專利名稱：：一種竹紅菌素脂質體制劑及其制備方法
技術領域：
：本發明涉及一種竹紅菌素脂質體制劑及其制備方法。
背景技術：
：微血管類疾病，包括鮮紅斑痣、視網膜黃斑變性等，臨床醫學分類屬于常見病范疇，發病率均在3—5%。，前者90%以上發病于面部，給患者帶來極大的精神痛苦；后者被認為是老年人致盲的首要原因，據統計，僅在美國此類病人就高達百萬以上。目前證明，光動力療法是治療微血管類疾病的唯一特效或首選療法，然而，微血管類疾病光動力藥物目前是此類疾病臨床應用的瓶頸問題。多年來，光動力療法主要以抗腫瘤為目標，因此，光動力藥物也主要以抗腫瘤功能為主要評價，例如為了實體腫瘤的治療效率，規定腫瘤的"光療窗口"在600—900nm，此波長范圍光的組織穿透深(3—10毫米)，利于實體腫瘤的療效。然而，微血管類疾病的病灶深度小于1毫米，此時用穿透深度更深的長波長光反而有可能造成正常組織的傷害！此外，臨床治療技術上，在腫瘤光動力治療中，給藥后到照光的時間間隔較長，通常數小時到數十小時，以使藥物在病灶上富集；而微血管類疾病的耙體是畸生微血管壁細胞，給藥后即時光照治療。因此可見，微血管類疾病藥物制劑要求藥物快速釋放，要求藥物代謝速度快。因此，針對疾病特點研發個性化光動力藥物是光動力醫療的新戰略。目前，世界上唯一批準上市的用于視網膜黃斑變性的光動力藥物苯卟啉衍生物單元酸(BPD—MA)，通用名維替泊芬(Vert印orfin)，其最大光吸收波長為690nm，其主吸收光的組織有效穿透深度3—5毫米(見以下討論)，目前市場價格為16000元人民幣/10毫克，此外，卟啉類藥物的一般特點是在體內代謝慢，且代謝產物原卟啉仍然有光敏活性，會使光敏副作用持續數天乃至數月。其它一些正在開發的光動力藥物的光動力活性低限制了其應用范圍。竹紅菌素是從特產于我國云南箭竹上的一種寄生真菌一竹紅菌(Hypocrdlabambusae(B.etBr.)Sacc.)中提取的一類天然光敏色素，包括竹紅菌甲素(HA)和竹紅菌乙素(HB)。竹紅菌素的主吸收光(470nm)的組織有效穿透深度不足1毫米，恰好與微血管類疾病的病灶深度相符，此外，其光敏活性高、暗毒性低、體內代謝快(24一48小時)，在光動力療法治療微血管病中具有特殊優勢。竹紅菌素母體分子是脂溶性有機分子，直接靜脈注射會引起自聚集而造成毛細血管栓塞；而完全水溶性的竹紅菌素衍生物在體內幾乎完全喪失其生物光動力活性(由于低的細胞攝取率)。近年來，本實驗室以改善水溶性和生物相容性為目標，研制了一系列竹紅菌素一生物材料的納米制劑，包括脂質體制劑、竹紅菌素一蛋白、竹紅菌素一多糖納米制劑(專利號03148147)、竹紅菌素一脂肪乳納米制劑(專利號200610001677.2)。生物學實驗證明這些制劑都具有良好的水溶性和光動力活性，且生物相容性好，不引入新的毒性。客觀地說，針對微血管類疾病的光動力治療，竹紅菌素水溶性納米粒是由蛋白交聯制備，使納米粒子釋放藥物速度慢，而光敏劑治療微血管病需要光敏劑的快速釋放以達到與微血管病灶快速結合以發揮藥效；竹紅菌素微乳尺度分布均勻(40—60nm)、生物光動力活性高，目前最大問題則是保存時間不超過6個月，不能滿足保存性要求。前期制備的竹紅菌素脂質體及其固體粉末(靳玄燁等，一種竹紅菌素脂質體固體粉末制劑及其制造方法，專利號ZL03110618.8)具有很高的耙向性和快速藥物釋放性，凍干后的脂質體粉劑具有較高的穩定性、足夠長的保存期，復溶后具有良好的生物光動力活性，是目前靜脈注射竹紅菌素的最理想藥物劑型。