治療病毒感染的方法及其藥物的制作方法

專利名稱：：治療病毒感染的方法及其藥物的制作方法
技術領域：
：本發明屬于生物醫藥
技術領域：
，具體而言，本發明涉及治療病毒感染的方法及其中所用的藥物。更特別地，本發明涉及治療肝炎病毒或免疫缺陷病毒感染的方法以及其中所用的核酸、疫苗、融合蛋白、載體或細胞。
背景技術：
：治療或預防病毒感染是當前醫學研究的重要而熱門的課題。其中，病毒的免疫耐受性為治療或預防病毒感染帶來了很大的困難。免疫耐受性以病毒的持續存在、B細胞和T細胞產生抗體和細胞免疫的能力下降或消失為特征，使得病毒可有效的逃逸機體免疫，引起免疫耐受，使人體的免疫機制不再對抗原產生免疫應答，使病毒在體內長期存在。例如，乙型肝炎病毒(HBV)是最典型的免疫耐受性病毒，染病母親所產90%新生兒成為病毒攜帶者，部分成人HBV患者也會形成乙肝的慢性感染。HBV的持續性感染和抗原的過量表達以及病毒的變異往往導致患者體內持續的病毒復制、胸腺中病毒特異的與免疫調節相關的Thl類細胞被克隆剔除、外周血和肝臟中與病毒清除和感染細胞裂解相關的CTL反應能力下降、消失或者克隆剔除。HBV的持續性感染以及與之相關的肝硬化和肝癌對患者對社會造成了極大的經濟和社會壓力。HBV的主要結構抗原包括表面抗原S，(包括糖基化的大抗原S1S2S，中抗原S2S和小抗原S)和核心蛋白C，此外還有聚合酶P和調節蛋白e和x。S和C抗原可以引起中和抗體的產生。核心蛋白C相對保守，它產生的特異的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)對病毒清除具有重要意義。然而對HBV來說，e抗原的大量表達能夠使得Thl類細胞受到抑制，表面抗原的大量表達使得免疫系統枯竭(exhausted)。丙型肝炎病毒(HCV)的免疫耐受機制與HBV不同，HCV多為低水平感染，不易產生活躍的免疫應答，此外HCV基因極易產生變異，造成免疫逃逸，產生持續性感染和免疫耐受。HCV多蛋白N末端191個氨基酸為核心蛋白,是病毒核衣殼的主要成分。核心蛋白的N末端富含堿性氨基酸且高度保守。核心蛋白后是病毒的包膜蛋白E1，E2，是高度糖基化的I型跨膜蛋白。在所有HCV蛋白中，E2的保守性最弱，是免疫反應的主要目標。大多數的HCV非結構蛋白(NS2-NS5B)為病毒基因組復制所必需。HCV是一種高度變異的病毒，這種變異使得HCV在感染者體內形成復雜多樣的HCV準種群，有可能對機體抗病毒免疫應答產生影響。免疫逃避株的形成則可能與病毒持續感染有關。免疫逃避的兩種可能機制(l)HCV對IFN應答的主動拮抗作用，如HCVNS3/4絲氨酸蛋白酶可以阻斷干擾素調節因子3的磷酸化和活性；E2和NS5蛋白能夠抑制RNA依賴性蛋白激酶的功能，從而影響IFN的抗病毒效應。(2)HCV蛋白上B淋巴細胞或者T淋巴細胞抗原表位在機體免疫力下發生被動變異，從而逃避適應性免疫應答的攻擊。免疫缺陷病毒的典型代表是人免疫缺陷病毒(HIV)。HIV通過感染CD4T細胞，導致CD4+T淋巴細胞數量不斷下降。另外，HIV感染還引起B-細胞功能失調和NK細胞的細胞毒功能下降，使具有免疫功能的樹突狀細胞(DC)的數量在血液中和組織中的分布和數量改變。HIV感染還可引起中樞神經系統以及胃腸道等器官產生病變。由于免疫功能下降，患者并發各種癌癥和傳染病的可能性大增，并最終導致獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)。HIV的結構基因包括gag(P55、P17、P24)、Pol和env。Pol基因編碼聚合酶前體蛋白(P34)，經切割形成蛋白酶、整合酶、逆轉錄酶、核糖核酸酶H，均為病毒增殖所必需。env基因編碼約863個氨基酸的前體蛋白，經糖基化形成gp160，gpl20和gp41。gpl20含有中和抗原決定簇，已證明HIV中和抗原表位在gpl20V3環上，V3環區是囊膜蛋白的重要功能區，在病毒與細胞融合中起重要作用。gpl20與跨膜蛋白gp41以非共價鍵相連。gp41參與靶細胞融合，促使病毒侵染細胞。實驗表明gp41亦有較強抗原性，能誘導產生抗體反應。HIV的調控基因至少包括Tat、Rev、Nef、Vif、Vpu、Vpr。HIV的免疫治療應該建立阻斷病毒持續侵染CD4+T細胞的機制，抑制感染細胞內部HIV的持續復制并產生中和抗體和CTL反應。為了治療或預防病毒感染，人們已經開發了多種治療或預防病毒感染的疫苗。例如，對于HBV，HBV的預防性表面抗原疫苗得到了廣泛的應用并在很大程度上降低了HBV的感染，但此種疫苗卻不能治療HBV的慢性感染。傳統治療HBV感染的方法包括a-IFN以及化學藥物，它們在控制病毒的復制方面具有重要的作用，但是卻不能有效地清除病毒(SeegerandMason2000)。單一策略的DNA疫苗雖然因為能夠誘發細胞和體液免疫而受到重視，但是DNA疫苗在小動物實驗中的結果卻不能在大動物身上實現(Payetteetal.2006;Zhaoetal.2006)。隨著對HBV以及其誘發疾病研究的深入，已經有部分的臨床實驗采用化學藥物和蛋白疫苗結合的綜合性療法，雖取得了一定的成果(Yang,Leeetal.2006)，但傳統藥物在克服病毒變異造成的免疫逃逸、降低病毒復制和恢復機體的CTL反應能力方面還沒有樂觀的報道。至今尚無被批準的HBV治療性疫苗問世。對于HCV，HCV引起的丙型肝炎，其感染的慢性化率高達60-80%，并導致肝硬化和肝癌。HCV主要通過輸血傳染，血液的嚴格檢查可控制HCV新感染的發生率，根據上述情況，HCV的疫苗研究主要是針對治療性疫苗的研究。由于HCV基因高度可變，又缺乏合適的細胞培養系統和小動物模型，有效的重組疫苗研發受到阻礙.盡管如此，基因疫苗，多肽和蛋白質疫苗，基于DC細胞的疫苗和類病毒顆粒疫苗等研究都被廣泛關注(Mannsetal.2001)。丙型肝炎的實驗疫苗起步時，不外乎傳統意義上的疫苗策略，即尋找特異的抗原成分，來免疫宿主以期獲得中和性或保護性抗體。在研究中，以重組E1/E2蛋白免疫猩猩能誘導高滴度抗膜蛋白(anti-envelope)抗體產生但只能保護動物免受低價病毒侵害(Fomsetal,1998;Zhoueta1.2000;Leeetal1998)。基因疫苗于1992年首先報道，近來發展迅速，該技術將編碼抗原的DNA直接注射到宿主肌肉或皮內，能誘導特異性體液免疫以及更廣譜的細胞免疫應答，HCV全基因組序列的測序使得HCV基因疫苗的研究逐步深入(Jiaoetal.2004)，但重組DNA疫苗的應用同樣受到載體特征的限制。HCV疫苗面臨的挑戰，仍然是病毒蛋白的高變性，尤其是包膜蛋白的變異更為主要，而與HCV相關的LDL蛋白又使得大部分病毒顆粒具有不可中和性，成為疫苗研究的挑戰。由于HCV中和抗體的弱保護活性、病毒的高度變異性以及機體免疫功能的破壞，單一策略的疫苗研究思路在HCV的免疫治療中不能產生重要的治療作用(Inchauspeetal.2003)。HCV臨床研究的現狀迫切需要人們確立一種按照病毒侵染過程和機體免疫反應為特征的綜合性治療策略。對于HIV，自20世紀80年代初發現艾滋病之后，人們早在1986年即開始嘗試HIV的預防和治療性疫苗。主要的疫苗策略包括HIV的滅活疫苗、減毒活疫苗，這些通過對病毒的處理而獲得的疫苗雖可持續產生抗體和CTL免疫反應，并可保護試驗成年恒河猴降低SIV感染，但這些猴子最終還是發展成艾滋病(BabaTWetal.，1999)，因此人們對滅活或減毒活疫苗在人體中的應用持保守態度。對HIV重組亞單位疫苗的研究也沒有獲得可應用的成果，如美國首次進入臨床實驗的HIV膜蛋白gpl60抗原疫苗，雖然gpl20能結合到CD4細胞上并在一定程度上阻斷HIV的入侵，但由于HIV具有其它途徑與細胞表面的病毒受體結合，此種亞單位疫苗應用人體后既不能誘發CTL也不能產生中和抗體，在美國和泰國進行的III期臨床實驗以失敗告終(DennisRBetal.,2004)。HIV病毒樣顆粒疫苗是應用部分HIVDNA感染后產生的病毒蛋白組裝成顆粒樣結構的一種疫苗。由于它在靈長類動物中具有很強的免疫原性而受到重視。我國肖瑤等(肖瑤等，2000)研制的Gag和GagV3基因的病毒樣顆粒在小鼠模型上可誘導體液免疫和一定程度的細胞免疫，但未見在靈長類動物上的實驗結果。重組DNA疫苗是把HIV外源基因插入活的病毒載體，通過病毒使外源基因在宿主細胞中表達，由此產生更廣的宿主免疫應答。這些載體增加了疫苗安全性而不減弱其免疫活性(BruynGeta1.,2004)。為進一步增加疫苗的安全性，研制減毒痘苗病毒載體已有進展(QingF,eta1.,2005)。DNA疫苗用含HIV基因的質粒免疫動物，可誘導特異性抗體產生，同時還觀察到特異性T淋巴細胞的CTL應答。質粒DNA疫苗在恒河猴能誘導SIV特異性CTL，這種疫苗誘導的免疫能促進第二次CTL應答的產生，并能控制隨后的致病性SIV感染后的病毒復制(EganMA,et2000)。采用質粒DNA免疫原作為HIV候選疫苗的人體早期實驗研究已在進行中。迄今全球艾滋病疫苗進行了廣泛的臨床前實驗研究，以及近百次的艾滋病疫苗I期臨床實驗，少數疫苗已完成或正在進行n期臨床實驗。但目前尚無在臨床實驗中顯示能提供確切保護作用的疫苗，已完成的兩個艾滋病疫苗III期臨床實驗均宣告失敗。另外，通過直接干擾病毒基因表達的技術也能夠抑制病毒的復制。例如，PCT申請WO2004070002A公開了多種可供干擾的病毒基因耙位。干擾病毒基因靶位的技術有許多，其中近些年來發展起來的RNA干涉(RNAi)技術己經有報道開始應用于治療或預防諸如HBV、HCV、HIV等病毒的感染中了。例如，美國專利申請US20060293271A、US20060292691A、US20060275903A公開了大量能介導RNA干涉病毒靶核酸的序列。然而，至今還沒有報道單獨利用這種RNA干涉技術來成功地預防或治療病毒感染。還有，對于HIV，人們也已經發現了通過HIV的gp41上的七肽重復(HR)區域(如HR1和HR2)來抑制病毒囊膜與細胞膜的融合，阻止病毒進入細胞，從而阻斷病毒侵染細胞(如參見美國專利US5464933A、US5656480A)。然而，不同HR部分及其組合構成的融合蛋白阻斷病毒侵染細胞的效力是不同的，甚至有數量級水平的差異。盡管PCT申請WO2004029073A公開了可以用至少一個HR1和至少一個HR2構成的融合蛋白，但是其中沒有提示包含HR1和至少兩個HR2的融合蛋白可以顯著提高阻斷病毒侵染細胞的效力。根據上述研究結果以及國內外對免疫耐受性和免疫缺陷性病毒藥物尚未取得突破性進展，并面臨嚴峻的社會需求和技術性挑戰的現狀，我們及時提出一種新的藥物研制策略，即組合(本文中也稱為"雞尾酒")式抗免疫耐受和免疫缺陷性病毒研制新策略，其要點是根據病毒感染的特征和機體的應答特征，將多種抗病毒元件結合在一個藥物或用藥療程中。我們構建的雞尾酒藥物經證實比單一組份的疫苗有更大的免疫活性，并可在多個層面上抑制病毒的感染、復制以及造成的免疫損傷，尤其是組合使用抑制病毒復制、引發針對病毒的免疫應答和/或阻斷病毒侵染細胞的藥物。另外，我們還優化了各層面上所使用的藥物，提供了有效的抑制病毒復制的核酸、引發針對病毒的免疫應答的疫苗、阻斷病毒侵染細胞的融合蛋白等藥物。
