專利名稱：：一種預(yù)防和/或治療過敏性哮喘的疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種預(yù)防和/或治療過敏性哮喘的疫苗。技術(shù)背景哮喘(asthma)是由肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞等多種細(xì)胞參與的慢性氣道炎癥。哮喘的發(fā)病機制主要是I型超敏反應(yīng)(過敏性)。過敏性哮喘多于幼年發(fā)病，患者常具有對某些物質(zhì)過敏的特應(yīng)性體質(zhì)，如吸入冷空氣、花粉、塵螨等；進食魚蝦、牛奶等；或接觸某些藥物，如青霉素。當(dāng)這些過敏原進入患者體內(nèi)，便通過一系列反應(yīng)，使肥大細(xì)胞或嗜堿粒細(xì)胞釋放致敏活性物質(zhì)，作用于支氣管上，造成廣泛小氣道狹窄，發(fā)生喘憋癥狀，如不及時治療，哮喘可以致命。當(dāng)變應(yīng)原進入體內(nèi)后，被樹突狀細(xì)胞等抗原提呈細(xì)胞加工并遞呈給T細(xì)胞，在T細(xì)胞上的CD28與樹突狀細(xì)胞上的B7分子及其分泌的IL-1、IL-12等的相互作用下，T細(xì)胞分化為Th2細(xì)胞，Th2細(xì)胞分泌的IL-3、IL-4、IL-5、IL-13和TNF-a、GM-CSF，其中IL-3、IL-5和GM-CSF影響嗜酸性粒細(xì)胞分化、成熟及存活，而IL-4、IL-5、IL-13和TNF-a則對上調(diào)粘附分子VC細(xì)-1，后者可使中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞黏附于血管內(nèi)皮或向血管內(nèi)皮遷移。IL-4、IL-13則促進B細(xì)胞向IgE合成細(xì)胞分化，此過程需B細(xì)胞上的CD40及T細(xì)胞上的CD40配體相互作用的有效信號。Thl細(xì)胞分泌IL-2、IL-12、IFN-y，能抑制IgE合成及其介導(dǎo)的I型超敏反應(yīng)。因此，Thl/Th2細(xì)胞比例和功能失衡，在哮喘發(fā)病機制中起重要作用。IgE合成后經(jīng)激活肥大細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞，使其脫顆粒并釋放炎性介質(zhì)而引發(fā)氣道炎癥，進而引發(fā)哮喘。氣道中的嗜酸性粒細(xì)胞被激活后，產(chǎn)生IL-8及RANTS，使更多的嗜酸性粒細(xì)胞向炎癥部位滲透。臨床上治療過敏性哮喘除囑咐病人遠(yuǎn)離過敏原外，主要使用激素，以控制哮喘發(fā)作的頻率與周期。然而長期口服激素，可能造成肥胖、骨質(zhì)疏松、高血壓等副作用；吸入激素噴霧可能出現(xiàn)口腔和咽喉的白色念珠菌感染。早在1920年左右，即有研究發(fā)現(xiàn)室內(nèi)灰塵的多寡與發(fā)生氣喘疾病之間的相關(guān)性，直到1965年時才證實室塵螨是室內(nèi)灰塵中過敏原的最主要來源之一。室塵螨是一種八只腳的節(jié)肢微小昆蟲；溫暖且潮濕的環(huán)境有利于其生長與繁衍，人類剝落的皮屑更是其主要的食物來源。室塵螨的排泄物是人類過敏原的重要成分，其次是蟲體本身，而死亡的塵螨仍然具有導(dǎo)致過敏的能力。有人做過這樣的實驗，將塵螨的浸出液稀釋到1/10萬的濃度，給對塵螨過敏的病人進行皮內(nèi)實驗，結(jié)果仍能出現(xiàn)陽性反應(yīng)。其發(fā)病率之高是相當(dāng)驚人的，據(jù)報道，德國60%以上的支氣管哮喘病人的皮試結(jié)果，其中對螨的反應(yīng)陽性率高達(dá)89.4%;北京某醫(yī)院統(tǒng)計120例常年性過敏性鼻炎，螨的皮試陽性者為94例，占總數(shù)的78.3%。在北方，每年春秋兩季是塵螨的繁殖高峰，此時室內(nèi)及糧食內(nèi)含螨量最高；南方空氣潮濕，更利于塵螨的生長繁殖。對塵螨過敏的病人常常是全年都發(fā)病，在塵螨繁殖季節(jié)，可使癥狀加重。因此，室內(nèi)塵螨過敏原是室內(nèi)最主要的致敏因素,可引起哮喘、過敏性鼻炎、變應(yīng)性球結(jié)膜炎等過敏性疾病。而Derpl是塵螨過敏原重要的蛋白組分。Derpl是蛋白酶，其與如組織蛋白酶H等其他半胱氨酸酶的序列具有同源性，它可以切割CD25以及人IgE低親和力受體CD23。它可以誘導(dǎo)機體產(chǎn)生較強的過敏反應(yīng)(ABCofallergies:Avoidingexposuretoindoorallergens.Si(/"1998;316:1075.Isallergenexposurethemajorprimarycauseofasthma.Thorax2000;55:424)。吸入花和草粉而引起的哮喘，稱之為"花粉性哮喘"，這是有過敏素質(zhì)的人在一定的地區(qū)和季節(jié)中因為吸入某些致敏花粉和草，而引起哮喘的季節(jié)性發(fā)作或季節(jié)性加重。還有常見一些霉菌產(chǎn)生的孢子也是過敏源，如點青、芽枝、交鏈孢、煙曲霉菌。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種預(yù)防和/或治療過敏性哮喘的疫苗。本發(fā)明所提供的預(yù)防和/或治療過敏性哮喘的疫苗，它的活性成分是下述混合物由造成過敏性哮喘的蛋白抗原或其表位多肽和在多克隆位點插入所述造成過敏性哮喘的蛋白抗原或其表位多肽編碼基因的重組真核細(xì)胞表達(dá)載體組成的混合物。所述造成過敏性哮喘的蛋白抗原可選自下述抗原中的任意一種氨基酸序列如GenBankAccessionNumberX56279所示的三裂葉豚草(j/^row'atri/Y&)過敏原AmbtV;2、氨基酸序列如GenBankAccessionNumber旭BPV2A所示的多年生豚草C4歷力ro57'3;5^7(95tsc//a)過敏原AmbpV;3、氣基酸序歹U如GenBankAccessionNumberAMBPV3A所示的多年生豚草過敏原AmbpV;4、氨基酸序列如GenBankAccessionNumberAMBPV1B所示的多年生豚草過敏原AmbpV;5、氨基酸序列如GenBankAccessionNumberAMBPV2B所示的多年生豚草過敏原AmbpV;6、氨基酸序列如GenBankAccessionN咖berAMBPV3B所示的多年生豚草過敏原AmbpV;7、氨基酸序列如GenBankAccessionNumberS39330所示的煙曲霉(Asperp'WiAs/謝.卵to)過敏原I/a=IgE-bindingribotoxin;8、氨基酸序歹!j如GenBankAccessionNumberAJ002026所示的煙曲霉過敏原rAspf13;9、氨基酸序列如GenBankAccessionNumberAJ001732所示的煙曲霉過敏原rAspf4;10、氨基酸序列如GenBankAccessionNumberAJ001732所示的煙曲霉過敏原rAspf7;11、氨基酸序列如GenBankAccessionNumberAJ224333所示的煙曲霉過敏原rAspf8;12、氨基酸序列如GenBankAccessionNumberAJ223327所示的煙曲霉過敏原rAspf9;13、氨基酸序列如GenBankAccessionNumberAJ006689所示的煙曲霉過敏原rAspf11;14、氨基酸序列如GenBankAccessionNumberAJ937743所示的煙曲霉過敏原cyclophilin(aspf27);15、氨基酸序列如GenBankAccessionNumberAJ937744所示的煙曲霉過敏原thioredoxin(aspf28);16、氨基酸序列如GenBankAccessionNumberAJ937745所示的煙曲霉過敏原thioredoxin(aspf29);17、氨基酸序列如GenBankAccessionNumberAF282850所示的歐洲白樺黃酮素還原酶(Betulapendulaisoflavonereductase)-likeproteinBetv6.0102(BETV6.0102);18、氨基酸序列如GenBankAccessionNumberAF135127所示的歐洲白樺異黃酮素還原酶-homologBetv6.0101(BETV6);19、氨基酸序列如GenBankAccessionNumberBGU40767所示的德國小蠊(Blattellage而nica)過敏原Blag4;20、氨基酸序列如GenBankAccessionNumberBGU92412所示的德國小蠊過敏原Blag5;21、氨基酸序列如GenBankAccessionNumberBGU28863所示的德國小蠊半胱氨酸蛋白酶前體(asparticproteaseprecursor)過敏原；22、氨基酸序歹ll如GenBankAccessionNumberAF072219所示的德國小蠊主要過敏原(Blag1.0101);23、氨基酸序列如GenBankAccessionNumberAF072221所示的德國小蠊主要過敏原(Blag1.0101)。;24、氨基酸序列如GenBankAccessionNumber號AF072220所示的德國小蠊主要過敏原Blag1.02;25、氨基酸序列如GenBankAccessionNumberAY283288所示的粉塵螨(Dermat叩hagoidesfarinae)Derf2過敏原;26、氨基酸序列如GenBankAccessionNumberAY947536的戶塵螨(Dermatophagoidespteronyssinus)DerDer-pl過敏原；27、氨基酸序列如GenBankAccessionNumberX63517所示的大麥(H.vulgare)Iaml—單體a—淀粉酉每抑制物(raonomericalpha—amylaseinhibitor);28、氨基酸序列如GenBankAccessionN咖berAJ243504所示的黑麥草(Loli咖perenne)花粉過敏原(5C);29、氨基酸序列如GenBankAccessionNumberAJ937746所示的合軸馬拉色菌(Malasseziasympodialis)硫氧還蛋白(thioredoxin,malas13gene);30、氨基酸序列如GenBankAccessionNumberAF072222所示的美洲大蠊(Periplanetaamericana)主要過敏原(Pera1.0101);31、氨基酸序列如GenBankAccessionNumberAF106961所示的美洲l大蠊(Periplanetaamericana)原肌球蛋白(tropomyosin);32、氨基酸序列如GenBankAccessionNumberAF082515所示的紅色毛癬菌(Trichophytonrubr咖)過敏原(Trir2);33、氨基酸序列如GenBankAccessionNumberAF082514所示的紅色毛癬菌過敏原(Trir4);34、氨基酸序列如GenBankAccessionNumberAF082514所示的紅色毛癬菌(rn'c力op力/to/r"力rwz/)過敏原Trir4;35、氨基酸序列如序列表中序列1所示的塵螨Derpi;36、氨基酸序列是KISQAVHAAHAEINEAG的pep323。其中，1、GenBankAccessionNumberX56279,289bpraRNA，三裂葉豚草(Ambrosiatrifida)過敏原基因AmbtV.