一種在醫療器械表面固定抗體的方法

文檔序號：1131516閱讀：418來源：國知局

專利名稱：一種在醫療器械表面固定抗體的方法
技術領域：
本發明屬于醫療器械領域，涉及一種在醫療器械表面固定抗體的方法。
技術背景將生物制品，如蛋白質、抗體、生長因子以及基因質粒等固定在固體表面，如金屬表面、陶瓷表面以及高分子材料表面已經在生物芯片中廣泛應用。隨著醫療器械的發展，尤其是含藥醫療器械的出現，將生物制品固定在醫療器械表面已經成為一種廣泛深入研究的課題。生物制品中的抗體相對于一般的蛋白質而言具有穩定性高，不易失活以及抗原抗體反應的特異性等優點，已經廣泛應用于體外診斷試劑，并且已經應用于藥物治療。因此將抗體牢固固定在醫療器械表面，包括金屬表面以及各種高分子涂層表面，并且不損壞抗體活性就成為一項很關鍵的科技攻關技術。目前將抗體固定在固體表面的一般包括化學鍵合和物理吸附兩種方法。化學鍵合方法一般采用首先對固體表面進行醛基化、羧基化處理，再利用化學接枝的方法固定抗體；在將抗體固定在固體表面時需要解決的兩個關鍵問題是1抗體在固體表面固定的牢固程度，2抗體在固體表面活性的保持。目前在生物芯片上，最常采用的方法是采用首先對固體表面，如玻璃，金屬以及塑料表面進行醛基化或者羧基化處理，然后采用化學接枝的方法將抗體固定在固體表面，這種方法牢固程度高，雖然能夠很好固定抗體，但是抗體的活性會有所降低；物理吸附方法雖然能很好保持抗體在固體表面活性，但是很難保持抗體固定的牢固度。因此如何將這些生物制品很好的固定在醫療器械表面是一個呈待解決的重要關鍵技術問題。發明內容本發明的目的在于提供一種在醫療器械表面固定抗體的方法，可提高抗體在器械表面固定的牢固程度，并保持抗體在醫療器械表面具有很高的活性。本發明采用的技術方案一種在醫療器械表面固定抗體的方法，主要包括①器械本體表面的預處理、②制備孔洞、③器械本體表面的后處理、固定抗體工藝步驟，所述的②制備孔洞是采用化學或物理方法在器械本體表面制備大小均一的孔洞；所述的④固定抗體是將表面帶有孔洞的器械本體浸沒在含有生物制品抗體的溶液中，調節抗體緩沖液的pH值使抗體溶液帶正電荷，通過正負電荷相吸將生物制品抗體固定在器械本體表面。所述的①器械本體表面的預處理利用超聲波對器械本體表面清洗清除雜質，使用濃度為99. 5%的丙酮分析純溶液，或濃度為75%的醫用乙醇溶劑，利用頻率為28 100khz超聲波清洗支架本體材料，清洗5-15min，去除本體材料表面的雜質，將清洗后的本體材料放置在干燥機中，溫度設定在30 40 °C，干燥30 60min后取出備用。所述的②制備孔洞采用化學腐蝕、電化學腐蝕、陽極氧化、微弧氧化、微弧氮化方法在器械本體上直接制備大小均一的多晶相結構孔洞；將器械本體材料浸泡在0 10(TC溫度的腐蝕液中，所述的腐蝕液優選濃度為1 38% 的鹽酸，或含有1 38%的鹽酸混合1 98%的硫酸成分的鹽酸混酸溶液，腐蝕時間根據濃度、溫度不同控制在lmin 480h后形成單尺寸納米級孔洞。所述的③器械本體表面的后處理將上述處理好的器械本體材料先使用濃度為99. 5%的丙酮分析純溶液，再經蒸餾水利用頻率為28 100khz超聲波清洗本體材料5-15min;最后將清洗后的本體材料放置在干燥機中，溫度設定在30 40。C，干燥30 60min后取出備用；或用蒸餾水配制濃度為1 38% 的鹽酸溶液，將本體材料浸泡在配好的溶液中，放置在恒溫箱中，溫度設定在20。C左右，放置30min 48h取出。