發明內容在本發明中，本發明人提出了一種新的制備疫苗的策略。我們按照病毒侵染細胞的過程和造成的機體免疫反應的特點，設計了針對病毒不同侵染階段的包含多個抗病毒元件的藥物。由它們的不同組合所構建的雞尾酒藥物中的多種成分可在不同層面上治療或預防病毒感染，例如包含HR1和HR2的融合蛋白可以在病毒入侵細胞時進行阻斷；針對病毒變異的特征設計的RNA干擾序列和序列庫可有效抑制病毒核酸復制和變異的機率；使用熱休克蛋白gp96作為免疫佐劑能增強免疫活性并活化抗病毒的天然免疫和適應性免疫能力；從病毒抗原的多個變異序列中的保守序列設計具有廣泛交叉反應活性的重組疫苗；采用重組DNA載體免疫和病毒載體免疫的方式能最有效的發揮抗病毒免疫作用。這種雞尾酒藥物具有單一成份的疫苗所不具備的整體優勢。本發明的目的在于提供治療或預防病毒感染的方法及其中所用的藥物，例如提供治療或預防肝炎病毒或免疫缺陷病毒感染的方法以及其中所用的核酸、疫苗、融合蛋白、載體或細胞等。具體而言，在第一個方面，本發明提供了治療病毒感染的方法，其包括，a)給藥抑制病毒復制的核酸，通過RNA干涉來抑制病毒復制，所述核酸包含編碼RNA干涉序列的核酸序列；和b)給藥引發針對病毒的免疫應答的疫苗，由此清除病毒，所述疫苗包含病毒抗原、病毒抗原表位或編碼其的核酸序列。本發明可以在兩個層次上消除病毒感染給藥抑制病毒復制的核酸，通過RNA干涉的機理來減少病毒的數量；給藥疫苗，通過機體免疫系統來清除病毒。給藥可通過所屬領域技術人員所熟知的方式來進行給藥，例如胃腸道外給藥、口服、直腸、舌下、肺部、透皮、離子透入、陰道及鼻內給藥。本發明的藥物組合物優選胃腸道外給藥，如皮下、肌內或靜脈內注射。給藥劑量根據制劑形式和期望的作用時間以及治療對象的情況而有所變化，實際治療所需的量可以由醫師根據實際情況(如，病人的病情、體重等)而方便地確定。對于一般的成人，給藥的劑量可以是每kg成人體重lng-10g。對于注射給藥模式來說，優選的劑量是每kg體重100ngii-lOmg，更優選的是每kg體重l嗎-lmg，最優選的是每kg體重IO嗎-IOO嗎。在本發明的第一個方面，不同的藥物可以同時或按順序給藥。同時給藥指在同一時間向受試者給藥各種不同藥物。按順序給藥指向依次給藥各種不同藥物，給藥不同藥物之間有時間間隔。例如，在給藥核酸后約3個月、約2個月、約1個月、約2周、約1周、約3天、約2天、約l天、約12小時、約6小時、約3小時或約0.5小時再給藥疫苗；反之亦然。本發明的方法可以治療病毒的感染，尤其是治療具有免疫耐受性的病毒的感染，優選治療肝炎病毒，例如是HBV、HCV;也優選治療免疫缺陷病毒，例如HIV-1。特別對于治療免疫缺陷病毒，本發明的方法可以進一步包括給藥阻斷病毒侵染細胞的融合蛋白來阻斷病毒侵染細胞，所述融合蛋白包含HR1和至少兩個HR2。在本發明的一個具體實施方式中，本發明特別構建了不同串聯形式的包含HR1和HR2的融合蛋白，其中以順序包含HR1、HR2和HR1的融合蛋白被稱為HR121，其中以順序包含HR2、HR1和HR2的融合蛋白被稱為HR212，其中以順序包含HR1、HR2、HR1、HR2和HR1的融合蛋白被稱為HR12121。結果表明HR2所占比重較高的HR12121和HR212阻斷病毒侵染的能力比HR121更高，尤其是HR2所占比重最高的HR212，其擁有最高的阻斷病毒侵染的能力。因此，優選的融合蛋白如HR2-L1-HR1-L2-HR2，HR2-L1-HR2-L2-HR1和HR1-L1-HR2-L2-HR2，所示，其中Ll和L2分別獨立地為接頭肽。最優選的融合蛋白如SeqlDNo:78所示。在本文中，接頭肽是起連接融合蛋白中各活性成分的不超過20個氨基酸殘基大小的肽，其本身并不具有融合蛋白中各活性成分的作用。優選接頭肽不超過IO個氨基酸殘基大小。本發明可使用接頭肽連接在本發明中的各活性成分(如，HR1、HR2)之間，也可以不使用連接肽而讓上述活性成分連接。例如，本領域的技術人員所公知的接頭肽的序列有(1)、Alan,n=2-10(2)、Glyn,n=2-10;(3)、Glyn—Ser，n=2-10(4)、(Glyn-Ser)m，m=2-3;n=2-10(5)、Glyn-Ser-Glym，m=0-10;n=0-10(6)、Glyn-Pro-Glym，m=0-10;n=0-10(7)、(Ala-Gly)n,n=l~10;(8)、(Gly-Ala)n,n=l10;(9)、Glyn-Ala-Glym，m=0-10;n=0-10(10)、Alan-Gly-Alam，m=0-10;n=0-10(11)、上述序列的任意組合形式。在本文中，HR1和HR2是公知的囊膜病毒(HIV)的七肽重復區域的氨基酸序列。HRl的示例序列有SGIVQQQNNLLRA正AQQHLLQLTVWGIKQLQAR以及該序列插入、缺失或取代一個或幾個氨基酸(優選一個至三個)殘基而得的、并保留該序列活性的氨基酸序列；HR2的示例序列有WMEWDREINNYTSLIHSL正ESQNQQEKNEQELL及該序列插入、缺失或取代一個或幾個氨基酸(優選一個至三個)殘基而得的、并保留該序列活性的氨基酸序列。除了直接給藥融合蛋白，給藥阻斷病毒侵染細胞的融合蛋白也包括給藥能夠表達或產生該融合蛋白的核酸或表達載體或細胞或細胞培養物，由此間接給藥融合蛋白。在本發明的一個具體實施方式中，我們構建了能夠表達HR212的載體pcDNA3.0-tPA-HR212和pSecTag2B-HR212，將這些載體分別轉染293T細胞，通過使用細胞培養上清來發揮HR212的作用。因此，本發明也包括編碼前述融合蛋白的核酸，優選其核苷酸序列如SeqIDNo:79所示。在本文中，抑制病毒復制的核酸優選包含編碼RNA干涉序列的單鏈正義核酸序列及其反義序列，所述正義核酸序列及其反義序列通過接頭核酸相連。接頭核酸是本領域技術人員所熟知的，其能彎曲使得所述核酸序列與其反義序列配對結合形成雙鏈核酸，從而能夠通過RNA干涉的機制來抑制病毒復制，減少病毒數量。對于HBV、HCV和HIV來說，所述核酸中編碼RNA干涉序列的核酸序列優選是衍生自乙型肝炎病毒的X抗原、S抗原、核心蛋白C或聚合酶P的RNA干涉序列的核酸序列，或是衍生自丙型肝炎病毒的5'UTR的RNA干涉序列的核酸序列，或是衍生自人免疫缺陷病毒的tat基因的RNA干涉序列的核酸序列。在本發明的具體實施方式中，我們開發的最優選的編碼RNA干涉序列的核酸序列如SeqIDNo:62-67、68和71之任一所示。由此構成的最優選的抑制病毒復制的核酸的核酸序列如SeqIDNo:20-21、22和23之任一所示。通過疫苗來清除病毒對于本領域技術人員來說是熟知的。在本文中，為了更有效地引發并保持免疫應答，弓I發針對病毒的免疫應答的疫苗優選包含病毒抗原、病毒抗原表位或編碼其的核酸序列，并包含非特異性免疫刺激蛋白或編碼其的核酸序列。本發明中的疫苗優選是DNA疫苗，即在DNA載體上克隆有編碼病毒抗原或病毒抗原表位的核酸序列，并克隆有編碼非特異性免疫刺激蛋白的核酸序列。在本發明的具體實施方式中，優選的DNA載體是pcDNA3.0載體。在另一方面，本發明中的疫苗優選是重組病毒疫苗，更優選是重組痘苗病毒疫苗，即在痘苗病毒上克隆有編碼病毒抗原或病毒抗原表位的核酸序列，并克隆有編碼非特異性免疫刺激蛋白的核酸序列。對于HBV、HCV和HIV來說，所述病毒抗原或病毒抗原表位優選選自乙型肝炎病毒的核心抗原、膜抗原、T細胞表位，或選自丙型肝炎病毒的衣殼蛋白core、El、E2，或選自人免疫缺陷病毒的結構抗原。在本發明的具體實施方式中，我們開發的最優選的病毒抗原或病毒抗原表位選自如SeqlDNo:4-6、72-76、58、69、70、59-61所示的序列或其編碼序列。非特異性免疫刺激蛋白優選選自IFN、gp96、MHC-1類分子、(32-微球蛋白。最特別地，本發明尤其優選編碼包含病毒抗原表位、和MHC-1類分子、P2-微球蛋白的單鏈三聚體(本文中簡稱為SCT)融合蛋白的DNA疫苗，即DNA載體(優選是pcDNA3.0載體)上依次克隆有編碼病毒抗原表位、MHC-1類分子、(32-微球蛋白的核酸序列，其中病毒抗原表位、MHC-1類分子、(32-微球蛋白的核酸序列之間連接有編碼本文所述接頭肽的核酸序列。特別優選該DNA疫苗中的單鏈三聚體序列如本申請的具體實施方式中所記載的。優選本發明第一個方面的方法中還包括在給藥抑制病毒復制的核酸和給藥引發針對病毒的免疫應答的疫苗之后，還包括給藥非特異性免疫刺激蛋白(如干擾素)來強化免疫。非特異性免疫刺激蛋白可以是直接給藥的，也可以是給藥能夠表達或產生該蛋白的核酸或表達載體或細胞或細胞培養物，由此間接給藥蛋白。在本發明的一個具體實施方式中，最后還給藥了表達干擾素的痘苗病毒。在第二個方面，本發明提供了抑制病毒復制的核酸和引發針對病毒的免疫應答的疫苗的組合在制備治療或預防病毒感染的藥物中的應用，其中所述核酸包含編碼RNA干涉序列的核酸序列，所述疫苗包含病毒抗原、病毒抗原表位或編碼其的核酸序列。制備組合(雞尾酒)藥物可以將各種不同的藥物混合在一起制成藥物組合物，也可以將它們分別獨立包裝然后裝在同一個藥劑盒中，或者結合上述兩種方式，將部分不同的藥物混合在一起并將部分藥物獨立包裝，然后將它們都裝在同一個藥劑盒中。本發明的應用可以預防或治療病毒的感染，尤其是預防或治療具有免疫耐受性的病毒的感染，優選預防或治療肝炎病毒，例如是HBV、HCV;也優選預防或治療免疫缺陷病毒，例如HIV-1。特別對于預防或治療免疫缺陷病毒，本發明的應用中，組合中可進一步包括阻斷病毒侵染細胞的融合蛋白，所述融合蛋白包含HR1和至少兩個HR2。在本發明的一個具體實施方式中，HR2所占比重較高的HR12121和HR212阻斷病毒侵染的能力比HR121更高，尤其是HR2所占比重最高的HR212，其擁有最高的阻斷病毒侵染的能力。因此，優選的融合蛋白如HR2-L1-HR1-L2-HR2所示，其中L1和L2分別獨立地為接頭肽。最優選的融合蛋白如S叫IDNo:78所示。除了直接將融合蛋白制成藥物，阻斷病毒侵染細胞的融合蛋白也包括能夠表達或產生該融合蛋白的核酸或表達載體或細胞或細胞培養物，由此這些產品進入機體內可以間接給藥融合蛋白。因此，本發明也包括編碼前述融合蛋白的核酸，優選其核苷酸序列如SeqIDNo:79所示;另外本發明也包括包含編碼前述融合蛋白的核酸的載體或細胞。抑制病毒復制的核酸優選包含編碼RNA干涉序列的單鏈正義核酸序列及其反義序列，所述正義核酸序列及其反義序列通過接頭核酸相連。接頭核酸是本領域技術人員所熟知的，其能彎曲使得所述核酸序列與其反義序列配對結合形成雙鏈核酸，從而能夠通過RNA干涉的機制來抑制病毒復制，減少病毒數量。對于HBV、HCV和HIV來說，所述核酸中編碼RNA干涉序列的核酸序列優選是衍生自乙型肝炎病毒的X抗原、S抗原、核心蛋白C或聚合酶P的RNA干涉序列的核酸序列，或是衍生自丙型肝炎病毒的5，UTR的RNA干涉序列的核酸序列，或是衍生自人免疫缺陷病毒的tat基因的RNA干涉序列的核酸序列。在本發明的具體實施方式中，我們開發的最優選的編碼RNA干涉序列的核酸序列如SeqIDNo:62-67、68和71之任一所示。由此構成的最優選的抑制病毒復制的核酸的核酸序列如SeqlDNo:20陽21、22和23之任一所示。為了更有效地引發并保持免疫應答，引發針對病毒的免疫應答的疫苗優選包含病毒抗原、病毒抗原表位或編碼其的核酸序列，并包含非特異性免疫刺激蛋白或編碼其的核酸序列。本發明中的疫苗優選是DNA疫苗，即在DNA載體上克隆有編碼病毒抗原或病毒抗原表位的核酸序列，并克隆有編碼非特異性免疫刺激蛋白的核酸序列。在本發明的具體實施方式中，優選的DNA載體是pcDNA3.0載體。在另一方面，本發明中的疫苗優選是重組病毒疫苗，更優選是重組痘苗病毒疫苗，即在痘苗病毒上克隆有編碼病毒抗原或病毒抗原表位的核酸序列，并克隆有編碼非特異性免疫刺激蛋白的核酸序列。對于HBV、HCV和HIV來說，所述病毒抗原或病毒抗原表位優選選自乙型肝炎病毒的核心抗原、膜抗原、T細胞表位，或選自丙型肝炎病毒的衣殼蛋白core、El、E2，或選自人免疫缺陷病毒的結構抗原。在本發明的具體實施方式中，我們開發的最優選的病毒抗原或病毒抗原表位選自如S叫IDNo:4-6、72-76、58、69、70、59-61所示的序列或其編碼序列。非特異性免疫刺激蛋白優選選自IFN、gp96、MHC-1類分子、P2-微球蛋白。