積比為1∶2～1∶20，得到初乳；(4)將所得初乳置于盛有含乳化劑的植物油或礦物油的攪拌容器中，在0～60℃和每分鐘100～2000轉(zhuǎn)的速度攪拌形成油包油包水型復(fù)乳；(5)持續(xù)攪拌揮發(fā)內(nèi)油相中的混合有機(jī)溶劑，待微球固化后用微孔濾膜過濾分離，用溶劑洗滌微球表面殘留的植物油或礦物油，真空干燥后得到微球成品。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述重組人血管內(nèi)皮抑制素為重組人血管內(nèi)皮抑制素Endostar,其在緩沖液中的濃度為l~500mg/ml。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑包括明膠、硫酸軟骨素、山梨醇、木糖醇、甘露醇、海藻糖、碳酸鋅、白蛋白、泊洛沙姆中的一種或多種，優(yōu)選硫酸軟骨素；穩(wěn)定劑在內(nèi)水相中的濃度按重量體積百分比計(jì)為0.1%~20%。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的緩沖液為pH=3~7的醋酸鈉溶液或pH:511的磷酸鹽溶液，優(yōu)選pH-5.5的醋酸鈉溶液或pI^7.4的磷酸鹽溶液。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述共聚物為乳酸-羥基乙酸共聚物，乳酸-羥基乙酸分子量大小為5000~150000，其單體組成比例乳酸羥基乙酸為99:150:50，其在混合有機(jī)溶劑中的濃度為10~500mg/tnl。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(2)中所述混合有機(jī)溶劑為二氯甲垸和乙腈，或二氯甲烷和醋酸，或二氯甲烷和丙酮，或乙酸乙酯和丙酮，或乙酸乙酯和乙腈，二者比例為1:99:1;或者所述混合有機(jī)溶劑為二氯甲烷和乙腈和乙酸乙酯，或二氯甲烷和丙酮和乙酸乙酯，或乙酸乙酯和乙腈和丙酮，三者比例為3:0.01:0.01~0.01:3:0.01~0.01:0.01:3。7、根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(4)所述植物油為大豆油、玉米油、棉籽油、花生油、茶油的一種或多種；所述礦物油為液體石蠟或二甲基硅油。8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于步驟(4)所述植物油的乳化劑為卵磷脂、蔗糖酯的一種或多種，加入量按重量體積百分比計(jì)為植物油的0.1~10%，所述礦物油的乳化劑為司盤-80、司盤-60、蔗糖酯的一種或多種，加入量按重量體積百分比計(jì)為礦物油的0.1~10%。9、根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(5)所述的微孔濾膜過濾為過濾微球的技術(shù)手段，采用的膜為有機(jī)膜，孔徑范圍0.2pm2^im。10、根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(5)所述洗滌微球的溶劑為正己垸、環(huán)己烷、正庚烷、石油醚的-一種或多種。全文摘要本發(fā)明公開了一種重組人血管內(nèi)皮抑制素緩釋微球的制備方法。該方法先將重組人血管內(nèi)皮抑制素溶解于含有蛋白穩(wěn)定劑的緩沖液中，得內(nèi)水相；再將乳酸-羥基乙酸共聚物溶解于混合有機(jī)溶劑中得內(nèi)油相；高速分散內(nèi)水相及內(nèi)油相的混合溶液，得初乳；將所得初乳置于盛有含乳化劑的植物油或礦物油的攪拌容器中，攪拌形成油包油包水型復(fù)乳；持續(xù)攪拌揮發(fā)內(nèi)油相中的混合有機(jī)溶劑，待微球固化后用微孔濾膜過濾分離，用溶劑洗滌微球表面殘留的植物油或礦物油，真空干燥后得到微球成品。采用該方法制備的微球高載藥量、高包封率，突釋量合適且緩釋周期較長(zhǎng)。文檔編號(hào)A61K9/19GK101396347SQ200710132290公開日2009年4月1日申請(qǐng)日期2007年9月27日優(yōu)先權(quán)日2007年9月27日發(fā)明者劉春暉,蘇華,李海瑞,林巧平,殷曉進(jìn),征江,許向陽(yáng),陳英杰申請(qǐng)人:江蘇先聲藥物研究有限公司