所述的器械本體包括支架、導管、導絲、心臟起搏器、心臟瓣膜、外科植入材料、植入硬組織，以及基材為陶瓷、有機聚合物、無機物、金屬氧化物的非金屬醫療器械；所述的支架為球囊擴張型支架、自膨脹型支架、血管支架、非血管支架，基材為不銹鋼、鎳鈦記憶合金、鈷基合金、純鈦、鈦合金的支架，以及絲材編織、管材激光切割、模鑄、焊接的支架。所述的生物制品抗體包括下述一種或多種物質肝素、抗血小板膜糖蛋白(GPIIb/IIIa)受體劑拮抗、抗體治癌藥物、阿昔單抗、生物多肽、CD34 抗體、CD31抗體、CD133抗體。所述的④固定抗體(1) .將表面帶有孔洞的支架浸沒在含有0. l 10ug/mL CD34抗體磷酸鹽緩沖液溶液中，25 37'C溫育20 30min后取出；(2) .將支架用磷酸鹽緩沖液溶液清洗3次，每次5min，保持室溫向支架吹風15min，待支架干燥后4"C保存；(3) .將表面帶有抗體的支架浸沒在500 UL5X牛血清白蛋白(BSA)的磷酸鹽緩沖液溶液中，25 37'C溫育20 30 min后取出支架，空氣中晾干；(4) .將支架放入500 UL 0.01ng/"L人重組CD34抗原的磷酸鹽緩沖液溶液中，25 37'C放置20 30 min，取出支架，空氣中晾干；(5) .將支架放入500uL lug/mL異硫氰酸熒光素(FITC)標記的CD34 抗體的磷酸鹽緩沖液溶液，或辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗小鼠的IgG，的磷酸鹽緩沖液溶液，25 37'C溫育20 30min后取出支架；(6) .將支架用磷酸鹽緩沖液溶液清洗3次，每次5min后晾干支架。所述的④固定抗體之后進行⑤抗體活性檢測采用人工模擬血液動力學和支架表面抗體活性檢測方法驗證固定生物制品抗體的有效性，通過熒光顯微鏡對支架進行熒光照相，或采用3-氨基-9-乙基-咔唑(AEC)染色試劑盒，免疫組化染色后拍照。所述的④固定抗體之后進行⑤抗體活性檢測將表面固定有小鼠抗人 CD34抗體支架，此時支架處于預裝前或者球囊擴張后狀態，放置在流動人工模擬體液，如壓力lOOmmHg、流速91cm/s，磷酸鹽緩沖液溶液中進行沖刷試驗。所述的④固定抗體與⑤抗體活性檢測(1) .將表面帶有孔洞的支架浸沒在含有0. l 10yg/mL CD34抗體磷酸鹽緩沖液溶液中，25 37X:溫育20 30 min后取出；(2) .將支架用磷酸鹽緩沖液溶液清洗3次，每次5 min，保持室溫向支架吹風15 inin，待支架干燥后4'C保存；(3) .將表面帶有抗體的支架浸沒在500 uL5X牛血清白蛋白(BSA)的磷酸鹽緩沖液溶液中，25 37'C溫育20 30 min后取出支架，空氣中晾干；(4) .將支架放入辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗小鼠的IgG的磷酸鹽緩沖液溶液中，25 37t:溫育20 30 min，取出支架；(5) .將支架用磷酸鹽緩沖液溶液清洗3次，每次5min，將支架放入500 uLTMB底物緩沖液，如10mg/5mL無水乙醇0.5mL，底物緩沖液，如Na2HP04 1.42g;檸檬酸鈉0. 96g，加蒸餾水至50mL， 5 mL; 0. 75%過氧化氫32 y L， 25 37。C溫育15 min后，加入250 yL 2 M硫酸溶液以終止反應；(6) .