專利名稱：治療中樞神經系統病癥的方法和組合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及用于預防和/或治療患有或易感上述病癥的患者的方法，和特別地，涉及用于預防和/或治療患有那些與腦神經元神經變性相關的病癥的患者的方法。本發明也涉及在預防和/或治療已經歸因于神經變性疾病的CNS病癥中用作為藥物組合物的物質的組合物。
背景技術：
煙堿性受體 煙堿性乙酰膽堿受體(nAChR)由α亞基(α2-α9)和β亞基(β2-β4)的不同組合而組成的，并根據它們對煙堿或α-銀環蛇毒素(αBTX)的親和力分為兩類(Vijayaraghavan，S.等，Neuron8353-362(1992))。在已知的αBTX結合亞型α7-α9中，只有α7受體的表達遍及哺乳動物腦組織。α7受體形成功能同數的(homomeric)離子通路促使Ca2+的流入，其被快速地脫敏化(Breese，C.R.等，J.Com.Neurol.387385-398(1997)；Vijayaraghavan，S.等，Neuron8353-362(1992))并因此被認為與突觸傳遞有關(McGehee，D.S.等，Science 2691692-1696(1995))。選擇作用于α7受體的煙堿性激動劑已被證明能有效地提高大鼠、靈長類動物和AD患者的認知功能。基于在AD中所觀察到的多方面的缺陷和有限的用于治療AD患者的處方，因此急切需要新的治療方法和用于優化已有的和出現的療法的方法。
煙堿也被發現能抑制在無血清培養基中培養的PC12細胞的死亡(Yamashita，H.和S.Nakamura，Neurosci.Lett.213145-147(1996))。此外，選擇性的α7受體激動劑，anabaseine衍生的3-(4)-dimethylaminocinamylidine(DMAC)(de Fiebre，C.M.等，Mol.Pharmacol.47164-171(1995))，和nAChR的活化劑，包括α7亞型，ABT-418(Donnelly-Roberts，D.L.等，Brain Res.71936-44(1996))也已被報道能發揮細胞保護的作用。
在神經元細胞中煙堿誘導的保護作用被αBTX、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抑制劑(LY294002和渥曼青霉素)和Src抑制劑(PP2)抑制。此外，通過煙堿能增加PI3K的效應物磷酸化Akt的水平(Kihara，T.S.等，J.Biol.Chem.27613541-13546(2001))。這些發現暗示α7煙堿性受體以級聯的方式轉導信號到PI3K，最終有助于神經保護作用。
AngII信號途徑 血管緊張素II(AngII)的作用是通過兩種類型的細胞表面受體(AT1和AT2)被介導的。在腎小球膜細胞(GMC)中大多數針對AngII的生理響應是通過AT1受體亞型發生(Bernstein，K.E.和M.B.Marrero，Trends.Cardiovasc.Med.6179-187(1996)；Marrero，M.B.等，Cell.Signal.821-26(1996))。對于AT1受體，通過AngII激活產生G蛋白介導的信號，包括蛋白激酶C依賴的磷脂酶C的激活和釋放來自于細胞內儲藏的鈣(Bernstein，K.E.和M.B.Marrero，Trends.Cardiovasc.Med.6179-187(1996))。AT1受體也激活傳統上與生長因子和細胞因子受體相關的信號途徑導致產生早期生長響應基因。通過AngII信號級聯誘導早期生長響應基因，如c-fos和c-jun原癌基因，通常不需要合成新蛋白質和看來能通過預先存在的轉錄因子的翻譯后修飾被調控(Sadoshima，J.和S.Izumo，Circ.Res.73413-423(1993)；Okuda，M.，Y.Kawahara，和M.Yokoyama，Am.J.Physiol.271H595-H601，(1996)；Sadoshima，J.和S.Izumo，Circ.Res.73413-423(1993)；Sadoshima，J.和S.Izumo，Circ.Res.73424-438 (1993)；Taubman，M.B.等，J.Biol.Chem.264526-530(1989))。因此，這些早期生長響應基因的AngII誘導表達是在胞內信號轉導途徑的直接調節下進行的。近來已暗示三個胞內信號途徑與原癌基因的激活有關JAK/STAT、p21ras/Raf-1/MAP激酶和PLC-γ1級聯(Bernstein，K.E.和M.B.Marrero，Trends.Cardiovasc.Med.6179-187(1996)；Marrero，M.B.等，Cell.Signal.821-26(1996)；Sayeski，P. P.等.Regulatory Peptides 7819-29(1998))。從關注于AT1受體信號轉導途徑的多方面研究中，已經清楚激動劑刺激信號的時間排列(temporal arrangemnet)的變化從秒(即PLC-γ1的激活和肌醇磷酸的產生)到分鐘(如，MAP激酶的激活)到小時(如，JAK/STAT途徑)(Bernstein，K.E.和M.B.Marrero，Trends.Cardiovasc.Med.6179-187(1996)；Sayeski，P.P.等.Regulatory Peptides 7819-29(1998))。AT1受體與不同信號轉導途徑的有差別地偶聯的確切機制是不清楚的，但推測包括一系列復雜的步驟，即以時間依賴性機制選擇性恢復、激活和接著失活每一信號系統。
在AngII信號中JAK/STAT途徑的作用 JAK家族的胞質酪氨酸激酶通常被認為偶聯細胞因子受體如那些白細胞介素和干擾素，其有四個成員(JAK1、JAK2、JAK3和TYK2)(Darnell，J.E.，Jr.等，Science 2641415-1421(1994)；Taubman，M.B.等，J.Biol.Chem.264526-530(1989))。在配體結合的響應中，這些JAK酪氨酸激酶聯合酪氨酸磷酸化并激活自身的細胞因子受體。一旦被激活，JAK酪氨酸磷酸化并激活其它信號分子包括在STAT和受體結合后的STAT家族的核轉錄因子(Darnell，J.E.，Jr.等，Science 2641415-1421(1994)；Taubman，M.B.等，J.Biol.Chem.264526-530(1989))。因此，JAK/STAT途徑是在細胞表面受體和導致細胞生長的核轉錄活動中的重要連接。近來，Baker和其同事已經證明在心臟纖維原細胞和AT1受體轉染的CHO細胞中STAT1、STAT3和STAT5在響應AngII過程中酪氨酸被磷酸化(Bhat，G.J.等，J.Biol.Chem.26931443-31449(1994)；Bhat，G.J.等，J.Biol.Chem.27019059-19065(1995)；McWhinney，C.D.等，J.Mol.Cell.Cardiol.30751-761(1998))。這些研究者也發現AngII的暴露刺激磷酸化單體STAT蛋白形成同-(STAT12、STAT32或STAT52)或異-(STAT1STAT3)二聚復合體，稱為SIF(sis-誘導因子)。這些SIF復合體隨后移位到細胞核并與在c-fos啟動子中被稱為SIE(sis-誘導元件)或PIE(催乳素誘導元件)類似元件的特定DNA基序相互作用，最后激活早期生長響應基因(Bhat，C.J.等，J.Biol.Chem.26931443-31449(1994)；Darnell，J.E.，Jr.等，Science 2641415-1421(1994)；McWhinney，C.D.等，J.Mol.Cell.Cardiol.30751-761(1998)；Schindler，C.和J.E.Darnell，Jr.，Annu.Rev.Biochem.64621-651(1995))。JAK/STAT級聯能通過AngII產生的JAK2、STAT1和STAT3的酪氨酸磷酸化和STAT1和STAT3移位到細胞核被激活(Bhat，G.J.等，J.Biol.Chem.27019059-19065(1995)；Marrero，M.B.等.Clin.Exp.Pharmacol.Physiol.2383-88 1996；Marrero，M.B.等，Nature 375247-250(1995))。此外，AT1受體的羧基末端尾部以AngII依賴的方式結合到JAK2上(Ali，M.S.等，J.Biol.Chem.27223382-23388(1997))。另外，用藥理上的JAK2抑制劑(AG490)抑制JAK2酪氨酸磷酸化或用抗STAT1或STAT3的抑制性抗體的電穿孔來抑制AngII誘導的血管平滑肌細胞(VSMC)增殖和DNA合成(Marrero，M.B.等，J.Biol.Chem.27224684-24690(1997))。這些結果表明G蛋白偶聯受體，特別是AT1受體能通過同樣的先前結合促有絲分裂的細胞因子和生長因子受體的細胞內酪氨酸磷酸化途徑來起作用。最后，酪氨酸磷酸酯酶，SHP-1和SHP-2，在AngII誘導的JAK2磷酸化中具有相反的作用。SHP-1顯示引起JAK2去磷酸化和AngII誘導的JAK/STAT級聯的終止，而SHP-2顯示出在JAK2磷酸化和導致細胞增殖的AngII誘導的JAK/STAT級聯的啟動中起著關鍵的作用(見Jiao，H.等.Direct association with anddephosphorylation of Jak2 kinase by the SH2-domain-containingprotein tyrosine phosphatase SHP-1.Mol Cell Biol 16(12)6985-92(1996))。
AT1受體的基序需要與JAK2結合，其也需要與SHP-2結合(Marrero，M.B.等，Am.J.Physiol.275C1216-C1223(1998))。此外，SHP-2也需要與JAK2-AngII AT1受體結合(Marrero，M.B.等，Am.J.Physiol.275C1216-C1223(1998))。SHP-2因此可起著作為一個JAK2與受體結合的接頭蛋白的作用，從而幫助JAK2磷酸化和激活(Marrero，M.B.等，Am.J.Physiol.275C1216-C1223，1998)。
煙堿性乙酰膽堿受體和β-淀粉狀蛋白毒性 膽堿能的不足在阿爾茨海默病中已被清楚地明確了并且是當前治療該病癥的策略的基礎。在阿爾茨海默病患者的腦中高親合力的煙堿受體具有早期和明顯的減少(Court，J.等.Biol.Psychiatry 49175-184(2001))，且一些研究已經表明給予靶向nAChRs的配體能提高嚙齒動物、包括人類的靈長類動物的認知能力(Newhouse P A，等，Biol Psychiatry 49(3)268-78(2001))。除他們所知的對癥狀的影響外，神經元煙堿性配體在體外(Donnelly-Roberts，D.L.等.Brain Res.71936-44(1996))和體內(Ryan RE等，132(8)1650-6(2001))已經顯示出神經保護活性，暗示存在用于治病的額外潛能。
α7受體形成功能同數的(homomeric)配體控制(gated)的離子通路以促使快速減少Ca2+的流入，其在哺乳動物腦中廣泛地表達，并與感覺的控制、識別和神經保護相關(Seo，J.等，Biol Psychiatry 49(3)240-7(2001))。通過α-Bgt和發揮細胞保護作用的選擇性α7-nAChR激動劑-anabaseine衍生的3-(4)-dimethylaminocinamylidine(DMAC)，煙堿誘導的抗β-淀粉狀蛋白誘導毒性的神經保護作用被抑制(De Fiebre C.M.等，Mol.Pharmacol.47164-171(1995)；Kem WR.，Behav Brain Res.113(1-2)169-81(2000))。PI-3-K效應物磷酸化Akt的水平通過煙堿被增加且細胞保護作用通過磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抑制劑(LY294002和渥曼青霉素)和Src抑制劑(PP2)被抑制(Kihara，T.等，J.Biol.Chem.27613541-13546(2001))。在級聯中α7-nAChR轉導信號到PI3K，最后有助于抗Aβ的神經保護作用。