，編碼區(qū)27..248;2、GenBankAccessionNumberAMBPV2A，234bpmRNA多年生豚草(Ambrosiapsilostachya)過敏原基因AmbpV(A2克隆)，編碼區(qū)1..234;3、GenBankAccessionNumberAMBPV3A，234bpmRNA多年生豚草過敏原基因AmbpV(A3克隆)，編碼區(qū)1..234;4、GenBankAccessionNumberAMBPV1B,234bpmRNA多年生豚草過敏原基因AmbpV(Bl克隆)，編碼區(qū)1..234;5、GenBankAccessionNumberAMBPV2B，234bpmRNA多年生豚草過敏原基因AmbpV(B2克隆)，編碼區(qū)1,,234;6、GenBankAccessionNumberAMBPV3B，234bpmRNA多年生豚草過敏原基因AmbpV(B3克隆)，編碼區(qū)L.234;7、GenBankAccessionNumberS39330,450bpmRNA煙曲霉(Aspergillusf咖igatus)過每夂原I/a=IgE-bindingribotoxin基因，編碼區(qū)1..450;8、GenBankAccessionNumberAJ002026,721bpmRNA煙曲霉過敏原rAspf13基因，編碼區(qū)1..721;9、GenBankAccessionN咖berAJ001732,861bpmRNA煙曲霉過敏原rAspf4基因，編碼區(qū)1..861;10、GenBankAccessionNumberAJ001732,855bpmRNA煙曲霉過敏原rAspf7基因，編碼區(qū)1..339;11、GenBankAccessionNumberAJ224333,336bpmRNA煙曲霉過敏原rAspf8基因，編碼區(qū)1..336;12、GenBankAccessionNumberAJ223327,906bpmRNA煙曲霉過敏原rAspf9基因，編碼區(qū)1..906;13、GenBankAccessionNumberAJ006689,675bpmRNA煙曲霉過敏原rAspf11基因，編碼區(qū)1…537;14、GenBankAccessionNumberAJ937743,492bpmRNA煙曲霉過敏原cyclophilin基因(aspf27)，編碼區(qū)1..492;15、GenBankAccessionNumberAJ937744，600bpmRNA煙曲霉過敏原thioredoxin基因(aspf28)，編碼區(qū)78..404;16、GenBankAccessionNumberAJ937745,582bpm脂A煙曲霉過敏原thioredoxin基因(aspf29)，編碼區(qū)116..448;17、GenBankAccessionNumberAF282850,927bpmRNA歐洲白樺黃酮素還原酶(Betulapendulaisoflavonereductase)-likeproteinBetv6.0102基因(BETV6.0102)，編碼區(qū)1.,927;18、GenBankAccessionNumberAF135127,900bpmRNA歐洲白樺異黃酮素還原酶-homologBetv6.0101基因(BETV6)，編碼區(qū)1…900;19、GenBankAccessionN咖berBGU40767，601bpmRNA德國小蠊(Blattellagermanica)過敏原基因Blag4，編碼區(qū)1..550;20、GenBankAccessionNumberBGU92412，1140bpmRNA德國小蠊過敏原基因Blag5，編碼區(qū)1..605;21、GenBankAccessionNumberBGU28863,1317bpmRNA德國小蠊半胱氨酸蛋白酶前體(asparticproteaseprecursor)過敏原基因，編碼區(qū)3..1061;22、GenBankAccessionNumberAF072219,1429bpmRNA德國小蠊主要過敏原基因，克隆1(Blag1.0101)，編碼區(qū)1..1239;23、GenBankAccessionNumberAF072221,715bpmRNA德國小蠊主要過敏原基因，克隆2(Blag1.0101)，編碼區(qū)1..569;24、GenBankAccessionNumberAF072220,1791bpmRNA德國小蠊主要過敏原基因Blag1.02，編碼區(qū)1..1479;25、GenBankAccessionNumberAY283288,423bpmRNA粉塵螨(Dermatophagoidesfarinae)Derf2過敏原基因，編碼區(qū)1..423;26、GenBankAccessionNumberAY947536,650bpmRNA戶塵螨(Dermatophagoidespteronyssinus)DerDer-pi過敏原基因，編碼區(qū)1..650;27、GenBankAccessionNumberX63517,579bpmRNA大麥(H.vulgare)Iaml—單體a—淀粉酶抑制物(monomericalpha-amylaseinhibitor)基因，編石馬區(qū)1..441;28、GenBankAccessionNumberAJ243504,1215bpmRNA黑麥草(Loli咖perenne)花粉過敏原(5C)基因，編碼區(qū)1…906;29、GenBankAccessionNumberAJ937746,318bpmRNA合軸馬拉色菌(Malasseziasympodialis)硫氧還蛋白(thioredoxin，malas13gene)基因，編碼區(qū)1..318;30、GenBankAccessionNumberAF072222,870bpmRNA美洲大蠊(Periplanetaamericana)主要過敏原(Pera1.0101)基因，編碼區(qū)1.698;31、GenBankAccessionNumberAF106961,1325bpmRNA美洲大賺(Periplanetaamericana)原肌球蛋白基因(tropomyosin)，編碼區(qū)70..924;32、GenBankAccessionNumberAF082515,1505bpmRNA紅色毛癬菌(Trichophytonrubrum)過敏原基因(Trir2)，編碼區(qū)41…1279;33、GenBankAccessionNumberAF082514,2325bpmRNA紅色毛癬菌過敏原基因(Trir4)，編碼區(qū)77..2257;34、GenBankAccessionNumberAF082514,2325bpmRNA紅色毛癬菌(Trichophytonrubrum)過敏原基因(Trir4)，編碼區(qū)77,.2257;35、核苷酸序列如序列表中序列2所示的塵螨Derpl基因。序列表中序列2所示的塵螨Derpi基因，其編碼序列是自序列2的5'端第1至963位脫氧核糖核苷酸。所述預(yù)防和/或治療過敏性哮喘的疫苗，優(yōu)選為由造成過敏性哮喘的蛋白抗原和在多克隆位點插入所述造成過敏性哮喘的蛋白抗原編碼基因的重組真核細(xì)胞表達(dá)載體組成的混合物。在共免疫組合物中，也可以采用過敏性哮喘自身蛋白抗原和在多克隆位點插入所述過敏性哮喘自身蛋白抗原表位多肽編碼基因的重組真核細(xì)胞表達(dá)載體組成的混合物。此混合物同樣可以產(chǎn)生調(diào)節(jié)性T細(xì)胞而抑制過敏性哮喘發(fā)生。同樣，也可以采用過敏性哮喘自身蛋白抗原表位多肽和在多克隆位點插入所述過敏性哮喘自身蛋白抗原編碼基因的重組真核細(xì)胞表達(dá)載體組成的混合物。此混合物同樣可以產(chǎn)生調(diào)節(jié)性T細(xì)胞而抑制過敏性哮喘發(fā)生。采用以上兩種混合物免疫產(chǎn)生的效果與過敏性哮喘自身蛋白抗原和在多克隆位點插入所述過敏性哮喘自身蛋白抗原編碼基因的重組真核細(xì)胞表達(dá)載體組成的混合物產(chǎn)生的效果相同。所述造成過敏性哮喘的蛋白抗原優(yōu)選為氨基酸序列如序列表中序列1所示的塵螨Derpl。所述造成過敏性哮喘的蛋白抗原編碼基因優(yōu)選為核苷酸序列如序列表中序列2所示的塵螨Derpl基因。用于插入所述過敏性哮喘自身蛋白抗原編碼基因或所述過敏性哮喘自身蛋白抗原表位多肽編碼基因的真核細(xì)胞表達(dá)載體可為哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體，如pcDNA3.0或pVAXl或provax(涂亦嫻，金華利，張馨玉，楊若耶，楊富，張富春，王賓。豬瘟病毒E2基因真核表達(dá)載體表達(dá)效率和免疫效果的比較。中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2005，10(6):37—41)。所述預(yù)防和/或治療過敏性哮喘的疫苗的活性成分具體可為氨基酸序列如序列表中序列l(wèi)所示的塵螨Derpl和pVAX-Derpl。所述預(yù)防和/或治療過敏性哮喘的疫苗的活性成分具體還可為p印323和pD323。所述預(yù)防和/或治療過敏性哮喘的疫苗的活性成分中，1)過敏性哮喘自身蛋白抗原和在多克隆位點插入所述過敏性哮喘自身蛋白抗原編碼基因的重組真核細(xì)胞表達(dá)載體的質(zhì)量比為1:5-5:1;優(yōu)選為1:1-1:2;2)過敏性哮喘自身蛋白抗原表位多肽和在多克隆位點插入所述過敏性哮喘自身蛋白抗原表位多肽編碼基因的重組真核細(xì)胞表達(dá)載體的質(zhì)量比為1:5-5:1;優(yōu)選為1:1-1:2;3)過敏性哮喘自身蛋白抗原和在多克隆位點插入所述過敏性哮喘自身蛋白抗原表位多肽編碼基因的重組真核細(xì)胞表達(dá)載體的質(zhì)量比為1:5-5:1;優(yōu)選為1:1-1:2;4)過敏性哮喘自身蛋白抗原表位多肽和在多克隆位點插入所述過敏性哮喘自身蛋白抗原編碼基因的重組真核細(xì)胞表達(dá)載體的質(zhì)量比為1:5-5:1;優(yōu)選為l:l-l:2。所述預(yù)防和/或治療過敏性哮喘的疫苗可通過注射、噴射、滴鼻、滴眼、滲透、吸收、物理或化學(xué)介導(dǎo)的方法導(dǎo)入機體如肌肉、皮內(nèi)、皮下、靜脈、粘膜組織；或是被其他物質(zhì)混合或包裹后導(dǎo)入機體。所述預(yù)防和/或治療過敏性哮喘的疫苗的用量一般為200ug—10nig活性成分/kg體重/次，每7—30天給藥一次，一般共需2-5次。實驗證明OVA抗原表位多肽p印323和在多克隆位點插入p印323編碼基因的重組真核細(xì)胞表達(dá)載pD323組成的混合物可抑制免疫小鼠的T細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)免疫抑制的產(chǎn)生，并能夠有效地預(yù)防和/或治療由OVA蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生的過敏性哮喘的發(fā)生。由于外界過敏原多是蛋白質(zhì)，而導(dǎo)致哮喘的過敏原多數(shù)為吸入性，所以支氣管哮喘動物模型的制作多采用過敏原致敏后，再經(jīng)氣道給予變應(yīng)原誘發(fā)哮喘發(fā)生。制作過敏性哮喘動物模型的過敏原主要有卵蛋白(ovalbumin,OVA)、蛔蟲卵、塵螨、豚草花粉、真菌孢子、蟑螂以及某些職業(yè)性致喘物質(zhì)。所以國際上利用OVA(雞卵蛋白，gradeV，Sigma公司)在小鼠體內(nèi)進行致敏和激發(fā)，再在氣管處誘導(dǎo)哮喘發(fā)生作為代表性可重復(fù)的哮喘動物模型用于評價哮喘的預(yù)防和治療效果(CurrentProtocolsinImmunology;支氣管哮喘動物模型的研究狀況http:〃www.biantaifanying.cn/News/news—detail.aspid=83)。本發(fā)明利用OVA過敏原中的抗原表位的p印323和pD323聯(lián)合免疫抑制OVA過敏源誘發(fā)的哮喘，同樣也能得出由其它過敏源蛋白造成過敏性哮喘的蛋白抗原或其表位多肽和在多克隆位點插入所述造成過敏性哮喘的蛋白抗原或其表位多肽編碼基因的重組真核細(xì)胞表達(dá)載體組成的混合物也可抑制哮喘。