最特別地，本發明尤其優選編碼包含病毒抗原表位、和MHC-1類分子、卩2-微球蛋白的單鏈三聚體(本文中簡稱為SCT)融合蛋白的DNA疫苗，即DNA載體(優選是pcDNA3.0載體)上依次克隆有編碼病毒抗原表位、MHC-1類分子、|32-微球蛋白的核酸序列，其中病毒抗原表位、MHC-1類分子、|32-微球蛋白的核酸序列之間連接有編碼本文所述接頭肽的核酸序列。特別優選該DNA疫苗中的單鏈三聚體序列如本申請的具體實施方式中所記載的。另外，本發明第二個方面的應用中的組合還包括給藥非特異性免疫刺激蛋白(如干擾素)。通過這種非特異性免疫刺激蛋白可以強化免疫。非特異性免疫刺激蛋白可以是直接制成藥物，也可以是將能夠表達或產生該蛋白的核酸或表達載體或細胞或細胞培養物制成藥物。在本發明的一個具體實施方式中，治療中還包括了表達干擾素的痘苗病毒。在第三個方面，本發明提供了一種治療病毒感染的藥物組合物，其包括抑制病毒復制的核酸和引發針對病毒的免疫應答的疫苗，其中所述核酸包含編碼RNA干涉序列的核酸序列，所述疫苗包含病毒抗原、病毒抗原表位或編碼其的核酸序列。對于本領域普通技術人員來說，已經有很多公知的方法能將核酸、多肽或疫苗等活性成分與藥學上可接受的載體制備成藥物組合物。本文中使用的藥學上可接受的載體指無毒的填充劑、稀釋劑、佐劑或其他制劑輔料。根據本領域的公知技術，可以根據治療目的、給藥途徑的需要將藥物組合物制成各種劑型，優選該組合物為單位劑量形式，如片劑、膠囊、粉劑、乳液劑、注射劑、噴霧劑型或作為詞料添加劑的劑型。優選本發明的藥物組合物為注射劑型。這些組合物包含不同緩沖液內容(如磷酸鹽緩沖液、Tris-HCl緩沖液)、相應的離子強度和pH值，以及其它物質(如聚乳酸、甘露醇等)。在第四個方面，本發明提供了一種治療病毒感染的藥品，其包括，a)裝有抑制病毒復制的核酸的容器，所述核酸包含編碼RNA干涉序列的核酸序列；和b)裝有引發針對病毒的免疫應答的疫苗的容器，所述疫苗包含病毒抗原、病毒抗原表位或編碼其的核酸序列。藥品對于大眾來說都是一種常見的產品。其中，容器可以是瓶、盒、注射器等能容納核酸、多肽、蛋白質、疫苗或其藥物組合物、藥物制劑等的常用容器。藥品可以只包括一個容器，如可以將抑制病毒復制的核酸和引發針對病毒的免疫應答的疫苗裝載同一個容器中；也可以包括多個容器，分別裝有不同核酸、多肽、蛋白質、疫苗或其藥物組合物、藥物制劑等產品。通常，藥品包括標簽。標簽可以貼在上述容器上，或者直接打印到上述容器上，也可以以獨立的形式存在，如作為能裝上述容器的藥盒或直接提供的說明書。標簽指示給藥的方法，如本發明第一方面的方法，其中可以包括給藥次序、時間、劑量、給藥方式等內容。根據需要，如方便運輸、存放，藥品可以進一步包裝進更大的包裝中，這也在本發明的范圍內。優選在本發明的第三個方面或第四個方面中，對于用于治療免疫缺陷病毒的藥物組合物或藥品，其可進一步包括阻斷病毒侵染細胞的融合蛋白或裝有該融合蛋白的容器，所述融合蛋白包含HR1和至少兩個HR2。在本發明的一個具體實施方式中，HR2所占比重較高的HR12121和HR212阻斷病毒侵染的能力比HR121更高，尤其是HR2所占比重最高的HR212，其擁有最高的阻斷病毒侵染的能力。因此，優選的融合蛋白如,丄1-HR1-L2-HR2所示，其中Ll和L2分別獨立地為接頭肽。最優選的融合蛋白如SeqlDNo:78所示。除了直接將融合蛋白制成藥物，阻斷病毒侵染細胞的融合蛋白也包括能夠表達或產生該融合蛋白的核酸或表達載體或細胞或細胞培養物，由此這些產品進入機體內可以間接給藥融合蛋白。因此，本發明的藥物組合物或藥品也包括編碼前述融合蛋白的核酸，優選其核苷酸序列如SeqlDNo:79所示；另外本發明的藥物組合物或藥品也包括包含編碼前述融合蛋白的核酸的載體或細胞。在藥物組合物或藥品中，抑制病毒復制的核酸優選包含編碼RNA干涉序列的單鏈正義核酸序列及其反義序列，所述正義核酸序列及其反義序列通過接頭核酸相連。接頭核酸是本領域技術人員所熟知的，其能彎曲使得所述核酸序列與其反義序列配對結合形成雙鏈核酸，從而能夠通過RNA干涉的機制來抑制病毒復制，減少病毒數量。所述核酸中編碼RNA干涉序列的核酸序列優選是衍生自乙型肝炎病毒的X抗原、S抗原、核心蛋白C或聚合酶P的RNA干涉序列的核酸序列，或是衍生自丙型肝炎病毒的5'UTR的RNA干涉序列的核酸序列，或是衍生自人免疫缺陷病毒的tat基因的RNA干涉序列的核酸序列。在本發明的具體實施方式中，我們開發的最優選的編碼RNA干涉序列的核酸序列如SeqIDNo:62-67、68和71之任一所示。由此構成的最優選的抑制病毒復制的核酸的核酸序列如SeqIDNo:20-21、22和23之任一所示。為了更有效地引發并保持免疫應答，在藥物組合物或藥品中，引發針對病毒的免疫應答的疫苗優選包含病毒抗原、病毒抗原表位或編碼其的核酸序列，并包含非特異性免疫刺激蛋白或編碼其的核酸序列。本發明中的疫苗優選是DNA疫苗，即在DNA載體上克隆有編碼病毒抗原或病毒抗原表位的核酸序列，并克隆有編碼非特異性免疫刺激蛋白的核酸序列。在本發明的具體實施方式中，優選的DNA載體是pcDNA3.0載體。在另一方面，本發明中的疫苗優選是重組病毒疫苗，更優選是重組痘苗病毒疫苗，即在痘苗病毒上克隆有編碼病毒抗原或病毒抗原表位的核酸序列，并克隆有編碼非特異性免疫刺激蛋白的核酸序列。所述病毒抗原或病毒抗原表位優選選自乙型肝炎病毒的核心抗原、膜抗原、T細胞表位，或選自丙型肝炎病毒的衣殼蛋白core、El、E2，或選自人免疫缺陷病毒的結構抗原。在本發明的具體實施方式中，我們開發的最優選的病毒抗原或病毒抗原表位選自如SeqlDNo:4-6、72-76、58、69、70、59-61所示的序列或其編碼序列。非特異性免疫刺激蛋白優選選自IFN、gp96、MHC-1類分子、卩2-微球蛋白。最特別地，本發明尤其優選編碼包含病毒抗原表位、和MHC-1類分子、{32-微球蛋白的單鏈三聚體(本文中簡稱為SCT)融合蛋白的DNA疫苗，即DNA載體(優選是pcDNA3.0載體)上依次克隆有編碼病毒抗原表位、MHC-1類分子、p2-微球蛋白的核酸序列，其中病毒抗原表位、MHC-1類分子、p2-微球蛋白的核酸序列之間連接有編碼本文所述接頭肽的核酸序列。特別優選該DNA疫苗中的單鏈三聚體序列如本申請的具體實施方式中所記載的。另外，本發明第三個方面的藥物組合物還包括非特異性免疫刺激蛋白(如干擾素)；本發明第四個方面的藥物組合物還包括裝有非特異性免疫刺激蛋白(如干擾素)的容器。通過這種非特異性免疫刺激蛋白可以強化免疫。非特異性免疫刺激蛋白可以是直接制成藥物組合物或藥品，也可以是將能夠表達或產生該蛋白的核酸或表達載體或細胞或細胞培養物制成藥物或藥品。在本發明的一個具體實施方式中，治療的藥品中還包括了表達干擾素的痘苗病毒。在第五個方面，本發明提供了一種抑制病毒復制的核酸，其包含編碼RNA干涉序列的單鏈正義核酸序列及其反義序列，所述正義核酸序列及其反義序列通過接頭核酸相連。接頭核酸是本領域技術人員所熟知的，其能彎曲使得所述核酸序列與其反義序列配對結合形成雙鏈核酸，從而能夠通過RNA干涉的機制來抑制病毒復制，減少病毒數量。對于HBV、HCV和HIV來說，所述核酸中編碼RNA干涉序列的核酸序列優選是衍生自乙型肝炎病毒的X抗原、S抗原、核心蛋白C或聚合酶P的RNA干涉序列的核酸序列，或是衍生自丙型肝炎病毒的5'UTR的RNA干涉序列的核酸序列，或是衍生自人免疫缺陷病毒的tat基因的RNA干涉序列的核酸序列。在本發明的具體實施方式中，我們開發的最優選的編碼RNA干涉序列的核酸序列如SeqIDNo:62-67、68和71之任一所示。由此構成的最優選的抑制病毒復制的核酸的核酸序列如SeqlDNo:20-21、22和23之任一所示。在一個優選的方面，本發明提供了包含第五個方面的抑制病毒復制的核酸的載體。合適的載體例如有在本發明的具體實施方式中所用的腺病毒載體。在本文中，這種載體可以替換相應的抑制病毒復制的核酸來使用。在第六個方面，本發明提供了一種引發針對病毒的免疫應答的疫苗，其包含病毒抗原、病毒抗原表位或編碼其的核酸序列，并包含非特異性免疫刺激蛋白或編碼其的核酸序列。本發明中的疫苗優選是DNA疫苗，即在DNA載體上克隆有編碼病毒抗原或病毒抗原表位的核酸序列，并克隆有編碼非特異性免疫刺激蛋白的核酸序列。在本發明的具體實施方式中，優選的DNA載體是pcDNA3.0載體。在另一方面，本發明中的疫苗優選是重組病毒疫苗，更優選是重組痘苗病毒疫苗，即在痘苗病毒上克隆有編碼病毒抗原或病毒抗原表位的核酸序列，并克隆有編碼非特異性免疫刺激蛋白的核酸序列。所述病毒抗原或病毒抗原表位優選選自乙型肝炎病毒的核心抗原、膜抗原、T細胞表位，或選自丙型肝炎病毒的衣殼蛋白core、El、E2，或選自人免疫缺陷病毒的結構抗原。在本發明的具體實施方式中，我們開發的最優選的病毒抗原或病毒抗原表位選自如S叫IDNo:4-6、72-76、58、69、70、59-61所示的序列或其編碼序列。非特異性免疫刺激蛋白優選選自IFN、gp96、MHC-1類分子、j32-微球蛋白。最特別地，本發明尤其優選編碼包含病毒抗原表位、和MHC-1類分子、P2-微球蛋白的單鏈三聚體(本文中簡稱為SCT)融合蛋白的DNA疫苗，即DNA載體(優選是pcDNA3.0載體)上依次克隆有編碼病毒抗原表位、MHC-1類分子、卩2-微球蛋白的核酸序列，其中病毒抗原表位、MHC-1類分子、卩2-微球蛋白的核酸序列之間連接有編碼本文所述接頭肽的核酸序列。特別優選該DNA疫苗中的單鏈三聚體序列如本申請的具體實施方式中所記載的。在第七個方面，本發明提供了一種阻斷HIV侵染細胞的融合蛋白，其包含HR1和至少兩個HR2。通過本發明的研究，在構建了的不同串聯形式的包含HR1和HR2的融合蛋白中，以順序包含HR1、HR2和HR1的融合蛋白被稱為HR121，其中以順序包含HR2、HR1和HR2的融合蛋白被稱為HR212，其中以順序包含HR1、HR2、HR1、HR2和HR1的融合蛋白被稱為HR12121,其中HR2所占比重較高的HR12121和HR212阻斷病毒侵染的能力比HR121更高，尤其是HR2所占比重最高的HR212，其擁有最高的阻斷病毒侵染的能力。因此，優選的融合蛋白如HR2-L1-HR1-L2-HR2所示，其中Ll和L2分別獨立地為接頭肽。最優選的融合蛋白如SeqlDNo:78所示。盡管并不優選，但是如SeqIDNo:82所示的HR12121也包括在本發明的該方面中。在本文中，接頭肽是起連接融合蛋白中各活性成分的不超過20個氨基酸殘基大小的肽，其本身并不具有融合蛋白中各活性成分的作用。優選接頭肽不超過IO個氨基酸殘基大小。本發明可使用接頭肽連接在本發明中的各活性成分(如，HR1、HR2)之間，也可以不使用連接肽而讓上述活性成分連接。例如，本領域的技術人員所公知的接頭肽的序列有(1)、Alan,n=2-10(2)、Glyn,n=2-10;(3)、Glyn—Ser，n=2-10(4)、(Glyn-Ser)m，m=2-3;n=2-10(5)、Glyn-Ser-Glym，m=0-10;n=0-10(6)、Glyn-Pro-Glym，m=0-10;n=0-10(7)、(Ala-Gly)n，n=l~10;(8)、(Gly-Ala)n,n=l~10;(9)、Glyn-Ala-Glym，m=0-10;n=0-10(10)、Alan-Gly-Alam，m=0-10;n=0-10(11)、上述序列的任意組合形式。在本文中，HR1和HR2是公知的囊膜病毒(HIV)的七肽重復區域的氨基酸序列。HR1的示例序列有SGIVQQQ麗LLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQAR以及該序列插入、缺失或取代一個或幾個氨基酸(優選一個至三個)殘基而得的、并保留該序列活性的氨基酸序列；HR2的示例序列有WMEWDREINNYTSLIHSL正ESQNQQEKNEQELL及該序列插入、缺失或取代一個或幾個氨基酸(優選一個至三個)殘基而得的、并保留該序列活性的氨基酸序列。