相對于α7-nAChR的減少，來自于患有阿爾茨海默病的患者的顳葉(temporal)皮層中的血管緊張素轉換酶(ACE-該酶轉換血管緊張素I為血管緊張素II)的濃度增加了(Barnes，N.M.等，Eur.J.Pharmacol.200289-292(1991))，且在一些人中該ACE基因型與AD有關(Narain Y等J Med Genet.，37(9)695-7(2000))。在培養的細胞和體內AT2受體都發揮抑制生長的作用或細胞凋亡作用(Horiuchi，M.等，Endocr.Res.24307-314(1998))，其在PC12細胞中表達，并已顯示能抑制JAK/STAT信號級聯(Horiuchi，M.等，Circ.Res.84876-882(1999))。
期望能進一步地了解在α7 nAChR介導的有益途徑和AT2介導的細胞凋亡作用之間任何關系，可通過調節nAChR和/或AT2的活性來使細胞的生存最大化。
也期望能進一步地了解在Aβ介導的毒性和受煙堿性受體影響的信號途徑之間的任何關系。例如，進一步闡明這些關系能提供發現用于減輕阿爾茨海默病癥狀的治療組合物。
發明簡述 本發明提供了一種測定能刺激或抑制煙堿受體的物質的方法。本發明也提供了增加通過Janus-活化激酶2(JAK2)磷酸化介導刺激煙堿受體活性的物質的作用。
本發明者已經表明血管緊張素II，類型2(AT2)受體的拮抗劑(或能刺激AT2受體的物質的抑制劑)通過減輕或消除AT2介導的干擾煙堿受體誘導的JAK2磷酸化而增加煙堿樣刺激物質的作用。進一步地，發明者已經證明通過JAK2的磷酸化啟動抗β-淀粉狀蛋白介導的毒性的煙堿性保護作用。提供了用于預防和/或治療的方法和組合物和篩選方法，包括適合于高通量篩選(HTS)的方法。
因此，在一方面，本發明涉及一種篩選物質或能作用于煙堿受體物質的方法。該方法包含用測試化合物接觸具有煙堿受體的細胞；和測定JAK2磷酸化的任何增加或減少。
在另一方面，本發明涉及一種篩選能增加或減少能刺激煙堿受體物質的作用的物質的方法。該方法包含用能刺激煙堿受體的物質接觸具有煙堿受體的細胞；用測試物質接觸該細胞；和相對于在測試物質不存在的條件下當該細胞與能刺激煙堿受體的物質接觸時測量的JAK2磷酸化水平，在存在測試物質的條件下測定JAK2磷酸化的任何增加或減少。
還在另一方面，本發明涉及一種篩選能抑制或刺激AT2受體和/或削弱或增強介導對AT2受體作用的物質的作用的物質的方法。該方法包含用可刺激煙堿受體的物質接觸具有煙堿受體和AT2受體的細胞；用測試物質接觸該細胞；和相對于在測試物質不存在的條件下當該細胞與能刺激煙堿受體的物質接觸時測量的JAK2磷酸化水平，在存在測試物質的條件下測定JAK2磷酸化的任何增加或減少。JAK2磷酸化的增加表示該測試物質抑制AT2受體，削弱了能刺激AT2受體的物質的作用，或增強了能抑制AT2受體的物質的作用。JAK2磷酸化的減少表示該測試物質刺激AT2受體，增強了能刺激AT2受體的物質的作用，或削弱了能抑制AT2受體的物質的作用。
還在另一方面，本發明涉及一種減少含有煙堿受體和AT2受體的細胞的凋亡的方法。該方法包含用能刺激煙堿受體的物質和AT2受體的抑制劑或能刺激AT2受體的物質的抑制劑的任一者或兩者接觸該細胞。
還在另一方面，本發明涉及一種減少含有煙堿受體和AT2受體的細胞的凋亡的方法。該方法包含用能刺激煙堿受體的物質接觸該細胞；和用AT2受體的抑制劑或能刺激AT2受體的物質的抑制劑的任一者或兩者接觸細胞。
還在另一方面，本發明涉及一種用于治療和/或預防患有通過煙堿受體介導的中樞神經系統病癥的患者的方法。該方法包含施用有效量的包括至少一種AT2受體抑制劑或至少一種能刺激AT2受體的物質的抑制劑的任一者或兩者；能刺激煙堿受體的物質；和藥學上可接受的載體的藥物組合物。藥物組合物的量能有效地刺激煙堿受體。
仍在另一方面，本發明涉及一種用于治療和/或預防中樞神經系統病癥施用于患有該病癥的患者的藥物組合物。該藥物組合物包含至少一種AT2受體抑制劑或至少一種能刺激AT2受體的物質的抑制劑的任一者或兩者；能刺激煙堿受體的物質；和藥學上可接受的載體。
本發明也提供了涉及β-淀粉狀蛋白和煙堿樣受體相互作用的方法和組合物。因此，在一方面，本發明涉及一種篩選能作用于通過β-淀粉狀蛋白肽、多肽或蛋白和煙堿樣受體的結合而介導的β-淀粉狀蛋白關聯的神經毒性的物質的方法。該方法包含用β-淀粉狀蛋白多肽接觸具有煙堿受體的細胞和測定Janus活化激酶2(JAK2)磷酸化的水平；和用測試物質接觸該細胞并測定JAK2磷酸化的任何增加或減少。
在另一方面，本發明也涉及一種篩選能減少通過β-淀粉狀蛋白多肽和煙堿受體結合介導的β-淀粉狀蛋白多肽的神經毒性的物質的方法。該方法包含用β-淀粉狀蛋白多肽接觸具有煙堿受體的細胞和測定Janus活化激酶2(JAK2)磷酸化的水平；和用測試物質接觸該細胞并測定JAK2磷酸化的任何增加或減少。任何JAK2磷酸化的增加意味著該測試物質減少β-淀粉狀蛋白肽的神經毒性。
在另一方面，本發明涉及一種防止或減少具有煙堿受體的細胞的凋亡的方法，包含用能增加JAK2磷酸化的物質接觸該細胞。此細胞凋亡與β-淀粉狀蛋白介導的毒性相關。
在另一方面，本發明涉及一種預防和/或治療與阿爾茨海默病有關的神經變性的方法，包含施用治療有效量的可增加JAK2磷酸化的物質。
還在另一方面，本發明涉及一種用于預防和/或治療與與阿爾茨海默病有關的神經變性的組合物，包含治療有效量的可增加JAK2磷酸化的物質。
附圖簡要描述
圖1顯示在PC12細胞中JAK2抑制劑AG-490對煙堿誘導的JAK2和PI-3激酶的酪氨酸磷酸化和Akt的絲氨酸磷酸化的作用。PC12細胞，在存在或不存在10μM的JAK2抑制劑AG-490條件下，預溫育1小時，用煙堿(10μM)刺激不同的時間(0，5，10，30，60和120分鐘)。裂解細胞并用磷酸特異性和磷酸非特異性抗JAK2和抗Akt抗體免疫印跡，或裂解細胞，用抗PI-3激酶抗體免疫沉淀。PI-3激酶免疫沉淀的蛋白接著用抗磷酸酪氨酸和抗PI-3激酶的抗體免疫印跡。結果顯示的是三次實驗的代表值。
圖2顯示Western印跡分析結果，闡明了在PC12細胞中煙堿對由α7受體形成的JAK2復合體的影響。PC12細胞用煙堿(10μM)刺激不同的時間(0，5，10，30和60分鐘)。細胞被裂解，并用抗JAK2的抗體從裂解液(1mg蛋白)中免疫沉淀JAK2。免疫沉淀物接著用抗α7抗體進行免疫印跡。在三次實驗中獲得了相似的結果。
圖3顯示在PC12細胞中用或不用AngII受體拮抗劑預處理的AngII對煙堿誘導的JAK2活化的作用。PC12細胞，在有或無100nM的AT1拮抗劑(candesartan)或100nM的AT2拮抗劑(PD 123177)的100nM的AngII存在或不存在的條件下預溫育8小時，用煙堿(10μM)刺激不同的時間(0，10和30分鐘)。細胞也用磷酸特異性和磷酸非特異性抗JAK2裂解和免疫印跡。結果顯示的是三次實驗的代表值。
圖4是一副表示在PC12細胞中JKA2抑制劑AG-490對抗Aβ-和AngII誘導的細胞死亡的煙堿保護作用的影響的圖。PC12細胞在存在或不存在煙堿和/或AG-490的條件下，用100nM的Aβ(1-42)肽或100nM的AngII處理8小時。PC12細胞培養用在實施例中描述的方法進行，并在分別溫育結束后計數細胞數目。結果代表四個獨立培養物的平均±SEM。Aβ誘導細胞數目明顯的減少(*P＜0.01)，其通過用煙堿共溫育其明顯地被抑制(**P＜0.01)。在另一方面，煙堿在存在AG-490的條件下無作用。AngII也明顯地減少PC12細胞的數目(+P＜0.01)，用煙堿對結果沒有明顯地影響(#P＞0.05)。
圖5是一副表示在PC12細胞中JAK2抑制劑AG-490和煙堿對Aβ(1-42)淀粉狀蛋白誘導的caspase 3的激活的影響的圖。PC12細胞在存在或不存在10μM的煙堿和用AG-490(10μM)共溫育的煙堿的條件下用100nM的Aβ(1-42)溫育0，2，4，8，12和24小時。Caspase3活性用實施例中描述的方法測定。結果代表三個獨立培養物的平均±SEM。在4，8，12和24小時，Aβ誘導的caspase3活性明顯地增加(*P＜0.01)，其被與煙堿共溫育明顯地抑制(**P＜0.01)。在另一方面，煙堿在AG-490存在的條件下無作用。
圖6顯示Western印跡分析結果，闡明了在PC12細胞中JAK2抑制劑(AG-490)對抗Aβ誘導的細胞凋亡的煙堿保護作用的作用。多聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)是細胞在經歷凋亡過程中的標記物。通過Western印跡分析在存在或不存在煙堿和/或AG-490的條件下用Aβ處理8小時的PC12細胞核的提取物來測定PARP的表達。
圖7顯示Western印跡分析結果，闡明了在PC12細胞中JAK2抑制劑(AG-490)對抗Aβ-和AngII-誘導的細胞凋亡的煙堿保護作用的作用。PARP是細胞在經歷凋亡過程中的標記物。通過Western印跡分析在存在或不存在煙堿和/或AG-490的條件下用100nM的Aβ(1-42)肽或100nM的AngII處理8小時的PC12細胞裂解物來測定PARP的表達。
圖8顯示Western印跡分析結果，闡明了α7nAChR和Aβ(1-42)淀粉狀蛋白的共免疫沉淀。制備自用10μM的Aβ(1-42)肽處理5分鐘的PC12細胞的等量的PC12細胞膜蛋白用抗Aβ(1-42)免疫沉淀并用抗α7nAChR進行Western印跡分析。第1行是用Aβ(1-42)肽單獨處理的細胞，和第2行是在存在AG-490(10μM)的條件下用Aβ(1-42)肽處理的細胞。在存在10μM的煙堿和有AG-490或無AG-490的條件下用10μM的Aβ(1-42)肽處理的PC12細胞分別在第3行和第4行中顯示。
圖9顯示Western印跡分析結果，闡明了AG-490對Aβ(1-42)淀粉狀蛋白誘導的JAK2磷酸化的作用。PC12細胞，在存在或不存在10μM的JAK2抑制劑AG-490的條件下預溫育1小時，用100nM(A)或1μM(B)的Aβ(1-42)淀粉狀蛋白肽刺激不同的時間(0，5，10，30，60和120分鐘)。裂解細胞并用磷酸特異性和磷酸非特異性抗JAK2抗體免疫印跡。結果顯示的是三次實驗的代表值。
圖10是煙堿受體介導的生存途徑的示意圖，闡明了該途徑與AT2-和Aβ介導的凋亡途徑的關系。
圖11顯示Western印跡分析，基本同圖1一樣進行，使用化合物TC-1698并顯示在PC12細胞中JAK2、Akt和PI-3激酶的活化，在存在JAK2抑制劑AG-490的條件下激活被抑制。
圖12闡明在PC12細胞中血管緊張素II誘導的SHP-1的磷酸化。
圖13闡明在PC12細胞中SHP-1抑制劑釩酸鹽(vanadate)對血管緊張素II誘導的SHP-1的激活的作用(見，Jiao，H.，等，Mol Cell Biol16(12)6985-92(1996)，在此全文作為參考文獻，用于SHP-1活性單位的定義)。
圖14闡明JAK2抑制劑AG-490和SHP-1抑制劑釩酸鹽對TC-1698誘導的抗Aβ(1-42)和血管緊張素II誘導的細胞凋亡的神經保護作用的作用(PARP是凋亡的標記物-缺乏表明產生神經保護的影響，如上所述及于此所述)。
圖15顯示在存在或不存在SHP-1抑制劑釩酸鹽的條件下，在PC12細胞中TC-1698誘導的JAK2的激活。
發明詳述 本發明提供了用于檢測能刺激或抑制(直接或間接)煙堿受體的物質的篩選方法，包括高通量的方法。這些因子可以針對α7煙堿受體被檢測并鑒定。測量Janus活化激酶2(JAK2)的酪氨酸磷酸化可檢測煙堿受體的激活或抑制。進一步地，提供篩選方法，能檢測和鑒定能刺激或抑制(直接或間接)AT2受體的物質。也提供了減少細胞凋亡和增加能刺激煙堿受體物質的作用的方法 在一些情況中，可期望進行初步或隨后的篩選分析來確定是否測試物質對細胞凋亡途徑(如，AT2或Aβ途徑)能發揮抑制作用，或對存活途徑(如，煙堿途徑)具有刺激效應。例如，單獨的配體可通過使用選擇性激動劑或拮抗劑的競爭性結合方法來測試以排除任一途徑。但是本發明的篩選方法不需要該額外的測定方法，無需進一步的篩選就能完成對測試物質的所需的評估。
本發明也證明了β-淀粉狀蛋白肽和α7煙堿樣乙酰膽堿受體(α7-nAChR)之間的直接相互作用。進一步地，也闡明了nAChR介導的神經保護的分子機制，包括JAK2磷酸化信號級聯。α7-nAChR的煙堿刺激導致磷酸化酪氨酸激酶Janus活化激酶2(JAK2)的水平開始的增加和隨后PI-3激酶和Akt的磷酸化水平的增加。這些作用通過用JAK2特異性抑制劑AG-490預溫育和通過用α-Bgt阻斷。α7-nAChR用磷酸化的JAK2共沉淀且該作用和煙堿對Aβ毒性的神經保護作用可通過AG-490被取消。在缺乏煙堿的條件下，暴露于β-淀粉狀蛋白導致和JAK2解偶聯，誘導產生caspase-3，并誘導產生DNA修復酶多聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)。此級聯用煙堿通過JAK2磷酸化被抑制。這些發現暗示α7-nAChR在產生神經保護的級聯中經JAK2轉導信號到PI3K和Akt。在α7-nAChR和β-淀粉狀蛋白誘導的細胞死亡之間的負反饋調節通過JAK2磷酸化介導。煙堿刺激的JAK2和它的神經保護作用通過激活AT2受體可被阻止。因此，本發明人已經確定關于神經生存能力的受體相互作用的新機制。該機制為盡可能地保護神經提供了新的治療策略。
