選擇性復制的病毒載體的制作方法

專利名稱：選擇性復制的病毒載體的制作方法
本申請為分案申請，原申請的申請日為1999年10月14日，申請號為99814361.8(PCT/US99/21452)，發明名稱為“選擇性復制的病毒載體”。
背景技術：
重組腺病毒目前在各種治療方案中用于傳送治療性轉基因。然而，這類載體系統的廣泛感染性已經引起對所述病毒在非腫瘤細胞中的表達可能引起對非贅生性細胞的伴隨損傷的擔心。因此，已經開發了各種導向系統，以在特定的細胞類型中優先表達所述轉基因。組織特異性啟動子和腫瘤特異性啟動子已經用于在某些細胞類型中優先復制所述載體。例如，1997年1月16日公開的國際專利申請號PCT/US96/10838(國際公開號WO97/01358)描述了載體的應用，所述載體利用驅動E1、E2或F4功能的前列腺特異性啟動子元件在特定的宿主細胞中復制，所述啟動子元件任選地可含有細胞毒性轉基因表達盒。具體而言，該說明書描述一種構建物，其中前列腺特異性增強子控制E1的表達，并具有一個含CMV啟動子的表達盒，所述CMV啟動子驅動插入到E3區中的胞嘧啶脫氨酶基因的表達。這些載體為可復制載體，并能夠在特定細胞類型中包裝入完整病毒體中。
使用腫瘤特異性啟動子驅動病毒復制的一個可替代途徑是使用特異性缺失的腺病毒E1b 55K蛋白編碼序列。在1997年10月14日頒發的美國專利第5,677,178號中描述了在編碼E1b 55K的核苷酸序列中含有缺損的重組腺病毒。然而，已經觀察到這些組織或腫瘤特異性控制元件是“滲漏的”，即允許在非優選靶細胞的細胞類型中復制。
使用徹底消除E1功能的復制缺陷型腺病毒載體可替代所述類型的選擇性復制載體。具體而言，已經使用消除E1、E2、E3并含有部分F4缺失的載體輸送外源性轉基因。已經使用這類載體向靶細胞輸送p53基因。已經證明，外源性給予的野生型p53在p53缺失型(p53突變或p53無效)腫瘤細胞中的表達能夠在該腫瘤細胞中誘導p53介導的凋亡。目前Schering Corporation和Introgen Corporation正在研制這類用于輸送p53的病毒載體。此外，這些載體已經表現出可接受的毒理學特征和用于人類治療用途的治療效力，并在成年男子中進行治療p53相關惡性腫瘤的II期臨床試驗。
復制缺陷型載體和選擇性復制載體至少在理論上具有臨床醫生擔心的設計缺點。因為復制缺陷型載體將不會在患者體內不受控地增殖，所以理論上它們具有更吸引人的安全性。但是，因為有效消除腫瘤需要感染相當大部分的待感染腫瘤細胞，所以通常使用摩爾數顯著過量的載體，以確保治療的有效性。因為選擇性復制載體能夠在患者體內復制并潛在性地突變成為可充分復制的載體，所以人們更多的是從前瞻性安全角度看待選擇性復制載體問題。然而，通過保持所述病毒在特定條件下繁殖的本能，能夠使這些載體擴散至腫瘤細胞周圍。因為所述載體本身能夠復制，所以要求這類載體的初始劑量較低。這從免疫學角度以及生產這類藥物的經濟理由來講是有利的。因此，本領域中需要選擇性復制載體，該載體解決了認識到的安全性問題，同時提高了治療指數。
本發明通過提供含途徑靶向性途徑效應啟動子的選擇性復制腺病毒載體解決了這些問題，所述途徑效應啟動子驅動病毒復制阻遏物的表達，使得所述載體優先在所述途徑缺陷的細胞中復制。本發明還提供包含此類載體的藥用制劑。本發明還提供使用這類載體從正常細胞群中消除途徑缺陷細胞的方法。
發明概述本發明提供重組病毒，該重組病毒通過使用驅動病毒復制抑制物表達的途徑效應啟動子，隨著靶細胞的細胞內環境選擇性地復制所述病毒基因組，所述病毒復制抑制物基于被感染細胞的表型或基因型在所述宿主細胞中顯著抑制病毒復制。在所述靶細胞中，所述途徑效應啟動子的啟動子元件是失活的，因此允許所述病毒復制。這導致(1)通過所述病毒的自然裂解特性殺傷所述細胞，和/或(2)提供針對所述靶細胞的治療劑量(相對于不能復制的載體增加)的轉基因產物，和(3)引起所述病毒在局部濃集，促進周圍的靶細胞感染所述重組病毒。本發明還提供利用所述載體的治療和診斷方法、包含所述載體的藥用制劑、制備所述載體和含所述載體的轉化細胞的方法。
附圖簡述

圖1檢測編碼E2F-Rb融合編碼序列的重組腺病毒載體的細胞致病作用的CPE測定結果，所述編碼序列處于或者TGF-β途徑效應啟動子(PAI或SRE)或者p53途徑效應啟動子(RGC或p53CON)控制之下。另外，還在所述載體中加入了編碼綠色熒光蛋白的基因作為報道基因。A組代表MRC-9細胞，B組代表Hep3B細胞，C組代表WIDR細胞。泳道1表達綠色熒光蛋白(GFP)的復制缺陷型(E1缺失)重組腺病毒；泳道2PAI-Ad；泳道3SRE-Ad；泳道4RGC-Ad；泳道5p53CON-Ad。在該圖右側標明了顆粒濃度。
圖2圖示與途徑導向性載體一起表達的GFP的熒光顯微鏡檢查(上面各組)結果。A組代表GFCB對照載體，B組代表SRE-Ad載體，C組代表p53CON-Ad載體。以5×105顆粒/ml進行感染。
圖3用重組病毒U3EE(正方形)、T1LT(圓形)以及L9IU(三角形)感染正常支氣管上皮細胞(A圖)和C33A細胞(B圖)的結果。縱軸表示未感染對照的百分率，橫軸以顆粒/ml表示病毒劑量。通過將每種細胞的培養物暴露于六種不同濃度(105-109病毒顆粒/ml)的病毒，進行所述試驗。將所述細胞暴露于所述病毒1小時，洗去過量的病毒，基本上按照生產商(Promega，Madison WI)的說明，用MTS分析檢測在感染后的6天中活細胞的百分數。水平線代表50％的所述細胞保持存活狀態的水平。由所述數據生成的曲線與水平點線的交叉點為所述病毒的ED50檢測值。
發明詳述本發明提供含途徑效應啟動子的選擇性復制重組病毒，所述途徑效應啟動子有效連接至一種病毒復制阻遏物。
術語“選擇性復制”是指相對于另一種表型狀態的細胞，能夠在一種表型狀態的細胞中優先復制的載體。不同表型狀態的實例應當包括給定細胞類型的p53途徑缺陷型細胞與正常細胞。優先復制的病毒顯示，在給定的劑量水平，相對于在相同類型的正常(對照)細胞中的復制，所述病毒在靶細胞類型中的復制效率增加至少為5倍。為了測定病毒是否確實具有選擇性，必須在考慮許多因素的情況下，相對于相同細胞類型的正常細胞，評價所述病毒在靶細胞中的復制能力。
最好是比較給定載體在具有被靶向條件的靶細胞中復制的能力與在不具有這種條件的相同類型正常細胞中復制的能力。例如，在病毒感染后的第一步是誘導所述細胞進入細胞周期，因為最高病毒復制效力所必需的因素僅存在于S期。然而，如果人們試圖根據載體在腫瘤細胞中的選擇性來評價載體的選擇性，即相對于已經進入細胞周期的另一種細胞(例如無限增殖化細胞系或轉化細胞系)評價載體在腫瘤細胞中的復制能力，則在某種程度上模糊了所述病毒對腫瘤細胞的選擇性。另外，已經觀察到不同細胞類型對給定病毒的感染性差別較大。盡管某些病毒例如腺病毒具有廣泛的組織嗜性，但其它病毒更受限于它們感染的細胞類型。通過嘗試評價給定病毒在感染性差別較大的細胞中的性能，難以確定缺乏效力是緣于所述載體在所述細胞中的性能，還是僅僅由于所述病毒根本不能感染所述細胞。通過評價在給定類型的靶細胞和正常細胞中的選擇性，使得這種感染性作用最小。
還必須考慮所述病毒生命周期的時序性。例如，相對于感染后不久的正常細胞，即使是野生型載體似乎在腫瘤細胞中也具有選擇性，因為所述細胞已進入細胞周期。但是，一旦所述病毒已經刺激所述細胞周期，則這種表觀選擇性隨時間減弱。因此，在感染后評價選擇性的時間必須足以避免正常細胞中的這種起始復制延遲。盡管所述起始延遲將隨所使用的病毒類型改變，但本領域技術人員可以輕易測定這種起始延遲。
在確定給定的重組腺病毒是否在靶細胞類型中呈現選擇性作用時，還必須考慮劑量的作用。例如，如果人們目標在于消除腫瘤細胞并通過細胞毒性檢測該作用，則可以制備似乎按劑量的不同具有選擇性細胞毒性的病毒。已經觀察到足夠高劑量的幾乎任何病毒，不管其基因組被修飾的程度如何，僅由于存在已知的具有細胞毒性的病毒蛋白(例如在腺病毒，為六鄰體)的作用而具有細胞毒性。同樣地，即使科技文獻可以將病毒稱為“復制缺陷型”(提示所述病毒在缺乏能夠互補該病毒缺陷的細胞系的情況下完全不能復制)，這樣的病毒更精確地描述為“復制衰減型”。例如，通常稱為“復制缺損型”或“復制缺陷型”的整個E1區缺失的腺病毒將在某種程度上復制，尤其是處于細胞周期中的細胞或快速分裂的細胞。正如Mulligan(1990，Science 260926-932)觀察到的盡管E1區的表達已經顯示影響復制所必需的其它病毒基因產物的表達(援引Horwitz，M.，載于Virology，B.N.Fields編輯(Raven，New York，1990，第60章))，但是病毒復制似乎并不絕對需要E1基因表達。
E1缺損型病毒的早期特征證實，在高感染復數時，所述E1區不是復制所必需的(援引Jones和Shenk(1979)PNAS(USA)76(8)3665-3669)。
因此，在確定病毒是否以選擇性方式復制時，病毒劑量的作用不能被忽視。
評價病毒對靶細胞的復制選擇性的一個方法是使用如下的評價病毒的“選擇性指數”。通常使用的參數ED50(定義為足以誘導50％的所述細胞死亡的劑量)提供了合適的比較基礎。通過典型的體外劑量擴大試驗可以輕易測定病毒的ED50。為了確保比較基礎最大程度地一致，相對于病毒對照表示ED50是最合適的，以使待比較的細胞類型之間的感染性變化和任何測定變異的作用最小。因此，無單位比率ED50(病毒)/ED50(對照)用于表示所述病毒在所述細胞中的相對毒性，并將其稱為“相對毒性指數”或“RTI”。給定病毒的“選擇性指數”表示為RTI(靶細胞)/RTI(正常細胞)比。選擇性復制載體將具有至少為10的選擇性指數，但優選為50、100或更高。