圖la為各組小鼠肺組織灌洗液中細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞的計數(shù)結(jié)果圖lb為各組小鼠肺組織灌洗液中細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞的計數(shù)結(jié)果圖2a為各組小鼠肺組織HE-20X染色照片圖2b為各組小鼠肺組織HE-40X染色照片圖2c為各組小鼠肺組織PAS-40X染色照片圖3a為各組小鼠血清中抗體的檢測結(jié)果圖3b為各組小鼠血清中細(xì)胞因子的檢測結(jié)果圖4&為各組小鼠的004+0025+的T調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)量圖4b為抗體注射后各組小鼠肺組織灌洗液中細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞的計數(shù)結(jié)圖5a為流式細(xì)胞分析各免疫組小鼠的脾細(xì)胞、非T細(xì)胞、T細(xì)胞、CD4+、CD8+、CD4+CD25一T細(xì)胞對靶細(xì)胞擴增的抑制圖5b為p印323和pD323共免疫組以及p印323和pcDNA3.0共免疫組小鼠的嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)比較圖6為p印323和pD323共免疫組以及p印323和pcDNA3.0共免疫組的CD4+CD25—T調(diào)節(jié)細(xì)胞抑制0VA或BSA抗原免疫的T細(xì)胞增殖情況圖7a為流式細(xì)胞分析p印323和pD323共免疫組以及p印323和pcDNA3.0共免疫組的IL-10的表達(dá)情況圖7b為流式細(xì)胞分析p印323和pD323共免疫組以及p印323和pcDNA3.0共免疫組的IFN-Y的表達(dá)情況圖7c為流式細(xì)胞分析p印323和pD323共免疫組以及p印323和pcDNA3.0共免疫組的Foxp3的表達(dá)情況圖7d為流式細(xì)胞分析p印323和pD323共免疫組以及p印323和pcDNA3.0共免疫組的IL-4的表達(dá)情況圖7e為RT-PCR檢測p印323和pD323共免疫組以及p印323和pcDNA3.0共免疫組小鼠免疫后7天的TGF-e的表達(dá)情況圖8為流式細(xì)胞分析IL-10和TGF-P兩種細(xì)胞因子體外參與CD4+CD25—T調(diào)節(jié)細(xì)胞的調(diào)解功能情況的結(jié)果圖9為流式細(xì)胞分析IL-10和TGF-P兩種細(xì)胞因子體內(nèi)參與CD4+CD25—T調(diào)節(jié)細(xì)胞的調(diào)解功能情況的結(jié)果具體實施例方式實施例1、p印323和pD323聯(lián)合免疫抑制哮喘實驗方法實驗動物雌性BALB/c小鼠(8-10周齡)購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所。D011.IO小鼠(8-IO周齡)購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司(SLAC)。中和抗體實驗中所用的各種中和抗體，包括anti-CD25，anti-CD4，anti-IL-10，anti-IFN-y，anti-TGF-0及anti-IL-4，anti-IL-2均由購自ATCC(Manassas，VA，USA)的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)獲得。一、實驗方法1、哮喘模型誘導(dǎo)將0VA(Sigma，USA;lmg/ml溶于PBS)作為過敏抗原與等體積的10%的鋁鹽(Sigma，USA)混合，室溫條件下震蕩混合2小時。經(jīng)過750Xg5min的離心，棄上清并用去離子水將OVA/鋁的復(fù)合物重新懸浮使其濃度為lmg/ml。第0天時，每只雌性BALB/c小鼠(8-10周齡)腹腔注射100u1OVA/鋁復(fù)合物，第8，14，16和18天，分別利用100ug/100ulOVA(溶于PBS)經(jīng)過氣管注入小鼠的肺組織，進行哮喘模型的誘導(dǎo)。2、疫苗的制備合成肽疫苗是將OVA抗原的323-339位肽段(氨基酸序列是KISQAVHAAHAEINEAG)在體外合成并與不完全弗氏佐劑乳化而得到，命名為p印323;核酸疫苗是將表達(dá)此肽段的cDNA克隆至真核表達(dá)載體并命名為pD323;最后是載體對照pcDNA3.0(Invitrogen公司)。其中，pD323的構(gòu)建方法如下將編碼OVA抗原的323-339位肽段的DNA序列(AAGATATCTCAAGCTGTCCATGCAGCACATGCAGAAATCAATGAAGCAGGC)由北京奧科公司體外合成，其上下游序列分別加入H眾^II和Ba/sHI的酶切位點，然后將其克隆至真核表達(dá)載體pcDNA3.0的H^c5n和BarfH多克隆位點內(nèi)，得到的重組載體命名為pD323。3、疫苗免疫在誘導(dǎo)小鼠哮喘前，小鼠被分組并分別肌肉注射p印323(100u1/100ug/只)，pD323(100ul/100Pg/只)，p印323+pD323，p印323+pcDNA3，每組6只小鼠，在-15天(誘導(dǎo)前15天)和-5天(誘導(dǎo)前5天)分別注射兩次；在劑量實驗中，不同劑量的核酸疫苗pD323將會與固定劑量的p印323混合后免疫，具體劑量在結(jié)果圖中顯示。具體免疫方法如下將72只雌性BALB/c小鼠(8-10周齡)，均分為12組，每組6只小鼠，第l組為對照組，只在第0天時，每只小鼠腹腔注射100u10VA/鋁復(fù)合物。第2組為模型組，按照步驟1的方法進行哮喘模型誘導(dǎo)。第3組為pD323免疫組，共肌肉注射免疫兩次，第一次免疫后10天，再加強一次，每次每只分別免疫含100微克pD323的0.9%NaCl水溶液100微升；第二次免疫后5天，按照步驟1的方法進行哮喘模型誘導(dǎo)。第4組為p印323免疫組，共肌肉注射免疫兩次，第一次免疫后10天，再加強一次，每次每只分別免疫含100微克p印323的0.9。/oNaCl水溶液100微升；第二次免疫后5天，按照步驟1的方法進行哮喘模型誘導(dǎo)。第5組為pcDNA3.0和p印323共免疫組(V+P或V+P印)，共肌肉注射免疫兩次，第一次免疫后10天，再加強一次，每次每只分別免疫含100微克p印323和100微克pcDNA3.0的0.9%NaCl水溶液100微升；第二次免疫后5天，按照步驟1的方法進行哮喘模型誘導(dǎo)。第6組為p印323和pD323共免疫組(pD323+p印323、D+P或D+P印)，共肌肉注射免疫兩次，第一次免疫后10天，再加強一次，每次每只分別免疫含100微克p印323和100微克pD323的0.9%NaCl水溶液100微升；第二次免疫后5天，按照步驟1的方法進行哮喘模型誘導(dǎo)。第7組為p印323和pD3231)共免疫組，共肌肉注射免疫兩次，第一次免疫后10天，再加強一次，每次每只分別免疫含100微克p印323和25微克pD323的0.9%NaCl水溶液100微升；第二次免疫后5天，按照步驟1的方法進行哮喘模型誘導(dǎo)。第8組為p印323和pD323(2:1)共免疫組，共肌肉注射免疫兩次，第一次免疫后10天，再加強一次，每次每只分別免疫含100微克p印323和50微克pD323的0.9%NaCl水溶液100微升；第二次免疫后5天，按照步驟1的方法進行哮喘模型誘導(dǎo)。第9組為p印323和pD323(1:1)共免疫組，共肌肉注射免疫兩次，第一次免疫后10天，再加強一次，每次每只分別免疫含100微克p印323和100微克pD323的0.9%NaCl水溶液100微升；第二次免疫后5天，按照步驟1的方法進行哮喘模型誘導(dǎo)。第10組為p印323和pD323(1:2)共免疫組，共肌肉注射免疫兩次，第一次免疫后10天，再加強一次，每次每只分別免疫含100微克p印323和200微克pD323的0.9%NaCl水溶液100微升；第二次免疫后5天，按照步驟1的方法進行哮喘模型誘導(dǎo)。第ll組為p印323和pD323(1:4)共免疫組，共肌肉注射免疫兩次，第一次免疫后10天，再加強一次，每次每只分別免疫含100微克p印323和400微克pD323的0.9%NaCl水溶液100微升；第二次免疫后5天，按照步驟1的方法進行哮喘模型誘導(dǎo)。第12組為pcDNA3.0和p印323(1:2)共免疫組，共肌肉注射免疫兩次，第一次免疫后10天，再加強一次，每次每只分別免疫含100微克p印323和200微克pcDNA3.0的0.9%NaCl水溶液100微升；第二次免疫后5天，按照步驟1的方法進行哮喘模型誘導(dǎo)。4、抗體中和有些實驗中，為了在體內(nèi)中和細(xì)胞因子的功能，在小鼠前兩次氣管注入OVA的同時，將被靜脈注射50ug的中和抗體(包括抗IL-10和TGF-P)。5、肺組織灌洗液中細(xì)胞數(shù)的測定在最后一次0VA抗原灌肺后24h，小鼠被麻醉致死。由喉部手術(shù)剝離其氣管，用0.8ral生理鹽水經(jīng)氣管注入并反復(fù)灌洗肺組織3-5次。收集灌洗液，離心并重懸于100ml含有0.1%BSA的生理鹽水中。細(xì)胞經(jīng)瑞士-吉木薩染液染色后分別進行細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞的計數(shù)。6、組織學(xué)檢測在最后一次0VA抗原灌肺后24h，小鼠被麻醉致死。取小鼠的肺組織進行固定、包埋和切片。分別進行服E(hematoxylinforevaluation)染色和PAS(periodicacid-Schiff)染色。7、抗體檢測在最后一次0VA抗原灌肺后5天，分離小鼠抗血清。利用ELISA方法檢測血清中OVA抗原特異性的IgGl、IgG2a和IgE抗體水平。其中，用于包被的抗原為0VA(Sigraa，USA)，lmg/ml溶于PBS;—抗為分離的血清，二抗分別為辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgGl、IgG2a和IgE(這些二抗均購自Sigma公司)。8、RT-PCR:在最后一次0VA抗原灌肺后24小時，收集小鼠肺組織灌洗液并離心得到總細(xì)胞，利用TRIzolreagent(Promega，USA)提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄，并利用特異性異物PCR擴增HPRT，以及IL-2、IFN-y、IL-4、IL-5、IL-13和TGF-P等細(xì)胞因子。其中，用持家基因次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(HPRT)為內(nèi)源表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)，將各組cDNA濃度調(diào)為一致。凝膠電泳檢測各種細(xì)胞因子的變化。PCR反應(yīng)條件和引物序列見表1。表l.PCR引物<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>二、實驗結(jié)果(一)p印323和pD323聯(lián)合免疫抑制哮喘的發(fā)生根據(jù)參考文獻(xiàn)的方法，BALB/c小鼠被OVA抗原免疫和肺刺激后能誘導(dǎo)小鼠的哮喘模型。而哮喘發(fā)生的癥狀之一就是肺部會有大量炎癥細(xì)胞的浸潤。如圖la中第2組(模型組)和2a、2b和2c中的模型組所示，模型組的小鼠肺組織灌洗液中存在大量的炎癥細(xì)胞，包括嗜酸性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。