本發明的方法和組合物可選擇性地針對α7nAChR。本發明這方面能提供用于選擇性增強α7介導的活性，因此可達到本文中所述的有益作用且副作用發生率低，如，那些通過非α7受體亞型介導的副作用。為了達到本發明此方面的有益效果，結合α7受體的選擇性比其它受體亞型高大約10到大約100倍。進一步地，對于α7-nAChR的選擇性能高大約100到大約1000倍。作為公認的，選擇性也能通過評估功能的激活或抑制被確定，如，依本發明通過測量JAK2磷酸化來確定。
也提供了預防和/或治療中樞神經系統病癥的方法，在該方法中使用的藥物組合物。
本文中所用的如下術語具有的含義表示為 “激動劑”是一種能刺激其結合配偶體，特別是受體的物質。刺激在上下文的特殊方法中定義的，或是在文獻中顯而易見的，通過與被本領域技術人員公認的特殊結合配偶體的“激動劑”或“部分激動劑”的因子或物質作比較的討論中得到。刺激也可被定義為通過激動劑或部分激動劑與結合配偶體的相互作用所誘導的在特定作用或功能中的增加，且能包括變構作用。
“拮抗劑”是一種能抑制其結合配偶體，特別是受體的物質。抑制在上下文的特殊方法中定義，或在文獻中顯而易見的，通過與被本領域技術人員公認的特殊結合配偶體的“拮抗劑”的因子或物質作比較的討論中得到的。抑制也可被定義為通過拮抗劑與結合配偶體的相互作用所誘導的在特定作用或功能中的減少，且能包括變構作用。
在這里，術語Aβ、Aβ肽、β-淀粉狀蛋白、淀粉狀蛋白β和淀粉狀蛋白指與阿爾茨海默病的淀粉狀蛋白特性有關的任何種類的肽、多肽或蛋白。術語“Aβ(1-42)”指42個氨基酸的β-淀粉狀蛋白，但也包括能結合煙堿受體或介導通過煙堿受體的作用的其片段。
術語“α7 nAChR”指被報道在動物和人類中與認知和神經保護相關的同五聚(homopentamieric)的煙堿性乙酰膽堿受體。在人腦中也廣泛表達的異五聚α4β2也具有這些作用(見Bencheri，M.和J.D.Schmitt，Current Drug Targets第1卷，第4期，2002年8月；pp349-357的評論-也見整期，其專門討論煙堿受體的分布和作用(如α4β2和α7))。因此，術語“nACnR”和“煙堿受體”在這里包括包含這些亞基的此類受體。
在這里所用的“PC12”指大鼠腎上腺嗜鉻腫瘤細胞系PC12。該細胞系，最初由Greene和Tischler建立(Greene，L.A.和A.S.Tischler，Establishment of a noradrenergic clonal line of rat adrenalpheochromocytoma cells which respond to nerve growth factor.ProcNatl Acad Sci USA，73 (7)2424-8(1976))，其已被經常地用于研究神經元乙酰膽堿受體，包括α7 nAChR(見，如Patrick，J.和W.B.Stailcup，Immunological distinction between acetylcholine receptorand the alpha-bungarotoxin-binding component on sympatheticneurons.Proc Natl Acad Sci USA.，74(10)4689-92(1977)；Whiting，等，Functional acetylcholine receptor inPC12 cells.Nature 327515-518(1987)；Cooper，S.T.和N.S.Millar，Host cell-specificfolding and assembly of the neuronal nicotinic acetylcholine receptoralpha7 subunit.J.Neurochem.68(5)2140-51(1997)，所有的全文在此引用作為參考)。血管緊張素受體亞型II(AT2)也已在PC12細胞中表達(見，如Wolf，G.等，Angiotensin II′s antiproliferative effectsmediated through AT2-receptors depend on down-regulation of SM-20.Lab Invest.82(10)1305-17(2002)；和Lehtonen，J.Y.等，Analysisof functional domains of angiotensin II type 2 receptor involved inapoptosis.MolEndocrinol.13(7)1051-60(1999)，所有的全文在此引用作為參考)。該PC12細胞系眾所周知且已被保藏，如，具有美國典型培養物收集中心保藏號ATCCCRL-1721。
現有編碼nAChRs的多種核酸序列，包括編碼α7的核酸序列(見，如，Chini，B.等，Molecular cloning and chromosomal localization ofthe human alpha7-nicotinic receptor subunit gene(CHRNA7)，Genomics 19(2)379-381(1994)；登錄號NM_000746，版本NM_000746.2 GI21536283，所有的全文在此引用作為參考)。
也已知編碼AT2受體的核酸序列，和關于表達克隆的指南在文獻中可得到(見，如，Mukoyama，M.等，Expression cloning of type 2angiotensin II receptor reveals a unique class of seven-transmembranereceptors.J Biol Chem.268(33)24539-42(1993)；Nakajima，M.等，Cloning of cDNA and analysis of the gene for mouse angiotensin IItype 2 receptor.Biochem Biophys Res Commun.197(2)393-9(1993)；和Nakajima，M.等，The angiotensinII type 2(AT2)receptorantagonizes the growth effects of the AT1 receptorgain-of-functionstudy using gene transfer.Proc Natl Acad Sci USA.92(23)10663-7(1995)；Homo sapiens angiotensin receptor 2(AGTR2)，mRNA，登錄號XM_030897，版本XM_030897.2 GI22058388，所有的全文在此引用作為參考)。
當然，其它適合于本發明方法的細胞系存在并可被制備。例如，人成神經細胞瘤細胞系SH-SY5Y也是“α7容許的”并可用于根據本發明的α7特異性方法(見，如，Cooper，S.T.和N.S.Millar，JNeurochem.68(5)2140-51(1997))。基于對nAChR亞型的評價，其它的細胞系可以是適用的。
除非另有指定，本發明的實施將使用本領域技術人員所熟悉的常規分子生物學、微生物學、細胞生物學和重組DNA的技術。見，如，Sambrook，Fritsch，和Maniatis，MOLECULAR CLONINGALABORATORY MANUAL，2nd edition(1989)；CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，(F.M.Ausubel等編，1987)；the series METHODS IN ENZYMOLOGY(Academic Press，INC.)，PCR 2A PRACTICAL APPROACH(M.J.McPherson，B.D.Hames和(G.R.Taylor編，1995)；ANIMAL CELL CULTURE(R.I.Freshney編，1987)；ANTIBODIESA LABORATORY MANUAL(Harlow等編，1987)，所有的全文在此引用作為參考。
因此，在一方面，本發明涉及一種通過用測試物質接觸具有煙堿受體的細胞；和測定Janus活化激酶2(JAK2)磷酸化的任何增加或減少來篩選能作用煙堿受體的物質的方法。JAK2磷酸化的增加表示此測試物質刺激了煙堿受體，和JAK2磷酸化的減少表示此測試物質抑制了煙堿受體。
此測試物質可以是測試物質文庫中的一員，且該文庫可是組合化學文庫、肽、多肽、非肽肽模擬物、抗體或小分子有機化合物文庫。該文庫也可以是化合物的隨機組合。該測試物質可通過高通量篩選被篩選。
在另一方面，本發明涉及一種篩選能增加或減少能刺激煙堿受體的物質的作用的物質的方法，通過用能刺激煙堿受體的物質來接觸具有煙堿受體的細胞；用測試物質來接觸該細胞；和相對于在不存在測試物質的條件下當細胞與能刺激煙堿受體的物質接觸時測量的JAK2磷酸化水平，在存在測試物質的條件下測定JAK2磷酸化的任何增加或減少。JAK2磷酸化增加表示該測試物質增加了能刺激煙堿受體的物質對煙堿受體的作用；和JAK2磷酸化減少表示該測試物質減少了可刺激煙堿受體的物質對煙堿受體的作用。
在另一方面，本發明涉及一種篩選能抑制或刺激AT2受體的物質的方法，通過用能刺激煙堿受體的物質和具有煙堿受體和AT2受體的細胞接觸；用測試物質接觸該細胞；和相對于在不存在該測試物質的條件下當細胞與能刺激煙堿受體的物質接觸時測量的JAK2磷酸化水平，在存在測試物質條件下測定JAK2磷酸化的任何增加或減少。JAK2磷酸化增加表示該測試物質抑制AT2受體；和JAK2磷酸化減少表示該測試物質刺激AT2受體。在不存在AT2受體的條件下測試物質對煙堿受體的任何作用被預先測定，相對于相關該作用的任何JAK2磷酸化的JAK2磷酸化的任何增加或減少被測定。此測試物質可以是測試物質文庫的一員，且該文庫可是組合化學文庫、肽、多肽、非肽性肽模擬物(peptidominetic)、抗體或小分子有機化合物文庫。該文庫也可以是化合物的隨機組合。該測試物質通過高通量篩選被篩選。
在另一方面，本發明涉及一種篩選可削弱或增強能刺激AT2受體的物質的作用的物質的方法，通過用能激煙堿受體和能激AT2受體的物質接觸具有煙堿受體和AT2受體的細胞；用測試物質接觸該細胞；和相對于在不存在測試物質的條件下當細胞和能刺激煙堿受體的物質及能刺激AT2受體的物質接觸時測量的JAK2磷酸化水平，在存在測試物質的條件下測定JAK2磷酸化的任何增加或減少。JAK2磷酸化增加表示該測試物質削弱了能刺激AT2受體的物質的作用，或增強了能抑制AT2受體的物質的作用；和JAK2磷酸化減少表示該測試物質增強了能刺激AT2受體的物質的作用，或削弱了能抑制AT2受體的物質的作用。
在另一方面，本發明涉及一種篩選對通過煙堿樣受體介導的β淀粉狀蛋白關聯的神經毒性具有作用的物質的方法，通過用β淀粉狀蛋白肽接觸含有煙堿受體的細胞并測定Janus活化激酶2(JAK2)磷酸化水平；和用測試物質接觸該細胞并測定JAK2磷酸化的任何增加或減少。JAK2磷酸化的增加表示該測試物質是一種能進一步用于評估作為能減少β淀粉狀蛋白關聯的神經毒性的物質的一種候選物質。
在另一方面，本發明涉及一種篩選能減少通過煙堿性受體介導的β淀粉狀蛋白肽的神經毒性的物質的方法，通過用β淀粉狀蛋白肽和含有煙堿受體的細胞接觸并測定Janus活化激酶2(JAK2)磷酸化水平；和用測試物質接觸該細胞并測定JAK2磷酸化的任何增加或減少。JAK2磷酸化的任何增加表示該測試物質減少β淀粉狀蛋白肽的神經毒性。
在另一方面，本發明涉及一種在包含有煙堿受體和AT2受體的細胞中增加能刺激煙堿受體的物質的作用的方法，通過用能刺激煙堿受體的物質接觸該細胞；和用選自AT2受體抑制劑和能刺激AT2受體的物質的抑制劑的物質接觸該細胞。
在另一方面，本發明涉及一種在包含有煙堿受體和AT2受體的細胞中減少細胞凋亡的方法，通過用能刺激煙堿受體的物質接觸該細胞；和用選自AT2受體的抑制劑和能刺激AT2受體的物質的抑制劑的物質和該細胞接觸。增加的細胞存活表示凋亡的減少。減少的凋亡也能通過多聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)活性的減少、caspase3活性的減少，或Bcl2的誘導結果來表示。
在另一方面，本發明涉及一種用于患有通過煙堿受體介導的中樞神經系統病癥的患者的治療或預防的方法，通過施用一定量的包含有能刺激煙堿受體的物質；至少一種AT2受體抑制劑或至少一種可刺激AT2受體的物質的抑制劑的任一者或兩者；和藥學上可接受的載體的藥物組合物。藥物組合物的用量能有效地刺激此受體。
