全堿性氨基酸寡肽及其銅絡(luò)合物、其合成方法、自組裝及應(yīng)用的制作方法

專利名稱：：全堿性氨基酸寡肽及其銅絡(luò)合物、其合成方法、自組裝及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及寡肽及其銅絡(luò)合物，尤其涉及全堿性氨基酸寡肽及其銅絡(luò)合物、其合成方法、自組裝為納米顆粒，本發(fā)明還涉及所述的全堿性氨基酸寡肽及其銅絡(luò)合物作為抗血栓藥物的應(yīng)用，屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：血管栓塞性疾病對(duì)心腦血管疾病的高死亡率負(fù)最重要的責(zé)任。血栓形成是血管栓塞性疾病發(fā)病的最重要的病因。目前臨床使用的治療急性血栓栓塞性疾病的鏈激酶、尿激酶和重組組織型纖溶酶原激活劑等藥物普遍存在全身出血傾向和免疫原性反應(yīng)，尋找安全有效的溶血栓藥物是新藥研究的熱點(diǎn)之一。在天然氨基酸中，L-Arg和L-Lys是堿性氨基酸。已知這兩種堿性氨基酸有一些重要的生物活性。例如，在NO合成酶的作用下，L-Arg的胍基被氧化釋放N0。N0具有舒血管活性和抗血小板聚集活性，賴氨酸抑制細(xì)胞黏附。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的之一提供一類全堿性氨基酸寡肽及其銅絡(luò)合物。本發(fā)明目的之二是提供一種制備上述全堿性氨基酸寡肽及其銅絡(luò)合物的方法。本發(fā)明目的之一是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的全堿性氨基酸寡肽(通式I化合物)H-(AA)ra-0H(通式I)，其中AA選自L-Arg或L-Lys殘基中的一種；m為2-5的任意整數(shù)。全堿性氨基酸寡肽與銅的絡(luò)合物(通式n化合物)Cu(II)[H-(AA)m-OH]n(通式II)，其中AA選自L-Arg或L-Lys殘基中的一種；m為2-5的任意整數(shù)，n為1或2。本發(fā)明人認(rèn)識(shí)到，重復(fù)結(jié)構(gòu)單元獲得的結(jié)構(gòu)會(huì)導(dǎo)致活性增強(qiáng)，例如寡肽重復(fù)序列的生物活性往往強(qiáng)于母體肽，寡肽與過(guò)渡金屬(如Cu)的絡(luò)合物的生物活性往往強(qiáng)于肽配體?；谏鲜龅恼J(rèn)識(shí)，本發(fā)明人將L-Arg或L-Lys自身偶聯(lián)成為全L-Arg或全L-Lys寡肽(本發(fā)明統(tǒng)稱全堿性氨基酸寡肽)，所獲得的全堿性氨基酸寡肽更具有較好的舒血管活性和抗血栓功效。本發(fā)明將全L-Arg或全L-Lys寡肽與Cu(II)絡(luò)合，所獲得的全精氨酸寡肽銅絡(luò)合物或全賴氨酸寡肽銅絡(luò)合物更具有較好的舒血管活性和抗血栓功效。本發(fā)明目的之二是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的將L-Arg或L-Lys按照常規(guī)方法自身偶聯(lián)成2-5個(gè)重復(fù)單元的全L-Arg或全L-Lys寡肽；在按照常規(guī)方法與銅(II)絡(luò)合，得到全精氨酸寡肽銅絡(luò)合物或全賴氨酸寡肽銅絡(luò)合物。本發(fā)明在大鼠頸動(dòng)靜脈旁路插管模型上評(píng)價(jià)了通式I化合物和通式II化合物的抗血栓活性，使用掃描電鏡考察了它們自組裝為納米顆粒的現(xiàn)象。試驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明通式I化合物或通式II化合物均具有優(yōu)秀的抗血栓活性。圖l全精氨酸寡肽及銅(II)配合物的合成路線；i)二環(huán)己基羰二亞胺(DCC)、羥基苯并三氮唑(H0Bt)、N-甲基嗎啉(NMM);ii)氯化氫/乙酸乙酯溶液(4N);iii)三氟乙酸/三氟甲磺酸(4/l);iv)pH8-9。圖2全賴氨酸寡肽及銅(II)配合物的合成路線；i)DCC、H0Bt、NMM;ii)氯化氫/乙酸乙酯溶液(4N);iii)H2、Pd/C;iv)pH8-9。圖3H-Lys-Lys-0H(5)的掃描電鏡圖。圖4Cu(II)[H-Lys-Lys-0H](5-Cu)的掃描電鏡圖。具體實(shí)施方式下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)指出，這些實(shí)施例僅僅是本發(fā)明的例證，不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例1制備H-Arg-Arg-OH(該化合物的編號(hào)為1)1)制備Boc-Arg(Tos)-Arg(Tos)-OBzl將654mg(1.53mmol)Boc-Arg(Tos)-OH溶于6ml無(wú)水THF，冰浴下往得到的溶液中加入206mg(1.5mmol)N-羥基苯并三氮唑(H0Bt)，并使完全溶解。10分鐘后滴加入371mg(1.8mmo1)二環(huán)己基羰二亞胺(DCC)無(wú)水THF溶液。得到反應(yīng)液(1)，待用。冰浴下將884mg(1.5畫(huà)1)TosH-Arg(Tos)-OBzl溶于9ml無(wú)水THF中，然后用N-甲基嗎啉(NMM)，調(diào)pH7-8。攪拌35分鐘，得到反應(yīng)液(11)，待用。冰浴下把反應(yīng)液(I)加入反應(yīng)液(II)中，先冰浴下攪拌lh，再室溫?cái)嚢?6h，TLC(氯仿/甲醇，5:1)顯示TosH-Arg(Tos)-0Bz1消失。