例如，設計選擇性復制的腺病毒載體U3EE和T1LT以實現選擇性復制和殺傷具有p53途徑缺陷的腫瘤細胞。基本上按照本文實施例的講述制備U3EE。簡而言之，所述U3EE病毒包含一個含有驅動E2F-Rb融合蛋白表達的p53效應元件(p53 CON)的第一表達盒。E2F-Rb融合蛋白是腺病毒E2啟動子活性的有效抑制物，其在所述細胞中的存在將有效抑制病毒復制。所述p53效應元件在功能性p53途徑存在下是有活性的。因此，在p53途徑完整的正常細胞中，所述U3EE病毒將表達E2F-Rb融合蛋白，并且該病毒將不復制。然而，在p53途徑缺損的細胞(大多數腫瘤細胞)中，所述p53CON效應元件是無活性的，因此不存在對病毒復制的抑制。所述U3EE載體還包含一個含有驅動Ad5 E3-10.5K原凋亡(pro-apoptotic)基因表達的MLP啟動子的表達盒。在使用原凋亡基因時最好使用所述時序啟動子(例如MLP啟動子)，因為人們希望在激活原凋亡信號之前促進病毒DNA在所述靶細胞中的復制。MLP啟動子大約在感染后7小時被激活，在激活以后如果U3EE基因組復制，則誘導E3-10.5K蛋白的活性。所述T1LT腺病毒載體與所述U3EE載體基本相同，只是T1LT腺病毒載體在E1a區中含有其它的缺失以去除243R和289R腺病毒E1a蛋白的氨基酸4-25。此缺失破壞了p300蛋白結合這些E1a蛋白的能力。
使用L9IU載體作為對照，評價U3EE和T1LT病毒在正常人支氣管上皮細胞(NHBE)和C33A(具有p53缺陷途徑的上皮腫瘤細胞系)中復制的能力以及殺傷該細胞的能力。這些試驗的結果示于附圖的圖3。下表概述了所獲得的數據
由所示數據可見，U3EE和T1LT病毒對腫瘤細胞具有高選擇性。如前所論述，相對于休眠的正常細胞，L9IU病毒在處于周期中的腫瘤細胞中具有輕微的復制優勢。通過在計算選擇性指數之前比較每種細胞類型的ED50(病毒)/ED50(對照)比率，可使這種變化的作用最小化。
術語“重組”是指已經通過常規的重組DNA技術進行修飾的基因組。
術語“病毒”是指任何不具有蛋白合成機制或能量產生機制的專性細胞內寄生物。所述病毒基因組可以是包含在脂質膜蛋白的包膜結構中的RNA或DNA。用于實施本發明的病毒的實例包括桿狀病毒科、細小病毒科、小RNA病毒科(picornoviridiae)、皰疹病毒科(herepesviridiae)、痘病毒科、腺病毒科、小轉移RNA病毒科(picotrnaviridiae)。術語重組病毒包括嵌合(乃至多嵌合)病毒，即采用互補編碼序列由一個以上的病毒亞型構建的載體。參見例如Feng等，Nature Biotechnology 15866-870。
術語“腺病毒”與術語“腺病毒載體”同義，是指腺病毒科的病毒屬。術語腺病毒科總起來說是指乳腺病毒屬的動物腺病毒，包括但不限于人、牛、綿羊、馬、犬、豬、鼠和猿腺病毒亞屬。具體而言，人腺病毒包括A-F亞屬以及它們各自的血清型，各自的血清型和A-F亞屬包括但不限于人腺病毒1、2、3、4、4a、5、6、7、8、9、10、11(Ad11A和Ad11P)、12、13、14、15、16、17、18、19、19a、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、34a、35、35p、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48和91型。術語牛腺病毒包括但不限于牛腺病毒1、2、3、4、7和10型。術語犬腺病毒包括但不限于犬腺病毒1型(CLL、Glaxo、RI261、Utrect、Toronto26-61病毒株)和2型。術語馬腺病毒包括但不限于馬腺病毒1型和2型。術語豬腺病毒包括但不限于豬腺病毒3和4型。在本發明的優選實踐中，所述腺病毒得自人腺病毒血清型2或5。
術語“途徑效應啟動子”是指DNA序列，該序列結合某種蛋白并引起鄰近基因對正常細胞的該蛋白結合作轉錄性應答。可以通過加入效應元件制備這類啟動子，所述效應元件為與轉錄因子結合的序列。這種效應通常是誘導性的，但是存在蛋白水平的增加降低轉錄的一些情況。途徑效應啟動子可以是天然產生或者合成獲得。途徑效應啟動子通常根據途徑或被靶向的功能性蛋白構建。例如，天然產生的p53途徑效應啟動子包括由于存在功能性p53(如p21或bax啟動子)而被激活的轉錄控制元件。或者，可以使用含最小啟動子(例如SV40TATA盒區)上游p53結合位點的合成啟動子產生合成途徑效應啟動子。合成途徑效應啟動子通常由一個或多個拷貝的匹配共有結合基元的序列構建。這種共有DNA結合基元易于測定。這種共有序列通常以直線或以被幾個堿基對分隔的頭-尾重復序列排列。含頭-頭重復序列(例如AGGTCATGACCT)的元件稱為回文序列或反向重復序列，而那些含尾-尾重復序列的元件稱為反卷重復序列。
用于實施本發明的途徑效應啟動子的實例包括含共有胰島素結合序列的合成性胰島素途徑效應啟動子(Jacob等，(1995).J.Biol.Chem.27027773-27779)、細胞因子途徑效應啟動子、糖皮質激素途徑效應啟動子(Lange等(1992)J Biol Chem 26715673-80)、IL1和IL6途徑效應啟動子(Won K.-A和Baumann H.(1990)Mol.Cell.Biol.103965-3978)、T3途徑效應啟動子、含共有基元5′AGGTCA 3′的甲狀腺激素途徑效應啟動子、TPA途徑效應啟動子(TRE)、TGF-β途徑效應啟動子(如在Grotendorst等，(1996)Cell Growth and Differentiaion7469-480中所述)。其它途徑效應啟動子的實例是本領域眾所周知的，并可以在通過國際互聯網http://www.eimb.rssi.ru/TRRD獲得的真核生物基因組轉錄調節區數據庫中對其進行鑒定。
本文列舉的本發明的優選實踐中，所述載體包含在功能性TGF-β途徑存在下有活性的合成性TGF-β途徑效應啟動子，諸如含SRE和PAI-RE效應元件的啟動子。PAI-RE是指包含TGF-β信號、分離自纖溶酶原激活物-I啟動子區的效應序列的合成TGF-β效應元件。PAI-RE的構建描述于本文的實施例3。所述PAI-RE途徑效應啟動子可以作為分離自質粒p800luc的一個749個堿基對片段分離(如在Zonneveld等，(1988)PNAS 855525-5529中所述并可以登錄號J03836由GenBank獲得)。SRE是指包含重復的4個Smad-4 DNA結合序列(GTCTAGAC，如在Zawel等，(1988)Mol.Cell 1611-617中所述)的合成TGF-β效應元件。SRE的構建描述于本文的實施例3。所述SRE效應元件可以通過退火編碼Smad-4結合序列的互補寡核苷酸并在質粒pGL#3-啟動子熒光素酶載體(購自ProMega)中克隆而產生。
同樣地，“p53途徑效應啟動子”是指在功能性p53途徑存在下有活性的轉錄控制元件。所述p53途徑效應啟動子可以是在功能性p53途徑存在下有活性的天然產生的轉錄控制區，例如p21或mdm2啟動子。或者，所述p53途徑效應啟動子可以是在功能性p53途徑存在下有活性的合成性轉錄控制區，例如SRE和PAI-RE途徑效應啟動子。p53-CON代表一個含合成p53效應元件的p53途徑效應啟動子，它通過在SV40 TATA盒的上游插入兩個合成p53共有DNA結合序列(如在Funk等，(1992)Mol.Cell Biol.122866-2871中所述)而構建。p53-CON途徑效應啟動子的構建描述于本文的實施例3。RGC是指使用單一p53結合域的、在核糖體基因簇中鑒定的合成p53途徑效應啟動子。Kern等(1991)Science 2521708-1711和Park等(1996)MolecularCarcinogenesis 16101-108。p53CON和RGC效應元件可以通過退火互補寡核苷酸構建，而p53效應啟動子可以通過在質粒pGL3-啟動子熒光素酶載體(可購自ProMega)中克隆構建(在實施例3中更充分地描述)。
術語“靶細胞”是指希望通過給予治療性轉基因處理的特定表型狀態的細胞。通過使用各種途徑效應啟動子元件，人們可以將所述病毒的表達導向具有完整途徑的任何特定細胞。例如可以在贅生性靶細胞中，通過使用TGF-β或p53途徑效應啟動子表達病毒復制阻遏物。同樣地，可以在關節炎靶細胞中，通過炎癥效應啟動子表達病毒復制阻遏物，其中所述載體可選地編碼IL-10。
術語“有效連接的”是指多核苷酸元件以功能性關系連接。當一個核酸序列與另一個核酸序列處于功能性關系時，該核酸序列是“有效連接的”。例如，啟動子或增強子如果影響編碼序列的轉錄，則該啟動子或增強子與所述編碼序列有效連接。有效連接意指所連接的核苷酸序列通常是連續的。然而，因為增強子通常在與所述啟動子相隔幾千個堿基時起作用，并且內含子序列的長度可以變化，所以某些多核苷酸元件可以有效連接但不直接位于側翼，甚至可以在不同等位基因或染色體的易位中起作用。