在另一方面，本發明涉及一種治療與阿爾茨海默病相關的神經變性的方法，通過施用治療有效量的可增加JAK2酪氨酸磷酸化的物質。
在另一方面，本發明涉及一種治療或預防與阿爾茨海默病相關的神經變性的方法，通過施用一定量的包含能刺激煙堿受體的物質；至少一種AT2受體抑制劑或至少一種可刺激AT2受體的物質的抑制劑的任一者或兩者；和藥學上可接受的載體的藥物組合物。藥物組合物的用量能有效地刺激此受體。
在另一方面，本發明涉及一種用于治療或預防中樞神經系統病癥施用于患有該病癥的患者的藥物組合物，包含能刺激煙堿受體的物質；和至少一種AT2受體抑制劑或至少一種可刺激AT2受體的物質的抑制劑的任一者或兩者；和藥學上可接受的載體。該能刺激煙堿受體的物質可以是膽堿能配體、煙堿性激動劑或乙酰膽堿酯酶抑制劑。此可刺激煙堿受體的物質也對α7-nAChR是選擇性的。此對α7-nAChR選擇性的選擇性物質能是取代的奎寧環化合物。此物質也能用選自下列的I、II和III式表示
能抑制AT2受體或抑制能刺激AT2受體的物質的物質可以是一種能抑制能刺激AT2的物質的物質，包括，例如，血管緊張素II轉換酶(ACE)抑制劑。
在另一方面，本發明涉及一種用于治療或預防神經變性病癥施用于患有該病癥的患者的藥物組合物，包含能刺激煙堿受體的物質；和至少一種AT2受體抑制劑或至少一種可刺激AT2受體的物質的抑制劑的任一者或兩者；和藥學上可接受的載體。該能刺激煙堿受體的物質可以是膽堿能配體、煙堿性激動劑或乙酰膽堿酯酶抑制劑。能刺激煙堿受體的物質對α7-nAChR是選擇性的。對α7-nAChR是選擇性的物質可以是取代的奎寧環化合物。刺激煙堿受體的物質能用選自下列的I、II和III式表示
能抑制AT2受體或抑制能刺激AT2受體的物質的物質可以是一種抑制能刺激AT2的物質的物質，例如，血管緊張素II轉換酶(ACE)抑制劑。抑制AT2受體或抑制能刺激AT2受體的物質的物質是一種能刺激AT2的物質。該刺激AT2的物質可以是PD123177和/或PD123319。
神經元信號中的煙堿和JAK/STAT途徑 在PC12細胞中煙堿激活生長啟動酶Janus活化激酶2(JAK2)。這些細胞和JAK2特異性抑制劑AG490預溫育(見Kumano，K.，A.等，Biochem.Biophys.Res.Commun.270209-214(2000))阻斷了PI3K和Akt的煙堿誘導活化(圖1)。此外，在JAK2和α7受體之間煙堿也誘導形成復合物(圖2)。這些結果為在PC12細胞中JAK2和煙堿誘導的PI3K級聯活化之間聯系提供了直接的證據。
JAK2抑制劑AG490對PC12細胞中煙堿誘導的JAK2和PI-3激酶酪氨酸磷酸化和Akt的絲氨酸磷酸化的作用 在響應煙堿的5到10分鐘內JAK2酪氨酸磷酸化且該激活甚至在暴露于煙堿后的更長時間(120分鐘)內，仍保持在超過基底的水平上(圖1)。JAK2抑制劑AG-490抑制該基底水平和煙堿刺激的JAK2酪氨酸磷酸化、PI-3K酪氨酸磷酸化和Akt絲氨酸磷酸化(圖1)。相似的結果在人細胞系SH-SY5Y中也觀察到了。這些結果暗示通過煙堿的JAK2的激活在PI-3K和其效應物Akt的激活之前。JAK2激活能被α銀環蛇毒素預溫育完全阻止，證明了受體介導作用(圖3)。
煙堿對與α7受體形成的JAK2復合物的作用 為檢驗JAK2直接和α7-nAChR相互作用的假設，用兔多克隆抗JAK2抗體來進行免疫沉淀研究。培養的PC12細胞用煙堿(10μM)刺激不同時間，裂解，且JAK2用抗JAK2抗體來免疫沉淀。免疫沉淀的蛋白通過凝膠電泳被分離，轉移到硝酸纖維素膜上，并用抗α7的抗體進行免疫印跡。如圖2中所示，在5分鐘內煙堿誘導了JAK2和α7受體的快速結合。α7受體結合JAK2的時間過程類似于煙堿誘導的JAK2的激活(圖1)。當該實驗用抗α7受體的抗體來免疫沉淀此受體并用抗JAK2的抗體進行Western印跡的標記時，也獲得了同樣的結果。
用或不用AngII受體拮抗劑預處理的AngII對煙堿誘導的JAK2的激活的作用 AngII發揮其生物學功能通過激活兩種不同的受體，它們已知為AT1和AT2受體，都屬于G蛋白偶聯受體家族(Horiuchi，M.，W.等，Circ.Res.84876-882(1999))。不但在培養的細胞和其它PC12細胞中，也同樣在體內該AT1受體刺激增殖，而AT2受體發揮生長抑制作用(Gallinat，S.，S.等.，FEBS Lett.44375-79(1999))。此外，還報道在來自阿爾茨海默病患者的顳葉(temporal)皮層中血管緊張素轉化酶的密度增加了(Barnes，N.M.等，Eur.J.Pharmacol.200289-292(1991))。與血管緊張素II(AngII)預溫育的PC12細胞通過AT2受體阻斷煙堿誘導的JAK2的激活(圖3)。
與AngII預溫育的PC12細胞通過AT2受體阻斷了煙堿誘導的JAK2酪氨酸磷酸化(圖3)。該抑制通過用AT2拮抗劑(100nM的PD123177)預溫育可被完全地阻止，但不被AT1拮抗劑(100nM的candesartan)阻止，與在PC12細胞中表達的受體表現型一致。煙堿誘導的JAK2磷酸化的抑制伴有煙堿誘導的神經保護的完全逆轉，通過細胞生存和通過煙堿非敏感的PARP誘導來表示。
α7-nAChR和Aβ(1-42)淀粉狀蛋白的共免疫沉淀和JAK2磷酸化 近來的研究已經表明Aβ(1-42)高親和力與α7-nAChR結合，且該相互作用能被α7-nAChR的拮抗劑抑制。該研究導致本發明證實了在用Aβ(1-42)(10μM，5分鐘)處理并用抗Aβ(1-42)抗體免疫沉淀的細胞中Aβ(1-42)與α7-nAChR之間的分子結合。用抗α7-nAChR抗體的Western印跡分析鑒定一個與內源的Aβ(1-42)共免疫沉淀與抗α7-nAChR反應的57kDa的蛋白(圖8)。用AG-490預處理的細胞中該作用被阻止(圖8)。然而，當細胞用10μM煙堿共溫育時，Aβ(1-42)和α7-nAChR的復合物形成甚至在存在AG-490的條件下被阻斷(圖8)。雖然不希望與任何特殊的理論束縛，這些結果看來暗示在Aβ(1-42)和α7-nAChR之間的相互作用能通過煙堿不依賴JAK2被抑制。用Aβ(1-42)(0.1μM到1μM)預處理并不能導致JAK2的活化(圖9A和9B)，甚至在十分高的濃度下(如在10μM和100μM下，在圖9A和9B中未顯示)也不行。
煙堿對Aβ(1-42)誘導的細胞凋亡的作用和JAK2的作用Caspase 3在PC12細胞中表達，且已知與細胞凋亡有關。在Aβ(1-42)誘導的細胞凋亡后測定Caspase 3活性。熒光肽底物Ac-DEVD-7AMC被用于測量在細胞裂解物中的caspase 3類似的(caspase 3-like)活性。在圖5中所示，導致分解肽底物Ac-DEVD-7AMC的caspase 3活性在4小時的Aβ(1-42)處理后是明顯的且隨著時間的過去一直增加，直到處理8小時后達到頂峰。Aβ(1-42)誘導的caspase 3的活化通過煙堿被阻斷(P＜0.01)，而該抑制通過AG-490被阻止(圖5)。
在Aβ(1-42)處理后caspase 3的激活通過用Western印跡方法測量DNA修復酶多聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)的裂解進一步地被研究。PARP是caspase 3的內源性底物，在不同形式的細胞凋亡中其被裂解為典型的85kDa片段。如圖7所示，在Aβ(1-42)處理后PARP(116 KDa)被裂解成其85kDa片段。此PARP裂解進一步地表明在Aβ(1-42)誘導的細胞死亡中caspase 3或caspase 3類似蛋白酶被激活。
測試在存在或不存在Aβ(1-42)的條件下，在煙堿誘導的細胞保護中JAK2所涉及的情況。在存在或不存在煙堿和AG-490的條件下，在Aβ(1-42)和AngII處理后用COULTTER計數器(ZM型，Coulter，Hialeah，F1)測量PC12細胞數目的減少。如圖4所示，通過Aβ(1-42)處理誘導的細胞死亡在存在煙堿的條件下明顯地減少(P＜0.01)。當與AG-490共溫育時，煙堿對Aβ(1-42)誘導的細胞死亡沒有影響(圖4)。這些結果證明了JAK2在煙堿誘導的抗Aβ(1-42)誘導的細胞死亡的神經保護中起作用。相反地，AngII誘導的細胞凋亡不受煙堿的影響(圖4)。
α7-nAChR/JAK2神經保護級聯 在α7-nAChR和酪氨酸磷酸化酶JAK2之間的直接關聯產生隨即而來的PI-3-K、Akt和Bcl-2誘導的激活。當Aβ(1-42)與α7-nAChR相互作用時，該復合物的形成和下游的神經保護級聯被阻止。通過前凋亡事件包括caspase 3誘導、PARP誘導和細胞生存的減少被證實。然而，通過JAK2激活與α7-nAChR相互作用的煙堿對Aβ(1-42)的毒性是有“統治優勢”的，通過AT2受體激活煙堿神經保護作用能被中和，可通過JAK2的磷酸化被逆轉以煙堿誘導的神經保護作用的抑制來證明。
煙堿性神經傳遞在AD患者的腦中受到損害且在β-淀粉狀蛋白的沉淀腦區中而選擇性失去nAChR的主要作用(Court，J.，等，Biol.Psychiatry 49175-184(2001))。在包括由β-淀粉狀蛋白毒性產生的神經元死亡的許多的細胞和動物模型中，大量的證據表明神經元煙堿性受體(NNR)-選擇性配體也能提供神經保護作用。通過近來的發現證實了在β-淀粉狀蛋白肽和α7-nAChR之間的直接相互作用。β-淀粉狀蛋白肽高親和力與α7-nAChR相互作用，并導致在海馬神經元中α7-nAChR的功能性非競爭阻斷(Wang，H.Y.等，J.Biol.Chem.2755626-5632(2000)；Liu，Q.等，Proc Natl Acad Sci USA 98(8)4734-9(2001))。在克隆細胞中煙堿介導的神經保護機制與PI3P激酶的磷酸化有關，該酶涉及磷酸肌醇新陳代謝及與細胞的生存和凋亡相關。在許多研究中已經報道了經JAK2的抗凋亡信號轉導。在造血細胞中，JAK2的激酶功能區介導Bcl-2的誘導并抑制細胞死亡(Sakai，1.和A.S.Kraft，J.Biol.Chem.27212350-12358(1997))。用JAK2抑制劑AG-490處理減少PI-3-K的磷酸化(Kumano，K.等，Biochem.Biophys.Res.Commun.270209-214(2000))和STAT3的磷酸化，其導致在急性心肌梗塞中caspase-3活性和Bax蛋白的增加(Negoro，S.等，Cardiovasc.Res.47797-805(2000))。神經元EPO受體(EPORs)激活阻止了通過在JAK2信號途徑和核因子-kappaB(NF-kappaB)之間觸發通訊(crosstalk)由NMDA(N-甲基-D-天冬氨酸)或NO誘導的細胞凋亡(Digicaylioglu，M.和S.A.Lipton.Nature 412641-647(2001))。
本發明已表明α7-nAChR激活誘導JAK2磷酸化且此最初事件伴隨PI-3激酶的磷酸化和Akt的磷酸化，如AG-490對上述兩種蛋白的磷酸化的抑制作用所示。在存在煙堿條件下JAK2磷酸化可被α-銀環蛇毒素(α7-nAChR的一種拮抗劑)所完全抑制。煙堿刺激的α7-nAChR導致在α7受體蛋白和酪氨酸磷酸化的JAK2之間形成一種復合物。
因為基于配體結合和功能的研究，已報道在α7-nAChR和Aβ(1-42)之間的相互作用，β-淀粉狀蛋白也能誘導α7-nAChR/JAK2復合物的可能性被測試。證實了β-淀粉狀蛋白和α7-nAChR的關聯，但顯示結合沒有引起可檢測水平的酪氨酸磷酸化JAK2。在存在煙堿的條件下，在細胞裂解物中Aβ免疫反應性沒有被檢測到，表明煙堿已經從α7-nAChR “置換”了Aβ。該作用不依賴于JAK2的磷酸化，通過在存在AG-490的條件下該作用缺少任何逆轉作用所證明。
煙堿抑制Aβ毒性的機制是不清楚的。本發明闡明了JAK2酪氨酸磷酸化在細胞生存和前細胞凋亡途徑的抑制中涉及的的關鍵細胞酶的α7-nAChR激活過程中的重要作用。煙堿抑制β-淀粉狀蛋白細胞毒性且該作用能被JAK2酪氨酸磷酸化的抑制所完全阻止。這些作用能通過細胞毒性的標記(如PARP)、前細胞凋亡酶的誘導(如，caspase 3)、細胞數目或Bcl2的誘導的測定來證明。
AT2受體在PC12細胞中表達并已表明可抑制JAK/STAT信號級聯(Kunioku，H.等，Neurosci.Lett.30913-16(2001))。相對于煙堿誘導的抗Aβ(1-42)的神經保護，用AngII預處理的細胞阻斷了經AT2受體煙堿誘導的JAK2的活化，并完全阻止了α7-nAChR介導的神經保護作用，進一步地證實JAK2磷酸化的關鍵作用。本發明闡明了α7-nAChR和AT2受體活性(激活后者抑制了前者的潛在作用)對于細胞生存的對立的作用。這些結果和磷酸化的JAK2的這些途徑集中表明了α7-nAChR介導的抗Aβ(1-42)的神經保護的恢復在AT2介導的JAK2磷酸化的抑制被最小化的條件下可被最優化。這些發現證明了新的分子機制，其與AT2和β-淀粉狀蛋白對在阿爾茨海默病患者的腦中觀察到的病理生理學的作用完全一致。