減壓濾除二環(huán)己基脲(DCU)，濾液減壓濃縮至干。殘留物用15ml乙酸乙酯溶解。得到的溶液依次用飽和NaHC03水溶液洗、飽和NaCl水溶液洗、5XKHS04水溶液洗和飽和NaCl水溶液洗。乙酸乙酯層用無(wú)水Na2S04干燥、過(guò)濾、濾液減壓濃縮至干，得到620mg(50%)標(biāo)題化合物，為無(wú)色粉末。ESI-MS(m/z)829[M+H]+.2)制備H-Arg-Arg-0H將104mg(0.125mmol)Boc-Arg(Tos)-Arg(Tos)-OBzl置于100ml茄形瓶中，冰浴下滴加入4mlCF3C02H后再滴加入lmlCF3S03H，進(jìn)行二次脫除保護(hù)基，TLC(氯仿/甲醇，10:1)顯示原料點(diǎn)消失，加入100ml乙醚攪拌，棄去乙醚層，殘?jiān)檬兔褤v磨得30mg(72%)標(biāo)題化合物，為黃色粉末。ESI-MS(m/z)331[M+H]+.[a]D20=1.6(c=1.0，H20)實(shí)施例2制備Cu(II)[H-Arg-Arg-0H](該化合物的編號(hào)為1-Cu)將20mg(0.06mmol)H-Arg-Arg-OH溶于1ml蒸餾水中，加入lOrag(0.06mmol)CuC12.H20，用Na0H(2N)水溶液調(diào)PH=9，溶液變藍(lán)，生成少許氣泡，減壓抽氣，室溫?cái)嚢?小時(shí)，TLC(純水)顯示H-Arg-Arg-0H消失。減壓濾除Cu(0H)2，濾液為藍(lán)色，減壓濃縮減少水分，用S印hdexG10除鹽，洗脫劑為蒸餾水。收集藍(lán)色組分凍干，得18mg藍(lán)色粉末。ESI-MS(m/z)423[M+63Cu]+[a]D20=-14.7(c=l.0，H20).實(shí)施例3制備Cu(II)[H-Arg-Arg-0H]2(該化合物的編號(hào)為1'-Cu)將20mg(0.06mmol)H-Arg-Arg-0H溶于lml蒸餾水中，加入10mg(0.06mraol)CuC12.H20，用Na0H(2N)水溶液調(diào)PH=9，溶液變藍(lán)，生成少許氣泡，減壓抽氣，室溫?cái)嚢?小時(shí)，TLC(純水)顯示H-Arg-Arg-0H消失。減壓濾除Cu(0H)2，濾液為藍(lán)色，減壓濃縮減少水分，用S印hdexG10除鹽，洗脫劑為蒸餾水。收集藍(lán)色組分，凍干得5rag藍(lán)色粉末。ESI-MS(ra/z)362[M+l/263Cu]+[a]D20二-111。8(c=1.0，H20).實(shí)施例4制備H-Arg-Arg-Arg-0H(該化合物的編號(hào)為2)1)制備HCl'H-Arg(Tos)-Arg(Tos)-OBzl將424mg(0.5ramo1)Boc-Arg(Tos)-Arg(Tos)-OBzl置于50ml琉形瓶中，冰浴下滴加入2ml4mol/l氯化氫-乙酸乙酯溶液，冰浴攪拌2小時(shí)，TLC(氯仿/甲醇，10:1)顯示原料點(diǎn)消失，減壓濃縮除去乙酸乙酯，殘留物反復(fù)加少量乙醚進(jìn)行減壓濃縮以除去氯化氫氣。最后加少量乙醚將殘留物研磨成209mg(100%)標(biāo)題化合物，為白色粉末，直接用于下一步反應(yīng)。2)制備Boc-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Arg(Tos)-OBzl將655mg(1.53腸l)Boc-Arg(Tos)-0H溶于6ml無(wú)水THF，冰浴下往得到的溶液中加入206mg(l.5mfflo1)H0Bt，并使完全溶解。10分鐘后滴加入371rag(L8mmo1)DCC的無(wú)水THF溶液。得到反應(yīng)液(1)，待用。冰浴下將1.147g(l.5ramo1)HCl.H-Arg(Tos)-Arg(Tos)-OBzl溶于12ml無(wú)水THF中，然后用N-甲基嗎啉(NMM)，調(diào)pH7-8。攪拌35分鐘，得到反應(yīng)液(II)，待用。冰浴下把反應(yīng)液(I)加入反應(yīng)液(n)中，先冰浴下攪拌lh，再室溫?cái)嚢?6h，TLC(氯仿/甲醇，5:1)顯示HC1.H-Arg(Tos)-Arg(Tos)-0Bzl消失。減壓濾除DCU，濾液減壓濃縮至干。殘留物用15ml乙酸乙酯溶解。得到的溶液依次用飽和NaHC03水溶液洗、飽和NaCl水溶液洗、5XKHS04水溶液洗和飽和NaCl水溶液洗。乙酸乙酯層用無(wú)水Na2S04干燥、過(guò)濾、濾液減壓濃縮至干，得到1.069g(62%)標(biāo)題化合物，為黃色粉末。ESI-MS(m/z)1161[M+Na]+.3)制備H-Arg-Arg-Arg-0H將114mg(0.1,1)Boc-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Arg(Tos)-OBzl置于100ml茄形瓶中，冰浴下滴加入4mlCF3C02H后再滴加入lmlCF3S03H，進(jìn)行二次脫除保護(hù)基，TLC(氯仿/甲醇，10:1)顯示原料點(diǎn)消失，加入100ml乙醚攪拌，棄去乙醚層，殘?jiān)檬兔褤v磨得39mg(79%)標(biāo)題化合物，為黃色粉末。ESI-MS(m/z)244[l/2(M+2H)]+.[a]D20=1.7(c=l.0，H20).實(shí)施例5制備Cu(II)[H-Arg-Arg-Arg-OH](該化合物編號(hào)為2-Cu)將20mg(0,04mmol)H-Arg-Arg-Arg-0H溶于1ml蒸餾水中，加入7mg(0.04ramol)CuC12.H20，用NaOH(2N)水溶液調(diào)ra=9，溶液變藍(lán)，生成少許氣泡，減壓抽氣，室溫?cái)嚢?