術語“病毒復制阻遏物”是指如果在給定細胞中表達，顯著阻遏病毒復制的蛋白。正如本領域的技術人員將預見到的，所述病毒復制阻遏物將取決于衍生本發明重組載體的親代腺病毒載體的性質。例如，當為腺病毒載體或其它DNA腫瘤病毒時，可以使用E2F-Rb融合構建物，該構建物描述于1995年12月6日公開的歐洲專利申請第94108445.1號(公開號0 685 493 A1)。E2F-Rb融合蛋白由融合Rb生長抑制域(野生型Rb蛋白的氨基酸379-928)的人E2F轉錄因子蛋白(野生型E2F的氨基酸95-286)的DNA結合域和DP1雜二聚化域組成。E2F-Rb融合蛋白是E2F依賴性轉錄的有效阻遏物，并使細胞停滯在G1期。所述DNA結合域位于氨基酸128-193，而所述二聚化域位于氨基酸194-289。人E2F-1蛋白的序列根據登錄號M96577由GenBank(1992年8月10日收錄)獲得。當構建用于其它物種的載體時，可以使用來自其它物種的其它E2F家族成員的E2F序列。在所述重組病毒是基于腺伴隨病毒(AAV)的情況下，不存在腺病毒感染時，rep蛋白及其衍生物是病毒復制的有效阻遏物。在所述病毒是衍生自單純皰疹病毒的情況下，ICPO-NX蛋白(立即早期蛋白ICPO的缺失形式(Liun等，(1998)J.Virol.727785-7795))可以用作病毒復制的有效阻遏物。同樣地，任何顯性失活活性的蛋白都可以用作病毒復制的阻遏物。
TGF-β和相關蛋白(包括活化素、抑制素以及BMP)是有效的天然抗增殖劑，據信它們在抑制腫瘤發生中起重要作用。生物活性形式的TGF-β是一個25 kDa的二硫鍵連接的同型二聚體，并真正在所有人類組織中表達。有趣的是，許多惡性細胞類型保有見于正常細胞的表達模式。TGF-β通過I型和II型絲氨酸/蘇氨酸激酶受體的雜二聚化受體復合物發送信號。在這兩種受體激酶中，II型受體具有內在的激酶活性，并在結合TGF-β配體時，II型受體與I型受體雜二聚化并對I型受體轉磷酸。I型受體的磷酸化激活其激酶活性，這又導致細胞內效應子Smad的磷酸化。磷酸化的I型受體將信號傳送到細胞內，導致如生長抑制的細胞反應。一旦在細胞核內，則已知Smad復合物或者通過它們自身作為轉錄因子起作用，或者通過調節其它轉錄因子的活性，激活靶基因的轉錄。據信由TGF-β信號調節的轉錄因子包括CTF/NF1、FAST-1、Spl、Jun、SRF/TRF、Oct和CREB。這些相互作用的最終結果導致各種已知的TGF-β的基因多效作用。
轉化生長因子-β(TGF-β)和相關蛋白是許多細胞類型增殖的有效抑制物。幾種上皮腫瘤和造血源性腫瘤的惡性發展與TGF-β的抗增殖和抗侵染作用的喪失有關。已經表明，TGF-β不能發送信號與所述受體和/或信號轉導途徑的細胞內效應子表達的突變或缺失或缺乏有關。許多抗TGF-β的惡性腫瘤的其它腫瘤抑制基因也多重缺損，因此限制了用于有效治療的腫瘤抑制基因替換的實用性。
通過加入纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-啟動子)的序列或SV40TATA盒上游的Smad4/DPC4(SRE-啟動子)結合位點，構建TGF-β途徑效應啟動子。在瞬時轉染測定中，使用熒光素酶作為報道基因，評價這些啟動子的活性。結果示于下表2
這些結果證實，這兩種啟動子僅在具有功能性TGF-β信號轉導的細胞中有活性。在TGF-β途徑缺陷細胞系如MDA-MB468(它由于純合缺失Smad4/DPC4而造成TGF-β信號轉導缺陷)中，轉染有效連接熒光素酶的PAI啟動子或SRE啟動子并用編碼Smad4的重組腺病毒感染，恢復了以上兩種效應元件的活性，這進一步證實這些含效應元件的啟動子對TGF-β途徑的特異性，正如下表3所示數據所證實的一樣。
然后構建含有效連接至E2F-Rb的PAI啟動子的質粒，并測試其在具有完整TGF-β途徑的細胞中選擇性抑制E2啟動子的能力。在瞬時轉染測定中，連接熒光素酶的E2啟動子與有效連接E2F-Rb的PAI啟動子的共轉染顯示在293細胞(具有正常的TGF-β途徑)中選擇性抑制E2啟動子活性，而不能在MDA-MB 468細胞(具有缺損的TGF-β途徑)中選擇性抑制E2啟動子活性，如表4所示，這是因為E2F-Rb在293細胞中選擇性表達。正如所預料的，與在這兩種細胞系中都表達E2F-Rb的CMV-E2F-Rb的共轉染在這兩種細胞系中都抑制E2啟動子的活性。
通過加入已知的源自核糖體基因簇(RGC啟動子)或者高親和力p53結合位點(p53CON啟動子)的p53結合位點，構建p53途徑效應啟動子。在瞬時轉染測定中，使用熒光素酶作為報道基因，評價這些啟動子的活性。這些試驗的結果示于下表5。
結果表明，這兩種效應元件在具有功能性p53的細胞中有活性。為了證實所述p53效應啟動子活性是緣于功能性p53，用驅動熒光素酶基因表達的RGC啟動子和或者空表達盒對照腺病毒載體(ZZCB)或者在CMV啟動子控制下組成產生p53的重組腺病毒(FTCB)，共轉染WIDR和U87兩種細胞系。這些試驗的結果示于表6。
由所示數據可以看出，p53效應啟動子活性以劑量依賴方式隨p53活性的增加而增加。
產生處于或TGF-β途徑效應啟動子(PAI或SRE)或p53途徑效應啟動子(RGC或p53CON)控制下的編碼E2F-Rb融合編碼序列的重組腺病毒。另外，還在所述載體中加入編碼綠色熒光蛋白的基因作為報道基因。測試產生的病毒的選擇性復制能力和在細胞致病作用(CPE)測定中殺傷TGF-β途徑缺陷或p53途徑缺陷細胞的能力。結果示于附圖中的圖1。在MRC9(p53途徑陽性和TGF-β途徑陽性)中，野生型腺病毒甚至能以低濃度(1×106顆粒/ml)復制并誘導CPE，而TGF-β或p53途徑導向載體在該濃度不能誘導CPE。途徑導向載體僅在最高測試劑量(1×108顆粒/ml)顯示一定的CPE。相反，在諸如WIDR(p53和TGF-β途徑均缺損)和Hep3B(p53無效以及在沒有外源性TGF-β的情況下TGF-β途徑缺損)細胞系中，途徑導向載體甚至在低濃度(1×106顆粒/ml)都和野生型病毒一樣有效誘導CPE。熒光顯微檢測用途徑導向載體(SRE-Ad和p53CON-Ad)感染的Hep3B細胞，結果顯示甚至在低顆粒濃度(1×105顆粒/ml，暴露2小時)感染時，所述細胞都高水平表達所述轉基因，并在培養物中擴散所述病毒。相反，用復制缺陷(E1A缺失)的編碼GFP的腺病毒(GFCB)，以相同濃度(1×105顆粒/ml)感染Hep3B細胞，顯示沒有GFP表達。
如先前所指出的，本發明的載體能夠選擇性復制并能在選擇條件下裂解靶細胞。然而，這并不意味著暗示不能將其它層面的選擇性或毒性工程入這些載體。本發明還提供含病毒基因組其他修飾的重組腺病毒，如導向修飾、轉基因表達盒或促進在特定細胞類型選擇性復制或表型狀態的病毒基因組修飾。
術語“導向修飾”是指為優先感染特定細胞類型而設計的病毒基因組修飾。在衍生自特征為廣泛感染性的病毒(諸如腺病毒)的載體中，通過修飾病毒包膜蛋白，也可以實現細胞類型特異性或細胞類型導向性。例如，用腺病毒載體，通過選擇性修飾病毒基因組染色紐和尾絲編碼序列，實現與獨特細胞表面受體特異性相互作用的修飾的染色紐和尾絲結構域的表達，已經實現了細胞導向。這種修飾的實例描述于Wickham等，(1997)J.Virol 71(11)8221-8229(在腺病毒尾絲蛋白中加入RGD肽)；Arnberg等，(1997)Virology 227239-244(修飾腺病毒尾絲基因以獲得對眼和生殖道的向性)；Harris和Lemoine(1996)TIG12(10)400-405；Stevenson等，(1997)J.Virol.71(6)4782-4790；Michael等，(1995)Gene Therapy 2660-668(在腺病毒尾絲蛋白中加入胃泌素釋放肽片段)；以及Ohno等，(1997)Nature Biotechnology 15763-767(在Sindbis病毒中加入A蛋白-IgG結合域)。已經通過將抗體或抗體片段與包膜蛋白結合，獲得細胞特異性導向的其它方法(參見例如Michael等，(1993)J.Biol.Chem.2686866-6869，Watkins等，(1997)GeneTherapy 41004-1012；Douglas等，(1996)Nature Biotechnology 141574-1578)。另一方面，特定部分可以與病毒表面結合以實現細胞特異性導向(參見例如Nilson等，(1996)Gene Therapy3280-286(將EGF與逆轉錄病毒蛋白接合))。可以按照本發明的實踐生產這些重組修飾的載體。
術語“轉基因表達盒”是指在有效連接治療性轉基因的靶細胞中起作用的啟動子。術語啟動子是指影響另一個核苷酸序列轉錄的核苷酸序列。啟動子的實例包括弱組成型啟動子、時序病毒啟動子或可調節啟動子。
術語“時序啟動子”是指相對于控制途徑效應啟動子表達的啟動子，在病毒周期晚期的一個時間點驅動治療性轉基因轉錄的啟動子。這種時序調節啟動子的實例包括腺病毒主要晚期啟動子(MLP)、其它啟動子如E3。在本發明的優選實踐中，使用MLP啟動子。對于單純皰疹病毒而言，可以使用潛伏激活啟動子。