高通量篩選(HTS) 本發明的篩選方法可容易地適用于推動高通量分析。酪氨酸磷酸化狀態的評估提供了關于能刺激或抑制煙堿受體如α7受體、或能刺激或抑制AT2受體的候選物質的信息。
物質(化合物)可存在于組合的或其他化合物文庫中，例如，先導產生(lead generation)和/或先導最優化(lead optimization)文庫。對于本發明的目的而言，先導產生文庫是含有潛在的先導化合物的比較大的文庫，先導最優化文庫是圍繞著通過分析先導產生文庫而被鑒定為潛在的先導化合物的化合物而產生的。這些文庫典型地包括大量的化合物，包括至少兩個化合物，和可包括超過好幾萬個化合物。
潛在的活性化合物的邏輯排列集合能用在此所述的高通量生物鑒定法測定，如結構，活性關系(SARs)能被獲得。用于排列測定化合物的邏輯排列的方法為本領域的技術人員所熟知，并在例如，Zambias等的美國專利5,962,736中描述，其內容在此全文引入作為參考。在一個實施方案中，化合物被加到“陣列”形式的多孔滴定板上，在此其定義為Cartesian coordinates邏輯位置排序的化合物，該陣列包括具有類似核心結構和不同的取代基的化合物。關于HTS分析方法的額外指南見Brooker的美國專利6,468,736；和Wu的美國申請公開號2002/0039749A1。
通過在多管陣列或多孔板中以邏輯陣列的方式放置化合物，可評估單個化合物的作用，并與結構類似的化合物作比較以產生SAR數據。
在一個實施方案中，化合物的特性和活性被儲存在相關的數據庫中。通過評估SAR數據，可鑒定出先導化合物，并設計出最優化的先導文庫。可用一種自動生成完全相關結構信息的方法來評價邏輯排列的陣列，這樣一個陽性結果可提供(1)在多孔平板上的任何給定空間地址的化合物的信息和(2)在存在陽性結果的條件下，從陰結果中提取相關結構信息的能力。
在本發明的分析中任何化學化合物都能被用作為測試物質(化合物)。該分析可被設計通過自動化該分析的步驟和為分析提供來自任何方便來源的化合物以篩選大的化學文庫，其可典型地平行運行(如，在自動分析中在微量滴定板上以微滴的形式)。有許多的化學化合物的供應商，包括Sigma(St.Louis，Mo)、Aldrich(St.Louis，Mo)、Sigma-Aldrich(St.Louis，Mo)、Fluke Chemika-BiochemicaAnalytika(Buchs，瑞士)等。
在一個實施方案中，高通量篩選方法包括提供含有大量測試物質的組合文庫，接著該“組合化學文庫”在一種或多種分析中被篩選，如在此所述的，來鑒定那些顯示期望的特征活性的文庫成員(特殊的化學物質或亞類)。這樣鑒定的化合物可作為常規的“先導化合物”或它們本身能被用作為潛在的或實際的治療劑。
組合化學文庫是一個不同的化學化合物的集合，所述化合物通過組合許多的化學“結構單元”如反應物，通過化學合成或生物合成產生的。例如，線性組合的化學文庫如多肽文庫對于給定的化合物長度(即在多肽化合物中氨基酸的數目)通過結合一組化學結構單元(氨基酸)以任何可能的方式來形成。通過此化學結構單元的組合混合能合成成百萬的化學化合物。
制備和篩選組合化學文庫對于本領域的技術人員而言是眾所周知的。這樣的組合化學文庫包括，但不限于，肽文庫(見，如美國專利5,010,175，Fluka，int.J.Pept.Prot.Res.37487-493(1991)和Houghton等，Nature 35484-88(1991))。其它用于產生化學多樣性文庫的化學物質也可被利用。這樣的化學物質包括，但不限于肽(peptoids)(PCT公開號WO 91/19735)、編碼肽(PCT公開號WO 93/20242)、隨機生物寡聚體(random bio-oligomers)(PCT公開號WO 92/00091)、苯并二氮雜(美國專利號5,288,514)、diversomers如乙內酰脲、苯并二氮雜 和二肽(Hobbs等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 906909-6913(1993))、聯乙烯多肽(vinylogous polypeptide)(Hagihara等，J.Amer.Chem.Soc.1146568(1992))、具有β-D-葡萄糖骨架的非肽肽模擬物(nonpeptidal peptidomimetics)(Hirschmann等，J.Amer.Chem.Soc.1149217-9218(1992))、類似有機合成的小化合物文庫(Chen，等，J.Amer.Chem.Soc.1162661(1994))、寡聚氨基甲酸酯(Cho等，Science 2611303(1993))、和/或肽基膦酸鹽(Campbell等，J.Org.Chem.59658(1994))、核酸文庫(見，Ausubel，Berger和Sambrook，如上)、肽核酸文庫(見美國專利號5,539,083)、抗體文庫(見，如Vaughn等，Nature Biotechnology，14(3)309-314(1996)和PCT/US96/10287)、碳水化合物文庫(見，如Liang等，Science，2741520-1522(1996)和美國專利號5,593,853)、有機小分子文庫(見，如苯并二氮雜，Baum C & EN，Jan 18，page 33(1993)；類異戊二烯，美國專利號5,569,588；噻唑烷并酮(thiazolidinones)和metathiazanones，美國專利號5,549,974；吡咯烷(pyrrolidines)，美國專利號5,525,735和5,519,134；嗎啉代化合物(morpholinocompounds)，美國專利號.5,506,337；苯并二氮雜，美國專利號.5,288,514，等)。
用于制備組合文庫的設備是商品化的(見如，357 MPS，390 MPS，Advanced Chem Tech，Louisville Ky.，Symphony，Rainin，Wobum，Mass.，433A Applied Biosystems，Foster City，Calif.，9050 Plus，Millipore，Bedford，Mass.)。此外，無數的組合文庫本身是商品化的(見如，ComGenex，Princeton，N.J.，Asinex，Moscow，Ru，Tripos，Inc.，St.Louis，Mo.，ChemStar，Ltd，Moscow，RU，3D Pharmaceuticals，Exton，Pa.，Martek Biosciences，Columbia，Md.，等)。
值得注意的是，本發明提供了影響煙堿受體活性的測試物質的體外分析方法，其通過以高通量形式檢測JAK2酪氨酸磷酸化。由于這些分析方法是高度一致的，不包括任何測試物質的反應中測量JAK2磷酸化水平的對照反應是任選的。這樣任選的對照反應是適當的并可增加該分析方法的可靠性。因此，在一個實施方案中，本發明的方法包括這樣一個對照反應。對于所述的每一個分析方法，不包括測試物質的對照反應能提供JAK2磷酸化的背景水平的測試物質。
在一些分析方法中，期望使用陽性對照來確保分析方法的組分工作正常。至少兩種類型的陽性對照是適合的。首先，一種已知的可增加JKA2磷酸化的nAChR刺激物可與該方法中的一種樣品溫育，且信號產生的增加通過本發明中的方法能被測定。其次，可加入一種已知的nAChR抑制劑，產生的活性減少被類似地檢測。應當理解測試物質也能與刺激物質或抑制劑組合以發現抑制激活或通過存在已知的刺激物質或抑制劑導致的抑制的測試物質。因為由刺激nCAhR產生的JAK2磷酸化的水平在此證明被能刺激AT2受體的物質減少，應當理解用于測試通過AT2受體介導作用的物質的同樣的方法可被安排來測試物質通過AT2介導的作用，或間接地，通過他們本身是AT2活性的調節劑的物質的作用(如，ACE抑制劑的作用，阻止形成AngII)。
在本發明的高通量分析方法中，在一天內可篩選多達幾千種不同的測試物質。特別地，可用微量滴定板的每一個孔來對一個被選擇的測試物質運行一個獨立的分析，或如果要觀察聚集或誘導時間的作用，每5-10個孔能測試一個單獨的測試物質。因此，一塊單獨的標準的微量滴定板能分析大約100(96)個物質。如果使用1536孔板，那么一塊單獨的板能容易地分析大約100到1500個不同的化合物。每天可能分析許多不同的板；用本發明的完整的系統可能分析篩選多達大約6,000～20,000個，甚至多達大約100,000～1,000,000個不同的化合物。
動物模型測試 就本發明的針對治療和/或預防神經變性病癥的組合物和方法而論，基于1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)誘導作用的動物模型是相關的(Behmand，R.A.和S.I.Harik.Nicotineenhances 1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine neurotoxicity.J.Neurochem.，58776-9(1992)；Ferger，B.等，Effects of nicotine onhydroxyl free radical formation in vitro and on MPTP-inducedneurotoxicity in vivo.Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol，358351-9(1998)；Fung，Y.K.等，Chronic administration of nicotine failsto alter the MPTP-induced neurotoxicity in mice.Gen Pharmacol22(4)669-72(1991)；Maggio，R.等，Nicotine prevents experimentalparkinsonism in rodents and induces striatal increase of neurotrophicfactors.J Neurochem，712439-46(1998)；和Parain，K等，Nicotine，but not cotinine，partially protects dopaminergic neurons againstMPTP-induced degeneration in mice.Brain Res.890347-350(2001)，所有的全文在此一并引用作為參考)。
基于MPTP-誘導作用的模型包括慢性半帕金森氏病的猴(chronichemi-Parkinsonian monkeys)(Domino，E.F.等，Nicotine alone and incombination with L-DOPA methyl ester or the D(2)agonist N-0923 inMPTP-induced chronic hemiparkinsonian monkeys.Exp Neurol，158414-21(1999)，全文在此引入作為參考)，在小鼠中黑質紋狀體多巴胺神經元變性(Janson，A.M.等，Differential effects of acute andchronic nicotine treatment on MPTP-(l-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine)induced degeneration of nigrostriatal dopamineneurons inthe black mouse Clin Investig，70232-8(1992)，在此全文引入作為參考)，在MPTP-處理的動物中認知功能評估(Schneider，J.S.等，Nicotinic acetylcholine receptor agonist SIB-1508Y improvescognitive functioning in chronic low-dose MPTP-treated monkeys.JPharmacol Exp Ther，290731-9(1999)，在此全文作為參考)，和測量1-甲基-4-苯基吡啶(MPP+)的紋狀體(striatal)水平(Quik，M.和D.A.Di Monte，Nicotine administration reduces striatal MPP+levels inmice.Brain Res，917219-24(2001)，在此全文作為參考)。