小時(shí)，TLC(純水)顯示H-Arg-Arg-Arg-0H消失。減壓濾除Cu(0H)2，濾液為藍(lán)色，減壓濃縮減少水分，用S印hdexGlO除鹽，洗脫劑為蒸餾水。收集藍(lán)色組分，凍干得20mg(93%)藍(lán)色粉末。ESI-MS(m/z)543[M+63Cu]+.[a]D20二7.6(c:l.O，H20).實(shí)施例6制備H-Arg-Arg-Arg-Arg-OH(該化合物的編號(hào)為3)1)制備HC1.H-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Arg(Tos)-OBzl將569mg(0.5imio1)Boc-Arg(Tos)-Arg(Tos)-OBzl冰浴下滴加入6ml4rao1/1氯化氫-乙酸乙酯溶液，冰浴攪拌2小時(shí)，TLC(氯仿/甲醇，10:1)顯示原料點(diǎn)消失，減壓濃縮除去乙酸乙酯，殘留物反復(fù)加少量乙醚進(jìn)行減壓濃縮以除去氯化氫氣。最后加少量乙醚將殘留物研磨成537mg(100%)標(biāo)題化合物，為白色固體粉末，直接用于下一步反應(yīng)。ESI-MS(m/z)1039[M+H]+.2)制備Boc-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Arg(Tos)-OBzl將209mg(0,51mmol)Boc-Arg(Tos)-OH溶于10ml無(wú)水謹(jǐn)F，冰浴下往得到的溶液中加入69mg(0.5mmo1)H0Bt，并使完全溶解。10分鐘后滴加入124mg(0.6腿o1)DCC無(wú)水DMF溶液。得到反應(yīng)液(1)，待用。冰浴下將537g(0.5mmo1)HC1-H-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Arg(Tos)-OBzl溶于10ml無(wú)水DMF中，然后用N-甲基嗎啉(NMM)，調(diào)pH7-8。攪拌35分鐘，得到反應(yīng)液(11)，待用。冰浴下把反應(yīng)液(I)加入反應(yīng)液(II)中，先冰浴下攪拌lh，再室溫?cái)嚢?6h，TLC(氯仿/甲醇，5:1)顯示HCl.H-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Arg(Tos)-OBzl消失。減壓濾除DCU,濾液吹干。殘留物用30ml氯仿溶解。得到的溶液依次用飽和NaHC03水溶液洗、飽和NaCl水溶液洗、5XKHS04水溶液洗和飽和NaCl水溶液洗。氯仿層用無(wú)水Na2S04干燥、過(guò)濾、濾液減壓濃縮至干，得到311mg(43%)標(biāo)題化合物，為黃色粉末。ESI-MS(m/z)1470[M+Na]+.3)制備H-Arg-Arg-Arg-Arg-0H將207mg(0.14,1)Boc-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Arg(Tos)-OBzl置于250ml茄形瓶中，冰浴下滴加入8mlCF3C02H后再滴加入2mlCF3S03H，進(jìn)行二次脫除保護(hù)基，TLC(氯仿/甲醇，10:1)顯示原料點(diǎn)消失，加入250ml乙醚攪拌，棄去乙醚層，殘?jiān)檬兔褤v磨得72mg(80%)標(biāo)題化合物，為黃色固體粉末。ESI-MS(m/z)643[M]+.[a]D20二-2.4(c二l。0，H20)實(shí)施例7制備Cu(n)[H-Arg-Arg-Arg-Arg-0H](該化合物的編號(hào)為3-Cu)將20mg(0.03mmol)H-Arg-Arg-Arg-Arg—OH溶于1ml蒸餾水中，力口入5mg(0.03mraol)CuC12.H20，用NaOH(2N)水溶液調(diào)PH二9，溶液變藍(lán)紫，生成少許氣泡，減壓抽氣，室溫?cái)嚢?小時(shí)，TLC(純水)顯示H-Arg-Arg-Arg-Arg-0H消失。減壓濾除Cu(0H)2，濾液為藍(lán)色，減壓濃縮減少水分，用S印hdexG10除鹽，洗脫劑為蒸餾水。收集藍(lán)色組分，凍干得16mg藍(lán)色粉末。ESI-MS(m/z)717[M+63Cu-4H]+.[a]咖190.2(c=l.0，H20).實(shí)施例8制備Cu(II)[H-Arg-Arg-Arg-Arg-0H]2(該化合物的編號(hào)為3，Cu)將20mg(0.03mmol)H-Arg-Arg-Arg-Arg-OH溶于lml蒸餾水中，加入5mgC0.03畫(huà)l)CuC12.H20，用NaOH(2N)水溶液調(diào)PH二9，溶液變藍(lán)紫，生成少許氣泡，減壓抽氣，室溫?cái)嚢?小時(shí)，TLC(純水)顯示H-Arg-Arg-Arg-Arg-0H消失。減壓濾除Cu(0H)2,濾液為藍(lán)色，減壓濃縮減少水分，用S印hdexGlO除鹽，洗脫劑為蒸餾水。收集紫色組分，凍干得4mg紫色粉末。ESI-MS(m/z)730[M+3/263Cu_6H]+.[a]D20=2,8(c=l.0，H20).