同時與哮喘相關(guān)的其它指標(biāo)也進行了檢測，如血清中IgE和IgGl的水平與對照相比在模型組也有了顯著的提高(圖3a)，及浸潤細(xì)胞表達(dá)較高水平的Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-5和IL-13(圖3b)。這些結(jié)果都說明成功的誘導(dǎo)了小鼠哮喘模型。圖la、lb、3a、3b、4b、5b、6和9中，"+"表示添加了該物質(zhì)或進行了該項處理或，"一"表示未添加該物質(zhì)或未進行該項處理；OVAsensitized表示第0天時，每只小鼠腹腔注射100y1OVA/鋁復(fù)合物；OVAchallenge表示第8，14，16和18天，分別利用100ng/100u1OVA(溶于PBS)經(jīng)過氣管注入小鼠的肺組織。為了用聯(lián)合免疫的方法對哮喘疾病進行免疫治療，將表達(dá)OVA抗原表位323-339的核酸疫苗pD323與其對應(yīng)的體外合成的肽p印323進行共免疫，而單獨免疫作為對照。結(jié)果證明，第6組即p印323和pD323共免疫組(D+P)的肺組織炎癥細(xì)胞浸潤與模型組(第2組)相比有了顯著的降低(圖la和圖2a至c)，血清中IgE和IgGl的水平與模型組相比，也有了顯著的降低(圖3a)，侵潤細(xì)胞表達(dá)較低水平的Th2型細(xì)胞因子(圖3b)。然而，單獨免疫pD323(第3組)或者p印323(第4組)的兩組不能抑制哮喘的這些疾病指標(biāo)。說明只有共免疫才能抑制哮喘的發(fā)生。此外，將載體pcDNA3與p印323共免疫(第5組)后也不能抑制哮喘的發(fā)生。說明混合免疫的效果并不是由于載體上的CpG序列造成的。(二)p印323和pD323聯(lián)合免疫的劑量在證明了pD323與p印323共免疫能抑制哮喘的發(fā)生后，比較了共免疫的劑量變化對抑制效果的影響。核酸疫苗pD323的劑量分為25、50、100、200和400ug/只，而肽疫苗P印323的劑量固定為100ug/只。結(jié)果證明當(dāng)pD323的劑量達(dá)到或超過100ug/只時，才能顯著抑制肺組織炎癥細(xì)胞浸潤(圖lb)。而pD323的劑量為25wg/只和50iig/只時不能抑制炎癥細(xì)胞侵潤。說明p印323和pD323聯(lián)合免疫的抑制效果有明顯的劑量依賴性。(三)CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞不參與聯(lián)合免疫的抑制為了證明調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是否參與聯(lián)合免疫的抑制現(xiàn)象，首先分析CD4+CD25+的天然T調(diào)節(jié)細(xì)胞。將30只雌性BALB/c小鼠(8-IO周齡)，均分為5組，即第13組至17組，每組6只小鼠，第13組為正常組，共肌肉注射免疫兩次，第一次免疫后10天，再加強一次，每次每只分別免疫0.9%NaCl水溶液100微升；第14組為pD323免疫對照組，共肌肉注射免疫兩次，第一次免疫后10天，再加強一次，每次每只分別免疫含100微克pD323的0.9%NaCl水溶液100微升。第15組為p印323免疫對照組，共肌肉注射免疫兩次，第一次免疫后10天，再加強一次，每次每只分別免疫含100微克p印323的0.9%NaCl水溶液100微升。第16組為p印323和pcDNA3.0共免疫對照組，共肌肉注射免疫兩次，第一次免疫后10天，再加強一次，每次每只分別免疫含100微克p印323和100微克pcDNA3.0的0.9%NaCl水溶液100微升。第17組為p印323和p印323共免疫對照組，共肌肉注射免疫兩次，第一次免疫后10天，再加強一次，每次每只分別免疫含100微克p印323和100微克p印323的0.9%NaCl水溶液100微升。小鼠被聯(lián)合免疫和單獨免疫處理后，取其脾臟細(xì)胞進行CD4+CD25+的熒光抗體染色及流式細(xì)胞檢測，小鼠在免疫后21天處死，制備脾臟單細(xì)胞懸液，加入2ml紅細(xì)胞裂解液溶解紅細(xì)胞，細(xì)胞進行計數(shù)；根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入適量的0VA抗原和CD28抗體，刺激過夜；第二天加蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運抑制劑monensin(2umol/L)，以阻止細(xì)胞因子分泌至細(xì)胞外。混勻后，37。C、5。/。C02培養(yǎng)2h。然后抗Fc抗體封閉(用量見試劑說明書，eBioscience公司)，封閉30分鐘；加入2-3ml洗液，充分混勻，2000rpm離心5分鐘，棄去上清，各管加入適量的抗CD4和CD25的熒光標(biāo)記單克隆抗體(用量見試劑說明書，eBioscience公司)，室溫避光反應(yīng)30分鐘；加入2-3mL洗液，充分混勻，2000rpra離心5分鐘，棄去上清，各管加入300pL洗液重懸細(xì)胞；上流式細(xì)胞儀分析。結(jié)果證明p印323和pD323聯(lián)合免疫的小鼠與其他對照組相比，其CD4+CD25+的T細(xì)胞數(shù)量無顯著差異(圖4a)。為了進一步的分析CD4+CD25+的T調(diào)節(jié)細(xì)胞是否參與共免疫的抑制現(xiàn)象，小鼠被共免疫處理和模型誘導(dǎo)的同時，anti-CD25的抗體被靜脈注射至第2、5和6組小鼠的體內(nèi)清除體內(nèi)的CD4+CD25+的T調(diào)節(jié)細(xì)胞，注射劑量為20pg/只。同時一同型對照抗體IgGl作為對照，注射劑量為20)ag/只。按照步驟一中5的方法進行肺組織灌洗液中細(xì)胞數(shù)的測定。結(jié)果證明，CD4+CD25+的T調(diào)節(jié)細(xì)胞被清除的情況下，p印323和pD323共免疫的抑制現(xiàn)象仍然存在(圖4b)。說明共免疫的抑制顯現(xiàn)并不是依靠CD4+CD25+的T調(diào)節(jié)細(xì)胞來實現(xiàn)的。(四)CD4+CD25-T細(xì)胞參與聯(lián)合免疫的抑制為了進一步的分析調(diào)節(jié)T細(xì)胞是否參與共免疫的抑制現(xiàn)象及其細(xì)胞類型。利用體外的T細(xì)胞增殖實驗。1、DC細(xì)胞培養(yǎng)DC細(xì)胞是由小鼠的骨髓細(xì)胞體外培養(yǎng)而得到。雌性BALB/c小鼠(8-10周齡)被麻醉致死，無菌條件下由其腿骨中分離出骨髓細(xì)胞，以RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco，Eggenstein，Germany)調(diào)整細(xì)胞濃度至5X1()6個/ml，同時加入10%(體積比)胎牛血清和20ng/ml鼠源GM-CSF體外培養(yǎng)6—8天。之后，用CDllc+磁珠進行分選從而得到純化的DC細(xì)胞。2、T細(xì)胞、CD4+、CD8+、CD4+CD25-T細(xì)胞的分離根據(jù)調(diào)節(jié)T細(xì)胞分離試劑盒(美國R&D公司)說明書，利用陰性選擇并得到純化的CD4+，CD4+CD25-T細(xì)胞。總T細(xì)胞的純化方法如下取小鼠脾臟細(xì)胞去除紅細(xì)胞后制成單細(xì)胞懸液，尼龍柱過濾后得到T細(xì)胞。CD8+T細(xì)胞的純化如下得到總T細(xì)胞后，調(diào)整細(xì)胞濃度為1X107cells/ml;加入適量的抗小鼠的CD4抗體"Bioscience公司)，在2-8°C冰箱孵育30分鐘；加入適量的兔補體(Sigma公司)，輕輕混勻，在37°C冰箱孵育30分鐘；加入PBS，輕輕混勻，2000rpra5分鐘，重選細(xì)胞；重復(fù)步驟2-4，最后重選細(xì)胞即為CD8+細(xì)胞流式細(xì)胞儀分析純度〉85。/。。調(diào)節(jié)T細(xì)胞抑制功能為了檢測調(diào)節(jié)細(xì)胞的抑制功能，選擇D011.10小鼠的CD4+T(5X105個)細(xì)胞經(jīng)綠色熒光染料CFSE染色后作為靶細(xì)胞；選擇免疫小鼠的CD4+CD25—T細(xì)胞(1X105個)作為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；選擇體外培養(yǎng)的DC細(xì)胞(1X1()5個)作為抗原遞呈細(xì)胞。將3種細(xì)胞置于48孔培養(yǎng)板共培養(yǎng)，并用0VA抗原(20)iig/ml)體外刺激48小時，利用流式細(xì)胞儀對靶細(xì)胞的增殖情況進行檢測，從而判斷調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的抑制功能。D011.10小鼠的CD4+T細(xì)胞被分離出來并以熒光染料CFSE染色作為耙細(xì)胞，在體外被抗原遞呈細(xì)胞(DC)和OVA抗原刺激下會發(fā)生抗原專一性的擴增現(xiàn)象。其擴增情況被流式細(xì)胞分析后表現(xiàn)為CFSE熒光強度的降低，如圖5a所示。在該培養(yǎng)液中同時加入來自對照組(第l組)、模型組(第2組)、pD323免疫組(第3組)、p印323免疫組(第4組)，p印323和pcDNA3.0共免疫組(第5組，V+P)，或p印323和pD323共免疫組(第6組)小鼠的脾臟細(xì)胞(1X105個)，結(jié)果如圖5a所示，當(dāng)在培養(yǎng)液中同時加入來p印323和pD323共免疫組(第6組)小鼠的脾臟細(xì)胞時，這種擴增被顯著的抑制了，說明p印323和pD323共免疫組(第6組，D+P)小鼠的脾臟細(xì)胞中有調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞。其他組均未出現(xiàn)抑制現(xiàn)象(圖5a)。為了進一步的分析調(diào)節(jié)細(xì)胞的分型情況，將脾臟細(xì)胞中的T細(xì)胞、CD4+、CD8+、CD4+CD25—T細(xì)胞分別分離出來加入培養(yǎng)液中與靶細(xì)胞共同培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)p印323和pD323共免疫組(第6組，D+P)的CD4+CD25—T細(xì)胞能顯著的抑制靶細(xì)胞的擴增，說明p印323和pD323共免疫組(第6組，D+P)誘導(dǎo)的抑制現(xiàn)象是由CD4+CD25—T細(xì)胞參與的。圖5a中的百分?jǐn)?shù)為DOll.10小鼠CD4T細(xì)胞增殖的比例。圖5a中，Non-TCell為非T細(xì)胞，百分?jǐn)?shù)為增殖細(xì)胞占總細(xì)胞的百分比。為了進一步在體內(nèi)證明CD4+CD25—T細(xì)胞參與共免疫的抑制功能，將p印323和pD323共免疫組(第6組，D+P)和p印323和pcDNA3.0共免疫組(第5組，V+P)小鼠脾臟中CD4+CD25—T細(xì)胞分離出，并過繼轉(zhuǎn)移到OVA抗原處理的小鼠體內(nèi)。其中，CD4+CD25—T細(xì)胞分離和過繼轉(zhuǎn)移方法如下小鼠經(jīng)麻醉致死，無菌制備其脾臟單細(xì)胞懸液，利用調(diào)節(jié)T細(xì)胞分離試劑盒(R&DSystems,Inc.,USA)純化其中的CD4+CD25—T細(xì)胞，純度達(dá)到96—98%。得到的CD4+CD25—T細(xì)胞經(jīng)靜脈注射的方式過繼轉(zhuǎn)移至同系的小鼠雌性BALB/c小鼠(8-10周齡)體內(nèi)，轉(zhuǎn)移的數(shù)量分別為2X105、1X106、5X106個細(xì)胞/只。