其它相關的動物模型包括紅藻氨酸誘導的效應(Borlongan，C.V.等，(-)-nicotine protects against systemic kainic acid-inducedexcitotoxic effects.Exp Neurol，136261-5(1995)，在此全文作為參考)，大鼠中6-羥多巴胺(6-OHDA)損害(Costa，G.等，Nicotineprevents striatal dopamine loss produced by 6-hydroxydopaminelesion in the substantia nigra.Brain Res，888336-342(2001)；Ryan，R.E.等，Dose-related neuroprotective effects of chronic nicotine in6-hydroxydopamine treated rats，and loss of neuroprotection in α4nicotinic receptor subunit knockout mice.Br J Pharmacol.1321650-6(2001)；和Soto-Otero，R.等，Effects of(-)-nicotine and(-)-cotinine on 6-hydroxydopamine-induced oxidative stress andneurotoxicityrelevance for Parkinson′s disease.BiochemPharmacol，64(1)125-35(2002)，在此全文作為參考)；喹啉酸誘導的海馬神經變性(O’Neill，A.B.等，Histological and behavioral protection by(-)-nicotine against quinolinic acid-induced neurodegeneration in thehippocampus.Neurobiol Learn Mem，6946-64(1998)，在此全文作為參考文獻)；新生興奮性中毒腦損傷的鼠模型(Laudenbach，V.等，Selective activation of central subtypes of nicotinic acetylcholinereceptor has opposite effects on neonatal excitotoxic brain injuries.FASEB J.16423-425(2002)，在此全文作為參考)；和利血平-誘導的紋狀體多巴胺缺乏(Oishi，R.等，Possible explanations for theantagonism by nicotine against reserpine-induced depletion ofmonoamines in mouse brain.Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol.348154-7(1993))。
黑質紋狀體多巴胺能神經元與老化相關的損失的作用也可被評估以測定用于預防或減輕神經變性疾病的潛在物質(見，如，Prasad，C.，等，Chronic nicotine intake decelerates aging of nigrostriataldopaminergic neurons.Life Sci，541169-84(1994)；和通常見，Piceiotto，M.R.和M.Zoli，Nicotinic receptors in aging anddementia.J Neurobiol.53641-55(2002)，在此所有的全文作為參考)。
組合物 預防和/或治療的方法和藥物組合物可包括直接或間接地刺激煙堿受體的物質和抑制AT2受體的物質。
直接或間接地刺激煙堿受體的物質包括α7激動劑、膽堿能配體、煙堿性激動劑和/或乙酰膽堿酯酶抑制劑。本發明的煙堿受體激動劑可包括那些在如，美國專利5,977,144；美國專利6,218,383；美國專利6,310,102；美國專利6,232,316；Miller等，國際專利申請公開號WO0190109A1；Bencherif等，國際專利申請公開號WO 0182978A2；Dull等，國際專利申請公開號WO 0071520A2；Bencherif，國際專利申請公開號WO 0007600A1；和Caldwell等，國際專利申請公開號WO 9965876A1中所討論的(在此所有的全文一并作為參考)。可用于根據本發明的方法的物質包括在下式I-III中所代表的化合物
能被使用的物質也包括在美國專利5,952,339；5,986,100；6,057,446；和6,211,372中所披露的化合物(在此全文作為參考)。選擇性刺激特定受體如α7-nAChR的物質能被使用。Schmitt和Bencherif提供了關于選擇與特定受體包括α7-亞型可選擇性相互作用的化合物的指南(見Schmitt，J.和M.Bencherif，Chapter 5，″NicotinicAcetylcholine Receptors，″in Ann.Rep.Med.Chem.3541-51(2000)；和Schmitt，J.，Curr.Med.Chem.，7(8)749-800(2000)，在此所有全文作為參考)。
已經報道有許多化合物和α7煙堿性受體相互作用，且已被建議作為治療的基礎。見，例如，PCT WO 99/62505、PCT WO 99/03859、PCT WO 97/30998、PCT WO01/36417、PCT WO 02/15662、PCT WO02/16355、PCT WO 02/16356、PCT WO 02/16357、PCT WO 02/16358、PCT WO 02/17358，Stevens等，Psychopharm.136320(1998)，Dolle等，J.Labelled Comp.Radiopharm.44785-795(2001)和Macor，等，Bioorg.Med.Chem.Lett.11319-321(2001)和它們的參考文獻。在這些化合物中，共有的結構主體是三位取代的二環(bicylic)胺(如，奎寧環)。類似的取代的奎寧環化合物也被報道可結合毒蕈堿性受體。見，如，Sabb的美國專利5,712,270和PCTs WO 02/00652和WO02/051841。
直接或間接地抑制AT2受體的物質包括可干擾AT2刺激物血管緊張素II轉化酶或ACE的作用的ACE抑制劑(見Brown，N.J.和D.E.Vaughan，Circulation.971411-1420(1998)，在此全文作為參考)。這樣的物質也包括AT2受體抑制劑自身(如，PD123177和PD123319；見Fischer，J.W.等，Cardiovasc.Res.51(4)784-91(2001)；和Horiuchi等，J.Clin.Invest.103(1)63-71(1999)，在此全文作為參考)。
多肽、抗體和相關的方法 化合物可以是，例如，抗體、抗體片段、酶、蛋白、肽、核酸如寡核苷酸或小分子。
具有一個或多個氨基酸的模擬物(mimic)，另外已知的多肽模擬物或肽模擬物也能被用作為本發明的蛋白或多肽化合物。在此所用的術語“模擬物”指氨基酸或該氨基酸的具有同樣或類似功能特性的氨基酸類似物。因此，例如，(D)精氨酸類似物可以是(D)精氨酸的模擬物，如果該類似物在生理pH時含有具有正電荷的側鏈，其為精氨酸特有的guinidinum側鏈反應基團。多肽模擬物或肽模擬物是一種保留有位于相應多肽中的藥效基團的類似多肽鏈的有機分子。基于對側鏈功能性的修飾，在氨基酸和上述的肽模擬物中發生的非天然氨基酸取代能增強單獨的多肽的整體活性或特性。例如，這些類型的改變能被應用在本發明的寡聚物組分中以進一步增強多肽抗酶解和/或提高其生物活性。
抗體可以是，例如，單克隆抗體、人源化(嵌合)或多克隆抗體和能利用常規技術制備的抗體。
能產生結合煙堿性受體，如α7-nAChR的抗體。也能產生結合AT2受體的抗體。這些抗體能被選擇以致于當結合到它們的靶目標時，它們能有效地阻止受體的激活。也能產生結合刺激或抑制受體的物質的抗體，以某種方式干擾該物質所期望的功能或活性。也能制備結合并影響酶(如ACE)活性的抗體，其產生刺激或抑制受體活性的活性配體。在此，用于制備特導抗體的受體、配體、相關的酶和其它效應物可簡單地稱為“抗原”。術語“配體”可指受體的特異結合配偶體，其可刺激或抑制一種特殊的活性。
可使用多克隆抗體，倘若它們全部的作用是期望的作用(即期望的刺激或抑制作用)。單克隆抗體和人源化(嵌合)抗體都能被使用。通過空間干擾和/或結合到受體或配體的實際結合位點的全部或部分上，這些抗體可抑制結合配偶體如受體和它們的配體之間的結合。
術語“抗體”指一種實質上由免疫球蛋白基因或它們的片段編碼的多肽，能特異地結合和識別被分析物或抗原，如與本發明的方法相關的受體和/或配體(刺激或抑制物質)。免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定區基因和無數免疫球蛋白可變區基因。輕鏈分為κ型或λ型。重鏈分為γ型、μ型、α型、δ型或ε型，依次分別定義了免疫球蛋白IgG、IgM、IgA、IgD和IgE類。
典型的免疫球蛋白(抗體)的結構單位包括一個四聚體。每一個四聚體由兩對同樣的多肽鏈組成，每一對有一條“輕鏈”(大約25kDa)和一條“重鏈”(大約50-70kDa)。每一條鏈的N-末端有大約100到110個或更多的氨基酸組成的主要負責抗原識別的可變區。術語“輕鏈可變區”(或“VL”)和“重鏈可變區”(或“VH”)分別指這些輕鏈和重鏈。
抗體可以以例如完整的免疫球蛋白或許多通過用不同的肽酶消化產生的充分定性的抗原結合片段的形式存在。例如，胃蛋白酶消化抗體絞鏈區域的二硫鍵可產生F(ab′)2片段，Fab的二聚體，其自身是通過二硫鍵結合至VH-CH1的輕鏈。F(ab′)2片段在破壞鉸鏈區二硫鍵的適度條件下能被還原，從而將該F(ab′)2二聚體轉變為Fab′單體。該Fab′單體實質上是具有鉸鏈區部分的Fab(見FundamentalImmunology，第3版，W.E.Paul(編)，Raven Press，N.Y.(1993)，其內容在此作為參考)。當依據完整抗體的消化來定義不同的抗體片段時，本領域的普通技術人員應明白該片段能通過化學方法或使用重組DNA方法被重新合成。因此在此所用的術語抗體也包括抗體片段，如單鏈抗體、抗原結合F(ab′)2片段、抗原結合Fab′片段、抗原結合Fab片段、抗原結合Fv片段、單條重鏈或嵌合(人源化的)抗體。這些抗體能通過修飾整個抗體或用重組DNA方法重新合成而產生。
受體、配體或與本發明的方法相關的其它物質(“抗原”-包括片段、衍生物和它們的類似物)能被用作免疫原以產生能免疫特異地結合該免疫原的抗體。這樣的抗體包括，但不限于，多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、結合抗原的抗體片段(如Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv或超變區)、和mAb或Fab表達文庫。在一些實施方案中，提供了抗原的多克隆抗體和/或單克隆抗體。也在另外的實施方案中，被鑒定有免疫原性的受體或配體片段被作為免疫原來產生抗體。
可用在本領域中已知的多種方法生產多克隆抗體。多種宿主動物(包括，但不限于，兔、小鼠、大鼠、綿羊、山羊、駱駝等動物)能通過注射抗原、片段、衍生物或類似物被免疫。基于宿主的種類，可使用不同的佐劑增加免疫應答。這樣的佐劑包括，例如，弗氏佐劑(完全和不完全)、無機物膠體如氫氧化鋁、表面活性物質如溶血卵磷脂、普盧蘭尼克多元醇(pluronic polyols)、聚陰離子、肽、乳油、匙孔血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanins)、二硝基酚和其它佐劑，如BCG(卡介苗)和小棒桿菌(Corynebacterium parvum)。
提供用于通過培養中的連續細胞系生產抗體分子的任何技術可被用于制備針對根據本發明的方法的受體或配體(刺激或抑制物質)的單克隆抗體。這些技術包括，例如，最初由Kohler和Milstein開發的雜交瘤技術(見，如，Nature 256495-97(1975))、三體雜交瘤技術(見，如，Hagiwara和Yuasa，Hum.Antibodies Hybridomas 415-19(1993)；Hering等，Biomed.Biochim.Acta 47211-16(1988))、人B細胞雜交瘤技術(見，如，Kozbor等，Immunology Today 472(1983))和產生人單克隆抗體的EBV-雜交瘤技術(見，如Cole等，InMonoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96(1985))。可使用人抗體，其通過使用人雜交瘤(見，如Cote等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 802026-30(1983))或通過在體外用EBV病毒轉化人B細胞而得到((見，如Cole等，在前所述)。