術語“可調節啟動子”是指誘導型啟動子、組織特異性啟動子或腫瘤特異性啟動子。術語“誘導型啟動子”是指優選(或僅)在某些條件下和/或應答外界化學物質或其它刺激物，促進所述治療性轉基因轉錄的啟動子。誘導型啟動子的實例在科學文獻中是已知的(參見例如Yoshida和Hamada(1997)Biochem.Biophys.Res.Comm.230426-430；Iida等，(1996)J.Virol.70(9)6054-6059；Hwang等，(1997)J.Virol 71(9)7128-7131；Lee等，(1997)Mol.Cell.Biol.17(9)5097-5105；以及Dreher等，(1997)J.Biol.Chem.272(46)；29364-29371。輻射誘導啟動子的實例描述于Manome等，(1998)Human Gene Therapy 91409-1417)。可以通過使用組織特異性或腫瘤特異性啟動子賦予其它水平的選擇性。組織特異性啟動子和腫瘤特異性啟動子是本領域眾所周知的，包括優選在平滑肌中有活性的啟動子(α-肌動蛋白啟動子)、胰腺特異性啟動子(Palmiter等，(1987)Cell 50435)、肝特異性啟動子(Rover等，(1992)J.Biol.Chem.26720765；Lemaihne等，(1993)J.Biol.Chem.26819896；Nitsch等，(1993)Mol.Cell.Biol.134494)、胃特異性啟動子(Kovarik等，(1993)J.Biol.Chem.2689917)、垂體特異性啟動子(Rhodes等，(1993)Genes Dev.7913)、前列腺特異性啟動子等。
術語“治療性轉基因”是指其在靶細胞中的表達產生治療作用的核苷酸序列。術語治療性轉基因包括但不限于腫瘤抑制基因、抗原基因、細胞毒性基因、細胞靜止基因、前體藥物激活基因、凋亡基因、藥用基因或抗血管生成基因。本發明的載體可以或者通過串聯使用IRES元件，或者通過獨立調節的啟動子，用于生產一個或多個治療性轉基因。
術語“腫瘤抑制基因”是指其在靶細胞中的表達能夠抑制贅生性表型和/或誘導凋亡的核苷酸序列。用于實施本發明的腫瘤抑制基因的實例包括p53基因、APC基因、DPC-4/Smad4基因、BRCA-1基因、BRCA-2基因、WT-1基因、成視網膜細胞瘤基因(Lee等，(1987)Nature329642)、MMAC-1基因、腺瘤息肉大腸桿菌蛋白(Albertsen等，美國專利5,783,666號，1998年7月21日授予)、缺失的結腸癌(DCC)基因、MMSC-2基因、NF-1基因、位于染色體3p21.3.的鼻咽癌腫瘤抑制基因(Cheng等，1998.Proc.Nat.Acad.Sci.953042-3047)、MTS1基因、CDK4基因、NF-1基因、NF-2基因以及VHL基因。
術語“抗原基因”是指其在靶細胞中的表達導致產生能夠被免疫系統識別的細胞表面抗原蛋白的核苷酸序列。抗原基因的實例包括癌胚抗原(CEA)、p53(如在1994年2月3日公開的Levine，A.的PCT國際公開號WO94/02167中的描述)。為了易于免疫識別，抗原基因可以和MHCI類抗原融合。
術語“細胞毒性基因”是指其在細胞中的表達產生毒性作用的核苷酸序列。此類細胞毒性基因的實例包括編碼假單胞桿菌外毒素、蓖麻毒蛋白毒素、白喉(diptheria)毒素等的核苷酸序列。
術語“細胞靜止基因”是指其在細胞中的表達引起細胞周期停滯的核苷酸序列。此類細胞靜止基因的實例包括p21、成視網膜細胞瘤基因、E2F-Rb融合蛋白基因、編碼細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑的基因如P16、p15、p18以及p19、Branellec等所述的生長抑制特異性同源框(GAX)基因(1997年5月9日公開的PCT公開號WO97/16459和1996年10月3日公開的PCT公開號WO96/30385)。
術語“細胞因子基因”是指其在細胞中的表達產生細胞因子的核苷酸序列。此類細胞因子的實例包括GM-CSF；白介素，尤其是IL-1、IL-2、IL-4、IL-12、IL-10、IL-19、IL-20；α、β和γ亞型干擾素，尤其是α-2b干擾素；以及諸如干擾素α-2α-1的融合體。
術語“趨化因子基因”是指其在細胞中的表達產生細胞因子的核苷酸序列。術語趨化因子是指一組結構上相關的低分子量細胞因子，所述細胞因子由結構上相關的并具有促有絲分裂活性、趨化活性或炎性活性的細胞分泌。它們主要為共享4個半胱氨酸殘基的70-100個氨基酸殘基的陽離子蛋白。這些蛋白可以根據兩個N端半胱氨酸的間隔分為兩組。在第一組中，所述兩個半胱氨酸被單個殘基分隔(C-x-C)，而在第二組中，它們是相鄰的(C-C)。‘C-x-C’趨化因子成員的實例包括但不限于血小板因子4(PF4)、血小板堿性蛋白(PBP)、白介素-8(IL-8)、黑素瘤生長刺激活性蛋白(MGSA)、巨噬細胞炎性蛋白2(MIP-2)、小鼠Mig(m119)、小雞9E3(或pCEF-4)、豬塵細胞趨化因子I型和II型(AMCF-I和-II)、前B細胞生長刺激因子(PBSF)以及IP10。‘C-C’組成員的實例包括但不限于單細胞趨化蛋白1(MCP-1)、單細胞趨化蛋白2(MCP-2)、單細胞趨化蛋白3(MCP-3)、單細胞趨化蛋白4(MCP-4)、巨噬細胞炎性蛋白1α(MIP-1-α)、巨噬細胞炎性蛋白1β(MIP-1-β)、巨噬細胞炎性蛋白1γ(MIP-1-γ)、巨噬細胞炎性蛋白3-α(MIP-3-α)、巨噬細胞炎性蛋白3β(MIP-3-β)、趨化因子(ELC)、巨噬細胞炎性蛋白4(MIP-4)、巨噬細胞炎性蛋白5(MIP-5)、LD78β、RANTES、SIS-ε(p500)、胸腺和活化調節趨化因子(TARC)、eotaxin、I-309、人蛋白HCC-1/NCC-2、人蛋白HCC-3、小鼠蛋白C10。
術語“藥物蛋白基因”是指其表達導致產生的蛋白在靶細胞中具有藥理作用的核苷酸序列。此類藥物基因的實例包括胰島素原基因和類似物(如PCT國際專利申請號WO98/31397中所述)、生長激素基因、多巴胺、血清素、表皮生長因子、GABA、ACTH、NGF、VEGF(增加對靶組織的血液灌流、誘導血管生成，1998年7月30日公開的PCT公開號WO98/32859)、血小板反應蛋白等。
術語“原凋亡基因”是指其表達導致所述細胞程序性細胞死亡的核苷酸序列。原凋亡基因的實例包括p53、腺病毒E3-11.6K(衍生自Ad2)或腺病毒E3-10.5K(衍生自Ad)、腺病毒E4orf4基因、p53途徑基因以及編碼caspases的基因。
術語“前體藥物激活基因”是指核苷酸序列，該序列的表達產生能夠將非治療性化合物轉變為治療性化合物的蛋白，從而使得所述細胞對外界因子的殺傷敏感或引起所述細胞毒性狀態。前體藥物激活基因的實例是胞嘧啶脫氨酶基因。胞嘧啶脫氨酶將5-氟胞嘧啶(5-FC)轉變為5-氟尿嘧啶(5-FU)，它是一種有效的抗腫瘤藥物。腫瘤細胞的裂解在所述腫瘤的局部位置產生局部大量的能夠將5FC轉變為5FU的胞嘧啶脫氨酶，從而殺死許多周圍腫瘤細胞。這導致殺死大量的腫瘤細胞，而不必用腺病毒感染這些細胞(所謂的“旁觀者效應”)。另外，可以使用胸苷激酶(TK)基因(參見例如Woo等，1997年5月20日頒發的Freeman等的美國專利第5,631,236號，以及1997年2月11日頒發的美國專利第5,601,818號)，其中表達所述TK基因產物的細胞對給予9-[1，3-二羥-2-丙氧甲基]鳥嘌呤(gancyclovir)的選擇性殺傷易感。
術語“抗血管生成”基因是指其表達導致細胞外分泌抗血管生成因子的核苷酸序列。抗血管生成因子包括制管張素、血管內皮生長因子(VEGF)抑制劑如Tie2(如在PNAS(USA)(1998)958795-8800中的描述)、內抑制素(endostatin)。
對本領域技術人員顯而易見的是，修飾和或缺失以上提及的基因，以便編碼所述野生型蛋白的功能性亞片段，可能易于實施本發明。例如，提及的p53基因不僅包括野生型蛋白，而且包括修飾的p53蛋白。這類修飾的p53蛋白的實例包括修飾p53以增加核保留、缺失諸如Δ13-19氨基酸以消除鈣蛋白酶共有切割位點、對寡聚化結構域的修飾(如Bracco等在PCT公開申請號WO97/0492或美國專利第5,573,925號中所述)。
將對本領域技術人員顯而易見的是，上述治療基因可以分泌到培養基中，或由導向部分(諸如信號肽或核定位信號(NLS))的內涵體定位于細胞內特定的位置。在治療性轉基因的定義中還包括治療性轉基因和單純皰疹病毒1型(HSV-1)結構蛋白VP22的融合蛋白。含有所述VP22信號的融合蛋白當在感染細胞中合成時，輸出到所述感染細胞之外，并有效進入周圍直徑約為16個細胞寬范圍內的非感染細胞。此系統特別用于和轉錄活性蛋白(例如p53)結合，因而融合蛋白能夠有效轉運到周圍細胞的細胞核中。參見例如Elliott，G.&O′Hare，P.Cell.88223-2331997；Marshall，A.&Castellino，A.Research News Briefs.NatureBiotechnology.152051997，O′Hare等，1997年2月13日公開的PCT申請號WO97/05265。Vives等在(1997)J.Biol.Chem.27216010-16017中還描述了一種衍生自HIV Tat蛋白的相似導向部分。
增加本發明載體效力的其它修飾包括但不限于E1內部改變、在E4中導入突變以增加細胞毒性(Muller等(1992)J.Virol.665867-5878)、上調病毒死亡蛋白如E4orf4或E3 11.6K蛋白。
在本文例舉的本發明優選實踐中，本發明的載體包含條件性復制的腺病毒，它含有驅動E2F-Rb融合蛋白表達的p53或TGF-β途徑效應啟動子，還含有處于時序性E3啟動子控制下的胞嘧啶脫氨酶基因。在此情況下，胞嘧啶脫氨酶只在病毒復制之后的腫瘤細胞中產生。在本發明的優選實踐中，所述前體藥物轉化基因處于相對弱的組織特異性啟動子或腫瘤特異性啟動子控制之下。
在本發明的另一實施方案中，所述載體包含具有驅動E2F-Rb融合蛋白表達的p53或TGF-β途徑效應啟動子的重組腺病毒和單獨表達胞嘧啶脫氨酶或以含胞嘧啶脫氨酶的雙順反子表達盒的轉基因表達盒，以及IRES元件和MIP-3-α蛋白。因為表達胞嘧啶脫氨酶，所以在給予如5-氟胞嘧啶的前體藥物時實現了對腫瘤細胞的殺傷。低水平表達MIP-3-α將有助于形成抗腫瘤免疫。