但在配方中無例外地加入吐溫系列表面活性劑(4.30-6.50%)，目前，國家食品藥品管理局對吐溫類輔料做了更嚴格的明確限制，其注射濃度目前限制在100pg/ml以下，原固體粉末復溶后吐溫的濃度為10mg/ml，超限100倍；最大載藥濃度為0.5mg/ml，載藥量偏低；所用的制備方法為超聲法，由于脂質體尺度均一性和脂質體形貌由超聲場強決定，批次之間成品質量不易控制；在專利公布的冷凍干燥流程中使用逐步預凍的方法，產生大冰晶可能破壞雙分子層磷脂膜，影響脂質體固體粉末單分散性和復溶后形貌的穩定性。
發明內容本發明的目的是提供一種不含吐溫系列表面活性劑、藥物容量大、單分散性好、復溶后形貌更穩定的竹紅菌素脂質體制劑及其制備方法。本發明所提供的竹紅菌素脂質體制劑，含有如下重量份的組分竹紅菌素1~5份，磷脂40~200份，膽固醇2.4~12份，凍干保護劑50~100份。其中，磷脂可選自卵磷脂、氫化卵磷脂、氫化大豆磷脂中的一種或幾種。凍干保護劑選自甘油、二甲基亞砜、蔗糖、甘露糖、海藻糖、葡萄糖、聚乙烯吡咯垸酮和纖維素中的一種或幾種。該竹紅菌素脂質體制劑的制備方法，包括如下步驟1)將竹紅菌素、磷脂、膽固醇和水乳化制備成粒徑為1000nm以下的多層脂質體；2)在高壓均質機中，先在5—25MPa下將所得多層脂質體初均，然后，加壓至均質壓力下循環均質若干次獲得脂質體；3)加入凍干保護劑、超濾滅菌、分裝后急速預凍，然后，再冷凍干燥得到凍干的竹紅菌素脂質體制劑。其中，上述制備過程中，制備原料配比如下竹紅菌素15份，磷脂40~200份，膽固醇2.412份，水9774885份，凍干保護劑50~100份。步驟2)均質的溫度為0'C~15°C。步驟2)所述均質壓力等于或大于50MPa，均質循環次數為220次。步驟2)所述脂質體的粒徑為40—200nm。步驟3)所述預凍的溫度為-60~-80°C。為了能更好的保存本發明制劑，對凍干脂質體粉劑以惰性氣體密封保存。高壓均質法，是通過高壓均質機柱塞的往復運動，使柱塞壓縮的物料內形成強大的高壓能，通過調節限流閥座微小間隙，使物料瞬間在湍流、剪切、碰撞、空穴等復合力的作用下達到均質目的。本發明利用高壓均質法制備的竹紅菌素脂質體制劑，其特點是不含吐溫系列表面活性劑，更符合現代醫藥的要求；而且，制劑的藥物含量可由0.6%提高到1.2%以上，復溶藥物濃度達lmg/ml，提高了100%。本發明用高壓均質法制備替代超聲法制備，使質量可控、產量極大提高，能夠滿足竹紅菌素一脂質體藥物的工業生產和臨床應用雙重要求；用急速預凍的方法代替逐步預凍，獲得單分散性好、復溶后形貌更穩定的紅菌素脂質體固體粉末制劑。圖1為實施例1乳化后竹紅菌甲素多層脂質體的粒徑分布圖2為實施例1(180MPa)和實施例4(lOOMPa)循環次數對脂質體最大粒徑的影響；圖3為實施例1中180MPa循環5次竹紅菌甲素凍干前脂質體和復溶后脂質體的粒徑分布圖4為實施例4中lOOMPa循環6次竹紅菌乙素凍干前脂質體和復溶后脂質體的粒徑分布圖5為實施例1中180MPa循環5次竹紅菌甲素凍干前脂質體稀釋至0.05mg/ml的透射電鏡圖。圖6為光照實施例1和4與竹紅菌乙素的9,10-DPA隨時間變化的漂白圖。具體實施例方式本發明主要是利用高壓均質方法制備竹紅菌素脂質體制劑1)首先，將竹紅菌素、優質高純磷脂、膽固醇、水按一定比例乳化制備成粒徑為1000nm以下的多層脂質體。2)然后，將所得多層脂質體在高壓均質機均質。為防止多層脂質體進入高壓均質機時可能堵塞，在均質制備單室脂質體前必須進行初勻，且初勻壓力范圍選擇在525MPa。