本領域技術人員知曉，通過改變已知多肽的編碼基因序列并將其導入表達載體，可以制備出取代、插入或添加了氨基酸殘基的多肽，這些方法廣泛記載于《分子克隆實驗指南》(北京科學出版社，2002年)等本領域公知的文獻中。在變異的氨基酸殘基中，優選變異為與原氨基酸殘基側鏈性質相似的其他氨基酸，從而更得以保持原有功能活性。側鏈性質相似的氨基酸分別有疏水性氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、親水性氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、脂肪族側鏈的氨基酸(G、A、V、L、I、P)、含羥基側鏈的氨基酸(S、T、Y)、含硫原子側鏈的氨基酸(C、M)、含羧酸和酰胺側鏈的氨基酸(D、N、E、Q)、含堿性基團側鏈的氨基酸(R、K、H)、含芳香族側鏈的氨基酸(H、F、Y、W)。除了直接給藥融合蛋白，給藥阻斷病毒侵染細胞的融合蛋白也包括給藥能夠表達或產生該融合蛋白的核酸或表達載體或細胞或細胞培養物，由此間接給藥融合蛋白。在本發明的一個具體實施方式中，我們構建了能夠表達HR212的載體pcDNA3.04PA-HR212和pSecTag2B-HR212，將這些載體分別轉染293T細胞，通過使用細胞培養上清來發揮HR212的作用。因此，在另一個方面，本發明提供了編碼本發明第七個方面所述的融合蛋白的核酸，一種包含該核酸的載體，以及一種細胞，其包含該載體，或轉染或轉化有該核酸。其中，特別優選的核酸是核苷酸序列如SeqIDNo:79所示的核酸。在另一方面，由于前述多個方面中的核酸可以以載體的形式存在，因此本發明提供了一種載體，其包含前述多個方面之任一所述的核酸。載體在本文中是指本領域中常用的細菌質粒、粘粒、噬菌粒、酵母質粒、植物細胞病毒、動物病毒及其它各種病毒載體。本發明中適用的載體包括但不限于在細菌中表達用的載體(原核表達載體)、在酵母中表達用的載體(如畢赤酵母載體、漢遜酵母載體等)、在昆蟲細胞中表達的桿狀病毒載體、在哺乳動物細胞中表達用的載體(痘苗病毒載體、逆轉錄病毒載體、腺病毒載體、腺伴病毒載體等)、在植物中表達用的植物病毒載體以及在哺乳動物乳腺中表達用的各種載體。總之，只要能在宿主細胞中穩定復制，任何質粒和載體都可使用。優選表達載體包含選擇標記基因，如細菌的氨芐青霉素抗性基因、四環素抗性基因、卡那霉素抗性基因、鏈霉素抗性基因、氯霉素抗性基因；酵母菌的新霉素抗性基因、Zeocin抗性基因，酵母菌的缺陷選擇標志，如His,Leu,Trp等；真核細胞的新霉素抗性基因、Zeocin抗性基因、二氫葉酸還原酶基因及熒光蛋白標記基因等。本領域技術人員可利用DNA重組技術等一系列技術，構建含本發明所述編碼融合蛋白的DNA序列、合適的轉錄和翻譯調控序列、啟動子及選擇性標記基因等特定元件的表達載體。上述載體可用來轉化、轉染合適的宿主細胞，以便獲得所需要的融合蛋白。在另一方面，本發明還提供了一種細胞，其包含前述多個方面之任一所述的載體，或轉染或轉化有前述多個方面之任一所述的核酸。細胞可以是原核細胞，也可以是真核細胞，如，細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、昆蟲細胞、哺乳動物細胞等。宿主細胞在轉化或轉染含本發明所述編碼融合蛋白的基因序列后，即構成工程化細胞或細胞株，可用于生產所需融合蛋白，或將該能提供相應融合蛋白的細胞直接用于給藥。本領域技術人員能夠恰當地選擇適當的載體、宿主細胞，并熟知如何將載體高效地轉化或轉染入宿主細胞中，所用方法包括但不限于氯化鈣法、電穿孔法用于細菌細胞，電穿孔法和原生質體融合法用于酵母細胞，脂質體包裹、磷酸鈣共沉淀、電融合法以及顯微注射法用于哺乳動物細胞等真核細胞。由于在前述多個方面中的產品也可以單獨使用，因此在另一方面，本發明還提供了治療病毒感染的方法，其包括給藥前述多個方面之任一所述的核酸、疫苗、融合蛋白、載體或細胞，優選其中病毒是肝炎病毒或免疫缺陷病毒，優選是HBV、HCV或HIV-1;本發明還提供了前述多個方面之任一所述的核酸、疫苗、融合蛋白、載體或細胞在制備治療或預防病毒感染的藥物中的應用，優選其中病毒是肝炎病毒或免疫缺陷病毒，優選是HBV、HCV或HIV-1。另外，本發明還提供了用于治療病毒感染的藥物組合物，其包括前述多個方面之任一所述的核酸、疫苗、融合蛋白、載體或細胞；本發明還提供了用于治療或預防病毒感染的藥品，其包括裝有前述多個方面之任一所述的核酸、疫苗、融合蛋白、載體或細胞的容器。為了便于理解，以下將通過具體的附圖、實施例對本發明進行詳細地描述。需要特別指出的是，這些描述僅僅是示例性的描述，并不構成對本發明范圍的限制。依據本說明書的論述，本發明的許多變化、改變對所屬領域技術人員來說都是顯而易見的。另外，本發明引用了公開文獻，這些文獻是為了更清楚地描述本發明，它們的全文內容均納入本文進行參考，就好像它們的全文已經在本文中重復敘述過一樣。圖1:本發明的組合式抗免疫耐受和免疫缺陷性病毒研制新策略多載體雞尾酒疫苗的載體的治療策略。其中組分I是攜帶單個或多個RNA干涉元件的腺病毒載體，也可以是攜帶多種RNA干涉元件的多種腺病毒的組合(如，其中A、B、C、D表示不同的RNA干涉元件)；組分I可以單獨給藥，或可以是組合治療劑中的一種組分。組分II是DNA載體，其攜帶病毒的結構抗原基因、或由結構抗原與非特異性免疫刺激蛋白融合的核酸、或由多個或單個表位與非特異性免疫刺激蛋白融合的核酸；組分II可以單獨給藥，或可以是組合治療劑中的一種組分。組分m包括細胞因子編碼序列并任選帶有組分II基因，其中A、B、C、D分別表示組分m所攜帶的不同元件；組分m可以單獨給藥，或可以是組合治療劑中的一種組分。圖2:攜帶RNA干涉元件的重組腺病毒載體。其中，A:細胞內形成的針對HBV的siRNA的DNA模板。它們是根據HBV的序列設計出互補的sense和antisenseoligos，退火可形成雙鏈。為方便與Sall/Xbal消化載體pAVU6+27相連，在DNAoligos的5'末端加了Sall，3'端加了Xbal酶切位點，中間灰色部分為轉錄后預期形成的環結構，為使翻譯有效終止，在末端設計了終止信號dT(5)。B:Northern雜交檢測HepG2.2.15細胞中HBVmRNA的水平提取HepG2.2.15細胞的RNA，以HBVDNA為探針進行Northern雜交，并且以GAPDH作為內對照。磷屏分析結果表明，與對照相比，轉染了siHBVl(Pl)或siHBV2(P2)重組腺病毒的2215細胞中，3.5Kb和2.4Kb24/2.1Kb的mRNA水平明顯減少。在對照組中，轉染了與HBV基因無關的重組病毒U6(mock)或siEGFP(針對EGFP的RNA干擾序列)(E)的細胞中，其mRNA水平與未轉染細胞(C)中的mRNA水平相當，表明對照基因siEGFP不會影響HBVmRNA水平，顯示了siRNA作用的特異性。C代表未轉染的2215細胞；mock，E，Pl，P2分別代表轉染了含有U6+27，U6+27-s正GFP，U6+27-siHBVl，U6+27-siHBV2重組腺病毒的2215細胞。C:ELISA法檢測2215細胞中HBsAg和HBeAg的表達水平(與對照相比的百分比)取2215細胞的上清，用ELISA檢測試劑盒檢測細胞上清中的HBsAg、HBeAg水平。結果顯示與對照細胞(C)相比，轉染了siHBVl(Pl)或siHBV2(P2)重組腺病毒的細胞中HBsAg、HBeAg蛋白水平被明顯抑帝U。轉染了siHBVl重組病毒的細胞，其HBsAg下降了90.6士0.5%(P=0.00226)，HBeAg下降了88.4±0.9%(P=0.00011);轉染了siHBV2重組質粒的細胞，其HBsAg下降了92.9±0.6%(P=0.00216)，HBeAg下降了89.7±1.0%(P=0.0001)，數據顯示HBsAg的下降幅度略大于HBeAg。表明此干擾系統對HBV基因抑制的效果很好。C代表未轉染的2215細胞；mock,E，Pl，P2分別代表轉染了含有U6+27，U6+27-siEGFP，U6+27-siHBVl，U6+27-siHBV2重組腺病毒的2215細胞。D:RealtimePCR檢測HBVDNA含量取2215細胞的上清，對其中的病毒DNA進行realtimePCR分析。為定量HBVDNA的拷貝數，同時擴增了已知濃度的并且經過系列稀釋的t叩o-HBV質粒，制作出標準曲線，依據標準曲線和測得的HBVDNA的Ct值計算出HBVDNA的拷貝數。結果表明，含有siHBVl(Pl)禾口siHBV2(P2)的腺病毒感染的細胞，其上清中的HBVDNA水平與對照(14.48士2.15xlO、叩ys/mL)相比分別下降了3.7倍(3,91士0.72xl()4copys/mL;P^.00821)和3.3倍(4,41士0.85x104copys/mL;P=0,00780)。圖3:攜帶結構抗原的重組DNA載體。其中，A:融合基因的構建體草圖。(A)融合基因構建示意圖。基因在pcDNA3的CMV啟動子下。在融合基因中引入柔性的連接子"GGSGG"保證各基因的正確表達和維持正常功能。N355w代指鼠或人的gp96N端的355個氨基酸。(B)免疫印跡雜交分析。構建的克隆經磷酸鈣方法轉染293T細胞，兩天后，收集細胞，細胞裂解物經免疫沉淀后進行檢測。HBcAg(SEQIDNO:4)，HBsAg(SEQIDNO:5)，N355(SEQIDNO:2,3)，CN355(HBV核心抗原與N355的融合基因)(SEQIDNO:7)，SN355m(HBV的表面抗原S與鼠gp96N端N355的融合基因)(SEQIDNO:8)，SN355h(是HBV的表面抗原S與人gp96N端N355的融合基因)(SEQIDNO:9)，S2S(SEQIDNO:6)，S2SN355(HBV的表面抗原S2S與gp96N端N355的融合基因)(SEQIDNO:10)和N355S2S(HBV的表面抗原S2S與gp96N端N355的融合基因)(SEQIDNO:ll)，等基因產物的分子量分別為17kDa，24kDa，45kDa，62kDa，69kDa，69kDa，31kDa，76kDa和76kDa。(a)抗小鼠的核心抗原單抗檢測截短的核心抗原及其與N355的融合產物。(b,c，d)抗小鼠的表面抗原單抗檢測乙肝膜抗原的S和M蛋白及其與N355的融合產物。非糖基化(小帶)和糖基化(大帶)的帶都能夠檢測出來。B:DNA免疫BALB/c鼠和HLA/A2轉基因鼠后體液免疫反應的檢測。共免疫三次，每組5只鼠，每次肌肉注射100嗎質粒。對于共免疫組，注射前將兩種質粒各50嗎混合。最后一次免疫后10天眼眶取血，ELISA系列稀釋法測抗體效價。結果以光吸收平均值(A柳肌)士SD表示。(A)BALB/c鼠血清1/1000稀釋后的表面抗體，(B)Anti-HBsinHLA/A2轉基因鼠血清1/1000稀釋后的表面抗體，(C)和(D)分別是BALB/c鼠和HLA/A2轉基因鼠血清1/10000稀釋后的核心抗體，(E)BALB/c鼠和HLA/A2轉基因鼠血清1/100稀釋后N355抗體(IgG)。所有數據均為三次不同實驗的一個代表值。C:ELISPOT檢測HBV特異細胞反應。DNA疫苗免疫BALB/c鼠和HLA/A2轉基因鼠三次，每組5只鼠，每次肌肉注射100ng質粒。對于共免疫組，注射前將兩種質粒各50昭混合。最后一次免疫后10天取小鼠脾臟細胞進行分析。HBV特異的IFN-Y和CD8+雙陽性細胞形成的斑點數以5xl05脾臟細胞計算。每組斑點數(減去沒有多肽剌激的對照斑點)以三個數的均值±標準方差表示，所有數據均為三次不同實驗的一個代表值。