在本文中可交替使用的多水平、多功能或多途徑效應級聯是指構建途徑效應元件，以便產生治療作用，在該治療作用中可以同時探測到一個以上的途徑。對本領域技術人員顯而易見的是，可以組合如上所述的載體控制元件，以提供對本發明載體的多層選擇性。作為多水平控制的實例，應該能夠設計一種可復制并殺死Rb、TGF-β或p53途徑缺陷細胞的條件復制腺病毒。這種載體將包括表達由p53效應啟動子作為第一控制水平控制的病毒復制的顯性失活抑制劑。結果，在任何具有功能性p53的細胞(例如所有的正常細胞)中，但不是在p53失活的細胞中，表達所述顯性失活抑制劑并阻斷所述病毒復制。然而，該載體可以在具有功能性p53但其它途徑(如TGF-β和Rb途徑)缺陷的腫瘤細胞中復制。因此，可以插入使功能性p53在腫瘤細胞中基本失活的其它水平的控制，由此當其他途徑缺陷時允許病毒復制。
作為第二水平的控制，所述載體還應包括含腺病毒E1B-51K蛋白的表達盒，它可以在僅在TGF-β途徑缺陷細胞中有活性的啟動子控制下使p53功能失活。可以通過將阻遏物結合位點插入啟動子中，使得使用TGF-β效應啟動子在所述載體的其它位置表達所述阻遏物將導致在具有完整TGF-β信號轉導的細胞中阻斷所述啟動子活性，從而構建僅在TGF-β途徑缺陷細胞中有活性的啟動子。在另一方面，在TGF-β途徑缺陷的細胞中不合成所述阻遏物，所述啟動子將因此有活性。因為E1B-55K由僅在TGF-β途徑缺陷細胞中有活性的啟動子表達，所以內源性p53失活。或者，可以使用任何由于TGF-β信號發送而下調的天然啟動子。上述兩種表達盒的內含物將確保僅在p53和TGF-β途徑都正常時(導致復制阻斷)表達顯性失活抑制物，但在它們中的一個缺陷或兩個都缺陷時(導致病毒復制)不表達。
作為第三水平的控制，在相同載體中實現了蛋白的表達，所述蛋白例如Smad7或任何其它顯性失活形式的Smad，它能夠使E2F效應啟動子控制的TGF-β途徑失活(Nakao等，Nature 1997年10月9日；389(6651)631-635)的。當Rb途徑缺陷時，E2F效應啟動子(諸如E2F1啟動子、E2啟動子或在最小啟動子如SV40 TATA盒上游具有多個E2F結合位點的合成啟動子)有活性。因為此第三水平的控制，在Rb途徑缺陷細胞中，Smad7的表達又使Smad4失活，并阻斷TGF-β信號轉導。因此，制備E1B-55K和p53失活導致所述顯性失活抑制物不能表達。因此，病毒復制可以不受妨礙地進行。另一方面，如果Rb途徑正常，則Smad7不能合成，因此TGF-β信號轉導正常進行。因此，不制備E1B-55K，導致功能性p53能夠表達顯性失活抑制物以阻斷病毒復制。
在上述三種控制水平的情況下，所述三種途徑(Rb、TGF-β以及p53)中的任何一種或兩種或全部缺陷將最終導致病毒復制和細胞裂解。只有所有三種途徑都和在正常細胞中一樣起作用時，才不會發生病毒復制。
正如本領域的技術人員能夠意識到的，本發明的載體可以采用各種不同的途徑效應啟動子，以許多變化用于檢測和治療多種多樣的途徑缺陷。然而，在本文例舉的本發明優選實踐中，重組腺病毒載體得自腺病毒科病毒屬。特別優選的病毒得自人腺病毒2型或5型。當腺病毒載體用做親代載體時，優選的病毒復制抑制物是E2F-RB融合蛋白。
在本發明的優選實踐中，當使用本發明載體治療與不受控的細胞增殖相關的疾病時，最好是要使用的腺病毒載體在E1A區含有特異性缺失，以便消除E1 a基因產物結合p300和Rb蛋白的能力，同時保留E1a CR3結構域的反式激活功能。本發明載體在E1a編碼序列中包含缺失，以消除在13S編碼序列中的p300和p105-Rb結合位點。在本發明的優選實踐中，p300結合缺失表現為缺失約4至約25的氨基酸或約36至約49的氨基酸。
對于實現消除p300和pRb結合所必需的E1a 289R編碼序列中的缺失最好是最低限度的，以盡可能防止對E1a 289R蛋白的二級和三級結構的大的破壞。為了消除p300結合，最好是在289R的p300結合域DNA編碼序列中導入突變。盡管優選較小的修飾，但最好是在C末端區缺失低于約30個氨基酸，以消除p300結合。例如，可優先選擇缺失氨基酸4至25(dl1101)、缺失約氨基酸30至氨基酸49(dl1103)以及更具體的缺失氨基酸36至49，以消除p300結合。特別優選足以破壞p300結合的點突變。例如，已經證實，在289R蛋白中的第二個氨基酸由精氨酸變為甘氨酸(Arg2→Gly2)的點突變破壞p300結合(參見例如pm563，Whyte等，(1989)Cell5667-75)。同樣地，關于消除pRb105結合，優選最小修飾。最好是在pRb105結合域中消除選擇的氨基酸，例如氨基酸111-123(dl1107)和氨基酸124-127(dl1108)。特別優選消除氨基酸111-123(dl1107)，因為它保留289R蛋白的p107結合活性。
另外，可以導入對E1a 289R蛋白由約219至289氨基酸的消除，以及對E1A 243R蛋白的由173至243氨基酸的消除。例如，通過在相當于人Ad5基因組的位置1131的位置引入點突變(即將胞嘧啶1131變為鳥嘌呤)，產生一個終止密碼子。該突變消除E1a 289R蛋白的氨基酸219至289和E1A 243R蛋白的氨基酸173至243。除了上述的Rb和p300結合缺失以外，可任選地產生該突變。這類親代載體的其它實例描述于共同未決的美國專利申請序號60/104,317和1998年10月15日提交的美國專利申請序號08/09/172,684。
在本文例舉的本發明優選實踐中，優選的p53途徑效應啟動子是p53-CON和RGC。優選的TGF-β途徑效應啟動子選自PAI-RE和SRE。
在本發明優選實踐中，治療性基因是前體藥物激活基因，例如胞嘧啶脫氨酶。在誘導抗腫瘤免疫的本發明優選實踐中，本發明的載體編碼MIP-3-α。
用于表達所述治療性基因的優選啟動子是諸如MLP和E3的時序啟動子。
在腺病毒構建物中，實現了消除或延遲Ad E3-11.6K蛋白的作用，以使腺病毒誘導的細胞裂解最小化，直至復制。特別優選消除天然E3-11.6K/10.5K基因。這將使免疫應答最小化，直至首輪局部擴散發生之后。在所述后一時刻，一旦最初感染的細胞出現凋亡并允許局部病毒擴散，那么所述免疫應答將是有利的。所述11.6K蛋白(或對應的Ad5的E3-10.5K蛋白)是原凋亡基因，并可以用于殺傷腫瘤細胞。然而，因為人們希望延遲靶細胞的早期裂解以使病毒復制最大化，所以最好是將所述11.6K/10.5K基因置于時序啟動子如MLP啟動子控制之下，以延遲其凋亡作用的發生。
藥用制劑本發明還提供藥學上可接受的所述重組病毒與載體組合的制劑。本發明的載體可以實際配制為按照外加載體和賦形劑的常規藥物便于按劑量給予的制劑。給藥方式可以包括靜脈內、腫瘤內(intratumoral)、肌內、腹膜內、局部、基質或氣溶膠傳遞。
術語“載體”是指通常用于藥用化合物制劑的化合物，用來增強所述治療性化合物的穩定性、無菌性和傳遞能力。當所述病毒配制為溶液或懸浮液時，傳遞系統采用可接受的載體，最好是水性載體。可以使用各種各樣的水性載體，例如水、緩沖液、0.8％鹽水、0.3％甘氨酸、透明質酸等。這些組合物可以通過常規的、眾所周知的除菌技術除菌，或者可以無菌過濾除菌。獲得的水溶液可以封裝原樣使用或凍干，凍干制劑在給予前和無菌溶液混合。所述組合物根據需要可以包含藥學上可接受的輔助性物質以接近生理條件，諸如pH調節劑和緩沖劑、張力調節劑、濕潤劑等，例如乙酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、山梨醇(sorption)一月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯等。
本發明還提供本發明的病毒和載體以及一種(或多種)輸送增強劑的藥用制劑。術語“輸送增強物”或“輸送增強劑”在本文中交替使用，包括一種或多種促進所述病毒進入靶細胞的物質。輸送增強物的實例描述于共同未決美國專利申請序列號第09/112,074號(1998年7月8日提交)和第08/938,089號(1997年9月26日提交)。這種輸送增強劑的實例包括洗滌劑、醇類、二元醇、表面活性劑、膽汁鹽、肝素拮抗劑、環加氧酶抑制劑、高滲鹽溶液和乙酸鹽。醇類包括例如脂肪族醇，諸如乙醇、正丙醇、異丙醇、丁基乙醇、乙酰基乙醇。二元醇包括丙三醇、丙二醇、聚乙二醇和其它低分子量二元醇如甘油和硫代甘油。輸送增強劑的其它實例是乙酸鹽，例如乙酸、葡糖酸和乙酸鈉。高滲鹽溶液如1M NaCl也是輸送增強劑的實例。表面活性劑的實例是十二烷基硫酸鈉(SDS)和溶血卵磷脂、多乙氧基醚、壬基苯氧基聚氧乙烯、溶血磷脂酰膽堿、聚乙二醇400、多乙氧基醚、聚氧乙烯醚、聚乙二醇醚表面活性劑和DMSO。可以使用的膽汁鹽例如為牛磺膽酸、牛磺脫氧膽酸鈉、脫氧膽酸、鵝脫氧膽酸鹽、甘氨膽酸、鵝脫氧甘膽酸和其它收斂劑，例如硝酸銀。還可以使用象季銨一樣的肝素拮抗劑，例如硫酸魚精蛋白。可以使用的環加氧酶抑制劑例如為水楊酸鈉、水楊酸和非甾族類抗炎藥(NSAIDS)，例如吲哚美辛、萘普生、雙氯酚酸鈉。輸送增強劑包括式I的化合物I其中X1和X2選自膽酸基、脫氧膽酸基和糖基，m為2-8的整數，優選為2或3，n為2-8的整數，優選為2或3，而R是陽離子基團、糖基或-CO-X3結構，其中X3為糖基。所述糖基可選自戊糖單糖基、己糖單糖基、戊糖-戊糖二糖基、己糖-己糖二糖基、戊糖-己糖二糖基和己糖-戊糖二糖基。