結(jié)果證明CD4+CD25—T細(xì)胞的過繼轉(zhuǎn)移顯著的抑制了小鼠的哮喘發(fā)病(圖5b)。說明p印323和pD323共免疫抑制哮喘的現(xiàn)象是由于誘導(dǎo)產(chǎn)生了有調(diào)節(jié)功能的CD4+CD25—T細(xì)胞造成的。3、CD4+CD25—T調(diào)節(jié)細(xì)胞具有抗原專一性抑制功能為了分析共免疫誘導(dǎo)產(chǎn)生的CD4+CD25—T調(diào)節(jié)細(xì)胞抑制功能是否具有抗原專一性特點。將CD4+CD25—T調(diào)節(jié)細(xì)胞由p印323和pD323共免疫組(第6組，D+P)或p印323和pcDNA3.0共免疫組(第5組，V+P)的小鼠中分離后過繼轉(zhuǎn)移至被OVA抗原(100(ig/只)或BSA抗原(100pg/只)免疫的同系小鼠雌性BALB/c小鼠(8-10周齡)體內(nèi)，然后分離后者的脾臟T細(xì)胞進行體外擴增實驗，具體方法為在無菌條件下，取脾制成單個細(xì)胞懸液，用紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞，然后用PBS液洗三次，離心并進行細(xì)胞計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度到1X106個/ml，將每組細(xì)胞懸液分4份加入恥孔培養(yǎng)板中。其中一份加入100plConA(有絲分裂原)至終濃度為5pg/ml，一份加入相應(yīng)的特異性抗原(OVA抗原)作為刺激物至終濃度為5(ag/ml，一份不加刺激物，一份加入lOOjiilBSA至終濃度為2^g/ml作為無關(guān)抗原，37°C，C02培養(yǎng)箱孵育48h后，每孔加入10(V1MTS至終濃度為5mg/ml，孵育4h后，在酶標(biāo)儀上讀取492nra處的0D值，計算刺激指數(shù)(SI二實驗OD+非刺激OD)。結(jié)果如圖6所示，證明過繼轉(zhuǎn)移p印323和pD323共免疫組(第6組，D+P')的CD4+CD25—T調(diào)節(jié)細(xì)胞只能專一性的抑制OVA抗原免疫的T細(xì)胞增殖，而不能抑制BSA抗原免疫的T細(xì)胞增殖反應(yīng)(圖6)。4、CD4+CD25—T調(diào)節(jié)細(xì)胞細(xì)胞因子表達(dá)分析為了分析P印323和pD323共免疫組(第6組，D+P印)誘導(dǎo)產(chǎn)生的CD4+CD25—T調(diào)節(jié)細(xì)胞是否表達(dá)與調(diào)節(jié)功能相關(guān)的細(xì)胞因子。p印323和pD323共免疫組(第6組，D+P印)以及p印323和pcDNA3.0共免疫組(第5組，V+P印)小鼠被共免疫處理后不同時間(1、3、7、14天)分離其脾臟中CD4+CD25—T細(xì)胞，并進行胞內(nèi)細(xì)胞因子染色和流式檢測。具體方法如下為了檢測細(xì)胞表面分子及胞內(nèi)細(xì)胞因子水平的變化，采用流式細(xì)胞結(jié)合熒光抗體技術(shù)。首先制備脾臟細(xì)胞的單細(xì)胞懸液，anti-Fc抗體對細(xì)胞表面的Fc受體進行封閉；其次，PBS洗滌后直接進行細(xì)胞表面分子如CD4和CD25的染色；再次，當(dāng)需胞內(nèi)細(xì)胞因子的染色時，脾臟細(xì)胞經(jīng)ConA和anti-CD28單抗共同刺激過夜，再經(jīng)4%多聚甲醛固定及0.1%的皂素處理破膜，用熒光標(biāo)記抗體對細(xì)胞進行染色。最后，染色后的細(xì)胞進行流式細(xì)胞檢測及軟件分析數(shù)據(jù)。(美國eBioscience公司)結(jié)果發(fā)現(xiàn)與P印323和pcDNA3.0共免疫組(第5組，V+P印)相比，p印323和pD323共免疫組(第6組，D+P印)表達(dá)較高水平的IL-10(圖7a)、IFN-y(圖7b)、FoxP3(圖7c)、禾BTGF-e(圖7e)。IL-10、TGF-P、和FoxP3已被之前的研究證明與調(diào)節(jié)功能相關(guān)。說明共免疫誘導(dǎo)產(chǎn)生的CD4+CD25—T調(diào)節(jié)細(xì)胞能夠表達(dá)高水平的調(diào)解功能相關(guān)的細(xì)胞因子。圖7a-7d中的百分?jǐn)?shù)為各種細(xì)胞因子表達(dá)的比例。圖7e中，1、2、3分別表示第1、5、6各組分離得到的CD4+CD25—T細(xì)胞中tgf-p的RT-PCR結(jié)果。5、IL-10和TGF-P在體外參與CD4+CD25—T調(diào)節(jié)細(xì)胞的抑制功能為了進一步的分析在調(diào)解性T細(xì)胞中表達(dá)的IL-10和TGF-P是否與影響或參與其調(diào)解功能。還是選擇體外的T細(xì)胞增殖實驗。為了檢測調(diào)節(jié)細(xì)胞的抑制功能，選擇DOll.10小鼠的004+T(5X105個)細(xì)胞經(jīng)綠色熒光染料CFSE染色后作為靶細(xì)胞；選擇p印323和pcDNA3.0共免疫組(第5組，V+P)，p印323和pD323共免疫組(第6組，D+P)免疫小鼠的CD4+CD25—T細(xì)胞(1X105個)作為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；選擇體外培養(yǎng)的DC細(xì)胞(1X105個)作為抗原遞呈細(xì)胞。將3種細(xì)胞置于48孔培養(yǎng)板共培養(yǎng)，并用OVA抗原(20(ig/ral)體外刺激48小時，在刺激的同時，在培養(yǎng)體系中加入anti-IL-10(終濃度為5|ag/ral)、或anti-IFN-y(終濃度為5(ig/ml)、或anti-TGF-P(終濃度為5|ig/ml)的抗體或anti-IL-10(終濃度為5|ig/ml)和anti-TGF-P(終濃度為5叫/ml)抗體。同時設(shè)未加入抗體的對照，同型對照IgGl抗體對照。利用流式細(xì)胞儀對靶細(xì)胞的增殖情況進行檢測，從而判斷調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的抑制功能。結(jié)果表明，加入IL-IO或TGF-P的抗體能顯著的打破CD4+CD25—T調(diào)節(jié)細(xì)胞的抑制功能(圖8)。說明IL-10和TGF-P兩種細(xì)胞因子確參與CD4+CD25—T調(diào)節(jié)細(xì)胞的調(diào)解功能。圖8中的百分?jǐn)?shù)為D011.10小鼠CD4T細(xì)胞增殖的比例。6、IL-10和TGF-P在體內(nèi)參與CD4+CD25—T調(diào)節(jié)細(xì)胞的抑制功能為了進一步的在體內(nèi)證明IL-10和TGF-P是否CD4+CD25—T調(diào)節(jié)細(xì)胞的抑制功能，將p印323和pcDNA3.0共免疫組(第5組，V+P)，p印323和pD323共免疫組(第6組，D+P)的小鼠脾臟中CD4+CD25—T細(xì)胞分離出，并以5X106個/只過繼轉(zhuǎn)移到OVA抗原處理的雌性BALB/c小鼠(8-10周齡)體內(nèi)，同時將anti-IL-10(5|ig/ml/只)、或anti-TGF-P(5|ig/ml/只)的抗體或anti-IL-10(5jig/ml/只)和anti-TGF-P(5pg/ral/只)抗體注射入小鼠的體內(nèi)。同時設(shè)同型對照IgGl抗體對照。結(jié)果表明anti-IL-10和anti-TGF-P抗體的注射能打破調(diào)解性T細(xì)胞的抑制作用(圖9)。進一步的肯定了IL-10和TGF-P兩種細(xì)胞因子確參與CD4+CD25—T調(diào)節(jié)細(xì)胞的調(diào)解功能。實施例2、Derpl蛋白和pVAX-Derpl聯(lián)合免疫抑制哮喘一、Derpl的分子克隆(1)Derpl的cDNA序列的獲得設(shè)計用重疊片段PCR的方法獲得全序列。Derpl的cDNA如序列表中序列1所示。Derpl的全長cDNA為963bp，其中只有一個EcoRI和兩個HindIII酶切位點，前者位于221位，后兩者分別處于252位和681位，因此根據(jù)HindIII位點，先用重疊片段PCR得到Derpl的三個片段。片段一為序列1的自5'端第1一260位，弓l物如下，每條引物為50bp，之間重疊的部分為20bp。FDerplatgaaaattgttttggccatcgcctcattgttggcattgagcgctgtttaFDerp2:TCAAAAGTTTTGATCGATGATGGACGAGCATAAACAGCGCTCAATGCCAAFDerp3:tcatcg3tc3aaacttttg肌gaataca^aa3gccttc肌c朋肌gttaFDerp4:CGGGCAGCTTCTTCATCTTCGAAGGTAGCATAACTTTTGTTGAAGGCTTTFDerp5:gaagatgaagaagctgcccgtgLaaaactttttggaatcagtaaaatatgl:FDerp6:AAATGGTTGATGGCACCTCCATTTGATTGAACATATTTTACTGATTCCAAFDerp7:ggaggtgccatcaaccatttgtccgatttgtcgttggatgaattcaaaaaFDerp8:TCAAAAGCTTCTGCACTCATCAAAAATCGGTTTTTGAATTCATCCAACGAPCR體系FDerpl，F(xiàn)Derp2，F(xiàn)Derp3,FDerp4,FDerp5，F(xiàn)Derp6,FDerp7,FDerp8這8個引物各取2ul(每個引物的濃度均為25uM)，在EP管中混合均勻，取2y1作為模板；加FDerpl和FDerp8各0.5u1(FDerpl和FDe卬8的濃度均為25uM)作為上下游引物；在PCR體系中加入2.5ul的10XPCRbuffer(購于科昊澤公司);加入dNTP(2慮)2.5ul;最后加ddH20補齊體系至25ul。重疊序列PCR條件94。C3min;94。C40s,50°C40s,72°C40s進行30個循環(huán)；72。ClOrain.取第一次的PCR產(chǎn)物2"1，再加FDerpl和FDerp8各0.5y1(FDerpl和FDerp8的濃度均為25uM)作為上下游引物，再進行一次以上條件的PCR。取第二次的PCR產(chǎn)物2u1，再加FDerpl和FDerp8各0.5y1(FDerpl和FDerp8的濃度均為25uM)作為上下游引物，再進行一次以上條件的PCR，得到最終的產(chǎn)物。