使用酶標儀測定492nm下溶液的吸光度，將己知濃度的CD34抗體按照不同濃度梯度，1:10， 1:20， 1:50， 1:100， 1:500， 1:1000， 1:10000包被在酶標板上，將A492nm對CD34抗體濃度進行模擬得出標準曲線。(7).根據所測的吸光度和標準曲線確定支架表面抗體的量，結果表明帶有孔洞316L不銹鋼支架每lmm長度可固定1 20 ng CD34抗體。本發明所具有的積極有益效果1. 采用化學腐蝕、電化學腐蝕方法在醫療器械表面形成多孔表面，表面孔洞大小均一，呈多晶相結構，生物制品抗體通過孔洞的物理吸附作用固定在醫療器械的表面，牢固程度高，可保持抗體在醫療器械表面具有很高的活性；2. 孔洞的形成，可將生物制品抗體很好的固定在醫療器械表面，充分發揮生物制品在預防支架內再狹窄和抗血栓方面的作用，克服了醫療器械使用過程中帶來的一些負面影響，如支架內再狹窄和血栓形成的問題，為冠狀動脈粥樣硬化的患者帶來福音；3. 本發明工藝簡單，檢測準確可靠，可廣泛應用于生物芯片和在醫療器械表面，如血管支架，骨科植入設備等固定生物抗體。

圖1為本發明經處理后316L不銹鋼支架表面的掃描電鏡照片；圖2為本發明抗體支架熒光照片；圖3為本發明帶有孔洞的316L不銹鋼支架3-氨基-9-乙基-咔唑(AEC)染色照片；
圖4為本發明抗體支架3-氨基-9-乙基-咔唑(AEC)染色照片；圖5為本發明抗體支架預裝前24h沖刷后染色結果；圖6為本發明抗體支架經球囊擴張后24h沖刷后染色結果；圖7為本發明比較不同工藝條件下孔洞固定抗體的相對含量。
具體實施方法
一種在醫療器械表面固定抗體的方法，主要包括①器械本體表面的預處理、②制備孔洞、③器械本體表面的后處理、④固定抗體、⑤抗體活性檢測等工藝步驟；首先按照本公司的專利申請申請號為200610168125.0,申請日為2006.12.14，名稱為"藥物洗脫器械用納米級孔洞藥物釋放結構及其制備方法"中提出的工藝步驟，采用化學腐蝕、電化學腐蝕、陽極氧化、微弧氧化、微弧氮化方法在醫療器械表面，如316L不銹鋼金屬裸支架表面制備形成多孔表面，表面孔洞大小均一，呈多晶相結構，孔洞的大小為400 600nm，如圖1所示，為經處理后316L不銹鋼支架表面的掃描電鏡照片。其中
① 器械本體表面的預處理利用超聲波對器械本體表面清洗清除雜質，如選用不銹鋼裸支架，使用濃度為99. 5%的丙酮分析純溶液，或濃度為75%的醫用乙醇溶劑，利用頻率為28 100khz超聲波清洗支架本體材料，清洗 5-15min，去除本體材料表面的雜質，將清洗后的本體材料放置在干燥機中，溫度設定在30 40。C，干燥30 60min后取出備用；
② 制備孔洞采用酸溶液腐蝕致孔方法在器械本體上直接制備大小均一的孔洞；將器械本體材料浸泡在0 10(TC溫度的腐蝕液中，所述的腐蝕液優選濃度為1 38%的鹽酸，或含有1 38%的鹽酸混合1 98%的硫酸成分的鹽酸混酸溶液，腐蝕時間根據濃度、溫度不同控制在lmin 480h后形成單尺寸納米級孔洞；
③ 器械本體表面的后處理將上述處理好的器械本體材料先使用濃度為 99. 5%的丙酮分析純溶液，再經蒸餾水利用頻率為28 100khz超聲波清洗本體材料5-15min;最后將清洗后的本體材料放置在干燥機中，溫度設定在30 40°C，干燥30 60min后取出備用；或用蒸餾水配制濃度為1 38%的鹽酸溶液，將本體材料浸泡在配好的溶液中，放置在恒溫箱中，溫度設定在20。C左右，放置30min 48h取出；