術語“洗滌劑”包括陰離子、陽離子、兩性離子和非離子洗滌劑。洗滌劑的實例包括但不限于牛磺膽酸、脫氧膽酸、脫氧牛磺膽酸、十六烷基苯基偶氮二氨基吡啶、氯化苯甲烴銨(benalkonium chloride)、Zwittergent 3-14洗滌劑、CHAPS(3-[(3-膽酰氨丙基)二甲銨]-1-丙磺酸酯水合物)、Big CHAP、脫氧Big CHAP、Triton-X-100洗滌劑、C12E8、辛基-B-D-吡喃葡糖苷、PLURONIC-F68洗滌劑、吐溫20洗滌劑和吐溫80洗滌劑(CalBiochem Biochemicals)。
本發明的單位劑型可以包含在一個產物試劑盒中，該試劑盒含有凍干形式的權利要求1的重組病毒和重構所述凍干產物的溶液。本發明的重組病毒可以通過常規方法凍干并重構。
本發明的載體也可以和鈣蛋白酶抑制劑一起給予。所述“鈣蛋白酶抑制劑”(簡寫為“CI”)是指抑制鈣蛋白酶I例如μ-鈣蛋白酶蛋白水解作用的化合物。本文所用的術語鈣蛋白酶抑制劑包括除了其它生物活性以外還具有鈣蛋白酶I抑制活性的那些化合物，或者獨立于其它生物活性而具有鈣蛋白酶I抑制活性的那些化合物。已經證實，各種各樣的化合物都具有抑制鈣蛋白酶蛋白水解作用的活性。用于實施本發明的鈣蛋白酶抑制劑的實例包括也稱為“鈣蛋白酶抑制劑1”的N-乙酰基-leu-leu-正亮氨酸(norleucinal)。已經觀察到鈣蛋白酶抑制劑增加細胞對病毒載體的感染性，利用增加水平的NF-κB和AP-1轉錄因子增強啟動子的轉錄，以及減少對腺病毒載體的CTL應答。因此，本發明的制劑和方法可任選地包括鈣蛋白酶抑制劑。鈣蛋白酶抑制劑及其應用描述于1998年10月15日提交的Atencio等的共同未決美國專利申請序號第60/104,321和09/073,076號。
使用方法本發明提供一種方法，該方法通過使靶細胞與本發明的選擇性復制載體接觸，殺傷調節途徑缺陷的細胞。在本文例舉的本發明的一個實施方案中，包含途徑缺陷的所述細胞是贅生性細胞。術語“贅生性細胞”是表現出與正常細胞生長控制無關為特征的異常生長表型的細胞。因為贅生性細胞不一定在任何特定時間點復制，所以術語贅生性細胞包含可活躍復制的細胞或處于暫時非復制性靜止狀態(G1或G0)的細胞。贅生性細胞的局部群體稱為瘤。瘤可以為惡性或良性。惡性瘤也稱為癌癥。術語癌癥和術語腫瘤在本文中交替使用。瘤性轉化是指正常細胞轉變為贅生性細胞，通常為腫瘤細胞。
本發明提供一種方法，該方法通過給予藥學上可接受的本發明的重組腺病毒制劑，在哺乳動物體內消除贅生性細胞。術語“消除”是指活的贅生性細胞群明顯減少，以便減輕存在所述贅生性細胞引起的生理失調。術語“明顯”是指在哺乳動物機體中活的贅生性細胞群的減少為處理前群的約20％以上。術語“活的”是指具有贅生性細胞不受控制的生長和細胞周期調節特征。術語“活的贅生性細胞”在本文中用于區分所述細胞和不能再復制的贅生性細胞。例如，腫瘤塊可以在治療后繼續存在，但組成所述腫瘤塊的細胞群可能是死的。即使某些腫瘤塊還可能保留，但這些死亡的細胞已經被切除或失去復制能力。
術語“哺乳動物”包括但不限于人、豬、馬、牛、犬、貓。最好是使用對治療的哺乳動物類型為內源性的腺病毒載體。盡管使用來自待治療物種的病毒通常是有利的，但在某些情況下，可優選使用具有有利的病原特征的得自不同物種的載體。例如，有報道(1997年4月10日公開的WO 97/06826)指出可在人類基因治療中使用綿羊腺病毒載體，以使人腺病毒載體的免疫應答特征最小化。通過使免疫應答最小化，避免了所述載體的快速系統性清除，導致所述載體作用時間更長。
本發明的載體特別適用于治療與缺乏TGF-β抗增殖作用有關的腫瘤，包括但不限于乳癌、肝癌、胃癌、結腸癌和皮膚癌，以及B淋巴瘤和T淋巴瘤(Markowitz和Roberts，1996)。已經在結腸癌、胃癌、頭頸鱗狀細胞癌中鑒定出II型TGF-β受體的突變。也已經在Kaposi肉瘤、乳腺腫瘤、卵巢腫瘤和結腸直腸腫瘤中發現了I型TGF-β受體缺失的突變。在TGF-β信號轉導的細胞內效應子Smad中，Smad4/DPC4被鑒定為侯選腫瘤抑制基因，它在接近50％的胰腺癌中發生改變。在結腸癌、乳癌和卵巢癌中也發現了改變的DPC4基因，盡管機率低得多。本發明的載體特別用于治療TGF-β不敏感的腫瘤，例如胰腺癌。
本發明的載體還適用于治療含p53途徑缺陷的腫瘤細胞。這些腫瘤包括具有p53、mdm2和p14/p19ARF(INK4a基因)改變的腫瘤。本發明的載體還可用于治療Rb途徑缺陷的癌細胞。Rb途徑缺陷起因于Rb、細胞周期蛋白D、依賴細胞周期蛋白的激酶(例如CDK4)和p16(INK4a基因)的改變。
盡管本發明提供了單獨使用所述重組腺病毒的方法，但本發明的重組腺病毒及其制劑還可以同常規化療藥物或治療方案聯合使用。這種化療藥物的實例包括嘌呤合成抑制劑(例如戊制菌素、6-巰基嘌呤、6-硫代鳥嘌呤、氨甲蝶呤)或嘧啶合成抑制劑(例如Pala、azarbine)、核糖核苷酸轉變為脫氧核糖核苷酸(例如羥脲)、dTMP合成抑制劑(5-氟尿嘧啶)、DNA損傷劑(例如放射、博來霉素、鬼臼亞乙苷、表鬼臼毒噻吩糖苷、放線菌素、道諾紅霉素、阿霉素、二羥基蒽酮、烷化劑、絲裂霉素、順氯氨鉑、普魯芐肼)以及微管功能抑制劑(例如長春花生物堿和秋水仙素)。化療治療方案主要是指用來切除贅生性細胞的非化學方法，例如放射性治療。當所述治療性基因為p53時，聯合治療的實例描述于1998年8月20日公開的Nielsen等的WO/9835554A2。
免疫應答對體內重復給予病毒載體是重要的。因此，本發明的載體可以和免疫抑制劑聯合給予。免疫抑制劑的實例包括環孢菌素、硫唑嘌呤、氨甲蝶呤、環磷酰胺、淋巴細胞免疫球蛋白、抗CD3復合物的抗體、腎上腺皮質類固醇、水楊酸偶氮磺胺吡啶、FK-506、敏白靈和酞胺哌啶酮。
本發明還提供一種方法，該方法通過向贅生性細胞污染的正常細胞群給予本發明的重組腺病毒，體外切除所述細胞群中的贅生性細胞。目前該方法的一個應用實例是用于體外用途，例如通常稱為骨髓清洗的自身干細胞制品清洗。術語“干細胞制品”是指能夠再建接受myoablative therpay患者的長期造血功能的造血細胞群、祖細胞群和干細胞群。干細胞制品通常由取出(apheresis)或流動或非流動的外周血獲得。通常使用已知方法，采用市售的取出裝置，例如COBEInternational，Oak街1185號，Lakewood，CO出售的COBE光譜取出系統，實現取出。最好是優化治療條件以達到“3個對數的清洗”(即從干細胞制品中去除約99.9％的腫瘤細胞)，最優選是達到“5個對數的清洗”(即去除干細胞制品中約99.999％的腫瘤細胞)。在本發明的優選實踐中，100ml體積的干細胞制品應以約2×1011本發明載體的顆粒數/有核細胞比率于37℃處理約4小時。
診斷用途除了上述治療用途以外，本發明的載體還用于診斷目的。例如，本發明的載體可加入在病毒感染和復制時表達的報道基因。術語“報道基因”是指其產物能夠單獨或與其它元件組合產生可檢測信號的基因。報道基因的實例包括β-半乳糖苷酶基因、熒光素酶基因、綠色熒光蛋白基因、編碼可通過如X射線的成象系統或磁場成象系統(MRI)檢測的蛋白的核苷酸序列。這樣的載體將用于檢測功能性途徑(例如p53途徑或TGF-β途徑)的存在。或者，這類載體也可以用于表達能夠被例如熒光標記抗體的結合分子識別的細胞表面蛋白。或者，其中使用途徑效應啟動子驅動病毒復制阻遏物(例如E2F-Rb)的晚期病毒啟動子(例如由E2F-Rb產生的E2或任何具有例如E2F結合位點的阻遏物結合位點的其它啟動子)，可用于控制用于診斷用途的、其中沒有途徑效應啟動子的報道基因。這些診斷構建物可用于體內或體外診斷目的。體內的應用實例包括成象用途，例如X射線、CT掃描或磁共振成象(MRI)。
載體的制備方法本發明還提供一種產生如上所述的重組病毒的方法，所述方法包括以下步驟
a.用重組病毒感染生產細胞，b.在多種條件下培養所述感染的生產細胞，以允許所述病毒基因組在所述生產細胞中復制，c.收獲所述生產細胞，和d.純化所述重組病毒。
術語“感染”是指在多種條件下將所述重組病毒暴露于所述生產細胞，以促進重組腺病毒感染生產細胞。在已經被多拷貝的特定病毒感染的細胞中，病毒復制和病毒體包裝所需的活性是協同的。因此，最好是調整這些條件，使得存在明顯的所述病毒多次感染所述生產細胞的可能性。增強病毒在所述生產細胞中產生的一個條件實例是增加感染階段的病毒濃度。然而，每個生產細胞的病毒感染總數有可能過多，導致對所述細胞的毒性作用。因此，人們應當努力將病毒感染濃度保持在1×106至1×1010病毒體/ml的范圍內，最好是約1×109病毒體/ml。也可以使用化學試劑增加生產細胞系的感染性。例如，本發明提供一種利用鈣蛋白酶抑制劑的內含物增加生產細胞系對病毒感染的感染性的方法。用于實施本發明的鈣蛋白酶抑制劑的實例包括鈣蛋白酶抑制劑1(也稱為N-乙酰基-亮氨酰-亮氨酰-正亮氨酸，可由Boehringer Mannheim購買)。已經發現鈣蛋白酶抑制劑1增加生產細胞系對重組腺病毒的感染性。
術語“生產細胞”是指能夠促進所產生的重組腺病毒的病毒基因組復制的細胞。可公開獲得各種哺乳動物細胞系用于培養重組腺病毒。例如，已對293細胞系(Graham和Smiley(1977)J.Gen.Virol.3659-72)進行工程改造，以補充E1功能的缺陷，該細胞系是用于生產所述載體的優選細胞系。其它生產細胞的實例包括Hela細胞、PERC.6細胞(如公開號WO/97/00326，申請序列號為PCT/NL96/00244中所述)。
