專利名稱：：一種新的殺菌肽及其產生菌株和用途的制作方法
技術領域：
：本發明涉及生物資源利用領域。尤其是，本發明涉及一種新的殺菌肽及其產生菌株和用途。
背景技術：
：眾所共知，自1928年Flamin發明青霉素并于40年代實際應用于人類以來，各種產自微生物代謝產物的抗生素層出不窮，挽救了無數的生命，為人類健康作出了不可磨滅的貢獻。然而，隨著時間的推移，人們發現許多抗生素都存在一個致命的弱點，慢慢會產生耐藥性，有的還會在體內積累，或通過生物循環、食物鏈的作用而間接進入人體內，有些抗生素還會影響人的新陳代謝或生物合成，如氯霉素，因此已被停止應用。所以，人們迫切尋找抗生素的代用品或作為補充。抗菌肽是80年代以來被看好的物質之一。抗菌肽分子量小，一般為10000Da以下，因此，不產生抗原性；對細菌的作用機理獨特，主要是通過對細菌細胞膜穿孔的物理化學作用，與一般抗生素阻斷生物合成等途徑明顯不同，因此，比較難產生抗藥性。而且研究還發現，某些抗菌肽還有明顯的抑殺胂瘤細胞的作用。目前，抗菌肽的研究，已經成為許多生物學家的研究熱點。目前，已經從許多生物中發現了很多的抗菌肽。如從昆蟲、蛙類、豬小腸、植物、真菌、細菌等眾多生物中發現了各種各樣的抗菌肽，有些已在應用，如多肽抗菌素，有些已進入臨床ni試驗。但由于抗菌肽在生物體中含量不高，提取困難，自然成本就高，限制了它的實際應用。尋找效價高、來源易、成本低的抗菌肽，成為許多生物學家追求的目標。因此從微生物代謝產物中尋找抗菌肽是新藥研究中的重要課題之一。
發明內容本發明的目的是提供一種能夠產生新的殺菌肽的芽孢桿菌CP7菌株。能高效分泌抗菌蛋白的CP7菌株是多粘類芽孢桿菌(Pflem'&fldZ/ws,已于2005年10月19日保藏于中國典型培養物保藏中心(簡稱CCTCC)，保藏號為CCTCCNO:M205119。根據《伯杰細菌鑒定手冊》、《芽孢桿菌屬》、《常見細菌系統鑒定手冊》等對芽孢桿菌的特征和種的描述，上述CP7菌株的形態特征和生理生化特性與多稱類芽孢桿菌的形態特征和生理生化特性的描述相一致。因而屬于多粘類芽孢桿菌(尸fle"必fld/Z";spo/;ywyxfl)。用16SrDNA序列分析法進行生物分子的分類，該菌株16SrDNA序列與34個類芽孢桿菌屬(i^em'&flc說"s)的細菌的同源性為96%-99%，與多粘類芽孢桿菌po/ymym)的同源性為99%。同樣表明CP7菌株屬于多熬類芽孢桿菌(P;ofym戸fl)。16SrDNA序列已在GenBank上登錄，注冊號為AY772704。本發明的另一個目的在于提供一種新的殺菌肽，該殺菌肽由上述菌株發酵液中分離，由國家生物醫學分析中心測定該抗菌肽的分子量為2510Da,由23個氨基酸殘基組成，其氨基酸序列為LLLAQPTAAVRGRCQVQRYLLAA;經該中心的檢索為未知多肽。經圓二色譜初步檢測分析出其二級結構，該多肽在溶液中有74.5%呈p-折疊，25.5%為無規卷曲，沒有a-螺旋和轉角。利用軟件DNASIS計算出其等電點為11.13即Cpadn為陽離子型肽，與已經公開的在各種細菌中發現的抗菌肽有很大差別(很多都有cx-螺旋結構或環狀結構)，根據得到的多肽氨基酸序列經國際互聯網的蛋白質公用數據庫檢索，未發現有與其同源性的蛋白質，表明是一種新的蛋白。現初步命名為Cpacin。目前已經發現的多粘類芽孢桿菌的抗菌物質為多肽類的多粘菌素A、B、C、D、E系列，其中多粘菌素E和B已經在臨床上應用，專門用于抗革蘭氏陰性菌。