實(shí)施例9制備H-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-OH(該化合物的編號(hào)為4)1)制備HCLH-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Arg(Tos)-OBzl將145mg(0.lmmol)Boc-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Arg(Tos)-OBzl冰浴下滴加入2ml4mol/l氯化氫-乙酸乙酯溶液，冰浴攪拌2小時(shí)，TLC(氯仿/甲醇，30:1)顯示原料點(diǎn)消失，減壓濃縮除去乙酸乙酯，殘留物反復(fù)加少量乙醚進(jìn)行減壓濃縮以除去氯化氫氣。最后加少量乙醚將殘留物研磨成138mg(100%)標(biāo)題化合物，為白色粉末，直接用于下一步反應(yīng)。ESI-MS(m/z)1349[M+H]+.2)制備Boc-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Arg(Tos)-OBzl將218mg(0.51mmol)Boc-Arg(Tos)-OH溶于6ml無(wú)水畫(huà)F，冰浴下往得到的溶液中加入69mg(0.5mmo1)H0Bt，并使完全溶解。10分鐘后滴加入124mg(0.6mmol)DCC的無(wú)水DMF溶液。得到反應(yīng)液(1)，待用。冰浴下將692rag(0.5mmol)HCl-H-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Arg(Tos)-OBzl溶于7ml無(wú)水DMF中，然后用NMM調(diào)pH7-8。攪拌35分鐘，得到反應(yīng)液(11)，待用。冰浴下把反應(yīng)液(i)加入反應(yīng)液(n)中，先冰浴下攪拌ih，再室溫?cái)嚢?6h，TLC(氯仿/甲醇，5:1)顯示HC1.H-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Arg(Tos)-0Bzl消失。減壓濾除DCU，濾液吹干。殘留物用35ml氯仿溶解。得到的溶液依次用飽和NaHC03水溶液洗、飽和NaCl水溶液洗、5%KHS04水溶液洗和飽和NaCl水溶液洗。氯仿層用無(wú)水Na2S04干燥、過(guò)濾、濾液減壓濃縮至干，得到615mg(70%)標(biāo)題化合物，為黃色粉末。ESI-MS(m/z)1781[M+Na]+.3)制備H-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-0H將176mg(0.lmmol)Boc-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Arg(Tos)-0Bzl置于250ml茄形瓶中，冰浴下滴加8mlCF3C02H后再滴加2mlCF3S03H，進(jìn)行二次脫除保護(hù)基，TLC(氯仿/甲醇，10:1)顯示原料點(diǎn)消失，加入250ml乙醚攪拌，棄去乙醚層，殘?jiān)檬兔褤v磨得63mg(80%)標(biāo)題化合物，為黃色粉末。ESI-MS(m/z)400[l/2(M+2H)]+.[a]D20二-30.5(c=l.0，H20).實(shí)施例10制備Cu(II)[H-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-OH](該化合物的編號(hào)為4-Cu)將20mg(0.03mrao1)H-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-OH溶于1ml蒸餾水中，加入5mg(0.05mfflol)CuC12.H20，用Na0H(2N)水溶液調(diào)PH=9，溶液變藍(lán)紫，生成少許氣泡，減壓抽氣，室溫?cái)嚢?小時(shí)，TLC(純水)顯示H-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-0H消失。減壓濾除Cu(0H)2，濾液為藍(lán)色，減壓濃縮減少水分，用S印hdexG10除鹽，洗脫劑為蒸餾水。收集紫色組分，凍干得4mg紫色粉末。ESI-MS(m/z)856[M+63Cu-4H]+.[a]D20=-142.5(c=l.0，咖).實(shí)施例ll制備Cu(II)[H-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-OH]2(該化合物的編號(hào)為4'Cu)將20mg(0.03mmo1)H-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-OH溶于1ml蒸餾水中，加入5mg(0.05mmol)CuC12.H20，用NaOH(2N)水溶液調(diào)Hl=9，溶液變藍(lán)紫，生成少許氣泡，減壓抽氣，室溫?cái)嚢?小時(shí)，TLC(純水)顯示H-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-OH消失。減壓濾除Cu(0H)2，濾液為藍(lán)色，減壓濃縮減少水分，用S印hdexGlO除鹽，洗脫劑為蒸餾水。收集藍(lán)色組分，凍干得16mg藍(lán)色粉末。ESI-MS(m/z)901[M+7/463Cu-7H]+.[a]D20=-17.8(c二l,0,H20).實(shí)施例12制備Cu(II)[H-Arg-OH](該化合物的編號(hào)為R-Cu)將20mg(0,llmmol)H-Arg-OH溶于lml蒸餾水中，加入20mg(0.llmmol)CuC12.H20，用NaOH(2N)水溶液調(diào)PH=9，溶液變藍(lán)，生成少許氣泡，減壓抽氣，室溫?cái)嚢?小時(shí)，TLC(純水)顯示Arg消失。減壓濾除Cu(0H)2，濾液為藍(lán)色，減壓濃縮減少水分，用S印hdexGlO除鹽，洗脫劑為蒸餾水。