術語“在多種條件下培養，以允許所述病毒基因組復制”是指保持感染生產細胞的條件，以便允許所述病毒在所述生產細胞中繁殖。理想的是控制條件，使得每個細胞生產的病毒顆粒的數量最大。因此，監測和控制反應條件，例如溫度、溶解氧、 pH等，將是必需的。市售的生物反應器例如CelliGen Plus生物反應器(購自New BrunswickScientific，Inc.44 Talmadge Road，Edison，NJ)具有監測和保持這類參數的裝置。然而，最佳的感染和培養條件將多少有所變化，本領域的技術人員考慮了所述生產細胞系的已知特性、所述病毒的特性、生物反應器類型等后，可以獲得病毒有效復制和生產的條件。當使用293細胞作為生產細胞系時，氧濃度最好保持在約50％-約120％溶解氧，優選100％溶解氧。當病毒顆粒的濃度(通過常規方法例如使用Resource Q柱的HPLC進行測定)開始達到穩定水平時，對反應器進行收獲。
術語“收獲”是指由培養基中收集含所述重組腺病毒的細胞。這可以通過常規方法實現，例如差速離心法或層析法。在此階段，可儲存的收獲的細胞，或者可通過裂解和純化進一步加工收獲的細胞，以分離所述重組病毒。對于儲存而言，所收獲的細胞應以生理pH或在生理pH左右緩沖，并冷凍于-70℃。
術語“裂解”是指破裂所述生產細胞。通過各種本領域已熟知方法可以實現裂解。當需要由所述生產細胞分離病毒顆粒時，使用各種本領域已知方法裂解細胞。例如，可在低壓(100-200psi分壓)條件下或用常規凍融法裂解哺乳動物細胞。通過用DNA酶/RNA酶降解除去外源性游離的DNA/RNA。
術語“純化”是指由裂解的生產細胞中分離大致純的重組病毒顆粒群。可以使用常規的純化技術，例如層析法或密度差異梯度離心法。在本發明的優選實踐中，基本按照如在1995年3月7日提交的共同未決美國專利申請序列號第08/400,793號中所述的Huyghe等(1995)Human Gene Therapy 61403-1416的方法，通過柱層析純化所述病毒。
其它的優化本發明的重組腺病毒生產的方法和步驟描述于1998年5月4日提交的共同未決美國專利申請序列號第09/073,076號，題目病毒生產方法。
實施例以下的實施例提供了試驗的方法和結果，證實具體重組腺病毒和質粒載體的構建。對本發明所屬領域的技術人員而言顯而易見的是，本發明可以有別于這些實施例中具體公開的形式實施，而不背離本發明的宗旨或基本特征。因此，以下描述的本發明的具體實施方案被認為是說明性的和非限制性的。在以下的實施例中，“g”代表克，“ml”代表毫升，“mol”代表摩爾，“℃”代表攝氏度，“min”代表分鐘，“FBS”代表胎牛血清，而“PN”是指重組病毒的顆粒數。
實施例1.質粒構建在800bp的PAI啟動子控制下編碼熒光素酶的質粒p800luc得自David Luskutoff博士(Scripps Institute，LaJolla，California)。在腺病毒-5三聯前導序列后含一個CMV啟動子和在E2F-RB融合蛋白編碼序列上游含一個SV40增強子的質粒pCTMIE-E2F-Rb由Doug Antelman(Canji)提供。
實施例2.構建具有TGF-β效應啟動子的熒光素酶質粒A.PAI-熒光素酶質粒以5′-3′方向顯示所有片段的序列。一個749bp的片段兩側于5′和3′末端分別具有SacI位點和XhoI位點，并且由SV40 TATA盒代替所述啟動子中的天然TATA盒，使用模板p800luc和引物AGT CGAGCT CCA ACC TCA GCC AGA和GAT CCT CGA GCT CCT CTGTGG GCC ACT GCC TCC TCA TAA ATA CC(含SV 40 TATA盒)，通過PCR擴增該片段。獲得的PCR產物用SacI和XhoI消化，并連接至在消化一種不含啟動子的熒光素酶構建物PGL3-基(basic))(Promega)之后獲得的片段，以獲得PAI-熒光素酶。
B.SRE-熒光素酶質粒退火以下的寡核苷酸GG TAT TTA TGA GGA GGC AGT GGCCCA CAG AGG AGC TCG AGG ATC和GAT CCT CGA GCT CCTCTG TGG GCC ACT GCC TCC TCA TAAATA CC。用XhoI消化退火產物，并連接至用MluI消化的PGL3-基，用Klenow平端化，并用XhoI消化以獲得pSVT-luc(一種具有SV40 TATA盒的熒光素酶構建物)。退火含Smad4/DPC4結合位點的寡核苷酸CGT CTA GAC GTC TAGACG TCT AGA CGT CTA GAC TGT AC和AGT CTA GAC GTC TAGACG TCT AGA CGT CTA GAC GGT AC，并連接至用KpnI消化的pSVT-熒光素酶，獲得SRE-熒光素酶質粒。
實施例3.構建具有p53效應啟動子的熒光素酶質粒A.RGC-熒光素酶質粒退火兩個含核糖體基因簇的p53結合位點的互補性5′-磷酸化寡核苷酸AG AAA AGG CAA GGC CAG GCA AGT CCA GGC AACTCG TGG TAC和CA CGA GTT GCC TGG ACT TGC CTG GCC TTGCCT TTT CTG TAC。將退火的片段連接至用KpnI消化的pSVT-熒光素酶，獲得RGC-熒光素酶質粒。
B.p53CON-熒光素酶質粒退火兩個含共有p53結合位點(p53CON)的互補性5′-磷酸化寡核苷酸CT CGA CGG ACA TGC CCG GGC ATG TCC TCG ACG GACATG CCC GGG CAT GTC CTG TAC和AG GAC ATG CCC GGG CATGTC CGT CGA GGA CAT GCC CGG GCA TGT CCG TCG AGGTAC。將退火的片段連接至用KpnI消化的pSVT-熒光素酶，獲得p53CON-熒光素酶質粒。
C.PAI-E2F-Rb質粒
通過用BglI和XbaI消化，切除質粒pCTMIE-E2F-Rb中的序列，該序列在腺病毒-5三聯前導序列后含有CMV啟動子，并在E2F-RB融合蛋白的編碼序列上游含有一個SV40增強子，連接所獲得的片段，獲得啟動子減少的E2F-RB質粒。通過用SacI和XhoI消化，由質粒PAI-熒光素酶切除含修飾的PAI啟動子的片段，并用Klenow處理進行平端化。將該片段連接至用EcoRI消化并用DNA聚合酶I的Klenow片段處理的啟動子減少的E2F-RB質粒，獲得PAI-E2F-RB質粒。
實施例4.重組腺病毒的制備用BamHI、AccI和Klenow處理由pBHG11(26676至34140)至pNEB193(來自NEB的質粒)的7.4 kb的SnaBI片段，通過克隆該片段構建含E3區缺失3-kb的Ad5序列的轉移質粒pNEBΔE3。通過退火5-磷酸化寡核苷酸AAA TAC GTA ATG CAT TCT AGA GCG GCCGCT CGC GAG GAT CCT TAA T和TAA GGA TCC TCG CGA GCGGCC GCT CTA GAA TGC ATT ACG TAT TTA T，并通過連接至用PacI消化的pNEBΔE3引入退火的片段，將多個克隆位點引入上述質粒中，獲得pNEBΔE3(MCS)質粒。
如下構建產生重組腺病毒的轉移質粒，該質粒編碼處于PAI-啟動子控制下的E2F-Rb和處于CMV啟動子控制下的增強的綠色熒光蛋白(GFP)。通過連接含PAI啟動子的片段和用NacI和XbaI消化PAI-E2F-Rb制備的E2F-Rb編碼序列，并連接至用KpnI消化制備的pABS.4質粒(Microbix)片段，用Klenow處理，并用XbaI再消化，制備中間態載體pABS.4-E2F-Rb。然后用PacI消化，用Klenow處理，由質粒pABS.4-E2F-Rb切除含PAI啟動子、E2F-Rb編碼序列和卡那霉素基因的片段，并連接至用PacI消化pNEBΔE3質粒并用Klenow處理獲得的質粒片段，獲得不含PacI位點的質粒pNEBΔE3-PAI-E2F-Rb。通過用SwaI消化pNEBΔE3-PAI-E2F-Rb，并將其連接至用AflII和SspI消化并用Klenow處理由pEGFP-N(Clontech)分離的片段，用有效連接至綠色熒光蛋白(GFP)基因的CMV啟動子替換該質粒中的卡那霉素基因，獲得pΔE3-PAI-E2F-Rb-GFP質粒。
如下構建產生重組腺病毒的轉移質粒，該質粒編碼處于含SRE的TGF-β效應啟動子控制下的E2F-Rb和處于CMV啟動子控制下的增強的綠色熒光蛋白(GFP)。通過連接用XbaI和NruI消化pNEBΔE3(MCS)而分離的片段和用XbaI和NaeI消化pCTMIE-E2F-Rb產生的片段，將E2F-Rb編碼序列引入質粒pNEBΔE3(MCS)中，獲得質粒pNEBΔE3-E2F-Rb。使用SRE熒光素酶模板和磷酸化引物GTA AGGTGC CAG AAC ATT TCT C和GAT AAC TAG TGC TCC TCT GTGGGC CAC T，通過PCR擴增含SRE的TGF-β效應啟動子，將該序列引入上述質粒中。用SpeI消化所獲得的PCR產物，并連接至用SnaBI和XbaI消化的pNEBΔE3-E2F-Rb，獲得pΔE3-DPC-E2F-Rb。