均質壓力等于或大于50MPa，實際上，壓力越大，達到脂質體一定尺度分布要求的循環次數越少(見圖2)。溫度過高可能引起藥物從脂質體泄漏，故溫度范圍控制在O"C15°C。在相同均質壓力下，循環次數越多，得到的脂質體的平均粒徑越小、分布越窄，循環次數應控制在220次之間(如圖3、4、5所示)。為滿足靜脈注射針劑超濾除菌(濾膜孔徑220nm)要求，所述脂質體粒徑分布應在40~200nm以內。3)最后，加入凍干保護劑至充分溶解后經超濾滅菌、分裝，在-60-8(TC下急速預凍、真空冷凍干燥，得到的凍干脂質體粉劑充惰性氣體密封保存。實驗證明，逐步預凍產生大冰晶可能破壞雙分子層磷脂膜，影響脂質體固體粉末單分散性和復溶后形貌的穩定性。故冷凍干燥前用急速預凍代替逐步預凍，可以使脂質體在瞬間冷凍以保持脂質體穩定。以下以具體的實施例來說明本發明。實施例1將100mg竹紅菌甲素、4g卵磷脂、240mg膽固醇和97.7mL水通過乳化制成粒徑為1000nm以下的多層脂質體。將其倒入高壓均質機10MPa初均，后加壓至180MPa進行高壓均質，保持體系溫度15^，循環5次，得到粒徑分布為46140nm的單室脂質體。加入4g蔗糖振搖溶解，過孔徑為220nm濾膜超濾滅菌分裝放入-8(TC冰箱中急速預凍，冷凍干燥后得到的凍干脂質體粉劑充惰性氣體密封保存，制劑的藥物含量為1.20%。其中，多層脂質體的粒徑分布圖如圖l所示；凍干前脂質體和復溶后脂質體的粒徑分布圖如圖3所示；凍干前脂質體稀釋至0.05mg/ml的透射電鏡圖如圖5所示。圖2為實施例1(180MPa)和實施例4(lOOMPa)循環次數對脂質體最大粒徑的影響，結果表明，在相同均質壓力下，循環次數越多，得到的脂質體的平均粒徑越小、分布越窄。實施例2將200mg竹紅菌甲素、6g氫化大豆磷脂、480mg膽固醇和195.4mL水通過乳化制成粒徑為1000nm以下的多層脂質體。將其倒入高壓均質機15MPa初均，后加壓至200MPa進行高壓均質，保持體系溫度10QC，循環2次，得到粒徑分布為40129nm的單室脂質體。加入8g甘露糖振搖溶解，過孔徑為220nm濾膜超濾滅菌分裝放入-6(TC冰箱中急速預凍，冷凍干燥后得到的凍干脂質體粉劑充惰性氣體密封保存，制劑的藥物含量為1.36%。實施例3將500mg竹紅菌甲素、20g氫化卵磷脂、1.2g膽固醇和488.5mL水通過乳化制成粒徑為1000nm以下的多層脂質體。將其倒入高壓均質機20MPa初均，后加壓至130MPa進行高壓均質，保持體系溫度5^，循環7次，得到粒徑分布為49~162nm的單室脂質體。加入10g蔗糖振搖溶解，過孔徑為220nm濾膜超濾滅菌分裝放入-70"C冰箱中急速預凍，冷凍干燥后得到的凍干脂質體粉劑充惰性氣體密封保存，制劑的藥物含量為1.58%。實施例4將100mg竹紅菌乙素、5g卵磷脂、0.3g膽固醇和97.7mL水通過乳化制成粒徑為1000nm以下的多層脂質體。將其倒入高壓均質機25MPa初均，后加壓至100MPa進行高壓均質，保持體系溫度1()GC，循環6次，得到粒徑分布為45185nm的單室脂質體。加入3g海藻糖振搖溶解，過孔徑為220nm濾膜超濾滅菌分裝放入-8(TC冰箱中急速預凍，冷凍干燥后得到的凍干脂質體粉劑充惰性氣體密封保存，制劑的藥物含量為1.19%。其中，凍干前脂質體和復溶后脂質體的粒徑分布圖如圖4所示。實施例5將200mg竹紅菌乙素、7g氫化大豆磷脂、0.5g膽固醇和195.4mL水通過乳化制成粒徑為1000nm以下的多層脂質體。