本課題組也從CP7菌株中分離出多粘菌素El,分子量為1169.822Da，另外還分離出與多粘菌素類似的3個抗菌活性系列物質成分Bl(1155.703Da)、B2(1185.801Da)、C2(1191.923Da)，根據分子量的大小，其中B2和C2可能是多粘菌素的另兩種未知組分；經我們的測試，也是只對革蘭氏陰性菌有抑殺作用。另外還克隆到p-l,3-1，4-葡聚糖酶的基因，經初步研究該活性組分為抗真菌的組分。圖1是CP7菌株的菌體形態。其中A'為營養體，B，為孢子囊、芽孢。圖2是CP7菌株與相近菌株的聚類圖。圖3是CP7菌抗菌肽分離純化技術路線。圖4是固相萃取(Sep-Pak)各活性組分的分離效果。其中出芽短梗霉作為真菌的指示菌；大腸桿菌為革蘭氏陰性菌的指示菌；金黃葡萄球菌為革蘭氏陽性菌的指示菌。以0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%和100%(圖中濃度0—10分別表示0%~100%)的異丙醇水溶液分步梯度洗脫，檢測各步收集的洗脫液的抗菌活性。圖5是各活性組分的抗菌效果測試。其中A為抗真菌活性組分，B為多粘菌素El,C為Cpacin,CK為滅菌水，D為出芽短梗霉，E為大腸桿菌，F為金黃葡萄球菌。圖6是Cpadn的反相-高效液相色譜(RP-HPLC)層析效果。圖7是國家生物醫學分析中心測定Cpaciri的分子量結果。圖8是國家生物醫學分析中心測定Cpacin的氨基酸序列結果。圖9是Cpadn經圓二色譜分析結果。其中G為標準品色譜圖，H為Cpacin色譜圖。圖IO是Cpadn耐熱性測試結果。其中指示菌為金黃葡萄球菌。具體實施例方式實施例1.CP7菌株的篩選與鑒定菌株篩選自本實驗室冷凍保存的樣品，用傳統的平板劃線法分離。平板培養基為YEPD固體培養基(100mL):YEASTEXTRACT1.0g，TRYPTONE2,0g,Glucose2.0g，蒸餾水100mL，自然pH值，加1.5%的瓊脂；產抗菌蛋白的液體培養基為(lOOmL):YEASTEXTRACT1.0g，TRYPTONE2.0g,Glucose2.0g,蒸餾水100mL,自然pH值。LB培養基(100mL):TRYPTONE1.0g,YEASTEXTRACT0.5g，Nacll.Og，蒸餾水100mL，pH7，固體培養基另加1.5%的瓊脂。按《伯杰細菌鑒定手冊》、《芽孢桿菌屬》、《常見細菌系統鑒定手冊》等中的方法和標準對CP7菌株進行形態特征和生理生化特性測定，結果見圖l和表l。表lCP7菌株的生理生化特征<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>N03—N02—+卵磷脂酶+pH6.8肉湯生長+pH5.7肉湯+2%NaCl生長+5y。NaCl生長-7%NaCl生長_^_產"Cpacin"抗菌蛋白的CP7菌株的形態特征和生理生化特性與多粘類芽孢桿菌的形態特征和生理生化特性的描述相一致。因而菌種鑒定為多粘類芽孢桿菌(Pae"必fldZZ"s/7oZ戸yxa)。生物分子的分類法鑒定采用細菌16SrDNA的一對通用引物正向引物BsF8/20,反向引物BsR1541/20，序列由上海生物工程有限公司合成。BsF8/20:5，一AGAGTTTGATCCTGGCTCAG—3'BsR1541/20:5，一AAGGAGGTGATCCAGCCGCA—3'CP7菌抹的基因組DNA用《細菌基因組DNA提取試劑盒》(北京百泰克生物技術有限公司)提取，PCR擴增條件參照許玫英等〖2"的方法進行。