如下構建產生重組腺病毒的轉移質粒，該質粒編碼處于p53效應啟動子控制下的E2F-Rb和處于CMV啟動子控制下的增強的綠色熒光蛋白(GFP)。使用RGC-熒光素酶模板或p53CON熒光素酶模板和磷酸化引物GTA AGG TGC CAG AAC ATT TCT C和GAT ATC TAGACG TCC TCT GTG GGC CAC T，通過PCR擴增含來自核糖體基因簇的p53結合位點或p53共有位點(p53CON)的p53效應啟動子序列，將該p53效應啟動子引入質粒pNEBΔE3-E2F-Rb中。獲得的PCR產物用XbaI消化，并連接至SnaBI和XbaI消化的pNEBΔE3-E2F-Rb，獲得pΔE3-RGC-E2F-Rb和pdelataE3-PCON-E2F-Rb。
實施例5.產生重組腺病毒的同源重組如Chartier等，(1996)J.Virol.704805-4810所述，通過在細菌中進行同源重組，產生重組腺病毒PAI-Ad、SRE-Ad、RGC-Ad和CON-Ad。用AscI消化所述轉移質粒，獲得含有處于途徑效應啟動子控制下的E2F-Rb和處于位于Ad5序列側翼的CMV啟動子控制下的GFP的片段。將所獲得的片段與用BstBI和SpeI消化PTG4609(得自Transgene，Inc.并描述于Chartier等，(1996)J.Virol.704805-4810)獲得的片段共轉化到BJ 5183細菌菌株中。在所獲得的細菌菌落中篩選存在所需的重組Ad5感染性質粒pPAI-GFP-Ad、pSRE-GFP-Ad、pRGC-GFP-Ad和pCON-GFP-Ad的菌落。然后用PacI消化這些感染性質粒，使之線性化，并通過苯酚-氯仿萃取和乙醇沉淀純化，用于轉染293細胞。
使用Superfect(Qiagen)，按照生產商的說明進行轉染。使用2.5μg的線性化質粒轉染在每孔含12μl Superfect的6孔培養板上培養的250,000個細胞。8天后，觀察到起因于病毒的產生的細胞致病作用。收獲細胞和培養物上清液，并進行3輪凍融循環。通過再感染293細胞擴增所產生的裂解液中的重組病毒。
實施例6.細胞系在本研究中使用的所有細胞系都得自ATCC(Rockville，MD)，并于CO2培養箱中保持37℃，培養成為單層培養物。293、Hep3B、MRC9、A549、PancI、U87、Caco2、MCF-7和WIDR保持在補加10％胎牛血清的Dulbecco改良型Eagle培養基中。MDA-MB 468細胞在補加10％胎牛血清的Ham培養基中培養，而MiaPaca-2細胞在補加10％胎牛血清和2.5％馬血清的DMEM培養基中培養。
實施例7.轉染將細胞平板接種或者在6孔培養板(250,000細胞/孔)或者在24孔培養板(62,500細胞/孔)中，并使細胞過夜附著。然后如所述對293細胞使用磷酸鈣進行轉染，對其它細胞使用Superfect(Qiagen)按照生產商的說明進行轉染。
實施例8.報道基因/熒光素酶測定用1.5μg報道基因質粒和1.0μg所述抑制劑轉染細胞。轉染后48小時，通過將細胞加入1X報道基因裂解緩沖液(Promega)中并于室溫溫育10分鐘，制備裂解物。使用Top Count(Packard)和Packard的檢測試劑盒，按照Packard的說明書測定熒光素酶活性。
實施例9.檢測病毒介導的細胞致病作用的分析用標明的重組或野生型腺病毒感染細胞，并在感染后的6天中，基本上按照Bischoff等，(1996)Science 274373-376描述的方法，用在20％乙醇中制備的0.5％結晶紫染色。
實施例10.構建cU3EE和cT1LT病毒使用引物GAT CCG ATC GAT AGC GCG TAA TAT TTG TCTAGG GC和GAT CTT AAT TAA ATG GCA GTG ACC CGG AAG，使用諸如質粒pFG140(Microbix)中的Ad5 DNA作為模板，通過PCR擴增MLP啟動子序列。然后在質粒pdelataE3-PCON-E2F-Rb中的PacI位點克隆MLP PCR產物，獲得pdelataE3-PCON-E2F-Rb-MLP。使用引物GCG ACC CAC CCT AAC AGA和GAT CGG ATC CAA AGCGCA ACA AGG GTC A，通過PCR擴增腺病毒E3 10.5K蛋白編碼序列，獲得的PCR產物克隆在質粒pCDNA3.1(Invitrogen)中的Xho I位點，獲得pCDNA3-10.5質粒。然后用DraIII和XbaI消化繼之以Klenow處理，由pCDNA3-10.5中切除腺病毒E3 10.5K蛋白編碼序列，并將其連接至PacI和Klenow處理的pdelataE3-PCON-E2F-Rb-MLP，獲得pdelataE3-PCON-E2F-Rb-MLP-10.5K質粒。
如Chartier等，(1996)J.Virol.704805-4810所述，通過在細菌中進行同源重組，產生重組腺病毒cU3EE和cT1LT。用AscI消化所述轉移質粒，獲得包含處于p53CON序列控制下的E2F-Rb和處于位于Ad5序列側翼的MLP啟動子控制下的E310.5K的片段。將所獲得的片段和通過用BstBI和SpeI消化PTG4609(Transgene)獲得的片段共轉化到BJ 5283細菌菌株中。在所獲得的細菌菌落中篩選存在所需的重組Ad5感染性質粒pCEMD的菌落。按照相似的方法，但是使用PTG4609衍生物(Transgene)獲得Ad5感染性質粒p01/CEMD，在所述PTG4609衍生物中，用含具有01突變的E1A的序列代替野生型E1A序列。然后通過用PacI消化，使這些感染性質粒線性化，并通過苯酚-氯仿萃取和乙醇沉淀純化，用于轉染293細胞。
使用Superfect(Qiagen)，按照生產商的說明對質粒pCEMD和p01/CEMD進行轉染，分別產生重組病毒cU3EE和cT1LT。使用2.5μg的線性化質粒轉染在每孔含12μl Superfect的6孔培養板上培養的500,000個細胞。8天后，觀察到起因于病毒產生的細胞致病作用。收獲細胞和培養物上清液，并進行3輪凍融循環。通過再感染293細胞擴增所產生的裂解液中的重組病毒。
權利要求
1.一種選擇性復制的重組病毒，它包含有效連接至病毒復制阻遏物的途徑效應啟動子。
2.權利要求1的載體，其中所述途徑效應啟動子選自p53途徑效應啟動子、Rb途徑效應啟動子和TGF-β途徑效應啟動子。
3.權利要求2的載體，其中所述病毒得自腺病毒科病毒屬(genus adenoviridiae)。
4.權利要求3的載體，其中所述病毒復制阻遏物為E2F-RB。
5.權利要求4的載體，它還包含一個轉基因表達盒。
6.權利要求5的載體，其中所述治療性轉基因為原凋亡(pro-apoptotic)基因。
7.權利要求6的載體，其中所述前體藥物激活基因為Ad5E3-10.5K。
8.權利要求4的載體，它還包含E1功能的缺失，以便消除p300結合。
9.包含一種選擇性復制的重組病毒和一種藥學上可接受的載體的藥用制劑，所述重組病毒含有一個有效連接至病毒復制阻遏物的途徑效應啟動子。
10.權利要求9的制劑，其中所述病毒得自腺病毒科病毒屬。
11.權利要求10的載體，其中所述病毒復制阻遏物為E2F-RB。
12.權利要求11的載體，它還包含一個轉基因表達盒。
13.權利要求12的載體，其中所述治療性轉基因為原凋亡基因。
14.權利要求13的載體，其中所述前體藥物激活基因為Ad5E3-10.5K。
15.權利要求14的載體，它還包含E1功能的缺失，以便消除p300結合。
16.權利要求14的制劑，它還含有一種輸送增強劑。
17.一種方法，通過使途徑缺陷細胞接觸包含有效連接至病毒復制阻遏物的途徑效應啟動子的選擇性復制重組病毒，殺傷所述靶細胞。
18.權利要求17的方法，其中所述方法在體內實施。
19.權利要求18的方法，其中所述載體通過腹膜內、靜脈內或腫瘤內(intratumoral)注射給予。
20.權利要求17的方法，其中所述方法在體外實施。
21.權利要求14的方法，其中所述方法在體外實施，以消除干細胞制品中的腫瘤細胞。
22.用選擇性復制重組病毒轉化的細胞，所述重組病毒含有有效連接至病毒復制阻遏物的途徑效應啟動子。
23.基本選自p53CON和RGC的p53途徑效應啟動子。
24.選自PAI和SRE的TGF-β途徑效應啟動子。
25.一種重組腺病毒載體，它包含多個途徑效應啟動子，使得所述病毒能夠選擇性地在具有多個途徑缺陷的細胞中復制。
26.組件包含權利要求1的選擇性復制病毒的診斷試劑盒，它還含有一個含報道基因的轉基因表達盒和正確使用的說明書。
27.制備權利要求1的選擇性復制載體的方法，所述方法包含以下步驟(a)用重組病毒感染生產細胞，(b)在多種條件下培養所述感染的生產細胞，以便允許所述病毒(c)基因組在所述生產細胞中復制，(d)收獲所述生產細胞，和(e)純化所述重組病毒。
全文摘要
本發明提供重組病毒，所述重組病毒通過利用途徑效應啟動子，隨著靶細胞的細胞內環境選擇性地復制所述病毒的基因組，所述途徑效應啟動子基于被感染細胞的表型或基因型在宿主細胞中顯著抑制病毒復制。在所述靶細胞中，所述途徑效應啟動子的啟動子元件是失活的，因此允許所述病毒復制。這導致(1)通過所述病毒的自身裂解特性殺傷所述細胞，和/或(2)提供針對所述靶細胞的治療劑量(相對于不能復制的載體增加)的轉基因產物，以及(3)產生局限性濃度的所述病毒，促進周圍的細胞感染所述重組病毒。本發明還提供使用所述載體的治療和診斷方法、含所述載體的藥用制劑、制備所述載體及含所述載體的轉化細胞的方法。
文檔編號A61K48/00GK101092636SQ20071010403
公開日2007年12月26日 申請日期1999年10月14日 優先權日1998年10月15日
發明者M·拉馬錢德拉, P·W·沙布拉姆 申請人:坎吉有限公司