(A)表位HBs362-371和Ld28-39用BALB/c鼠分析，表位HBs348-357用于HLA/A2轉基因鼠分析。(B)表位HBc87-95用于BALB/c鼠分析，表位HBcl8-27用于HLA/A2轉基因鼠分析。圖4:攜帶抗原表位、MHC-I類分子和(32-微球蛋白的SCT重組DNA載體的構建和免疫效果。SCT是通過將抗原表位、MHC-I類分子和P2-微球蛋白通過15個氨基酸的GS連接子連接而構建的融合基因，其結構如圖A所示。圖4B顯示，SCT可以有效地將抗原表位呈遞在細胞表面。圖4C顯示，用SCT重組DNA載體免疫HLA-A2轉基因鼠可以產生特異的CTL。圖4D顯示，SCT具有抑制H印G2.2.15細胞中HBV復制的能力。圖5:單獨或聯合使用治療劑的小鼠實驗結果。其中，A:注射RNA干擾載體或者是DNA疫苗或者是痘病毒疫苗3周后小鼠血清中HBsAg和HBeAg的表達水平(用與對照相比的百分比表示)B:注射RNA干擾載體或者是DNA疫苗或者是痘病毒疫苗3周后小鼠血清中HBV-DNA的拷貝數C:三次免疫后小鼠血清中HBsAg和HBeAg的表達水平(用與對照相比的百分比表示)D:三次免疫后小鼠血清中HBV-DNA的拷貝數E:三次免疫轉基因老鼠免疫后小鼠脾臟細胞的ELISPOT結果圖6:重組痘苗病毒和多載體治療性HBV和HIV疫苗免疫產生的CTL。用實施例一載體2B中的HBV核心抗原-SCT重組DNA和如圖A所示的重組痘苗構成的多載體HBV治療性疫苗免疫HLA-A2轉基因鼠可以高效的誘發HBV核心抗原相關的CTL水平。用HIV的gag表位具有一致的實驗結果。圖6A，重組痘苗病毒的構建形式之一。圖6B，用含SCT的重組DAN載體和重組痘苗病毒免疫HLA-A2轉基因鼠可以高效產生HBV核心抗原和HIVgag抗原特異的CTL。在本實施例中，載體上的A是y-IFN，B是S2SN355，C是HLA-A2畫SCT-C18。圖7:真核分泌表達的囊膜病毒膜融合抑制基因的構建圖。其中，A帶tPA信號肽的膜融合抑制劑的構建。B帶IgG信號肽的膜融合抑制劑的構建。圖8:其他HBV的RNA干涉序列。其中，A:與HBVX抗原對應的干涉RNA序列轉化成的插入到pAVU6+27載體上的序列。B:與HBVS抗原對應的干涉RNA序列轉化成的插入到pAVU6+27載體上的序列。C:與HBVC抗原對應的干涉RNA序列轉化成的插入到pAVU6+27載體上的序列。D:與HBVP抗原對應的干涉RNA序列轉化成的插入到pAVU6+27載體上的序列。具體實施例方式以下本文將通過具體的實施例來描述發明。如未特別指明之處，可根據本領域技術人員所熟悉的《分子克隆實驗指南》(第三版)(科學出版社，北京，中國，2002年)、《細胞實驗指南》(科學出版社，北京，中國，2001年)、《RNA實驗技術手冊》(科學出版社,北京,中國,2004年)、《免疫檢測技術》(科學出版社,北京,中國,1991)等實驗手冊以及本文所引用的參考文獻中所列的方法來實施。實施例一.治療HBV感染的雞尾酒療法1.對HBV產生RNA干擾的重組腺病毒1.1構建針對HBV單個抗原(X抗原)靶位的RNA干擾的腺病毒載體根據乙肝病毒(HBV)X抗原的mRNA序列，我們設計了2個siRNA序列(其相應DNA序列為SEQIDNO:20、21)，并將其轉換成兩條雙鏈DNA序列(其序列如圖2A所示)，其中為了能連接表達載體pAVU6+27的U6+27啟動子之后，分別在DNA的5'末端加了&/I酶切位點，3'端加了1d酶切位點；而且為使翻譯有效終止，在末端設計了終止信號寡聚dT。上述DNA序列委托博亞公司(北京，中國)合成后，分別將互補序列混合溶解并于10(TC煮沸3分鐘，然后降溫至室溫從而退火形成如圖2A所示的雙鏈DNA，然后與經Sall/Xbal消化的載體pAVU6+27(購自Clontech公司，美國)連接，轉化大腸桿菌JM109菌株后，篩選出載體pAVU6+27上帶有siRNA序列的陽性克隆。經測序確認后，分別得到載有并能表達相應siRNA的質粒，分別命名為pAVU6+27-siHBVl(SEQIDNO:20)和pAVU6+27-siHBV2(SEQIDNO:21)。根據文獻(JingCeta1.selectiveinhibitionofhepatitisBvirusreplicationbyRNAinterference,BiochemBiophysResCommun.2003,309(2):482-4，分另U將pAVU6+27-siHBVl和pAVU6+27-siHBV2與pUC19-HBV1.3(購自MBI，美國)質粒瞬時共轉染進HepG2(購自ATCC,編號為HB8065)細胞中。根據廠商說明書，利用上海實業科華生物技術有限公司的乙肝病毒體外ELISA檢測試劑盒檢測乙肝相關S抗原和e抗原的表達，發現pAVU6+27-siHBVl和pAVU6+27-siHBV2都能有效抑制HBV的S抗原(分別下降了92.9±0.6%(P=0.00216)，94.3士0.8%(P=0.00311))和e抗原(分別下降了82.6±0.5%(P=0.00202)，86.3±0.9%(P=0.000132))的表達。分別將載體pAVU6+27-siHBVl和pAVU6+27-siHBV2中含有siRNA的表達盒用/z/"^in切下，電泳后回收，將它們分別與經歷'^mi酶切并去磷酸化的pshuttle(購自Stratagene,美國)連接，轉化大腸桿菌JM109菌種后，篩選出載體pshuttle上帶有siRNA序列的陽性克隆。經測序確認后，得到目的質粒pshuttle-U6+27-siHBVl和pshuttle-U6+27-siHBV2。根據廠商說明書，分別將上述目的質粒用pmel線性化，利用乙醇沉淀回收，與pA犯asy-l(購自Stratagene,美國)質粒共同電轉化到感受態細胞BJ5183(購自Stratagene,美國)中進行同源重組，篩選得到含有各siRNA表達框的重組體。然后，分別將重組體利用；^cl線性化酶切，回收后轉染病毒包裝細胞系GP-293(購自Clontech,PaloAlto，CA)，7-10天后，收集病毒，由此構建了腺病毒載體，分別命名為腺病毒siHBVl(表達SEQIDNO:20)禾口siHBV2(表達SEQIDNO:21)。為了檢測上述腺病毒載體能否針對HBVX抗原進行RNA干擾，進行如下測試將GP-293細胞(購自Clontech，PaloAlto，CA)鋪成單層，按照梯度加入系列稀釋的病毒液，然后用1%半固體培養基(2xDMEM(6。/。FCS，雙抗):l。/。瓊脂4:l)培養培養48小時，計數形成的嗜斑數，根據病毒稀釋比例和嗜斑數確定重組腺病毒的滴度。按照0.1MOI的感染復數感染HepG2.2.15細胞(可購自ATCC)，其能穩定表達HBV的各個抗原，并能包裝完整病毒顆粒)，72小時后用上海實業科華生物技術有限公司的乙肝病毒體外ELISA檢測試劑盒檢測HBV表面抗原S和e抗原的表達情況，其中對照細胞是未經轉染的GP-293細胞。結果如圖2B所示，與對照細胞(C)相比，感染了siHBVl(Pl)或siHBV2(P2)重組病毒的細胞中S、e抗原的表達水平被明顯抑制。感染了siHBVl病毒的細胞，其S抗原的表達下降了90.6±0.5%(P=0.00226)，e抗原的表達下降了88.4±0.9%(P=0.00011);感染了siHBV2腺病毒的細胞，其S抗原下降了92.9±0.6%(P=0.00216)，e抗原下降了89.7±1.0%(P=0.0001)。提取HepG2.2.15細胞的總RNA進行甲醛變性凝膠電泳，然后將變性的RNA從膠上轉移到纖維素膜上用探針進行雜交。Northern雜交結果如圖2C所示，被病毒感染的細胞中，HBV3.5Kb和2.4Kb/2.1Kb的mRNA水平明顯降低。提取細胞總RNA，用AppliedBiosystemsSYBRgreenmastermix試劑盒在AppliedBiosystemsPrism7000儀器上進行realtimePCR反應,熒光定量PCR檢測結果如圖2D所示，被siHBVl(PI)或siHBV2(P2)重組病毒感染的細胞，其上清中的HBVDNA水平與對照(14.48士2.15xl04拷貝/mL)相比分別下降了3.7倍(3.91士0.72xl()4拷貝/mL;P-0.00821)和3.3倍(4.41士0.85xl(^拷貝/mL;P-0.00780)。這些結果表明，上述構建的腺病毒能夠介導特異靶向HBV基因的RNA干擾，可以有效抑制HepG2.2.15細胞中HBV基因的表達，并能有效抑制HBV的復制。1.2構建針對HBV多個抗原靶位的RNA干擾的腺病毒載體利用l.l節中的方法，我們分別設計了下列針對HBV的S、X、C或者聚合酶P抗原的siRNA序列并構建相應的pAVU6+27載體針對X的干擾序列1:5'-GAGGACTCTTGGACTCTCA-3，(SEQIDNO:62);針對X的干擾序列2:5'-CCGTGTGCACTTCGCTTCACCTCTG陽3，(SEQIDNO:63);如圖8A所示，設計酶切位點和終止信號寡聚dT，經化學合成后克隆入pAVU6+27中，分別形成質粒pAVU6+27-siHBV-Xl和pAVU6+27-siHBV-X2;針對S的干擾序列1:5'-CATCACATCAGGATTCCTA-3，(SEQIDNO:64);針對S的干擾序列2:5'-CTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTC-3，(SEQIDNO:65);如圖8B所示，設計酶切位點和終止信號寡聚dT，經化學合成后克隆入pAVU6+27中，分別形成質粒pAVU6+27-siHBV-Sl和pAVU6+27-siHBV-S2;針對C的干擾序列5'-CATCACATCAGGATTCCTAAA-3，(SEQIDNO:66);如圖8C所示，設計酶切位點和終止信號寡聚dT，經化學合成后克隆入pAVU6+27中，形成質粒pAVU6+27-siHBV-C;針對P聚合酶的干擾序列5'-AGAAGATCTCAATCTCGGGAATCTC-3'(SEQIDNO:67);如圖8D所示，設計酶切位點和終止信號寡聚dT，經化學合成后克隆入pAVU6+27中，形成質粒pAVU6+27-siHBV-P。如U節所述，也可以進一步分別將構建好的載體中的針對S、X、C或P的siRNA的表達框兩兩組合克隆到pshuttle載體中。例如，先利用///^ffll酶切下pAVU6+27-siHBV-Xl載體中的表達框，膠回收后連到pshuttle中，得到含有該干擾序列的pshuttle-siHBVl-Xl,進一步將針對另一個抗原的pAVU6+27-siHBV-Sl的表達框用五CoRV和WzJ切下并回收，用ECoRV酶切pshuttle-siHBVl-Xl并且去磷酸化與用￡CoRV和Wwl切下的siRNA的表達框進行平末端連接，這樣得到了一個pshuttle載體上連接有兩個siRNA的表達框。以次類推，這樣可以將所有得到的針對HBV的siRNA的表達框進行兩兩組合，克隆進腺病毒載體上。然后用相應含有兩種分別針對不同蛋白的干擾序列的腺病毒感染HepG2.2.15細胞測試其針對HBV的抑制效率。2.含有HBV抗原的疫苗2.1含有HBV結構抗原的重組DNA質粒用下表2.1所述的引物對擴增相應的模板，分別得到帶有酶切位點的HBV的結構蛋白核心抗原HBcAg編碼序列(SEQIDNO:4)(縮寫為C)、膜抗原的小蛋白HBsAg(SEQIDNO:5)(縮寫為S)、中蛋白S2S(SEQIDNO:6)、人及小鼠的gp96的N端355個氨基酸(成熟肽，不含信號肽)編碼序列N355h(SEQIDNO:2)以及N355m(SEQIDNO:l)、以及上述結構蛋白和N355h或N355m構建的融合基因(融合基因不同部分通過編碼接頭序列"GGSGG"的編碼序列"GGTTCCTCTGGAGGT"連接)。