將其倒入高壓均質機5MPa初均，后加壓至70MPa進行高壓均質，保持體系溫度(A:，循環15次，得到粒徑分布為53192nm的單室脂質體。加入8g海藻糖振搖溶解，過孔徑為220nm濾膜超濾滅菌分裝放入-65。C冰箱中急速預凍，冷凍干燥后得到的凍干脂質體粉劑充惰性氣體密封保存，制劑的藥物含量為1.27%。實施例6將200mg竹紅菌乙素、9g氫化卵磷脂、0.6g膽固醇和195.4mL水通過乳化制成粒徑為1000nm以下的多層脂質體。將其倒入高壓均質機10MPa初均，后加壓至50MPa進行高壓均質，保持體系溫度不高于5°C，循環20次，得到粒徑分布為61198nm的單室脂質體。加入6.5g甘露糖振搖溶解，過孔徑為220nm濾膜超濾滅菌分裝放入-75X:冰箱中急速預凍，冷凍干燥后得到的凍干脂質體粉劑充惰性氣體密封保存，制劑的藥物含量為1.23%。實施例7、產品的性能測試一、脂質體粒徑測量將實施例l，4的樣品用蒸餾水稀釋使竹紅菌甲素濃度為10—5M，取3毫升置于動態光散射儀(BI-90Plus,BrookhavenInstrumentsCorporation制造)中，結果如圖2，3所示180MPa下，5循環后單室脂質體粒徑分布為46~140nm，復溶脂質體粒徑分布為84244nm;100MPa下，6循環后單室脂質體粒徑分布為45~185nm，復溶脂質體粒徑分布為68~268nm;均符合靜脈注射針劑要求。同時測定不同循環次數對實施例1，4脂質體最大粒徑的影響，如圖4所示在100MPa下達到200nm以下的循環次數為4次；在180MPa下達到200nm以下的循環次數僅為3次。二、脂質體透射電鏡測試透射電鏡為JEM-100CX(JEOL,Tokyo,Japan),測試電壓為80kV。將實施例1的一滴稀釋至0.05mg/ml樣品滴到噴碳銅網上，用醋酸雙氧鈾負染涼干后用透射電鏡觀察凍干前脂質體形貌和粒徑。由圖5可見，脂質體形貌圓整，分布均一，粒徑分布在40140nm，有較好的形態。三、單線態氧量子產率測試單線態氧量子產率用9,10-DPA漂白方法測定光源是450W鈉燈，用470nm的濾光片截住470nm以下波長的光，照射強度為7.2mW/cm2，以充氧的竹紅菌乙素的苯溶液為參照，通過DPA漂白法測量了相同光劑量下實施例1和實施例4所得脂質體粉末在苯中產生單線態氧的能力(圖6，圖中，HB代表竹紅菌乙素，HADRVs代表實施例1所得竹紅菌甲素脂質體制劑，HBDRVs代表實施例4竹紅菌乙素脂質體制劑)。從圖中可以計算得出，相同光劑量下實施例1竹紅菌甲素脂質體粉末復溶后產生的單線態氧的量是竹紅菌乙素的0.92倍，而實施例4竹紅菌乙素脂質體粉末復溶后產生的單線態氧的量是竹紅菌乙素的0.5倍，均保持了良好的光動力活性。四、細胞試驗測試體外培養的人肺癌A549細胞，按5.0X104個/ml的細胞密度接種于96孔細胞培養板，孵育24小時后，加入光敏劑，選取的光敏劑孵育濃度為500ng/ml，繼續孵育內皮細胞4小時后，采用KTP激光(波長為532nm)照射，激光照射的功率密度為9.5mW/cm2;照射時間為1000秒；能量密度為20J/cm2。其后采用MTT的方法，測定各孔的光密度值。受試的幾種樣品對細胞的殺傷率如下表1所示。表1人肺癌細胞OD值與竹紅菌素對其殺傷率的數據表<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>細胞殺傷率如下式得到:細胞殺傷率(％)=1-細胞存活率二1-(實驗組OD-本底組0D)/(空白組0D-本底組OD)X100%這里，HB代表竹紅菌乙素，HADRV代表實施例l所得竹紅菌甲素脂質體制劑，HBDRV代表實施例4竹紅菌乙素脂質體制劑，以只加培養液無細胞組為本底組，以既不給藥也不照光組為空白組。