④ 固定抗體將表面帶有孔洞的金屬裸支架浸沒在含有生物制品抗體的溶液中，通過調節抗體緩沖液的pH值使抗體溶液帶正電荷，從而通過正負電荷相吸的物理吸附原理將生物制品抗體固定在醫療器械表面，并利用金屬裸支架表面孔洞的深度和尺寸提高抗體在器械表面固定的牢固程度，不僅能夠牢固固定抗體并使支架表面抗體具有很高的活性；
⑤ 抗體活性檢測采用人工模擬血液動力學和支架表面抗體活性檢測方法驗證固定生物制品抗體的有效性。
所述的器械本體包括支架、導管、導絲、心臟起搏器、心臟瓣膜、外科植入材料、植入硬組織，以及基材為陶瓷、有機聚合物、無機物、金屬氧化
物的非金屬醫療器械；所述的支架為球囊擴張型支架、自膨脹型支架、血管支架、非血管支架，基材為不銹鋼、鎳鈦記憶合金、鈷基合金、純鈦、鈦合金的支架，以及絲材編織、管材激光切割、模鑄、焊接的支架。
所述的生物制品抗體包括下述一種或多種物質肝素、抗血小板膜糖蛋
白(GPIIb/IIIa)受體劑拮抗、抗體治癌藥物、阿昔單抗、生物多肽、CD34 抗體、CD31抗體、CD133抗體。以下給出本發明的較佳實施例實施例1
為基于CD34抗體抗原結合反應的支架表面固定抗體CD34的方法及抗體
活性的熒光檢測，其步驟如下
(1) .將表面帶有孔洞的316L不銹鋼支架浸沒在含有0. l 10ug/mL CD34
抗體，如小鼠抗人CD34抗體，II型，由美國干細胞科技有限公司出品的磷酸鹽緩沖液，PH=7. 2 7.4溶液中，25 37。C溫育20 30min后取出；
(2) .將支架用磷酸鹽緩沖液，PH二7.2 7.4溶液清洗3次，每次5min，保持室溫25°C向支架吹風15min，待支架干燥后4。C保存；
(3) .將表面帶有抗體的支架浸沒在500 ^L5X牛血清白蛋白(BSA)的磷酸鹽緩沖液，ra二7.2 7.4溶液中，25 37。C溫育20 30min后，取出支架，空氣中晾干；
(4) .將支架放入500 "L 0.01ng/uL人重組CD34抗原，由美國生物公司出品的磷酸鹽緩沖液，PH二7.2 7.4溶液中，25 37。C放置20 30 min，取出支架，空氣中晾干；
(5) .將支架放入500uL 1 u g/mL異硫氰酸熒光素(FITC)標記的CD34 抗體，如小鼠抗人CD34抗體，II型，由美國干細胞科技有限公司出品的磷酸鹽緩沖液，PH二7.2 7.4溶液，25 37。C溫育20 30min后，取出支架；
(6) .將支架用磷酸鹽緩沖液，ra=7.2 7.4溶液清洗3次，每次5min 后晾干支架；
(7) .采用熒光顯微鏡，如日本奧林巴斯熒光顯微鏡對支架進行熒光照相，以帶有孔洞的316L不銹鋼支架作為對照支架，結果如圖2所示。
實施例2
為基于CD34抗體抗原結合反應的支架表面固定抗體CD34的方法及抗體活性的免疫組化檢測，其支架表面固定抗體CD34的方法與實施例1中的1-6 步驟相同；對抗體活性的免疫組化檢測，如步驟7.采用3-氨基-9-乙基-咔唑(AEC)染色試劑盒，由中國華美生物工程公司出品，免疫組化染色后拍照，以帶有孔洞的316L不銹鋼支架作為對照支架，結果如圖3、圖4所示。
實施例3
為抗體支架在人工體液中的血液動力學模擬試驗與支架表面固定抗體的方法及牢固度的檢測，其步驟如下
(1).將表面固定有小鼠抗人CD34抗體支架，此時支架處于預裝前或者球囊擴張后狀態，放置在流動人工模擬體液，如壓力100mmHg、流速91cm/s，磷酸鹽緩沖液，PH=7. 2 7. 4的溶液中進行沖刷試驗；