PCR反應體系的總體積50[iL，其中10xPCRbuffer5^iL，2.5mmol/LdNTPs4nl，引物各2pL,模板DNA2pL,TaqDNA聚合酶(10000U/mL)1mL,無菌水36pL,混勻后，在上面加10石蠟油防止水分揮發。PCR擴增反應程序94T:預變性4min，然后緊接94。C30s,57。C40s，72°C90s，35個循環后72。C延伸10min，4。C保存。PCR產物經10g/L瓊脂糖凝膠電泳，采用《DNA快速純化/回收試劑盒》(北京鼎國生物技術有限責任公司)回收擴增的DNA片段。測序得到CP7菌株的16SrDNA的序列通過Blast程序與GenBank中核酸數據進行比對分析(http:Vwww.ncbi.nlm.nih.gov/blast)，結果見圖2。傳統細菌學方法和生物分子分類法鑒定的結果一致。說明CP7菌株屬于多粘類芽孢桿菌(i^em'&flc說MS/o/;ym戸fl)。實施例2.cp7菌株發酵條件和發酵培養基的優化對CP7菌的發酵培養條件進行了優化，經篩選發現，發酵培養基(100mL)的配方為花生餅粉10g，可溶性淀粉0.67g,MgS04.7H200.15g,K2HP043H200.1076g，自然pH值時，發酵液中的抗菌活性最高。通過單次單因素試驗，發現搖瓶發酵的適宜條件為培養溫度30。C、搖床轉速100r/min,接種量19Kv/v)菌液，自然pH值，培養48h。實施例3."Cpacin"的制備對CP7菌的發酵產物，經粗分離獲得粗提物(發酵液經IO(TC熱處理15min，低溫高速離心后去沉淀的上清液。下同)，經考馬氏藍反應為陽性，表明其為蛋白質；然后經葡聚糖凝膠過濾、陽離子交換或陰離子交換層析，快速或高效液相色譜反相層析等方法分別得到不同的抗菌活性組分。其分離純化路線見圖3。如圖所示，抗革蘭氏陰性菌的活性組分為多粘菌素El及其系列組分，已在此前分離鑒定；抗真菌的活性組分也通過基因克隆的方法初步確定其為p-l，3-1,4-葡聚糖酶；而Cpacin為本課題組最近分離的抗革蘭氏陽性菌的活性組分。圖4為分離的效果。各活性組分的抗菌效果如圖5如示，圖5中的D，是抗真菌(出芽短梗霉)的抑菌圈，其抑菌圈有18~20mm，E的抗G+菌的抑菌圈為16~18mm,F的抗G-菌的抑菌圈為8~10mm(用凝膠孔穴擴散法，孔的直徑2.7mm,加液量為5.5mL),用Hulmark(1980)對抗菌肽活性的檢測方法，其活性分別達到40000U/mL、30000U/mL、7000U/mL。實施例4."Cpacin"的活性鑒定瓊脂平板孔穴擴散法用接種環從￡.0^&2031菌種平板培養基上挑取單菌落于加有3mLLB液體培養基的試管中，37°C、250r/min振蕩培養過夜，吸取IO~50jiL轉接于3~5mL新鮮LB液體培養基中，37。C振蕩培養3~5h,測OD值，用滅菌水稀釋為OD55()=0.001~0.01(此時菌液的濃度應為105~106細胞/mL)。吸取此稀釋液IO~20nL于有刻度的滅菌試管中，加入10mL經溶解并冷卻至455(TC的LB固體培養基，迅速倒入直徑9cm的培養皿中，注意轉搖和充分振蕩培養i，使菌體均勾分散，凝固后用直徑2，7mm的真空打孔器打孔，每孔加入5.5nL待測液，37。C倒置培養過夜，測量抑菌圏直徑。真菌培養基改為PDA,菌種為培養4天以后取分生孢子加入培養基倒平板，其余同細菌。