經相應的酶切后克隆入真核表達載體pcDNA3(購自Invitrogen公司，美國)中CMV啟動子的下游，構建成如下表2.1所命名的質粒，各個質粒的結構示意圖如圖3A所示。表1.2.1構建HBV結構基因以及融合基因疫苗的引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>其中，上表各引物序列編號與序列表的對照如下(a)為SEQIDNO:24;(b)為SEQIDNO:25;(c)為SEQIDNO:26;(d)為SEQIDNO:27;(e)為SEQIDNO:28;(f)為SEQIDNO:29;(g)為SEQIDNO:30;(h)為SEQIDNO:31;(i)為SEQIDNO:32;(j)為SEQIDNO:33;;(k)為SEQIDNO:35;(1)為SEQIDNO:39;(m)為SEQIDNO:40。獲得的質粒作為DNA疫苗分別以肌肉注射的方式免疫BALB/c鼠以及HLA-A2轉基因鼠(購自JacksonLab)，免疫三次，每次間隔兩周，每次注射劑量為100pg/鼠。最后一次免疫的兩周后取鼠的外周血制備血清，根據文獻(DNA-MediatedImmunizationinaTransgenicMouseModeloftheHepatitisBSurfaceAntigenChronicCarrierStatePNAS,Vol.93，No.22，12496-12501)，采用serialend-pointdilutionmethod對血清進行梯度稀釋，進行ELISA檢測HBV中相關抗原的抗體滴度，結果如圖3B所示。同時，取鼠的脾臟細胞，根據ELISPOT酶聯免疫斑點檢測脾臟中產生的HBV抗原特異的CTL產生的水平，結果如圖3C中的A、B圖所示。實驗結果表明，DNA疫苗免疫的形式可以產生明顯的抗體和CTL水平，尤其在與gp96的N端的融合的時候，產生Thl類的中和抗體，CTL的水平提高6陽8倍。2.2含有HBV抗原表位的重組DNA質粒將HBV表位(HbcAg上第18-27位，或第107-116位)與MHC-I類分子(HLA-A2重鏈)和|32-微球蛋白融合成一個融合蛋白，形成包含以上三者的單鏈三聚體(本文簡稱為SCT),使用用如下引物，A2-SCT-ujA2-SCT-primer2:AATCAGCAAGCTTGGTACCGA(SEQIDNO:44)朋"g格"突,微.A2SCT-HBcAgl8-27-1(match1):AAAG(SEQIDNO:45)A2SCT-HBcAgl8-27-2(match2):TTTTTGCCTTCTGACTTCTTTCCTTCTGTTGGAGGTGGGGGAGGCGGA(SEQIDNO:46)A2SCT-HBcAgl07-115-l(match1):(SEQIDNO:47)A2SCT-HBcAgl07陽115陽2(match2):TGTCTTACTTTTGGAAGAGAAACTGTTGGAGGTGGGGGAGGCGGA(SEQIDNO:48)用A2-SCT-upl引物與A2SCT-HBcAgl8-27-l(match1)、A2SCT-HBcAgl07-115-l(matchl)引物分別擴增pKG-A2SCT-HIVgag載體(購自Invitrogen)得到SCT的前端片段；用A2-SCT-primer2引物與A2SCT-HBcAgl8-27-2(match2)或A2SCT-HBcAgl07-115-2(match2)引物分別擴增pKG-A2SCT-HIVgag載體得到SCT的后端片段。將純化的前端片段和后端片段做模板，用A2-SCT-upl和A2-SCT-primer2作引物，擴增得到SCT序列，并分別純化。將PCR獲得的SCT基因用XhoI、HindIII進行雙酶切，然后與雙酶切的pcDNA3.0載體進行連接，并鑒定重組體。這樣得到的SCT的重組體是反向插入pcDNA3.0載體的。重新設計N端和C端引物分別引入BamHl/Xho1酶切位點，序列如下SCT-5，-BamHl:TGAGGATCCGATATGTCTCGCTCCGTGSCT-3，陽Xhol:GAGCTCGAGTCACACTTTACAAGCTGTGAGAGAC，然后進行PCR，經酶切后插入經BamHI/XhoI雙酶切的pcDNA3.0載體，獲得重組表達載體pcDNA3-SCT-cl8(或稱pcDNA-C18，含HbcAg上第18-27位，SEQIDNO:13)和pcDNA3陽SCT-cl07(或稱pcDNA-C107，含HbcAg上第107-116位，SEQIDNO:14)，測序正確(其結構草圖和部分測序結果如圖4A所示)。另外，我們還構建了pcDNA-SCT-gag(SEQIDNO:15)作為對照。用上述表達SCT的載體分別轉染NIH-3T3細胞(購自中國協和醫科大學細胞中心)，用流式細胞儀檢測SCT在細胞表面的表達情況，其結果如圖4B所示。用上述SCT重組DNA載體以肌肉注射的方式分別免疫HLA-A2轉基因鼠(100yg^Ej，發現可以有效產生特異的CTL，其結果如圖4C所示。用上述SCT重組DNA載體轉染HepG2,2.15細胞，發現其具有抑制HepG2.2.15細胞中HBV復制的能力，其結果如圖4D所示。2.3含有IFN-Y的重組痘苗病毒委托奧科生物技術公司，以全基因合成的方式按照NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation,http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/)所公開的IFN-y(NM—000619,PRI15-APR-2007)所示的序列合成IFN-丫的全基因中的127-627位堿基，其中序列的5'端加入5'-GCGAAGCTTG-3，序列(SEQIDNO:49)，序列的3'端加入3'-ACTCGAGCAT-5'序列(SEQIDNO:50)。合成的基因插入pMD18T載體(可購自TAKARA，日本)，進行序列測定，測序正確后寄回該pMDlST-IFN-y質粒。用HindlII/XhoI進行雙酶切pMD18T-IFN-y質粒，然后將IFN-y核酸片段插入用同樣酶切的pcDNA3.0載體(購自Invitrogen，美國)中。將IFN-Y核酸片段插入痘病毒載體(武漢大學)中，構建重組痘病毒載體，通過酶切和測序的方式鑒定正確后，將野生痘苗病毒天壇株(O.IMOI)(該病毒在中國曾經被廣泛用于接種預防天花，與同類病毒相比具有更明顯的弱毒性，購自中國CDC)感染Vero細胞(購自ATCC，CCL-81)吸附培養1.5小時，洗滌細胞后，利用脂質體將之前獲得的重組痘病毒載體l嗎35轉染受感染vero細胞，在vero細胞內，野生型的痘苗病毒基因組和重組痘病毒載體進行同源重組，可形成重組痘苗病毒，24小時后通過EGFP的表達或者目的基因的表達篩選形成的重組病毒。重組病毒經過六輪的單斑篩選進行純化，純化的病毒在Vero細胞中進行擴增，并用36%的蔗糖墊進行純化。圖6A是包含多個元件的若干重組痘苗病毒載體的一個實例，圖6B是利用含有載體2和載體3的雞尾酒疫苗，取IOO昭的重組質粒pcDNA3.0-SCT-C18肌肉注射免疫轉基因鼠，一周后用2xlO"PFU的重組病毒采用肌肉注射的方式進行加強免疫，一周后取小鼠的脾臟細胞檢測小鼠所產生的CTL，其結果如圖6B所示。3.聯合治療HBV感染的小鼠的實例取HBV轉基因鼠(購自廣州空軍醫院)78只，隨機分成13組，具體分組如下表1.3.1所示表1.3.1動物實驗分組及其中所使用的藥物<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>整個實驗設置如上表中所列的對照實驗A:0.9%生理鹽水，B(非特異性對照)siEGFP+0.9。/。生理鹽水，C:siHBV+0.9。/。生理鹽水，D、E、F、G為單獨注射DNA疫苗，H、I為單獨的痘病毒疫苗。其中si代表該基因的RNA干擾序列，S2S和HBcAg為HBV表面膜中蛋白基因及核心蛋白基因，S2SN355和CN355為S2S和HBcAg與gp96N短355個氨基酸殘基片段基因的融合蛋白基因，pcDNA3.0-S2S和pcDNA3.0-HBcAg是將S2S和HBcAg基因連入pcDNA3.0載體中構建的DNA疫苗，AES2S禾口AEC(其中E代表EGFP基因)為將EGFP及S2S和HBcAg基因連入痘苗病毒空載體A2d并同源重組構建的重組痘苗病毒。每次肌肉注射樣品100ul/只，質粒劑量100ug/只，痘苗病毒劑量107pfUAR。各經過三次免疫，免疫程序如下表1.3.2所示表1.3.2進行免疫治療的程序<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>實驗結果表明用重組腺病毒和重組腺病毒庫RNAi疫苗迸行初免后轉基因鼠體內HBV滴度降低60。/。以上(圖5B)，血清中的表面抗原和核心抗原的含量也相應的發生變化，HBsAg、HBeAg蛋白水平也被明顯抑制(圖5A)。第二次免疫一周后開始出現表面抗原和核心抗原特異的CTL反應，并產生保護性的S抗體，HBV的滴度繼續降低。第三次用重組痘苗病毒(S抗原和C抗原基因)加強免疫后，血清中表面抗原和核心抗原對應的抗體水平顯著提高。治療兩個月后，血清HBVDNA的拷貝數明顯降低(圖5C、圖5D、圖5E)。HBV轉基因鼠經聯合治療后，產生明顯優于單組分治療的綜合性治療效果。經DNA疫苗和痘苗疫苗的聯合免疫，體內產生顯著的多克隆CTL應答，并產生記憶性T細胞克隆，從而進一步清除了肝臟內部痕量的感染細胞。由于保護性抗體以及多表位CTL和免疫記憶的產生，HBV轉基因鼠內部的病毒顆粒得到了有效的清除。此外用痘苗病毒和腺病毒載體的交叉免疫方式可避免機體對同一種病毒載體再度免疫時所產生的中和作用。實施例二.對HCV產生RNA干擾的重組腺病毒我們根據丙型肝炎病毒(HCV)的5'UTR區域的序列，設計了siRNA序列(其相應DNA序列為5'-CCCGCTCAATGCCTGGAG-3'，SEQIDNO:68),并如同實施例一1.1中那樣，為了能連接表達載體pAVU6+27的U6+27啟動子之后，分別在DNA的5'末端加了5WI酶切位點，3'端加了力d酶切位點；而且為使翻譯有效終止，在末端設計了終止信號寡聚dT。然后如同實施例一1.1中那樣，克隆到pAVU6+27載體上并通過載體pshuttle構建了腺病毒載體，命名為腺病毒siHCV(表達SEQIDNO:68)。為了檢測上述腺病毒載體能否針對HCV進行RNA干擾，進行如下測試按照0.1MOI的感染復數感染Huh-mono細胞(購自ATCC)，其能穩定表達B89/hyg-ubi/NS3-375.1HCV復制子，采用Northernblot及熒光定量PCR檢測HCV的拷貝數。提取細胞的總RNA進行甲醛變性凝膠電泳，然后將變性的RNA從膠上轉移到纖維素膜上用探針進行Northern雜交，并且提取細胞總RNA，用AppliedBiosystemsSYBRgreenmastermix試劑盒在AppliedBiosystemsPrism7000儀器上進行realtimePCR反應。結果表明被病毒感染的細胞中HCV的復制水平下降61.6±0.5%(PK).00116)，其中的一個重要蛋白HCV-NS5B的表達水平下降了72.6±0.8%(P=0.00237)。實施例三.治療HIV-I感染的療法1.