(2).沖刷24小時后采用實施例2的方法檢測支架表面抗體的活性；試驗結果如圖5、圖6所示，表明采用支架表面孔洞物理吸附抗體的牢固度很好，能夠在高速的動脈血流中仍能良好的固定在支架表面，并保持有較高的活性。
實施例4
為支架表面固定抗體的方法及抗體級聯放大的定量檢測，其步驟如下
(1) .將表面帶有孔洞的316L不銹鋼支架浸沒在含有0. 1 10 u g/mL CD34 抗體，如小鼠抗人CD34抗體，II型，美國干細胞科技有限公司的磷酸鹽緩沖液，PH=7. 2 7.4溶液中，25 37。C溫育20 30 min后取出；
(2) .將支架用磷酸鹽緩沖液，PH二7.2 7.4溶液清洗3次，每次5 min，保持室溫25。C向支架吹風15 min，待支架干燥后4。C保存；
(3) .將表面帶有抗體的支架浸沒在500 PL5^牛血清白蛋白(BSA)的磷酸鹽緩沖液，PH=7. 2 7. 4溶液中，25 37。C溫育20 30 min后取出支架，空氣中晾干；
(4) .將支架放入辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗小鼠的IgG，由中國華美生物工程公司出品的磷酸鹽緩沖液，ra = 7.2 7.4溶液中，25 37 。C溫育20 30 min，取出支架；
(5) .將支架用磷酸鹽緩沖液，PH二7.2 7.4溶液清洗3次，每次5min，將支架放入500 uL TMB底物緩沖液，如10 mg/5 mL無水乙醇0.5 mL，底物緩沖液，如Na2跳1.42 g;檸檬酸鈉0.96 g，加蒸餾水至50 mL， 5 mL; 0.75%過氧化氫32 uL， 25 37'C溫育15 min后，加入250 uL 2 M硫酸溶液以終止反應；
(6) .使用酶標儀測定492nm下溶液的吸光度(A492)，將帶有孔洞的316L 不銹鋼支架作為對照支架，同時將已知濃度的CD34抗體按照不同濃度梯度， 1:10, 1:20， 1:50， 1:100， 1:500， 1:1000， 1:10000包被在酶標板上按照上述方法測定A492nm，將A492nm對CD34抗體濃度進行模擬得出標準曲線；
(7) .根據所測的吸光度和標準曲線確定支架表面抗體的量，結果表明帶有孔洞316L不銹鋼支架每l腿長度可固定1 20 ng CD34抗體。
實施例5
為測定不同緩沖液對血管支架表面固定抗體相對含量的影響，比較不同工藝條件下孔洞固定抗體的相對含量，其步驟如下
(1) .將帶有孔洞的血管支架，長度為12rran浸沒在0. l 10ug/mL CD34 抗體，如小鼠抗人CD34抗體，II型，由美國干細胞科技有限公司出品的磷酸鹽緩沖液，PH=7. 2 7. 4或碳酸鹽緩沖液，PH=9. 6溶液25 37。C溫育20 30 min后取出，空氣中晾干；
(2) .按照實施例4中的檢測方法，確定不同pH值對孔洞血管支架表面固定抗體相對含量的影響，結果表明相同條件下碳酸鹽溶液中血管支架固定的抗體相對含量較多，結果如圖7所示。
權利要求
1. 一種在醫療器械表面固定抗體的方法，主要包括①器械本體表面的預處理、②制備孔洞、③器械本體表面的后處理、④固定抗體工藝步驟，其特征在于所述的②制備孔洞是采用化學或物理方法在器械本體表面制備大小均一的孔洞；所述的④固定抗體是將表面帶有孔洞的器械本體浸沒在含有生物制品抗體的溶液中，調節抗體緩沖液的pH值使抗體溶液帶正電荷，通過正負電荷相吸將生物制品抗體固定在器械本體表面。