片段二為序列1的自5'端第240—690位，引物如下，重疊規(guī)則如上FDerp9:atgagtgcagaagcttttgaacacctcaaaactcaattcgatttgaatgcFDerplO:TTTCCATTGATACTGCAGGCGTTAGTTTCAGCATTCAAATCGAATTGAGTFDerpll:gcctgc3gt3tc肪tgg3aatgctcc3gctg33atcgatttgcg3casatFDerpl2:CCTTGCATACGAATGGGAGTGACAGTTCGCATTTGTCGCAAATCGATTTCFDerpl3:actcccattcgtatgcaaggaggctgtggttcatgttgggctttctctggFDerpl4:GCCAAATAAGCTGATTCAGTTGCGGCAACACCAGAGAAAGCCCAACATGAFDerpl5:actgaatcagcttatttggcttaccgtaatcaatcattggatcttgctgaFDerpl6:TGTTGGGAAGCACAATCGACTAATTCTTGTTCAGCAAGATCCAATGATTGFDerPl7:gtcgattgtgcttcccaacacggttgtcatggtgEitEiccattccacgtggFDerpl8:ACGACACCATTATGTTGGATGTATTCAATACCACGTGGAATGGTATCACCFDerpl9:atccaacataatggtgtcgtccaagaa.agctacta_tcgatacgttgcacgFDerp20:TGTGCATTTGGTCGTCGGCATGATTGTTCTCGTGCAACGTATCGATAGTAFDerp21:tgccgacgaccaaatgcacaacgtttcggtatctcaaactattgccaaatPCR體系:以上的引物FDerp9，F(xiàn)DerplO，F(xiàn)Derpll，F(xiàn)Derpl2，F(xiàn)Derpl3，F(xiàn)Derpl4，F(xiàn)Derpl5，F(xiàn)Derpl6，F(xiàn)Derpl7，F(xiàn)Derpl8，F(xiàn)Derpl9，F(xiàn)Derp20，F(xiàn)Derp21，F(xiàn)Derp22這14個引物各取2u1(每個引物的濃度均為25uM)，在EP管中混合均勻，取2y1作為模板，加FDerp9和FDerp22(濃度均為25uM)各O.1作為上下游引物，在PCR體系中加入2.5ul的10XPCRbuffer(購于科昊澤公司)；加入dNTP(2mM)2.5ul;最后加ddH20補齊體系至25ul。OverlapPCR條件:94°C3min;94。C40s，50°C40s，72°C40s進行30個循環(huán)；72。C10min。取第一次的PCR產(chǎn)物2n1，再加FDerp9和FDerp22(濃度均為25uM)各0.5u1作為上下游引物，再進行一次以上條件的PCR。取第二次的PCR產(chǎn)物2u1，再加FDerp9和FDerp22(濃度均為25uM)各0.5u1作為上下游引物，再進行一次以上條件的PCR，得到最終的產(chǎn)物。片段三為序列1的自5'端第670—963位，引物如下FDerp23:aaattcgtgaagctttggctcaaacccacagcgctattgccgtcattattFDerp24:ATGACGGAATGCGTCTAAATCTTTGATGCCAATAATGACGGCAATAGCGCFDerp25:atttagacgcattccgtcattatgatggccgaacaatcattcaacgcgatFDerp26:GACAGCGTGATAGTTTGGTTGGTAACCATTATCGCGTTGAATGATTGTTCFDerp27:aaccaa8ct3tcacgctgtcaaca/ttgttggttacagtaacgcac肌ggtFDerp28:CCAACTGTTTCGTACGATCCAATAATCGACACCTTGTGCGTTACTGTAACFDerp29:ggatcgtacgaaacagttgggataccaattggggtgataatggttacggtFDerp30:CATCATCAAATCGATGTTGGCAGCAAAATAACCGTAACCATTATCACCCCFDerpSI:ccaacatcgatttgatgatgattgaagaatatccatatgttgtcattctctaaFDerp32:TTAGAGAATGACAACATATGGATPCR體系FDerp23，F(xiàn)Derp24，F(xiàn)Derp25，F(xiàn)Derp26，F(xiàn)Derp27，F(xiàn)Derp28，F(xiàn)Derp29，F(xiàn)Derp30，F(xiàn)Derp31，F(xiàn)Derp32這10個引物各取2u1(每個引物的濃度均為25uM)，在EP管中混合均勻，取2ii1作為模板，加FDerp23和FDerp32(濃度均為25uM)各O.5ul作為上下游引物，在PCR體系中加入2.5ul的10XPCRbuffer(購于科昊澤公司)；加入dNTP(2mM)2.5ul;最后加ddH20補齊體系至25ul。OverlapPCR條件94°C3min;94。C40s，50°C40s,72°C40s進行30個循環(huán)；72lOfflin.取第一次的PCR產(chǎn)物2u1，再加FDerp23和FDerp32(濃度均為25uM)各0.5ul作為上下游引物，再進行一次以上條件的PCR。取第二次的PCR產(chǎn)物2u1，再加FDerp23和FDerp32(濃度均為25uM)各0.5ul作為上下游引物，再進行一次以上條件的PCR，得到最終的產(chǎn)物。在得到三個片段的正確片段后，再用重疊片段PCR方法，把三段連接起來，首先用PCR方法得到這三個片段，酶用pfu酶，PCR條件相同。PCR條件94°C3min;94。C40s，55°C40s,72°C40s進行30個循環(huán)；72°ClOmin。連接PCR體系各取片段一和片段三各lul，取片段二2nl，作為模板，加FDerpl和FDerp32(濃度均為25uM)各0.5u1作為上下游引物。OverlapPCR條件:94。C3min;94。C40s，50°C40s，72°C65s進行30個循環(huán)；72°C10min，得到963的全長cDNA序列。經(jīng)過DNA測序，證明該片段的核苷酸序列是序列表中的序列l(wèi)。二、Derpl基因的克隆及亞克隆(一)克隆Derpl基因入T載體利用Takara公司PCRFragmentRecoveryKit按其說明書進行PCR產(chǎn)物的回收。回收的cDNA片段與pMD18-T載體(購自Takara公司)在T4DNA連接酶的作用下16。C過夜，使PCR得到的Derpi基因連接到pMD18-T的載體上。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化和質(zhì)粒的提取按參考文獻(xiàn)(Sambrook了,FritschEF，ManiatisT.MolecularCloning:ALaboratoryManual,(2nded).NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989.19-56)。提取后的質(zhì)粒用酶切BamHI和SalI鑒定得到963bp左右的產(chǎn)物，再用BamHI和EcoRI鑒定插入的方向正確，將克隆基因自身攜帶的ATG靠近載體M13R(—48)通用引物的質(zhì)粒命名為T一Derpl。然后將鑒定正確的菌落利用質(zhì)粒提取后保存。(二)Derpl蛋白的原核表達(dá)為了使用Derpl蛋白用于誘導(dǎo)asthma模型和疫苗制備，將Derpl亞克隆到pET-28a原核表達(dá)載體上，表達(dá)制備Derpl原核蛋白，具體方法如下選用BamHI和SalI分別酶切pET28a(+)(Novagen產(chǎn)品)載體和T一Derpl質(zhì)粒，將Derpl連接到pET28a(+)后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化按參考文獻(xiàn)(SambrookJ，F(xiàn)ritschEF,ManiatisT.MolecularCloning:ALaboratoryManual,(2nded).NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989.19-56)。將鑒定得到963bp左右的重組質(zhì)粒(命名為pET28a-Derpl)，保存菌種。在IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)原核體系中的Derpl，其條件為①重組質(zhì)粒pET28a-Derpl轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞后，挑取單克隆菌，37。C恒溫?fù)u床，220rpm/min，培養(yǎng)至A,二O.5。②在300mLLB培養(yǎng)基中加入3mL預(yù)培養(yǎng)的pET28a-Derpl菌液和300uL50mg/raL卡那霉素，37。C恒溫?fù)u床，220rpm/min，培養(yǎng)至A,二O.5。③在培養(yǎng)液中加入600uL0.5MIPTG，37。C恒溫?fù)u床誘導(dǎo)表達(dá)4h。培養(yǎng)液4°C，12000rpm，5min離心收集菌體，倒出上清，沉淀用BindingBuffer重懸。①4。C超聲破碎細(xì)胞20min。再4。C，12000rpm，5min離心收集沉淀。SDSPAGE檢測后。一2(TC凍存。利用SDSPAGE電泳和Western檢測(抗體用購買丹麥ALK公司的"安脫達(dá)"塵螨成蟲的提取液，免疫兔子制備的多抗)證明其表達(dá)產(chǎn)物為Derpl抗原。(三)Derpl的真核表達(dá)1.真核表達(dá)載體的構(gòu)建設(shè)計引物時把真核表達(dá)的Kozak序列加到ATG前，其序列為GCCACCATGAAAATTGTTTTGGCCA，選用BamHI和SalI分別酶切pVAX(Invitrogen公司產(chǎn)品)載體和T一Derpi質(zhì)粒，將Derpi連接到pVAX得到重組質(zhì)粒pVAX-Derpl。pVAX-Derpl轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞(方法同上)，小提質(zhì)粒并測序正確后保存菌種。2.真核表達(dá)的鑒定將pVAX-Derpl轉(zhuǎn)染B服細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后檢測Derpi在真核細(xì)胞中的表達(dá)情況。用Derpi專一性引物進行的RT—PCR可以檢測出％3bp左右的表達(dá)產(chǎn)物和及超聲破碎細(xì)胞后用Derpi多抗(兔抗)進行Western的方法檢測出大約為65kd的蛋白質(zhì)，確定為pVAX-Derpl可在真核中表達(dá)。三、誘導(dǎo)Derpl哮喘模型哮喘患者80%對塵螨過敏，塵螨是哮喘的重要過敏原，使用塵螨誘發(fā)的哮喘模型應(yīng)能更好地反映哮喘特征。過敏原使用原核細(xì)胞表達(dá)的Derpl蛋白(DerpI，10ug，Al(0H)31rag)將C57BL/6小鼠皮下注射致敏，第14天鼻內(nèi)滴入塵螨提取液(購買丹麥ALK公司的"安脫達(dá)"，其中含有48XDerpl，49%Derp2)激發(fā)，3天后可見起大小氣道、肺泡大量EOS浸潤，粘液栓形成，并與劑量相關(guān)，和血清IgE存在與否亦無關(guān)。Derpl誘喘作用同樣可以被動轉(zhuǎn)移，并證明氣道炎癥A服由抗原特異性淋巴細(xì)胞介導(dǎo)，速發(fā)相氣道反應(yīng)則由血清中因子介導(dǎo)[凡Gfer化力'^^7/JooWjVeerre/2,#ra/zjfaf,力先，5as,朋<^jf邵se/6erg.Serum-IgE-facilitatedallergenpresentationinatopicdisease.J.Immunol.,Apr1993;150:3643.]。(一)誘導(dǎo)哮喘模型實驗設(shè)計設(shè)計共六組每組5只C57小鼠，6—8周齡，每只小鼠的誘導(dǎo)免疫方法如表2所示:表2<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>50ugDerpl原核蛋50ugDerpl原核蛋50wgDerpl原白+4mg鋁佐劑白+4mg鋁佐劑核蛋白ESalineSaline50ug提取液FSalineSalineSaline表2中，提取液為塵螨提取液(購買丹麥ALK公司的"安脫達(dá)"，其中含有48XDerpl，49%Derp2);融合蛋白為上述步驟二中原核表達(dá)的Derpl蛋白；Saline為生理鹽水(0.9克氯化鈉，溶解在少量蒸餾水中，稀釋到100毫升)；鋁佐劑為10%的鋁鹽(Sigma,USA)溶液。