收集藍(lán)色樣品組分，凍干分別得23mg藍(lán)色粉末(95%)。ESI-MS(m/z)221[M+3/463Cu]+.[a]D20=-48.2(c=1.0，H20)實(shí)施例13制備H-Lys-Lys-OH(該化合物的編號(hào)為5)1)制備Boc-Lys(2-CI-Z)-Lys(Z)-OBzl將635mg(1.53腿ol)Boc-Lys(2-CI-Z)-OH溶于6ml無(wú)水THF，冰浴下往得到的溶液中加入206mg(1.5mmo1)HOBt，并使完全溶解。10分鐘后滴加入371mg(1.8mmo1)DCC無(wú)水THF溶液。得到反應(yīng)液(1)，待用。冰浴下將811mg(l.5mmol)TosH-Lys(Z)-0Bzl溶于8ml無(wú)水THF中，然后用匪調(diào)pH7-8。攪拌35分鐘，得到反應(yīng)液(II),待用。冰浴下把反應(yīng)液(I)加入反應(yīng)液(II)中，先冰浴下攪拌lh，再室溫?cái)嚢?6h，TLC(氯仿/甲醇，10:l)顯示Tos'Lys(Z)-0Bzl消失。減壓濾除DCU，濾液減壓濃縮至干。殘留物用15ml乙酸乙酯溶解。得到的溶液依次用飽和NaHC03水溶液洗、飽和NaCl水溶液洗、5%KHS04水溶液洗和飽和NaCl水溶液洗。乙酸乙酯層用無(wú)水Na2S04干燥、過(guò)濾、濾液減壓濃縮至干，得到1.15g(100%)標(biāo)題化合物，為無(wú)色粉末。ESI-MS(m/z)789[M+Na]+.2)制備HC1.Lys(2-CI-Z)-Lys(Z)-0Bzl將766mg(1.Ommol)Boc-Lys(2-CI-Z)-Lys(Z)-0Bzl冰浴下滴加入7ml4mo1/1氯化氫-乙酸乙酯溶液，冰浴攪拌2小時(shí)，TLC(氯仿/甲醇，20:1)顯示原料點(diǎn)消失，減壓濃縮除去乙酸乙酯，殘留物反復(fù)加少量乙醚進(jìn)行減壓濃縮以除去氯化氫氣。最后加少量乙醚將殘留物研磨成703rag(100%)標(biāo)題化合物，為白色固體粉末，直接用于下一步反應(yīng)。ESI-MS(m/z)668[M+H]+.3)制備H-Lys-Lys-0H將703rag(1.Ommol)HCl.Lys(2-Cl-Z)-Lys(Z)-OBzl置于50ml茄形瓶中，用乙醇/水(1:1)溶解，加70mgPd/C(10%)、通H2(0.02Mba)，室溫?cái)嚢柚猎宵c(diǎn)消失。濾除Pd/C,濾液減壓濃縮至干，殘留物反復(fù)用石油醚研磨，得274mg(100%)標(biāo)題化合物，為白色固體粉末。ESI-MS(m/z)275[M+H]+.[a]D20:47.5(c二l.0，H20)實(shí)施例14制備Cu(II)[H-Lys-Lys-0H](該化合物的編號(hào)為5-Cu)將50mg(0.18mrao1)H-Lys-Lys-0H溶于2ml蒸餾水中，加入31mg(0.18mmol)CuC12.H20,用NaOH(2N)水溶液調(diào)PH=9，溶液變藍(lán)，生成少許氣泡，減壓抽氣，室溫?cái)嚢?小時(shí)，TLC(純水)顯示Lys-Lys消失。減壓濾除Cu(0H)2，濾液為深藍(lán)色，減壓濃縮減少水分，用S印hdexG10除鹽，洗脫劑為蒸餾水。收集餾份凍干得62mg(100%)藍(lán)色粉末。ESI-MS(ra/z)318[M+3/463Cu-3H]+.[a]D20=142.6(c=l,0，H20)實(shí)施例15制備H-Lys-Lys-Lys-0H(該化合物的編號(hào)為6)1)制備Boc-Lys(2-CI-Z)-Lys(2-CI-Z)—Lys(Z)-OBzl將635mg(1.53畫(huà)l)Boc-Lys(2-CI-Z)-OH溶于6ml無(wú)水THF，冰浴下往得到的溶液中加入206rag(1.5mrao1)H0Bt，并使完全溶解。10分鐘后滴加入371mg(1.8mmo1)DCC的無(wú)水THF溶液。得到反應(yīng)液(1)，待用。冰浴下將lOOlmg(l.5ramol)HCl.Lys(2-CI-Z)-Lys(Z)-OBzl溶于10ml無(wú)水THF中，然后用NMM調(diào)pH7-8。攪拌35分鐘，得到反應(yīng)液(n)，待用。冰浴下把反應(yīng)液(I)加入反應(yīng)液(II)中，先冰浴下攪拌lh，再室溫?cái)嚢?6h，TLC(氯仿/甲醇，20:l)顯示HCl丄ys(2-C1-Z)-Lys(Z)-0Bzl消失。減壓濾除DCU,濾液減壓濃縮至干。殘留物用25ml乙酸乙酯溶解。得到的溶液依次用飽和NaHC03水溶液洗、飽和NaCl水溶液洗、5XKHS04水溶液洗和飽和NaCl水溶液洗。乙酸乙酯層用無(wú)水Na2S04干燥、過(guò)濾、濾液減壓濃縮至干，得到1.571g(100%)標(biāo)題化合物，為無(wú)色粉末。ESI-MS(m/z)1085[M+Na]+.2)制備HC1'H-Lys(2-C1-Z)-Lys(2-C1-Z)-Lys(Z)-OBzl將1.062g(1.O醒ol)Boc-Lys(2-CI-Z)-Lys(2-CI-Z)-Lys(Z)-OBzl冰浴下滴加入10ml4mo1/1氯化氫-乙酸乙酯溶液，冰浴攪拌2小時(shí)，TLC(氯仿/甲醇，10:1)顯示原料點(diǎn)消失，減壓濃縮除去乙酸乙酯，殘留物反復(fù)加少量乙醚進(jìn)行減壓濃縮以除去氯化氫氣。最后加少量乙醚將殘留物研磨成969mg(97%)標(biāo)題化合物，為白色固體粉末，直接用于下一步反應(yīng)。