2. 根據權利要求1所述的一種在醫療器械表面固定抗體的方法，其特征在于所述的①器械本體表面的預處理利用超聲波對器械本體表面清洗清除雜質，使用濃度為99. 5%的丙酮分析純溶液，或濃度為75。/。的醫用乙醇溶劑，利用頻率為28 100khz超聲波清洗支架本體材料，清洗5-15min，去除本體材料表面的雜質，將清洗后的本體材料放置在干燥機中，溫度設定在30 40 。C，干燥30 60min后取出備用。
3. 根據權利要求1所述的一種在醫療器械表面固定抗體的方法，其特征在于所述的②制備孔洞采用化學腐蝕、電化學腐蝕、陽極氧化、微弧氧化、微弧氮化方法在器械本體上直接制備大小均一的多晶相結構孔洞；將器械本體材料浸泡在0 10(TC溫度的腐蝕液中，所述的腐蝕液優選濃度為1 38% 的鹽酸，或含有1 38%的鹽酸混合1 98。/。的硫酸成分的鹽酸混酸溶液，腐蝕時間根據濃度、溫度不同控制在lmin 480h后形成單尺寸納米級孔洞。
4. 根據權利要求1所述的一種在醫療器械表面固定抗體的方法，其特征在于所述的③器械本體表面的后處理將上述處理好的器械本體材料先使用濃度為99. 5%的丙酮分析純溶液，再經蒸餾水利用頻率為28 100khz超聲波清洗本體材料5-15min;最后將清洗后的本體材料放置在干燥機中，溫度設定在30 4(TC，干燥30 60min后取出備用；或用蒸餾水配制濃度為1 38% 的鹽酸溶液，將本體材料浸泡在配好的溶液中，放置在恒溫箱中，溫度設定在20。C左右，放置30min 48h取出。
5. 根據權利要求1所述的一種在醫療器械表面固定抗體的方法，其特征在于所述的器械本體包括支架、導管、導絲、心臟起搏器、心臟瓣膜、外科植入材料、植入硬組織，以及基材為陶瓷、有機聚合物、無機物、金屬氧化物的非金屬醫療器械；所述的支架為球囊擴張型支架、自膨脹型支架、血管支架、非血管支架，基材為不銹鋼、鎳鈦記憶合金、鈷基合金、純鈦、鈦合金的支架，以及絲材編織、管材激光切割、模鑄、焊接的支架。
6. 根據權利要求1所述的一種在醫療器械表面固定抗體的方法，其特征在于所述的生物制品抗體包括下述一種或多種物質肝素、抗血小板膜糖蛋白(GPIIb/IIIa)受體劑拮抗、抗體治癌藥物、阿昔單抗、生物多肽、CD34 抗體、CD31抗體、CD133抗體。
7. 根據權利要求l所述的一種在醫療器械表面固定抗體的方法，其特征在于所述的④固定抗體(1).將表面帶有孔洞的支架浸沒在含有0. l 10ug/mL CD34抗體磷酸鹽緩沖液溶液中，25 37-C溫育20 30min后取出；(2) .將支架用磷酸鹽緩沖液溶液清洗3次，每次5min，保持室溫向支架吹風15min，待支架干燥后4"C保存；(3) .將表面帶有抗體的支架浸沒在500 uL5X牛血清白蛋白(BSA)的磷酸鹽緩沖液溶液中，25 37。C溫育20 30 min后取出支架，空氣中晾干；(4) .將支架放入500 uL 0.01ng/uL人重組CD34抗原的磷酸鹽緩沖液溶液中，25 37X:放置20 30 min，取出支架，空氣中晾干；(5) .將支架放入500uL lug/mL異硫氰酸熒光素(FITC)標記的CD34 抗體的磷酸鹽緩沖液溶液，或辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗小鼠的IgG，的磷酸鹽緩沖液溶液，25 37。C溫育20 30min后取出支架；(6) .將支架用磷酸鹽緩沖液溶液清洗3次，每次5min后晾干支架。