可能制備“嵌合”或“人源化”抗體(見，如，Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 816851-55(1984)；Neuberger等，Nature 312604-08(1984)；Takeda等，Nature 314452-54(1985))。產生該“嵌合”分子的方法通常是眾所周知的且被描述于，例如，美國專利號4,816,567；4,816,397；5,693,762；和5,712,120；PCT專利公開號WO 87/02671和WO 90/00616；和歐洲專利公開號EP 239 400(以上內容在此作為參考)。或者，人單克隆抗體或其部分能通過根據Huse等，Science2461275-81(1989)提出的常規方法(其內容在此引入作為參考)，首先篩選編碼可特異性結合本發明的受體或配體的抗體的核酸分子的cDNA文庫鑒定。接著核酸分子被克隆并擴增以獲得編碼具有目的特異性的抗體(或抗原結合區域)的序列而被鑒定。噬菌體展示技術提供了另一種技術用于選擇能結合受體、配體或與本發明的方法相關的酶、其片段、衍生物或類似物(見，如國際專利公開號WO 91/17271和WO 92/01047；Huse等，在前所述)。
可使用用于生產單鏈抗體的技術(見，如，美國專利4,946,778和5,969,108)。另一方面本發明使用了被稱為Fab表達文庫構建的技術(見，如，Huse等，在前所述)，可快速并容易地鑒定對抗原、其片段、衍生物或類似物具有目的特性的克隆的Fab片段。
通過已知的技術可產生含有獨特型分子的抗體。例如，該片段包括，但不限于，通過胃蛋白酶消化抗體分子產生的F(ab′)2片段、通過還原F(ab′)2片段的二硫鍵生成的Fab′片段、通過用木瓜蛋白酶和還原試劑處理抗體分子而產生的Fab片段和Fv片段。使用如描述于美國專利號5,965,405(其內容在此一并作為參考)的方法在真核細胞中也能產生重組Fv片段。
通過本領域已知的技術(如，ELISA(酶聯免疫吸附測定))能完成抗體的篩選。在一個例子中，可使用能識別抗原的特定區域的抗體來分析產生的用于可結合含有該區域的多肽的產品的雜交瘤。能在CHO細胞的瞬時表達系統中產生小量的人源化抗體用于確定它們結合到與本發明方法相關的表達抗原的HUVEC細胞上。然后分離穩定的細胞系產生大量的純化的物質。可用在Krause等Behring Inst.Mitt.，8756-67(1990)中描述的方法來測定鼠和人源化抗體的結合親和力。
根據本領域已知的方法，與本發明的方法相關的抗原(包括片段、衍生物和類似物)結合的抗體能被用于被動抗體處理。根據如上所述的方法產生該抗體且可以是多克隆或單克隆抗體，并能靜脈、腸內(如，以腸衣片的形式)、通過氣溶膠、口服、經皮、經轉化粘液質(transmucosally)、向胸膜內、向鞘內或其它適合的途徑施用。
前述的與抗體相關的方法可用于產生能特異性結合受體如AT2或α7nAChR，或結合可調節受體活性的物質，如能刺激或抑制受體激活的物質如血管緊張素II、煙堿或β-淀粉狀蛋白的抗體。進一步地，可制備抑制或影響酶(如經激活刺激物質而間接影響有關受體的刺激的ACE)的活性的特異抗體。
藥物組合物 本發明也涉及用于預防易感病癥或疾病的患者的該病癥或疾病的組合物，和用于治療患有上述病癥的患者的組合物。例如，該組合物可以化合物有效量施用于患者以提供對CNS病癥的進展的一定程度的阻止(即提供保護作用)，改善CNS病癥的癥狀和改善CNS病癥的復發。該組合物可包括有效量的能刺激煙堿受體化合物。本發明也涉及施用有效量的抑制AT2受體或抑制AT2受體的刺激物的作用的化合物。能阻止Aβ-介導的干擾JAK2磷酸化的化合物也能作為本發明的藥物組合物施用。
化合物可以以游離基質形式或鹽(如作為藥學上可接受的鹽)的形式使用。適合的藥學上可接受的鹽的例子包括無機酸加成鹽如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽和硝酸鹽；有機酸加成鹽如乙酸鹽、galactarate、hemigalactarate、丙酸鹽、琥珀酸鹽、乳酸鹽、乙醇酸鹽、蘋果酸鹽、酒石酸鹽、檸檬酸鹽、馬來酸鹽、延胡索酸鹽、甲磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽、二甲苯甲酰酒石酸鹽和抗壞血酸鹽；具有酸性氨基酸的鹽如天冬氨酸鹽和谷氨酸鹽；堿金屬鹽如鈉鹽和鉀鹽；堿土金屬鹽如鎂鹽和鈣鹽；銨鹽；堿性有機鹽如三甲胺鹽、三乙胺鹽、吡啶鹽、甲基吡啶鹽、二環己基胺鹽和N，N′-二芐基乙二胺鹽；和具有堿性氨基酸的鹽如賴氨酸鹽和精氨酸鹽。這些鹽可是一些水合物或醇溶劑合物的形式。
用于本文所述的方法中的化合物可以是那些在如下所述的，例如，Williams等.DN & P 7(4)205-227(1994)，Arneric等，CNS DrugRev.1(1)1-26(1995)，Arneric等，Exp.Opin.Invest.Drugs 5(1)79-100(1996)，Bencherif等.，JPET 2791413(1996)，Lippiello等，JPET 2791422(1996)，Damaj等，Neuroscience(1997)，Holladay等，J.Med.Chem 40(28)4169-4194(1997)，Bannon等，Science 27977-80(1998)，PCT WO 94/08992，PCT WO 96/31475，和Bencherif等的美國專利5,583,140，Dull等的美國專利5,597,919，和Smith等的美國專利5,604,231，以上文獻所披露的內容在此全文一并作為參考。本發明的化合物能被用作為止痛劑來預防或治療多種神經變性疾病，并可治療驚厥如那些癲癇癥所表現出的癥狀。根據本發明的內容，能被預防或治療的CNS病癥包括早老性癡呆(早期發作的阿爾茨海默病)、老年性癡呆(阿爾茨海默氏癡呆)、HIV-癡呆、多發性腦梗死、帕金森綜合征包括帕金森病、皮克氏病、亨廷頓舞蹈癥(Huntington′schorea)、進行性核上癱瘓(progressive supra nuclear palsy)、路易士肢體癡呆(Lewy body dementia)和輕度認知損害。本發明的化合物也能被用于預防或治療如梅毒和克雅氏癥等疾病。
藥物組合物也包括許多其它組分作為添加劑或助劑。用于相關環境中的典型的藥學上可接受的組分或助劑包括抗氧化劑、自由基清除劑、肽、生長因子、抗體、抑菌劑、免疫抑制劑、抗凝血劑、緩沖劑、抗炎劑、退熱劑、緩釋劑、麻醉劑、類固醇和皮質類固醇。這些組分能提供額外的治療功效，能影響藥物組合物治療效果或可阻止由于施用該藥物組合物而引起的任何潛在的副作用。
化合物能以不同的方法施用。化合物能通過吸入法施用(如，以氣溶膠的形式通過鼻或使用在Brooks等的美國專利4,922,901(在此全文作為參考)中提出的輸送物來進行)；局部性施用(如，以洗劑的形式)；口服施用(如，在溶劑中的液體形式如水成液或非水成液，或在固體載體中)；靜脈施用(如，在葡萄糖或鹽溶液中)；輸注或注射(如，以在藥學可接受的液體或液體混合物中的懸浮劑或乳劑)；鞘內施用；腦室內(intracerebro ventricularly)施用或經皮膚(如，使用透皮貼劑)施用。雖然能以大量的活性化學物質的形式使用化合物，但每一種化合物都能存在于藥物組合物或制劑中有效地施用。施用這樣的化合物的典型方法對于熟練的技術人員來說是顯而易見的。例如，此化合物能被以片劑、硬(明膠)膠囊或緩釋膠囊的形式被施用。作為另外的例子，此化合物能通過使用如來自Novartis和Alza公司的可用的貼劑技術經皮輸送。本發明的藥物組合物對暖血動物(如，哺乳動物如小鼠、大鼠、貓、兔、狗、豬、牛或猴)的給藥可以是間歇的或逐漸的、持續的、恒量的或以控制的速度；但優選對人類給藥。此外，該藥物制劑的給藥天數和每天給藥的次數可以不同。給藥方式可以是使得藥物制劑的活性成分和在患者體內的可影響CNS功能的受體位點相互作用。更特別地，在預防和/或治療CNS病癥中，給藥方式可以是使對那些相關的能影響CNS功能的受體亞型優化或對肌肉型受體亞型的影響最小的給藥方式。其它可適用的本發明的化合物的給藥方法描述于Smith等的美國專利5,604,231中。
化合物的合適的劑量是能預防患者患有的病癥癥狀發生或治療病癥的某些癥狀的有效量。“有效量”、“治療量”或“有效劑量”指得到期望的藥理學或治療效果，因此導致能有效地預防或治療該病癥的足夠量。因此，當治療CNS病癥時，化合物的有效量是可通過患者的血腦屏障而結合患者腦中相關受體位點并激活相關的煙堿性受體亞型(如，提供神經遞質分泌，從而導致有效地預防或治療該病癥)的足夠量。預防該病癥是延遲該病癥的癥狀的發生。治療該病癥是減輕該病癥相關的癥狀或改善該病癥癥狀復發。
有效劑量可以不同，基于如下因素患者的情況、癥狀的嚴重性和藥物組合物的給藥方式。對于人類患者，典型化合物的有效劑量通常需要給予該化合物以可激活相關受體來影響神經遞質(如，多巴胺)的釋放的足夠量，但是該劑量應不足以對骨骼肌和神經節產生任何明顯程度的影響。患者間的化合物的有效劑量當然不同，但是通常包括使CNS效應或其它期望的治療作用發生的起始量，但要低于可觀察到的肌肉效應的量。
典型地，化合物的有效劑量通常需要以約1μg到約20mg每公斤患者體重的量口服給藥該化合物。通常，本發明的化合物以約10μg到約10mg每公斤患者體重的量給藥，更常地以10μg到約1mg每公斤患者體重的量給藥。前述的有效劑量通常表示作為單次劑量給藥的量，或在24小時的時間中作為一或多次劑量給藥。
對于人類患者，典型的化合物的有效劑量通常需要以至少約1、通常至少約10和更經常地至少約1到約100mg/24小時/患者的量給予該化合物。對于人類患者，典型的化合物的有效劑量通常需要以常規劑量不超過約500、通常不超過400和更經常地不超過300mg/24小時/患者的量給予該化合物。此外，給藥的有效劑量是指化合物在患者血漿中的濃度通常不超過10μg/ml和更經常地不超過1μg/ml。
根據本發明方法的化合物具有通過患者血腦屏障的能力。該化合物具有能進入患者的中樞神經系統的能力。用于實施本發明的典型化合物的log P值一般大于約-0.5，通常大于約0和更經常地大于約0.5。該典型化合物的log P值一般小于約3，通常小于約2和更經常地小于約1。Log P值估量了化合物通過擴散障礙如生物膜的能力。見，Hansch，等，J.Med.Chem.111(1968)。
用于實施本發明的典型化合物的受體結合常數一般大于約0.1nM，通常大于約1nM和更經常地大于約10nM。某些化合物的受體結合常數小于約100μM，通常小于約10μM和更經常地小于約5μM；其它化合物的受體結合常數小于約1μM，通常小于約100nM和更經常地小于約50nM。某些化合物能具有小于10μM，和甚至小于100μM的受體結合常數。受體結合常數估量了化合物與患者某些腦細胞中相關受體位點的一半結合的能力。見，Cheng，等，Biochem.Pharmacol.223099(1973)。
用于根據本發明的方法的某些化合物能通過有效地結合到煙堿性乙酰膽堿受體證明煙堿性功能。這樣的化合物能激活相關神經元以釋放或分泌乙酰膽堿、多巴胺和其它神經遞質。一般地，用于實施本發明的典型化合物提供了煙堿性乙酰膽堿受體的活化，活化的受體的量至少比用于激活肌型(muscle-type)煙堿性受體的量少1/3，典型地至少少約10倍，經常地至少少約100倍和有時至少少約1,000倍。本發明的某些化合物能與同等摩爾量的(S)-(-)煙堿引起的量相當的量的多巴胺分泌。
根據本發明的方法使用的化合物，當依據本發明的方法使用有效量時，能選擇針對某些相關的煙堿性受體，但不導致與在至少大于激活多巴胺釋放所需的濃度時所產生的不期望的副作用相關的受體的明顯的激活。這就意味著在比激活多巴胺釋放所需的濃度高5倍、高100倍和高1,000倍的濃度時，能預防和/或治療CNS病癥的特定劑量的化合物是基本上不引發某些肌型煙堿受體的激活。本發明抗那些造成心血管副作用的神經節型受體的某些化合物的選擇性通過那些化合物在大于激活多巴胺釋放所需的濃度的濃度時可激活腎上腺嗜鉻組織的煙堿性功能的能力的缺乏而被證明。