計算可得，竹紅菌乙素的細胞殺傷率為49.1%;而凍干復溶的竹紅菌甲素脂質體制劑(實施例l)的細胞殺傷率為74.8%，為竹紅菌乙素的細胞殺傷率的1.52倍；凍干復溶的竹紅菌乙素脂質體制劑(實施例4)的細胞殺傷率為52.7%，在細胞實驗允許誤差范圍內與竹紅菌乙素的細胞殺傷率一致，證明冷凍干燥后的制劑保持了原制劑的物理化學特性和竹紅菌乙素的光動力活性。權利要求1.一種竹紅菌素脂質體制劑，含有如下重量份的組分竹紅菌素1～5份，磷脂40～200份，膽固醇2.4～12份，凍干保護劑50～100份。2、根據權利要求l所述的竹紅菌素脂質體制劑，其特征在于所述磷脂選自卵磷脂、氫化卵磷脂、氫化大豆磷脂中的一種或幾種。3、根據權利要求1或2所述的竹紅菌素脂質體粉末，其特征在于所述凍干保護劑選自甘油、二甲基亞砜、蔗糖、甘露糖、海藻糖、葡萄糖、聚乙烯吡咯垸酮和纖維素中的一種或幾種。4、權利要求1所述竹紅菌素脂質體制劑的制備方法，包括如下步驟1)將竹紅菌素、磷脂、膽固醇和水乳化制備成粒徑為1000nm以下的多層脂質體；2)在高壓均質機中，先在5—25MPa下將所得多層脂質體初均，然后，加壓至均質壓力下循環均質若干次獲得脂質體；3)加入凍干保護劑、超濾滅菌、分裝后急速預凍，然后，再冷凍干燥得到凍干的竹紅菌素脂質體制劑。5、根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于制備原料配比如下竹紅菌素15份，磷脂40200份，膽固醇2.412份，水9774885份，凍干保護劑50~100份。6、根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于步驟2)均質的溫度為ot:~15°C。7、根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于步驟2)所述均質壓力等于或大于50MPa，均質循環次數為220次。8、根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于步驟2)所述脂質體的粒徑為40—200nm。9、根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于步驟3)所述預凍的溫度為-60-80。C。全文摘要本發明公開了一種竹紅菌素脂質體制劑及其制備方法。本發明所提供的竹紅菌素脂質體制劑，含有如下重量份的組分竹紅菌素1～5份，磷脂40～200份，膽固醇2.4～12份，凍干保護劑50～100份。本發明利用高壓均質法制備的竹紅菌素脂質體制劑，其特點是不含吐溫系列表面活性劑；而且，制劑的藥物含量可由0.6％提高到1.2％以上，復溶藥物濃度達1mg/ml，提高了100％。本發明用高壓均質法制備替代超聲法制備，使質量可控、產量極大提高，能夠滿足竹紅菌素-脂質體藥物的工業生產和臨床應用雙重要求；用急速預凍的方法代替逐步預凍，獲得單分散性好、復溶后形貌更穩定的紅菌素脂質體固體粉末制劑。文檔編號A61K9/127GK101371828SQ20071012072公開日2009年2月25日申請日期2007年8月24日優先權日2007年8月24日發明者楊張,杰謝,趙井泉申請人:中國科學院化學研究所