ESI-MS(m/z)963[M+H]+.4)制備H-Lys-Lys-Lys-0H將945mg(l.O誦ol)HC1-H-Lys(2-CI-Z)-Lys(2-CI-Z)-Lys(Z)-OBzl置于50ml茄形瓶中，用乙醇/水(1:1)溶解，加95mgPd/C(10%)、通H2(0.02Mba)，室溫?cái)嚢柚猎宵c(diǎn)消失。濾除Pd/C，濾液減壓濃縮至干，殘留物反復(fù)用石油醚研磨，得381mg(95%)標(biāo)題化合物，為無(wú)色粉末。ESI-MS(m/z)403[M+H]+。[a]V-19(c=l0，H20)實(shí)施例16制備Cu(II)[H-Lys-Lys-Lys-OH](該化合物的編號(hào)為6-Cu)將50mg(0.12mmol)H-Lys-Lys-Lys-OH溶于2ml蒸餾水中，加入21mg(0.12,l)CuCl2.H20，用NaOH(2N)水溶液調(diào)PH=9，溶液變紫，生成少許氣泡，減壓抽氣，室溫?cái)嚢?小時(shí)，TLC(純水)顯示Lys-Lys-Lys消失。減壓濾除Cu(0H)2，濾液為紫紅色，減壓濃縮減少水分，用S印hdexGlO除鹽，洗脫劑為蒸餾水。收集餾份凍干，得57mg(98%)紫色粉末。ESI-MSO/z)446[M+63Cu]+.[a]D20=-123.0(c=1.0,H20)實(shí)施例17制備H-Lys-Lys-Lys-Lys-OH(該化合物的編號(hào)為7)1)制備Boc-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-CI-Z)-Lys(2-CI-Z)-Lys(Z)-OBz1將635mg(1.53mmol)Boc-Lys(2-CI-Z)-OH溶于6ml無(wú)水THF，冰浴下往得到的溶液中加入206mg(1.5mmo1)HOBt，并使完全溶解。10分鐘后滴加入371rag(L8mmo1)DCC的無(wú)水THF溶液。得到反應(yīng)液(1)，待用。冰浴下將L499g(1.5mmol)HCl.H-Lys(2-CI-Z)-Lys(2-CI-Z)-Lys(Z)-OBzl溶于15ml無(wú)水THF中，然后用NMM調(diào)pH7-8。攪拌35分鐘，得到反應(yīng)液(11)，待用。冰浴下把反應(yīng)液(I)加入反應(yīng)液(II)中，先冰浴下攪拌lh，再室溫?cái)嚢?6h，TLC(氯仿/甲醇，20:1)顯示HC1,H-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-C1-Z)-Lys(Z)-OBzl消失。減壓濾除DCU，濾液減壓濃縮至干。殘留物用30ml乙酸乙酯溶解。得到的溶液依次用飽和NaHC03水溶液洗、飽和NaCl水溶液洗、5XKHS04水溶液洗和飽和NaCl水溶液洗。乙酸乙酯層用無(wú)水Na2S(X干燥、過(guò)濾、濾液減壓濃縮至干，得到2.041g(99%)標(biāo)題化合物，為白色粉末。ESI-MS(m/z)1383[M+Na]+.2)制備HCl.H-Lys(2-C1-Z)-Lys(2-CI-Z)-Lys(2-CI-Z)-Lys(Z)-OBzl將1.360g(1.Ommol)Boc-Lys(2-CI-Z)-Lys(2-CI-Z)-Lys(2-CI-Z)-Lys(Z)-OBzl冰浴下滴加入14ml4mol/l氯化氫-乙酸乙酯溶液，冰浴攪拌2小時(shí)，TLC(氯仿/甲醇，10:1)顯示原料點(diǎn)消失，減壓濃縮除去乙酸乙酯，殘留物反復(fù)加少量乙醚進(jìn)行減壓濃縮以除去氯化氫氣。最后加少量乙醚將殘留物研磨成1.257g(97%)標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體粉末，直接用于下一步反應(yīng)。ESI-MS(m/z)1261[M+H]+.3)制備H-Lys-Lys-Lys-Lys-0H將1.297g(1.0,1)HC1.H-Lys(2-CI-Z)-Lys(2-CI-Z)-Lys(2-CI-Z)-Lys(Z)-OBzl置于50ml茄形瓶中，用乙醇/水(1:1)溶解，力[]130mgPd/C(10%)、通H2(0.02Mba)，室溫?cái)嚢柚猎宵c(diǎn)消失。濾除Pd/C，濾液減壓濃縮至干，殘留物反復(fù)用石油醚研磨，得532mg(100%)標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體粉末。ESI-MS(m/z)531[M+H]+。[a]D20=-73.7(c=1.0，H20)實(shí)施例18制備Cu(II)[H-Lys-Lys-Lys-Lys-OH](該化合物的編號(hào)為7-Cu)將50mg(0.09ramol)H-Lys-Lys-Lys-Lys-OH溶于2ml蒸餾水中，加入16mg(0.09mmol)CuClrH20，用NaOH(2N)水溶液調(diào)PH=7，溶液變藍(lán)，生成少許氣泡，減壓抽氣，室溫?cái)嚢?小時(shí)，TLC(純水)顯示H-Lys-Lys-Lys-Lys-OH消失。減壓濾除Cu(0H)2，濾液為藍(lán)色，減壓濃縮減少水分，用S印hdexGlO除鹽，洗脫劑為蒸餾水。收集餾份凍干，得55mg(100%)藍(lán)色粉末。ESI-MS(/ff/z)593[M+3/263Cu-6H]+.[a]D2。=13.8(c=1.0，H20)實(shí)施例19制備Cu(II)[H-Lys-Lys-Lys-Lys-0H]2(該化合物的編號(hào)為7，-Cu)將50mg(0.09mmol)H-Lys-Lys-Lys-Lys-OH溶于2ml蒸餾水中，加入16mg(0.09mmol)CuCl2.H20，用NaOH(2N)水溶液調(diào)PH=9，溶液變紫，生成少許氣泡，減壓抽氣，室溫?cái)嚢?