對HIV-1產生RNA干擾的重組腺病毒我們根據HIV的tat基因的序列，設計了siRNA序列(其相應DNA序列為5'-AAGTGTTGCTTTCATTGCCAAGTTTGTT-3，，SEQIDNO:71)，并如同實施例一1.1中那樣，為了能連接表達載體pAVU6+27的U6+27啟動子之后，分別在DNA的5'末端加了酶切位點，3'端加了酶切位點；而且為使翻譯有效終止，在末端設計了終止信號寡聚dT。然后如同實施例一1.1中那樣，克隆到pAVU6+27載體上并克隆到載體pshuttle上，得到了pshuttle—AVU6+27—siHIV。根據友誼中銀技術公司廠商說明書，將上述目的質粒用pmel線性化，利用乙醇沉淀回收，與pAdEasy-1(購自Stratagene，美國)質粒共同電轉化到感受態細胞BJ5183(購自Stratagene,美國)中進行同源重組，篩選得到含有siHIV表達框的重組體。然后，將重組體利用pMl線性化酶切，回收后轉染病毒包裝細胞系GP-293(購自Clontch,PaloAlto,CA)，7-10天后，收集病毒，由此構建了腺病毒載體，命名為腺病毒siHIV(表達SEQIDNO:71)。為了檢測上述腺病毒載體能否針對HIV進行RNA干擾，進行如下測試根據文獻(PRAlco-localizeswithenvelopebutdoesnotinfluenceprimatelentivirusproduction,infectivityorenvelopeincorporation.JournalofGeneralVirology(2005),86，1785—1790)，用HIVNL4.3質粒(購自Clontech公司)轉染293T細胞(購自ATCC)，以產生HIV假病毒顆粒。6小時后轉染包裝好的腺病毒siHIV，72小時后檢測抑制的效果。收集細胞，一部分用來提取細胞總蛋白,利用P24蛋白和gag蛋白抗體(SantaCruZ)進行Westernblotting檢測被抑制的效果。另一部分利用TriZol提取總RNA進行甲醛變性凝膠電泳，然后將變性的RNA從膠上轉移到纖維素膜上用探針進行雜交。Westernblotting結果顯示P24蛋白的表達被抑制掉73±0.5%(P=0.00127)，gag蛋白被抑制掉60.9±0.5%(P=0.00142)，Northernblotting表明HIV-RNA被抑制89±0.9%(P=0.00321)。說明腺病毒載體介導的RNA干擾技術能有效的抑制HIV中重要蛋白的表達，并進一步影響了病毒的復制。利用同樣的原理構建的HIVgag表位相關的SCT重組DNA和痘苗病毒載體也可以高效的誘發HIV表位相關的CTL作用(ELISPOT和IFN-y結果見圖4C)。2.HR的DNA制劑對HIV病毒侵染的阻斷作用用pcDNA3.0(Invitrogen)，pSecTag2B(Invitrogen)兩個真核表達載體，構建分別含有tPA(12誦0-tetradecanoylphorbol-13-acetate,tPA)和IgG信號肽序列的分泌表達載體。pcDNA3.0-tPA-HR212的構建采用搭橋PCR的方式，引物序列分別為Up-tPA-pl:GTCTTCGTTTCGCCCAGCTGGATGGAGTGGGACAG(SEQIDNO:51)Up-tPA-p2:GCTGTGTGCTGCTGCTGTGTGGAGCAGTCTTCGTTTCGCCCA(SEQIDNO:52)Up-tPA-p3:GATGCAATGAAGAGAGGGCTCTGCTGTGTGCTGCTGC(SEQIDNO:53)Up誦tPA-p4:CGCAGGATCCGCCACCATGGATGCAATGAAGAGAG(SEQIDNO:54)Down-HR212-pl:CGCGCTCGAGCTACAATAATTCTTGTTCATTC(SEQIDNO:55)所構建的基因結構如圖7A所示，PCR所得到的基因命名為tPA-HR212，構建入pcDNA3.0載體中，具體如下。pSecTag2B-HR212的引物序列如下，所構建的基因結構如圖7B所示。Up隱pSec-pl:CGCAGGATCCTGGATGGAGTGGGACAGAG(SEQIDNO:56)Down-HR212-pl:CTCTGTCCCACTCCATCCAGGATCCTGCG(SEQIDNO:57)PCR所得到的基因命名為HR212，構建入pSecTag2B載體中，具體如下將上述PCR得到的基因tPA-HR212(SEQIDNO:19)和HR212用BamHl/Xho1進行雙酶切，然后連入同樣酶切的真核表達載體pcDNA3.0和pSecTag2B中，構建分泌表達的真核重組DNA，分別命名為pcDNA3.0-tPA-HR212和pSecTag2B-HR212。將所構建的真核分泌表達載體轉染293T細胞(購自ATCC)，培養48-72小時后收集上清，用millipore的離心濃縮管進行濃縮。根據文獻(Expressioncloningofnewreceptorsusedbysimianandhumanimmunodeficiencyviruses.Nature1997M17;388(6639):296-300)包裝HIV的假病毒，具體操作方法為轉染前24h,消化293T細胞并傳至10cm皿中，濃度為4-5><106細胞/皿。24h后，細胞大約80%鋪滿。用磷酸鈣法將pNL43LucE-R(購自Invitrogen)禾QpMT3-HXB-2(購自Invitrogen)兩個質粒共轉染293T細胞，轉染48h后，細胞長滿變圓，離心(3000rpmxl0min)收獲含HIV-1假病毒上清液。對于pcDNA3.0-tPA-HR212組和pSecTag2B-HR212組，如下進行進行融合抑制實驗前24小時，消化GHOST-CXCR4(可購自ATCC)細胞并傳至24孔板中，細胞濃度為8><104細胞/1。將真核分泌表達載體表達的上清與病毒按照1:1混合，然后將混合物接種到GHOST-CXCR4細胞(可購自ATCC)中，待病毒吸附細胞2h后，吸棄病毒混合物，加入新鮮培養基繼續培養，每個稀釋度做2個重復，48-72小時后收獲并裂解細胞，用熒光測試儀測定細胞上清中螢火蟲熒光酶的活性。實驗結果如表3.2所示:表3.2:HR212抑制HIV侵染靶細胞<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>3，HR融合蛋白對HIV病毒侵染的阻斷作用(1)不同串聯形式的HR融合蛋白編碼基因的構建根據HIV-1的HR1和HR2的氨基酸序列HR1:SGIVQQQ麗LLRA正AQQHLLQLTVWGIKQLQARHR2:WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL設計了10條引物，即R1，Pl，A2，Bl，B2,Al，P2，R2，Dl和C2用于構建三螺旋蛋白HR121和HR212的基因，以及五螺旋蛋白HR12121基因。其中Rl和R2分別是從長引物Pl和P2上截取的與HR基因無關的序列。Pl:5'CTGGGTACCTTGGAAGTTCTATTCCAGGGTCCAGAATTCTCTGGTATAGTGCAGCAG3，A2:5，ACCTCCAGAGGAACCTCTTGCCTGGAGCTGCTT3'B1:5，GGTTCCTCTGGAGGTTGGATGGAGTGGGACAGA3'B2:5，TCCACCAGAACCACCCAATAATTCTTGTTCATT3'Al:5'GGTGGTTCTGGTGGATCTGGTATAGTGCAGCAG3'P2:5，TGGTGATGGTGGTGATGCTCGAGTCACTCGAGCTATCTTGCCTGGAGCTGCTT3'Pl:5，CTGGGTACCTTGGAAGTTCTATTCCAGGGTCCAGAATTCTGGATGGAGTGGGACAGA3'C2:5，TGGTGATGGTGGTGATGCTCGAGTCACTCGAGCTACAATAATTCTTGTTCATT3'Rl:5，CTGGGTACCTTGGAAGTTCTATTCCAGGGTCCA3'R2:5，TGGTGATGGTGGTGATGCTCGAGTCA3'利用搭橋PCR方法擴增HR121、HR212和HR12121基因。以P1、A2為引物，編碼HIV-1融合蛋白env的質粒pMT3-HXB-2(該質粒的構建參照文獻Ferrer,"a/.Naturestructuralbiology,1999(6):953-960)為模板擴增得到各個片段，并連接成添加了酶切位點的HR121(S叫IDNo:81，其編碼的多肽序列為SeqlDNo:80)、HR212(SeqlDNo:79，其編碼的多肽序列為SeqlDNo:78)和HR12121基因(S叫IDNo:83，其編碼的多月太序列為SeqlDNo:82)。其中，上述PCR擴增的溫度條件為94°C,3分鐘，一個循環。94°C，1分鐘;60°C，1分鐘；72°C，2分鐘，30個循環。72°C，IO分鐘，一個循環。將所構建的HR121，HR212,HR12121基因片段用EcoRI和XhoI雙酶切后無水乙醇沉淀回收，向酶切產物中加入1/10酶切產物體積的3mol/L醋酸鈉，2.5倍酶切產物體積的無水乙醇，-20°。沉淀30-60分鐘，12000rpm離心10分鐘，再用75%乙醇洗滌一次，12000rpm離心10分鐘，自然干燥，然后與相同的雙酶切后瓊脂糖電泳回收的pGEX-6p-l(AmershamBiosciences)載體連接，在16'C連接12h后轉化大腸桿菌DH5cc感受態細胞；隨機挑選轉化菌單菌落接種液體培養基，提取質粒用EcoRI和XhoI雙酶切鑒定，能夠獲得與目的片段分子量一致的質粒為候選陽性克隆，對所得候選陽性質粒進行DNA測序篩選出陽性克隆含有HR121基因的pGEX-6p-l/HIV-1-HR121;含有HR212基因的pGEX-6p-l/HIV-l-HR212，該HR212基因具有序列表中序列13的核苷酸序列；含有HR12121基因的pGEX-6p-l/HIV-l-HR12121。(2)HR121、HR212、HR12121的表達將經DNA測序的pGEX-6p-l/HIV-1-HR121，pGEX-6p-l/HIV-1-HR212和pGEX-6p-l/HIV-1-HR12121分別轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，挑選單克隆，接種含氨卞青霉素(10(Hig/ml)的2xYT液體培養基(胰蛋白胨16g，酵母提取物10g，氯化鈉5g，水1000ml)中，37"C搖振培養12h作為種子液；將種子液按1/100(V/V)接種量接種新鮮2xYT液體培養基(胰蛋白胨16g，酵母提取物10g，氯化鈉5g，水1000ml)，37。C搖振培養至OD600為0.8-1.0，加誘導物IPTG至終濃度lmM，37。C繼續培養4小時；5000ipm離心15分鐘收集菌體，用PBS緩沖液(140mMNaCl,2.7mMKC1,10mMNa2HP04,1.8mMKH2P04,pH7.3)懸浮菌體，超聲波裂解菌體，超聲波裂解后加入終濃度為1%的TritonX-lOO，冰浴30min，12000rpm，4。C離心15min，取上清；將超聲波裂解上清通過經PBS平衡的谷胱甘肽4B親和層析柱(購自Pharmacia公司)，再用PBS洗滌親和柱至少十個柱體積；用至少三個柱體積的還原型谷胱甘肽reducedglutathione溶液(10mM還原型谷胱甘肽，50mMTris-HClpH8.0)洗脫，收集洗脫液得到HR121、HR212、HR12121與GST的融合蛋白，經12%SDS-PAGE鑒定所得蛋白分子量與預期相符；用SuperdexG50脫鹽柱(Pharmacia公司)將融合蛋白溶解在酶切緩沖液(50mMTris-HCl，pH7.0;150mMNaCl;lmMDTT;1mMEDTA,pH8.0)，加入過量的PreScission蛋白酶(Pharmacia)5"C酶切16h;酶切產物再用谷胱甘肽4B親和層析柱親和除去酶切下的GST和PreScission,收集穿透液得到HR121、HR212、HR12121,用截流分子量為lOkDa的超濾管濃縮至適當濃度，利用分子篩進一步純化，-7(TC凍存備用。