用于根據本發明的方法的某些化合物，當依據本發明的方法使用有效量時，能有效地預防CNS病癥的進展，改善CNS病癥的癥狀和改善CNS病癥復發時的癥狀。然而，這些化合物的有效量是不足以引起任何可察覺到的副作用，通過與骨骼肌相關的作用的增加被證明。同樣地，使用本發明某些化合物提供了一個治療窗口，其中提供了某些CNS病癥的治療且避免了某些副作用。就是說，本發明有效劑量的化合物是足以對CNS提供期望的效果但不足以(即，不是足夠高的水平)產生明顯的不期望的副作用。
以下詳述的實施例是不受限制的且其僅是對本發明的方法和組合物起解釋作用。
實施例 以下實施例所使用的如下所述原料和方法 化學品。購買自Bio-Rad實驗室(Hercules，CA，USA)的分子量標準、丙烯酰胺、十二烷基磺酸鈉(SDS)、N，N′-亞甲基-雙丙烯酰胺、N，N，N′，N′-四亞甲基二胺、蛋白質分析試劑和硝酸纖維素膜。得自Santa-Cruz(Santa Cruz，CA，USA)的蛋白A/G-瓊脂糖和得自Mediatech Biotechnology Inc.(Herndon，VA，USA)的Dulbecco氏改良Eagle氏培養基(DMEM)、胎牛血清、胰島素和所有的培養基添加劑。磷酸化酪氨酸(PY20)的單克隆抗體、JAK2、Akt和PI3激酶購自Transduction Laboratories(Lexington，KY，USA)。抗磷酸化Akt和PARP抗體購自New England Biolabs(Beverly，MA，USA)。抗酪氨酸磷酸化JAK2抗體得自Biosource International(Camarillo，CA，USA)。Pierce SUPERSIGNAL底物化學發光檢測試劑盒得自PIERCE(Rockford，IL，USA)。山羊抗小鼠IgG和山羊抗兔IgG得自Amersham(Princeton，NJ，USA)，和TWEEN-20、煙堿、Aβ(1-42)肽、抗Aβ(1-42)和抗α7-nAChR和所有其它化學品購自Sigma化學公司(St.Louis，MO，USA)。
分離和培養PC12細胞。PC12(大鼠嗜鉻細胞瘤)細胞根據常規方法(Liu Q等，Proc Natl Acad Sci USA 98(8)4734-9(2001))在添加有10％馬血清、5％胎牛血清(Atlanta Biologicals，Norcross，GA)和抗生素(青霉素/鏈霉素)的DMEM(GIBCO/BRL，Gaithersburg，MD)培養基中保持在增殘生長階段。對特殊的實施例，該培養基在煙堿刺激前更換為含有10μM AG-490或10μM Aβ(1-42)的新鮮無血清培養基。
數據分析。用Student’s t檢驗(Student’s t test)和方差(ANOVA)分析對成對的數據進行所有的統計比較。顯著性是P＜0.05。
實施例1-途徑蛋白的免疫沉淀和磷酸化分析 PC12細胞用煙堿刺激一定時間。免疫沉淀和Western印跡用前述的(Liang，H.等，J.Biol.Chem.27419846-19851(1999)；Marrero，M.B.等，Nature 375247-250(1995).Marrero，M.B.等，Am.J.Physiol.275C1216-C1223(1998))的方法來進行。
下列抗體被用于免疫沉淀蛋白抗α7受體、抗PI-3激酶(2μg/ml)、抗JAK2(2μg/ml)或抗磷酸化酪氨酸(PY20克隆，10μg/ml)。回收的免疫沉淀的蛋白被轉移到硝酸纖維素膜上并用適當的抗體印跡。對于磷酸特異性的JAK2和Akt蛋白，硝酸纖維素膜與親和純化的抗磷酸特異性JAK2和Akt抗體在4℃溫育過夜。最后，蛋白用辣根過氧化酶綴合的山羊抗小鼠或猴抗兔IgG和增強化學發光試劑盒檢測。
實施例2-JAK2和Akt的Western印跡分析 在存在或不存在10μM AG-490(預溫育1小時)的條件下，用10μM煙堿刺激0到120分鐘不同時間的血清饑餓的PC12細胞中測定JAK2和Akt蛋白的磷酸化。在刺激結束時，細胞用冰冷的PBS-V(含1mmol/L Na3VO4的磷酸鹽緩沖液)洗滌兩次。每一培養皿接著用冰冷的裂解緩沖液(20mmol/L Tris-HCl，pH7.4，2.5mmol/L EDTA，1％Triton X-100，10％ 甘油，1％ 脫氧膽酸鹽，0.1％ SDS，10mmol/LNa4P2O7，50mmol/L NaF，1mmol/L Na3VO4和1mmol/LPMSF)處理60分鐘，接著通過細胞裂解物在58,000g、4℃下離心25分鐘得到上清液部分。樣品通過7.5％ SDS-PAGE凝膠電泳分離，轉移到硝酸纖維素膜上并在室溫(22℃)下在加5％脫脂奶粉的TTBS(含0.05％Tween-20的TBS，pH7.4)中溫育60分鐘被封閉。該硝酸纖維素膜與親和純化的抗磷酸化特異性JAK2和Akt抗體在4℃下溫育過夜。該硝酸纖維素膜用TTBS洗滌兩次每次各10分鐘，并用山羊抗兔IgG辣根過氧化酶綴合物溫育不同時間。在大量的洗滌后，結合的抗體用KODAK BIOMAX膠片，PIERCE SUPERSIGNAL底物化學發光檢測試劑盒檢測。分子量標記用于評估條帶的特異性。
實施例3-PI-3激酶的免疫沉淀研究 血清饑餓的PC12細胞用10μM煙堿刺激0到120分鐘不同的時間，并用冰冷的PBS-V(含1mmol/L Na3VO4的磷酸鹽緩沖液)洗滌兩次。每一培養皿接著用冰冷的裂解緩沖液(20mmol/L Tris-HCl，pH7.4，2.5mmol/L EDTA，1％ Triton X-100，10％ 甘油，1％ 脫氧膽酸鹽，0.1％ SDS，10mmol/LNa4P2O7，50mmol/L NaF，1mmol/LNa3VO4和1mmol/L PMSF)處理60分鐘，接著通過細胞裂解物在58,000g、4℃下離心20分鐘得到上清液部分。細胞裂解物在4℃與10μg/ml的抗PI3激酶單克隆抗體溫育2小時并通過加入50μl的蛋白A/G瓊脂糖在4℃沉淀過夜。通過離心回收免疫沉淀物并用冰冷的洗滌緩沖液(TBS，0.1％Triton X-100，1mmol/L PMSF，和1mmol/LNa3VO4)洗滌三次。免疫沉淀的蛋白在100ml Laemmli樣品緩沖液中溶解和80ml的每個樣品通過SDS-PAGE凝膠電泳分離。樣品被轉移到硝酸纖維素膜上并在室溫(22℃)下在加5％脫脂奶粉的T的TBS(含0.05％Tween-20 TBS，pH7.4)中溫育60分鐘被封閉。硝酸纖維素膜接著與10μg/ml親和純化的抗磷酸化酪氨酸抗體在4℃下溫育過夜，且結合的抗體用PIERCE SUPERSIGNAL化學發光檢測試劑盒檢測。
實施例4-PC12細胞凋亡的評估 通過用Western印跡分析方法測定DNA修復酶多聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)的斷裂程度來測定細胞凋亡程度。PARP(116kDa)是caspase-3的內源性底物，在多種細胞凋亡中其被斷裂為典型的85kDa片段。在存在或不存在煙堿和/或AG-490的條件下，PC12細胞用100nM Aβ處理8小時。收集這些細胞，并用PBS洗滌，接著在120μl的SDS-PAGE樣品緩沖液中煮沸10分鐘裂解。總的細胞裂解物(30μg蛋白)通過SDS-PAGE分離并轉移到硝酸纖維素膜上。該膜在含5％脫脂奶粉的TBST(25mM Tris-HCl，pH7.5，0.5M NaCl.0.05％Tween-20)中在25℃下封閉1小時。膜用對85kDa片段特異性的PARP一抗在25℃下溫育2-3小時，用TBST漂洗，并用二抗在25℃下溫育1小時。用增強化學發光(ECL)系統(Amersham)和合適的抗體進行免疫檢測。
PC12細胞粗提物中的Caspase 3酶活性通過用其熒光底物來測定。caspase-3熒光肽Ac-DEVD-AMC(Promega，Madison，WI)含有偶聯到熒光染料7-氨基-4-甲基香豆素的C-末端上的特異性caspase-3剪切序列(DEVD)。當在360nm波長處被激發時，該底物能發出藍色的熒光。當通過細胞裂解物中caspase 3酶活性剪切該肽時，自由的7-氨基-4-甲基香豆素被釋放出并能通過其在460nm處發出的黃/綠光被檢測到。適當的對照物包括可用來評估caspase 3酶活性的特異作用的caspase-3的可逆醛抑制劑。相對于細胞提取物的總蛋白濃度對熒光單位進行標準化。該分析重復進行三次，且試驗也被重復三次。此外，使用COULTER計數器(ZM型，Coulter，Hialeah，FI)測定PC12細胞數目的減少。
實施例5-用于評估神經保護作用的動物模型 連同具有可提供關于如何使用每一動物模型的引文(在此所有的全文內容一并引入作為參考)的適合的終點(基于所述的煙堿)，用于評估根據本發明的組合物和方法的神經保護作用的動物模型被提供如下 6-OHDA(部分損傷)-大鼠 煙堿(NIC)(1.0mg/kg；皮下)削弱了在黑質中6-OHDA(6μg)誘導的多巴胺能的神經毒性(即，紋狀體多巴胺損失的喪失)(Costa，G.等，Brain Res，888336-342(2001)；Soto-Otero，R.等，BiochemPharmacol，64(1)125-35(2002))。
利血平誘導的多巴胺缺失-小鼠 NIC(3mg/kg；s.c.)阻斷了利血平(0.5mg/kg；i.v.)誘導的多巴胺缺失，NIC的該作用能被梅坎米胺(mecamylamine)阻斷但不被六甲銨(hexamethonium)阻斷(Oishi，R.等，Naunyn Schmiedebergs ArchPharmacol.348154-7(1993))。
脫氧麻黃堿(methamphetamine)毒性-小鼠和大鼠 在鼠中NIC(1.0mg/kg)阻止脫氧麻黃堿(5mg/kg)毒性(腦水平)類似于MK-801(Maggio，R.等，J Neurochem，712439-46(1998)；和Parain，K，等，Brain Res.890347-350(2001))。
MPTP作用 小鼠 NIC(0.75mg/kg)減少MPTP(30mg/kg；s.c.)誘導的紋狀體MPP+水平類似于MK-801(Quik，M.和D.A.Di Monte，BrainRes，917219-24(2001))。
非人靈長類 SIB-1508Y(1.8mg/kg)在增強L-多巴對在靈長類MPTP模型中的運動和認知功能的作用方面比煙堿更有效(Domino，E.F.等，ExpNeurol，158414-21(1999)；Schneider，J.S.等，J Pharmacol Exp Ther.290(2)731-739(1999))。
實施例6-TC-1698介導的JAK2磷酸化的增加 在PC12細胞中，類似煙堿，TC-1698(2-吡啶-3-基-1-氮雜-雙環[3.2.2]壬烷)誘導Jak-2磷酸化并能有效地激活該途徑。見圖11-15和在前所述的內容。
TC-1698是有效的和選擇性的α7激動劑。功能分析表明TC-1698不激活神經節亞型α3β4、肌亞型α1β1γδ、神經元亞型α3β2和α4β2。相反地，TC-1698能高親和力(Ki＝0.8nM)結合α7并在激活α7nAChR中比內源性神經遞質乙酰膽堿更有效50倍。
權利要求
1.一種用于治療或預防中樞神經病癥而給予患有該病癥的患者的藥物組合物，它包含
a)由下式表示的刺激煙堿受體的物質，
b)至少一種AT2受體的抑制劑或至少一種刺激AT2受體的物質的抑制劑的任一者或兩者；和
c)藥學上可接受的載體。
2.一種用于治療或預防神經變性病癥而給予患有該病癥的患者的藥物組合物，它包含
a)由下式表示的刺激煙堿受體的物質，
b)至少一種AT2受體的抑制劑或至少一種刺激AT2受體的物質的抑制劑的任一者或兩者；和
c)藥學上可接受的載體。
3.根據權利要求1或2的藥物組合物，其中抑制AT2受體或抑制刺激AT2受體的物質的物質是抑制刺激AT2的物質的物質。
4.根據權利要求3的藥物組合物，其中抑制刺激AT2的物質的物質是血管緊張素II轉化酶抑制劑。
5.根據權利要求1或2的藥物組合物，其中抑制AT2受體或抑制刺激AT2受體的物質的物質是抑制AT2的物質。
6.根據權利要求5的藥物組合物，其中抑制AT2的物質選自PD123177和PD123319。
全文摘要
本發明提供了通過用測試物質接觸具有煙堿受體的細胞篩選能作用煙堿受體的物質的方法；和測定Janus活化激酶2(JAK2)磷酸化的任何增加或減少的方法。JAK2磷酸化的增加表明測試物質刺激煙堿受體，和其中JAK2磷酸化的減少表明測試物質抑制煙堿受體。本發明也提供了用于鑒定通過經AT2受體介導的活性能影響煙堿受體活性的物質的篩選方法。也提供了相關的藥物組合物和治療方法。
文檔編號A61P25/28GK101099736SQ200710106578
公開日2008年1月9日 申請日期2002年12月13日 優先權日2001年12月14日
發明者M·本切里夫, M·B·馬萊羅 申請人:塔加西普特公司, 佐治亞州研究院醫科大學公司