小時(shí)，TLC(純水)顯示H-Lys-Lys-Lys-Lys-OH消失。減壓濾除Cu(0H)2，濾液為紫色，減壓濃縮減少水分，用S印hdexGlO除鹽，洗脫劑為蒸餾水。收集餾份凍干，得55mg(100%)紫色粉末。ESI-MS(fflA)575[M+63Cu]+.[a]D20=7.3(c二l.0,H20)實(shí)施例20制備H-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-OH(該化合物的編號(hào)為8)1)制備Boc-Lys(2-CI-Z)-Lys(2-C1-Z)-Lys(2-CI-Z)-Lys(2-CI-Z)-Lys(Z)-OBzl將635g(L53mmo1)Boc-Lys(2-C1-Z)-OH溶于6ml無(wú)水THF，冰浴下往得到的溶液中加入206mg(1.5ramol)HOBt，并使完全溶解。10分鐘后滴加入371rag(1.8mmol)DCC的無(wú)水THF溶液。得到反應(yīng)液(I)，待用。冰浴下將1.944g(1.5誦o1)HC1-H-Lys(2-C1-Z)-Lys(2-C1-Z)-Lys(2-C1-Z)-Lys(Z)-OBzl溶于20ml無(wú)水THF中，然后用NMM調(diào)pH7-8。攪拌35分鐘，得到反應(yīng)液(11)，待用。冰浴下把反應(yīng)液(I)加入反應(yīng)液(II)中，先冰浴下攪拌lh，再室溫?cái)嚢?6h，TLC(氯仿/甲醇，10:1)顯示HC1.H-Lys(2-C1-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(Z)-OBzl消失。減壓濾除DCU，濾液減壓濃縮至干。殘留物用35ml乙酸乙酯溶解。得到的溶液依次用飽和NaHC03水溶液洗、飽和NaCl水溶液洗、5XKHS04水溶液洗和飽和NaCl水溶液洗。乙酸乙酯層用無(wú)水Na2S04干燥、過(guò)濾、濾液減壓濃縮至干，得到2.387g(96%)標(biāo)題化合物，為無(wú)色粉末。ESI-MS(m/z)1680[M+Na]+.2)制備HCl'H-Lys(2-C1—Z)-Lys(2-C1-Z)-Lys(2-C1—Z)-Lys(2—C1-Z)-Lys(Z)-0Bzl將1.657g(l.Ommol)Boc—Lys(2—C1—Z)—Lys(2—C1—Z)—Lys(2—CI—Z)-Lys(2-C1-Z)—Lys(Z)-0Bzl冰浴下滴加入17ml4rao1/1氯化氫-乙酸乙酯溶液，冰浴攪拌2小時(shí)，TLC(氯仿/甲醇，10:1)顯示原料點(diǎn)消失，減壓濃縮除去乙酸乙酯，殘留物反復(fù)加少量乙醚進(jìn)行減壓濃縮以除去氯化氫氣。最后加少量乙醚將殘留物研磨成1.514g(95%)標(biāo)題化合物，為無(wú)色粉末，直接用于下一步反應(yīng)。ESI-MS(m/z)1558[M+H]+.3)制備H-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-0H將1.557g(1.O咖ol)HC1.H-Lys(2—CI—Z)-Lys(2—CI—Z)—Lys(2—CI—Z)—Lys(2-C1-Z)-Lys(Z)-0Bzl置于50ml茄形瓶中，用乙醇/水(1:1)溶解，加156mgPd/C(10%)、通&(0.02Mba)，室溫?cái)嚢柚猎宵c(diǎn)消失。濾除Pd/C，濾液減壓濃縮至干，殘留物反復(fù)用石油醚研磨，得473mg(72%)標(biāo)題化合物，為無(wú)色粉末。ESI-MS(m/z)659[M+H]+.[a]D2。=—20.2(c=l.0，H20).實(shí)施例21制備Cu(II)[H-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-0H](該化合物的編號(hào)為8-Cu)將20mg(0.03mmol)H-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-OH溶于1ml蒸餾水中，加入5mg(0.03,l)CuCl2-H20，用Na0H(2N)水溶液調(diào)ra9，溶液變紫，生成少許氣泡，減壓抽氣，室溫?cái)嚢?小時(shí)，TLC(純水)顯示H-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-0H消失。減壓濾除Cu(0H)2，濾液為紫色，減壓濃縮減少水分，用S印hdexG10除鹽，洗脫劑為蒸餾水。收集餾份凍干，得21mg(99%)紫色粉末。ESI-MSU/z)760[M+7/463Cu-7H]+,[a]D2。=-38.8(c二l.O，H20)實(shí)施例22制備Cu(II)[H-Lys-OH](該化合物的編號(hào)為K-Cu)將20mg(0.14mmol)H-Lys-OH溶于1ml蒸餾水中，加入23rag(0.14mmol)CuCl2.H20，用NaOH(2N)水溶液調(diào)P^9，溶液變藍(lán)綠，生成少許氣泡，減壓抽氣，室溫?cái)嚢?小時(shí)，TLC(純水)顯示Lys消失。減壓濾除Cu(0H)2，濾液為藍(lán)色，減壓濃縮減少水分，用S印hdexGlO除鹽，洗脫劑為蒸餾水。收集組分凍干得14mg綠色粉末。ESI-MSO/k)197[M+3/463Cu-3H]+，[a]V-12.7(c=l.0，H20).實(shí)施例23制備Cu(II)[H-Lys-OHL(該化合物的編號(hào)為K2Cu)將20mg(0.14mmol)Lys溶于lml蒸餾水中，加入23mg(0.14mmol)CuCl2.H20，用Na0H(2N)水溶液調(diào)PH=9，溶液變藍(lán)綠，生成少許氣泡，減壓抽氣，室溫?cái)嚢?