(二)檢測的實驗①BAL收集最后一次抗原致敏24h后，把小鼠放血處死。1mlHank，s液，灌洗肺4次，收集液700g離心10min，4°C，用lOOulHank，s液懸浮，計數(shù)后進行分類統(tǒng)計。②病理學(xué)分析用4%多聚甲醛灌注肺，切下后浸泡在固定液里。哮喘模型的誘導(dǎo)結(jié)果如表3。表3.哮喘模型誘導(dǎo)結(jié)果組別EF第一次誘導(dǎo)(0天)50yg提取液+4mg鋁佐劑第二次誘導(dǎo)(7天)501^提取液+4mg鋁佐劑4mg鋁佐劑4mg鋁佐劑50ug融合蛋白+4mg鋁佐劑50ug天然蛋白+4mg鋁佐劑SalineSaline50ug融合蛋白+411^鋁佐劑50ug天然蛋白+411^鋁佐劑Saline皮膚試驗(8、10、12、14天)50ug提取液51ug提取液50iig融合蛋白50ug天然50pg提取液Saline組織學(xué)檢測(淋巴細(xì)胞浸潤)+++++++++Saline表3中，+++代表發(fā)生嚴(yán)重的1細(xì)胞親潤，平均打分大于2;---代表沒發(fā)生或輕微發(fā)生T細(xì)胞親潤，平均打分小于2。26切片后，染色檢測T細(xì)胞浸潤情況，用r印roduciblescoringsystem編碼和分級。分兩種標(biāo)準(zhǔn)1:外周炎癥；2:血管周炎癥。分級標(biāo)準(zhǔn)沒炎癥，0:偶然存在的炎性細(xì)胞，1:支氣管和血管周圍被1一5層炎性細(xì)胞包圍，2:被多于5層炎性細(xì)胞包圍，3:每一張切片隨即選取10—15個區(qū)域，計算這些區(qū)域的平均數(shù)。另一張片子用甲苯氨藍(lán)染肥大細(xì)胞。③按照實施例1中的方法ELISA檢測特異性的IgE、IgG2a、IgGl水平。RT—RCR方法檢測細(xì)胞因子提取脾細(xì)胞的mRNA反轉(zhuǎn)錄后，按照實施例1中的方法檢測過敏相關(guān)的細(xì)胞因子，如IL一4、IL一9、IL一5、IL一13、IF—y的表達(dá)情況。⑤皮試實驗設(shè)計由組胺、塵螨提取液、Saline、BSA各50ii1在側(cè)腹部進行皮試。四、預(yù)防/治療性免疫方案預(yù)防組設(shè)計共ll組A—H組5只C57小鼠，6—8周齡，I一K組3只C57小鼠。治療組設(shè)計也11組A—H組5只C57小鼠，6—8周齡，I一K組3只C57小鼠，時間改為14天成功誘導(dǎo)哮喘之后，從16天開始免疫，30天二免，37天開始檢測。組別第一次免疫(0d)第二次免疫(14d)誘導(dǎo)哮喘模型(21天)丄丄丄ADerpl蛋白(10011§)+Derpl蛋白(10(^呂)+pVAX-DerpVAX-Derpl(100ug)pl(100ug)十十十BDerpl蛋白(100"g)Derpl蛋白(100ug)+++CpVAX-Derpl(100ug)pVAX-Derpl(100ug)+++DOVA蛋白(100ug)+pVAX-DerOVA蛋白(10011呂)+pVAX-Der+++pl(100ug)pl(100ug)EDerpl蛋白(lOOug)+Derpl蛋白(100ug)十丄丄丄pVAX-0VA(100ug)pVAX-OVA(100ug)十十十FpVAXvector(100ug)pVAXvector(100ug)+++GSalineSaline+++HSalineSaline---I片段一p印tide(100n片段一p印tide(100ug)+pVAX_4__|_丄g)+pVAX—片段一(100ug)片段一(100ug)卞卞卞了片段二p印tide(100u片段二p印tide(100ng)+pVAX_+++g)+pVAX—片段二(100ug)片段二(lOOug)片段三p印tide(100ug)十pVAX—g)+pVAX—片段三(100ug)片段三(100lig)+++代表誘導(dǎo)哮喘模型；---代表不進行誘導(dǎo)哮喘模型①BAL收集最后一次抗原致敏24h后，把小鼠放血處死。lmlHank's液，灌洗肺4次，收集液700g離心10min，4'C，用100ulHank液懸起來，計數(shù)后拿獸醫(yī)院去進行分類統(tǒng)計。②病理學(xué)分析用4%多聚甲醛灌注肺，切下后浸泡在固定液里。切片后，染色檢測T細(xì)胞侵潤情況，用reproduciblescoringsystem編碼和分級。另一張片子用甲苯氨藍(lán)染肥大細(xì)胞活性。①ELISA檢測特異性的IgE、IgG2a、IgGl水平。②RT—RCR方法檢測細(xì)胞因子提取spleen的mRNA反轉(zhuǎn)錄后，檢測過敏相關(guān)的細(xì)胞因子，如IL一4、IL一9、IL一5、IL—13、IL一IO、IF—y、TGF—P。⑤皮試實驗設(shè)計由組胺、塵螨提取液、Saline、BSA各50ul在側(cè)腹部進行皮試。③T細(xì)胞增殖實驗用兩種方法MTT和CFSE檢測，組別設(shè)計為Derpl、BSA、ConA來刺激，p印tide組加一組p印tide刺激。檢測T細(xì)胞亞型如CD4+CD25+細(xì)胞占全部脾臟細(xì)胞和CD4+細(xì)胞的比例。⑦胞內(nèi)染色實驗主要染以下幾種細(xì)胞因子IL一IO、IF—y、TGF—P、IL一13、IL—5⑧混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)和抑制實驗抑制型T細(xì)胞用聯(lián)合免疫的小鼠的T細(xì)胞活化型T細(xì)胞正常C57小鼠的T細(xì)胞DC:來源于Balb/c小鼠◎過繼轉(zhuǎn)移實驗從以上免疫的各組小鼠體內(nèi)分離T細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移進正常小鼠體內(nèi)，聯(lián)合免疫組同時注射anti—CD25的抗體，然后誘導(dǎo)哮喘，檢測以上各種指標(biāo)。五、結(jié)果(一)預(yù)防免疫結(jié)果組別GH誘導(dǎo)哮喘模型(21天)第一次免疫(28天)第二次免疫(42天)T細(xì)胞活性+++++++++組織學(xué)檢測(淋巴細(xì)胞浸潤)Derpl蛋白(100ug)+pVAX-Derpl(100yg)Derpl蛋白(100ug)pVAX-Derpl(100ug)(^八蛋白(100118)+pVAX-Derpl(100ug)Derpl蛋白(100ug)+pVAX-OVA(100ug)pVAXvector(100ug)SalineSaline片段一p印tide(lOOwg)+pVAX-片段一(lOOug)片段二p印tide(lOOug)+pVAX-片段二(100iig)Derpl蛋白(1001^)+pVAX-Derpl(100ug)Derpl蛋白(100ug)pVAX-Derpl(100ug)OVA蛋白(10(^8)+pVAX-Derpl(100ixg)Derpl蛋白(100ug)+pVAX-OVA(100ug)pVAXvector(100ug)++++++++++++++++++++++++SalineSaline------片段一p印tide(100yg)+pVAX-片段一------(lOOug)片段二p印tide(100ug)+pVAX-片段二------(lOOug)片段三p印tide(100片段三p印tide(100uug)+pVAX-片段三g)+pVA-片段三------(lOOyg)(lOOyg)+++代表組織學(xué)發(fā)生嚴(yán)重的1細(xì)胞親潤，平均打分大于2;---代表沒發(fā)生或輕微發(fā)生T細(xì)胞親潤，平均打分小于2。(二)治療性免疫結(jié)果:<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>+++代表組織學(xué)檢測發(fā)生嚴(yán)重的1細(xì)胞親潤，平均打分大于2;---代表沒發(fā)生或輕微發(fā)生T細(xì)胞親潤，平均打分小于2*:由小鼠免疫了Derpl蛋白(100^§)+pVAX-Derpl(100ug)后分離純化得到。結(jié)論1、聯(lián)合免疫方式可以預(yù)防塵螨引起的哮喘(結(jié)果2)，其原因是降低了病理性的T細(xì)胞增值同時也降低患哮喘小鼠的組織病理細(xì)胞反應(yīng)；2、無論是免疫學(xué)指標(biāo)還是病理學(xué)指標(biāo)都反映這種免疫方式可以用于治療I型超敏反應(yīng)(結(jié)果3)，而這種治療是通過誘導(dǎo)出抗原特異性的CD4+CD25-的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞來產(chǎn)生作用的。序列表〈160〉2<210>1<211〉963<212〉腿〈213〉屋塵螨(Dermatophagoidespteronyssinus)〈400〉！atgsaaattgtcatcgatcaga卿tgeigigggaggtgccaatgagtgcaggcctgcagtaactcccattcactgaatcaggtcgattgtgatccaacatatgccgacgacggcatcaaagaatggttaccgtcgattatttattttgctgttttggccatcgcctcattgttggcattgagcgctgtttatgctcgtcca60aaact"tttg3aaagccttcatgctaccttc120aagctgcccgtaaaaac111ttggaatcagtaaaatatgt180tcaaccatttgtccgatttgtcgttggatgaattcaaaaaccgatttttg240aagcttttgaacacctcaaaactcaattcgatttgaatgctga_3acta_a_c300tcaatggaaatgctccagctgaaatcgatl:tgCg3C犯3tgcg肪ctgtc360gtatgcaaggaggctgtggttcatgttgggctttctctggtgttgccgca420cttatttggcttaccgtaMcaatcattggatcttgctgaacaaggiatta■cttcccaacacggttgtcatggtga/taccattccacgtggtattgaatac540atggtgtcgtcc肌gaaagctactatcgatacgttgcacgag肌caatca600c肌atgcacaacgtttcggtatctca^actattgccaaatttacccacca660^3ttCgtgSl兆ctttggctcaaacccacagcgctattgccgtcattatt720atttagacgcattccgtcattatgatggccgaac肌tC3ttcaacgcgat780aaccaaactatcacgctgtcaacattgttggttacagt肌cgcaceiaggt840ggatCgt￡LCg肌acagttgggataccaattggggtgataatggttacggt■ccaacatcgatttgatgatgattga^g^tatccatatgttgtcattctc960恥3〈210〉2<211>320<212〉PRT<213〉屋塵螨(Der腿tophagoidespteronyssinus)<400>2MetLyslieValLeuAlalieAlaSerLeuLeuAlaLeuSerAlaVal151015TyrAlaArgProSerSerlieLysThrPheGluGluTyrLysLysAla202530PheAsnLysSerTyrAlaThrPheGluAspGluGluAlaAlaArgLys354045AsnPheLeuGluSerValLysTyrValGinSerAsnGlyGlyAlalie505560AsnHisLeuSerAspLeuSerLeuAspGluPheLysAsnArgPheLeu65707580MetSerAlaGluAlaPheGluHisLeuLysThrGinPheAspLeuAsn859095AlaGluThrAsnAlaCysSerlieAsnGlyAsnAlaProAlaGlulie100105110AspLeuArgGinMetArgThrValThrProlieArgMetGinGlyGly115120125CysGlySerCysTrpAlaPheSerGlyValAlaAlaThrGluSerAla130135140TyrLeuAlaTyrArgAsnGinSerLeuAspLeuAlaGluGinGluLeu145150155160ValAspCysAlaSerGinHisGlyCysHisGlyAspThrlieProArg165170175GlylieGluTyrlieGinHisAsnGlyValValGinGluSerTyrTyr180185190ArgTyrValAlaArgGluGinSerCysArgArgProAsnAlaGinArg195200205PheGlylieSerAsnTyrCysGinlieTyrProProAsnValAsnLys210215220lieArgGluAlaLeuAlaGinThrHisSerAlalieAlaVallielie225230235240GlylieLysAspLeuAspAlaPheArgHisTyrAspGlyArgThrlie245250255lieGinArgAspAsnGlyTyrGinProAsnTyrHisAlaValAsnlie260265270ValGlyTyrSerAsnAlaGinGlyValAspTyrTrplieValArgAsn275280285SerTrpAspThrAsnTrpGlyAspAsnGlyTyrGlyTyrPheAlaAla290295300AsnlieAspLeuMetMetlieGluGluTyrProTyrValVallieLeu305310315320權(quán)利要求1、一種預(yù)防和/或治療過敏性哮喘的疫苗，它的活性成分是下述混合物由造成過敏性哮喘的蛋白抗原或其表位多肽和在多克隆位點插入所述造成過敏性哮喘的蛋白抗原或其表位多肽編碼基因的重組真核細(xì)胞表達(dá)載體組成的混合物。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的疫苗，其特征在于所述造成過敏性哮喘的蛋白抗原選自下述抗原中的任意一種氨基酸序列如GenBankAccessionNumberX56279所示的三裂葉豚草(^力row'az^ri/YGfe)過敏原AmbtV;2、氨基酸序列如GenBankAccessionNumberAMBPV2A所示的多年生豚草(掘r。sis/xsiA^sc細(xì))過敏原AmbPV;3、氨基酸序列如GenBankAccessionNumberAMBPV3A所示的多年生豚草過敏原AmbpV;4、氨基酸序列如GenBankAccessionNumberAMBPV1B所示的多年生豚草過每J(原AmbpV;5、氨基酸序列如GenBankAccessionNumberAMBPV2B所示的多年生豚草過敏原AmbpV;6、氨基酸序列如GenBankAccessionNumberAMBPV3B所示的多年生豚草過敏原AmbpV;7、氨基酸序列如GenBankAccessionNumberS39330所示的煙曲霉U,，XZ〃5"/固'卵f〃5")過敏原I/a=IgE-bindingribotoxin;8、氨基酸序列如GenBankAccessionNumberAJ002026所示的煙曲霉過敏原rAspf13;9、氨基酸序列如GenBankAccessionNumberAJ001732所示的煙曲霉過敏原rAspf4;10、氨基酸序列如GenBankAccessionNumberAJ001732所示的煙曲霉過敏原rAspf7;11、氨基酸序列如GenBankAccessionNumberAJ224333所示的煙曲霉過敏原rAspf8;12、氨基酸序列如GenBankAccessionNumberAJ223327所示的煙曲霉過敏原rAspf9;13、氨基酸序列如GenBankAccessionNumberAJ006689所示的煙曲霉過敏原rAspf11;14、氨基酸序列如GenBankAccessionNumberAJ937743所示的煙曲霉過敏原cyclophilin(aspf27);15、氨基酸序列如GenBankAccessionNumberAJ937744所示的煙曲霉過敏原thioredoxin(aspf28);16、氨基酸序列如GenBankAccessionNumberAJ937745所示的煙曲霉過敏原thioredoxin(aspf29);17、氨基酸序列如GenBankAccessionNumberAF282850所示的歐洲白樺黃酮素還原酶(Betulapendulaisoflavonereductase)-likeproteinBetv6.0102(BETV6.0102);18、氨基酸序列如GenBankAccessionNumberAF135127所示的歐洲白樺異黃酮素還原酶-homologBetv6.0101(BETV6);19、氨基酸序列如GenBankAccessionNumberBGU40767所示的德國小蠊(Blattellagermanica)過敏原Blag4;20、氨基酸序列如GenBankAccessionNumberBGU92412所示的德國小蠊過敏原Blag5;21、氨基酸序列如GenBankAccessionNumberBGU28863所示的德國小蠊半胱氨酸蛋白酶前體(asparticproteaseprecursor)過敏原；22、氨基酸序歹!j如GenBankAccessionNumberAF072219所示的德國小蠊主要過敏原(Blag1.0101);23、氨基酸序列如GenBankAccessionNumberAF072221所示的德國小蠊主要過敏原(Blag1.0101);24、氨基酸序列如GenBankAccessionNumber號AF072220所示的德國小蠊主要過敏原Blag1.02;25、氨基酸序列如GenBankAccessionNumberAY283288所示的粉塵螨(Dermatophagoidesfarinae)Derf2過敏原;26、氨基酸序列如GenBankAccessionNumberAY947536的戶塵螨(Dermatophagoidespteronyssinus)DerDer-pi過敏原；27、氨基酸序歹ll如GenBankAccessionNumberX63517所示的大麥(H.vulgare)Iaml—單體a—淀粉酵抑制物(monomericalpha—amylaseinhibitor);28、氣基酸序歹U如GenBankAccessionNumberAJ243504所示的黑麥草(Loliumperenne)花粉過敏原(5C);29、氨基酸序列如GenBankAccessionNumberAJ937746所示的合軸馬拉色菌(Malasseziasympodialis)硫氧還蛋白(thioredoxin，raalas13gene);30、氨基酸序歹U如GenBankAccessionNumberAF072222所示的美洲大蠊(Periplanetaamericana)主要過敏原(Pera1.0101);31、氨基酸序列如GenBankAccessionNumberAF106961所示的美洲大蠊(Periplanetaamericana)原肌球蛋白(tropomyosin);32、氨基酸序列如GenBankAccessionNumberAF082515所示的紅色毛癬菌(Trichophytonrubrum)過敏原(Trir2);33、氨基酸序列如GenBankAccessionNumberAF082514所示的紅色毛癬菌過敏原(Trir4);34、氨基酸序列如GenBankAccessionNumberAF082514所示的紅色毛癬菌(7^'c力op力j^wrw/^咖)過敏原Trir4;35、氨基酸序列如序列表中序列l(wèi)所示的塵螨Derpl。3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的疫苗，其特征在于所述預(yù)防和/或治療過敏性哮喘的疫苗，是由造成過敏性哮喘的蛋白抗原和在多克隆位點插入所述造成過敏性哮喘的蛋白抗原編碼基因的重組真核細(xì)胞表達(dá)載體組成的混合物。4、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的疫苗，其特征在于所述預(yù)防和/或治療過敏性哮喘的疫苗，是由造成過敏性哮喘的蛋白抗原表位多肽和在多克隆位點插入所述造成過敏性哮喘的蛋白抗原表位多肽編碼基因的重組真核細(xì)胞表達(dá)載體組成的混合物。5、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的疫苗，其特征在于所述造成過敏性哮喘的蛋白抗原為氨基酸序列如序列表中序列1所示的塵螨Derpl。6、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的疫苗，其特征在于所述造成過敏性哮喘的蛋白抗原編碼基因為核苷酸序列如序列表中序列2所示的塵螨Derpl基因。7、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的疫苗，其特征在于所述預(yù)防和/或治療過敏性哮喘的疫苗的活性成分為氨基酸序列如序列表中序列l(wèi)所示的塵螨Derpl和pVAX-Derpl。8、根據(jù)權(quán)利要求3所述的疫苗，其特征在于所述過敏性哮喘自身蛋白抗原和在多克隆位點插入所述過敏性哮喘自身蛋白抗原編碼基因的重組真核細(xì)胞表達(dá)載體的質(zhì)量比為1:5-5:1;優(yōu)選為1:1-1:2。9、根據(jù)權(quán)利要求4所述的疫苗，其特征在于所述過敏性哮喘自身蛋白抗原表位多肽和在多克隆位點插入所述過敏性哮喘自身蛋白抗原表位多肽編碼基因的重組真核細(xì)胞表達(dá)載體的質(zhì)量比為1:5-5:1;優(yōu)選為1:1-1:2。10、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的疫苗，其特征在于所述預(yù)防和/或治療過敏性哮喘的疫苗，是由所述過敏性哮喘自身蛋白抗原和在多克隆位點插入所述過敏性哮喘自身蛋白抗原表位多肽編碼基因的重組真核細(xì)胞表達(dá)載體組成的混合物；或是由所述過敏性哮喘自身蛋白抗原表位多肽和在多克隆位點插入所述過敏性哮喘自身蛋白抗原編碼基因的重組真核細(xì)胞表達(dá)載體組成的混合物。全文摘要本發(fā)明公開了一種預(yù)防和/或治療過敏性哮喘的疫苗。本發(fā)明所提供的預(yù)防和/或治療過敏性哮喘的疫苗，它的活性成分是下述混合物由造成過敏性哮喘的蛋白抗原或其表位多肽和在多克隆位點插入所述造成過敏性哮喘的蛋白抗原或其表位多肽編碼基因的重組真核細(xì)胞表達(dá)載體組成的混合物。該疫苗可誘導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的產(chǎn)生，抑制免疫動物的過敏性T細(xì)胞活性，從而能夠有效地預(yù)防和/或治療過敏性哮喘的發(fā)生。文檔編號A61P37/08GK101318017SQ20071010015公開日2008年12月10日申請日期2007年6月5日優(yōu)先權(quán)日2007年6月5日發(fā)明者康友敏,賓王,金華利,津靳申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)