實施例5."Cpacin"的鑒定反相-高效液相色譜(RP-HPLC)分離Cpacin的效果如圖6。上述組分送國家生物醫學分析中心測定該抗菌肽的分子量和氨基酸序列，結果如圖7、圖8。根據測定結果，Cpacin的分子量為2510Da;氨基酸序列為LLLAQPTAAVRGRCQVQRYLLAA。經國家生物醫學分析中心檢索和分析，以及本課題組的初步檢索，該抗菌肽尚未見報道。實施例6."Cpacin"化學性質的初步研究樣品在中山大學化工學院經圓二色譜分析，結果如圖9。根據檢測結果，經相關軟件分析，其結果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>從上述結果初步分析，Cpacin在溶液中沒有a-螺旋，主要為(3-折疊，沒有轉角，部分表現為無規卷曲。與多肽族里天蠶素類有螺旋-鉸鏈-螺旋的結果明顯不同。對其結構，還有待進一步深入研究。Cpacin的熱穩定性Cpacin樣品分別于恒溫水洛鍋中按下列條件處理，60。C20min;70。C20min;80。C10min，20min;90。C10min,20min;100。ClOmin，20min。結果如圖10。上述結果表明，Cpadn對熱不敏感，當100。C加熱20min時，其抗菌活性幾乎不受影響。實施例7."Cpacin"抗革蘭氏陽性菌譜的初步測定Cpacin對部分革蘭氏陽性菌的活性作用見表3。表3Cpadn抗革蘭氏陽性菌的效果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>由上述結果可知，在所測試的6個菌株中，除了枯草桿菌的抑菌效果相對低一些以外，其余均表現出顯著的抗革蘭氏陽性菌作用。鑒于人類對抗生素的耐藥性日益嚴重，迫切尋找或補充新的替代品。本課題組所分離的CP7菌能產生抗革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和真菌的抗菌蛋白，其中抗革蘭氏陽性菌的Cpadn屬于新發現的抗菌多肽。該菌培養容易，經優化的培養基成本低，代謝產物抗菌活性高。除有希望開發為醫藥以外，還可以開發為飼料添加劑，替代抗生素用于家畜、家禽和水產養殖的疾病預防，以及植物的病害防治。權利要求1.一種殺菌肽，其特征在于，氨基酸序列為LLLAQPTAAVRGRCQVQRYLLAA。2.—種可產生權利要求1所述殺菌肽的多粘類芽孢桿菌3.如權利要求2所述的多粘類芽孢桿菌，其為CP7菌株，保藏號為CCTCCNO:M205119。4.一種用于CP7菌株發酵的培養基，其特征在于，100mL該培養基含有如下配比的成分花生餅粉10g,可溶性淀粉0.67g,MgS04'7H200.15g，K2HP04.3H200.1076g;自然pH值。5.權利要求1所述的殺菌肽在抗革蘭氏陽性菌藥物制備中的應用。全文摘要本發明提供了一種能產生新抗菌多肽的CP7菌株，其產生的新抗菌多肽對革蘭氏陽性菌具有強烈的抑菌效果，經測定為23個氨基酸殘基的小肽，其氨基酸序列為LLLAQPTAAVRGRCQVQRYLLAA。本發明還提供了新抗菌多肽在抗革蘭氏陽性菌藥物制備中的應用。文檔編號A61P31/04GK101104637SQ20071011897公開日2008年1月16日申請日期2007年6月15日優先權日2007年6月15日發明者宋家清,宋雪艷,廖富蘋,徐鳳霞,林健榮,趙亞華,陳海英,黃旭華申請人:華南農業大學