小時(shí)，TLC(純水)顯示Lys消失。減壓濾除Cu(0H)2，濾液為藍(lán)色，減壓濃縮減少水分，用S印hdexGlO除鹽，洗脫劑為蒸餾水。收集得兩種組分凍干得10mg藍(lán)色固體粉末。ESI-MS(/h/z)351[2M+63Cu-4H]+.[a]V-1.7(c=l.0，緣試驗(yàn)例1本發(fā)明化合物抗血栓活性測(cè)定試驗(yàn)1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD雄性大鼠，體重200-220g(購(gòu)自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部，許可證號(hào)為醫(yī)動(dòng)字第01-3056)。2)實(shí)驗(yàn)材料聚乙烯管(外徑1.6mm及1.3mm兩種)、肝素(50IU/ml)、氨基甲酸乙酯(烏拉坦)。3)測(cè)定方法與結(jié)果雄性SD大鼠(體重200g至220g)腹腔注射戊巴比妥鈉溶液進(jìn)行麻醉，分離出右頸總動(dòng)脈和左頸外靜脈，在聚乙烯管的中段放入事先稱重的6cm長(zhǎng)的絲線，以肝素生理鹽水(50IU/kg)充滿聚乙烯管，將一端插入左頸外靜脈，用注射器將生理鹽水(3ml/kg)，阿司匹林的生理鹽水溶液(20mg/kg)，本發(fā)明實(shí)施例所制備的化合物(注編號(hào)與實(shí)施例的編號(hào)相對(duì)應(yīng))的生理鹽水溶液(10皿ol/kg)的生理鹽水溶液從另一端緩慢注入聚乙烯管中，此時(shí)管中原有的肝素已被推入左頸外靜脈中，管內(nèi)大部分為被測(cè)化合物溶液，然后將注射藥物端插入右頸總動(dòng)脈。血液從右頸總動(dòng)脈經(jīng)聚乙烯管流向左頸外靜脈，15rain后中斷血流，取出絲線稱重，總重量減去絲線重量即為血栓濕重，統(tǒng)計(jì)各組的血栓濕重的均值和標(biāo)準(zhǔn)差并作t檢驗(yàn)，結(jié)果如表l。表1本發(fā)明寡肽l-8及銅絡(luò)合物(l-8)-Cu的抗血栓活性<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>n=10，NS=22,6±4.80，a)與NS比PO.01,b)與生理鹽水比P<0.05,1-8及(l-8)-Cu的劑量為10"mol/kg;*劑量為l(T6mol/kg.試驗(yàn)例2本發(fā)明化合物在大鼠抗血栓模型上的量效關(guān)系按照試驗(yàn)例1的方法，本發(fā)明測(cè)定了H-Arg-Arg-OH(l)和H-Arg-Arg-Arg-OH(2)在10nmol/kg、l勤l/kg和0.l勵(lì)l/kg三種劑量下的抗血栓活性。結(jié)果見(jiàn)表2。表2.本發(fā)明化合物1和2在三種劑量下的抗血栓活性<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>n=10,NS=22.6±4.80,a)與lnmol/kg劑量組比PO.01;b)與生理鹽水比P0.05,給藥劑量3ml/kg試驗(yàn)例3本發(fā)明寡肽1-8及(1-8)-Cu固體狀態(tài)的納米粒測(cè)定按照掃描電鏡的測(cè)定要求，將本發(fā)明實(shí)施例所制備的寡肽(編號(hào)1-8)或(l-8)-Cu的水溶液，置于銅網(wǎng)上揮發(fā)干后測(cè)定1-8及(1-8)-Cu組裝的納米球。結(jié)果表明，1-8及它們的銅絡(luò)合物固體在掃描電鏡下可以看到均勻的粒狀態(tài)。這里給出的是代表性化合物H-Lys-Lys-0H(5)和Cu(II)[H-Lys-Lys-0H](5-Cu)的掃描電鏡圖(圖3、圖4)權(quán)利要求1、下述通式I化合物H-(AA)m-OH，其中AA選自L-Arg或L-Lys殘基中的一種；m為2-5的任意整數(shù)。2、下述通式II化合物Cu(II)[H-(AA),-OH]n，其中AA選自L-Arg或L-Lys殘基中的一種；m為2-5的任意整數(shù)，n為l或2。3、一種治療抗血栓的藥物組合物，含有有效量的權(quán)利要求1通式I化合物和藥學(xué)上可接受的載體或輔料。4、一種治療抗血栓的藥物組合物，含有有效量的權(quán)利要求2通式II化合物和藥學(xué)上可接受的載體或輔料。5、權(quán)利要求1所述通式I化合物在制備治療抗血栓藥物中的用途。6、權(quán)利要求2所述通式II化合物在制備治療抗血栓藥物中的用途。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了通式為H-(AA)_m-OH(其中AA選自L-Arg或L-Lys殘基中的一種；m為2-5的任意整數(shù))的全堿性氨基酸寡肽以及通式為Cu(II)[H-(AA)_m-OH]_n(其中AA選自L-Arg或L-Lys殘基中的一種；m為2-5的任意整數(shù)，n為1或2)的全堿性氨基酸寡肽銅絡(luò)合物。本發(fā)明還公開(kāi)了上述通式化合物的制備方法、它們作為抗血栓劑的應(yīng)用。文檔編號(hào)A61K38/04GK101318992SQ200710100030公開(kāi)日2008年12月10日申請(qǐng)日期2007年6月4日優(yōu)先權(quán)日2007年6月4日發(fā)明者崔國(guó)輝,彭師奇,泓王,明趙申請(qǐng)人:北京大學(xué)