8. 根據權利要求1所述的一種在醫療器械表面固定抗體的方法，其特征在于所述的④固定抗體之后進行⑤抗體活性檢測采用人工模擬血液動力學和支架表面抗體活性檢測方法驗證固定生物制品抗體的有效性，通過熒光顯微鏡對支架進行熒光照相，或采用3-氨基-9-乙基-咔唑(AEC)染色試劑盒，免疫組化染色后拍照。
9. 根據權利要求l所述的一種在醫療器械表面固定抗體的方法，其特征在于所述的④固定抗體之后進行⑤抗體活性檢測將表面固定有小鼠抗人 CD34抗體支架，此時支架處于預裝前或者球囊擴張后狀態，放置在流動人工模擬體液，如壓力lOOmmHg、流速91cm/s，磷酸鹽緩沖液溶液中進行沖刷試驗。
10. 根據權利要求1所述的一種在醫療器械表面固定抗體的方法，其特征在于所述的④固定抗體與⑤抗體活性檢測(1) .將表面帶有孔洞的支架浸沒在含有0. l 10ug/mL CD34抗體磷酸鹽緩沖液溶液中，25 37'C溫育20 30 min后取出；(2) .將支架用磷酸鹽緩沖液溶液清洗3次，每次5min，保持室溫向支架吹風15 min，待支架干燥后4"C保存；(3) .將表面帶有抗體的支架浸沒在500 uL5X牛血清白蛋白(BSA)的磷酸鹽緩沖液溶液中，25 37。C溫育20 30 min后取出支架，空氣中晾干；(4) .將支架放入辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗小鼠的IgG的磷酸鹽緩沖液溶液中，25 37t:溫育20 30 min，取出支架；(5) .將支架用磷酸鹽緩沖液溶液清洗3次，每次5min，將支架放入500 PLTMB底物緩沖液，如10mg/5mL無水乙醇0.5mL，底物緩沖液，如Na2HP04 1.42g;檸檬酸鈉0.96g，加蒸餾水至50mL， 5 mL; 0.75%過氧化氫32 u L， 25 37t:溫育15 min后，加入250 uL 2 M硫酸溶液以終止反應；(6) .使用酶標儀測定492nm下溶液的吸光度，將已知濃度的CD34抗體按照不同濃度梯度，1:10, 1:20， 1:50， 1:100， 1:500， 1:1000， 1:10000包被在酶標板上，將A492nm對CD34抗體濃度進行模擬得出標準曲線。(7) .根據所測的吸光度和標準曲線確定支架表面抗體的量，結果表明帶有孔洞316L不銹鋼支架每lmm長度可固定1 20 ng CD34抗體。
全文摘要
本發明涉及一種在醫療器械表面固定抗體的方法。主要包括①器械本體表面的預處理、②制備孔洞、③器械本體表面的后處理、④固定抗體等工藝步驟；所述的②制備孔洞是采用化學或物理方法在器械本體表面制備大小均一的孔洞；所述的④固定抗體是將表面帶有孔洞的器械本體浸沒在含有生物制品抗體的溶液中，調節抗體緩沖液的pH值使抗體溶液帶正電荷，通過正負電荷相吸將生物制品抗體固定在器械本體表面；最后采用人工模擬血液動力學和支架表面抗體活性檢測方法驗證固定生物制品抗體的有效性；可提高抗體在器械表面固定的牢固程度，并保持抗體在醫療器械表面具有很高的活性。
文檔編號A61L27/28GK101310778SQ20071010764
公開日2008年11月26日申請日期2007年5月23日優先權日2007年5月23日
發明者余占江, 蒲忠杰申請人:樂普(北京)醫療器械股份有限公司

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