所用蛋白樣品均用12%SDS-PAGE鑒定，蛋白濃度用Bio-RadDC蛋白試劑盒來確定(購自Pharmacia公司)。結果表明HR121的表達量為40mg/L培養液；HR212的表達量為50mg/L培養液；H12121的表達量為40mg/L培養液。將經分子篩純化的HR121、HR212或HR12121蛋白用PBS緩沖液將蛋白濃度調整到約10nM。用JascoJ-715分光光度計進行圓二色譜分析，結果表明這三種多螺旋蛋白均富含a螺旋結構。(3)HR121、HR212和H12121抑制HIV-l假病毒感染細胞抑制活性的測定接毒前24小時，消化GH0ST-CXCR4細胞(MckessonBioServicesCorporation)并傳至24孔板中。將純化得到的HIV-1-HR121，HIV-1-HR212和HIV-1-HR12121分別溶于PBS緩沖液中，過濾除菌，5倍梯度稀釋后分別與等量的HIV-1假病毒(HIV-1假病毒的制備參照文獻Deng，da/.Nature,388(1997):296-300)混合。同時以GST作為陰性對照(購自Pharmacia公司)，以HIV-l-HR2-30a為陽性對照(購自Clontech公司))。然后將這種蛋白病毒混合物分別加入到細胞中(80%鋪滿)，待病毒吸附細胞2h后，吸棄病毒和蛋白的混合物，加入新鮮培養基(DMEM,90%;胎牛血清，10%;G418，500(xg/ml;潮霉素，100(ig/ml;嘌呤霉素，lfig/ml。其中的百分含量為質量百分含量)繼續培養，每個稀釋度做8個重復，48-72后收獲并裂解細胞，根據promega公司的說明書，通過測定細胞上清中螢火蟲熒光酶的活性來計算這三種多螺旋蛋白阻斷HIV-1gp41介導的膜融合。結果表明，HIV-1的三種多螺旋蛋白均能夠在nM濃度范圍內阻斷病毒進入細胞。其中HR121、HR212和HR12121的半數抑制濃度分別是16.2±2.76,2.3±0.62和7.2±1.6nmol/L。參考文獻Payette,P.J.，X.Ma，etal.(2006)."TestingofCpG-optimizedproteinandDNAvaccinesagainstthehepatitisBvirusinchimpanzeesforimmunogenicityandprotectionfromchallenge."Intervirology49(3》144-51.Seeger，C.andW.S.Mason(2000》"HepatitisBvirusbiology."MicrobiolMolBiolRev64(1):51-68,Yang,S.H.，C.G.Lee,etal.(2006)."CorrelationofantiviralT響cellresponseswithsuppressionofviralreboundinchronichepatitisBcarriers:aproof-of-conceptstudy."GeneTher.Zhao,Y.G"B.Peng,etal.(2006)."Anti-HBVimmuneresponsesinrhesusmacaqueselicitedbyelectroporationmediatedDNAvaccination."Vaccine24(7):897-903.MannsMP,McHutchinsonJQGordonSC,etal.Peginterferonalpha-2bincombinationwithribavirincomparedwithinterferonalpha-2bplusribavirinforinitialtreatmentofchronichepatitisC:results.ofarandomizedtrial.Lancet,2001,358:958-965.LeeSW，ChoJH，SungYC.OptimalinductionofhepatitisCvirusenvelope-specificimmunity.JVirol，1998,72:8430-8436.FomsX，EmersonSU,TobinGJ,etal.DNAimmunizationofmiceandmacaqueswithplasmidsencodinghepatitisCvirusenvelopeE2proteinexpressedintracellularlyandonthecellsurface."Vaccine,1999,17:1992-2002.ZhouYH，ShimizuYK,EsumiM.Monoclonalantibodiestothehypervariableregion1ofhepatitisCviruscapturevirusandinhibitvirusadsorptiontosusceptiblecellsinvitro.Virology，2000,269(2):276-283JiaoX,WangRY,FengZ,etal.DNAimmunizationencodingthesecretednonstructuralprotein3(NS3)ofhepatitisCvirusandenhancingtheThltypeimmuneresponse.JViralHepat,2004，ll(l):18隱26.InchauspeG,FeinstoneS.DevelopmentofahepatitisCvirusvaccine.ClinLiverDis,2003,7:243陽259Baba,T.W"Liska，V"Khimani,A,H.,etal.Liveattenuated,multiplydeletedsimianimmunodeficiencyviruscausesAIDSininfantandadultmacaques.Nat.Med.,1999,5:194-203.Bruyn，G.,Rossini,A.J.，Chiu，Y丄,，etal.SafetyprofileofrecombinantcanarypoxHIVvaccines.Vaccine,2004,22(56):704713.Dennis,R.B.,Ronald,C.D.，Robert,W.D.，etal.Enhanced:AsoundrationaleneededforphaseIIIHIV-1vaccinetrials.Science,2004，303:316.Egan,M.A.,Charini,W.A.，Kuroda,M丄，etal.Simianimmunodeficiencyvirus(SIV)gagDNAvaccinatedrhesusmonkeysdevelopsecondarycytotoxicT-lymphocyteresponsesandcontrolviralreplicationafterpathogenicSIVinfection.J.Virol"2000,74:7485-7495.QingFang,LinYang,WeijunZhu,etal.Hostrange,growthproperty,andvirulenceofthesmallpoxvaccine:VacciniavirusTianTanstrain.Virology,2005，335:242-251.肖瑤，范秀娟.中國HIV-1B亞型P55和嵌合的P55-V3病毒樣顆粒候選疫苗免疫效果的研究.病毒學報，2000,16(4):313316.IB074015-序列表序列表〈110〉中國科學院微生物研究所<120>治療病毒感染的方法及其藥物<130>IB074015〈160>83〈170〉Patentlnversion3.1<210>1<211>1071<212〉腿<213〉小鼠<220><221>CDS<222〉(1)..(1071)<223><400〉1atggatgatgaagtcgacgtggatggcacagtggaagaggacctgggtaaaagccgagaa60ggctc卿gacagatgatgaagttgtgcagagagaggaagaagctattcagttggatggg120ttaaacgcataaaagttcgccttccaagct180ga.agtgaacaggatgatgaaacttatcatcaattctttgtat犯aaataaagagattttc240ctgagagaactgatttcaaatgcttctgatgctttagacaag由aggctcatctcccta300actgatgaaaatgcactcgctggaaatgaggagU犯cggtcaagattaagtgtgacaaa360ga.gaaaaacctgctgcatgtcacagacacgggtgtagg犯tgactagagaggagttggtt420a.aaaatctcggcaccatagcc犯aXctggaacaagcgagtttttaaacaaaatgacagaa480gctcaagaagatggtcagtcaacctctgaactgattggccagUtggtgtcggtttttat540tctgccttccttgtagcagagtcacatcgatgatacccag600cacatctgggaatcagactccaatgaattctctgtaattgctgacccaagaggaaacaca660ctaggtcgtggaacaacaattactcttgtcttaaaagaagaagcatctgattaccttgaa720ttggacacaatta犯犯tctcgtcaggaagtactctcagttcatcaactttcccatctac780gtgtggagtagcaagacagagactgttgaggagcccttggagcagcaaaa840gaagag犯3gaagaatctgatgatgaagctgcagtagaggaggaagaageiagaaaageiaai900ccaaa.a_a.ct3agaaagttgaaaaaactgtgtgggattggg犯cttatg犯tgatatcaaa960ccastatggcagagaccatcca犯gaagtagaagaagacgaatacaaa.gctttctacaaa1020tcattttc犯aggaaagtgatgaccccatggcttatatccacttcactta1071〈210>2<211〉1071<212〉DNA<213〉人<220>〈221〉CDS<222〉(1)..(1071)<223>〈婦2a.tggacgatgaagttgatgtggatggtacagtagaagaggatctgggtaaaagtagagaa60ggatcaaggacggatgatgaagtagtacagagagaggaagaagctattcagttggatgga120ttaaatgcatcacaaataagagaacttagag柳agtcggaaaagtttgccttccaagcc180gaagttaacaga.atgatgaaacttatcatcataaaaataaagei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細胞的融合蛋白，所述融合蛋白包含HR1和至少兩個HR2。15.—種治療病毒感染的藥品，其包括，a)裝有抑制病毒復制的核酸的容器，所述核酸包含編碼RNA干涉序列的核酸序列；和b)裝有引發針對病毒的免疫應答的疫苗的容器，所述疫苗包含病毒抗原、病毒抗原表位或編碼其的核酸序列。16.前述權利要求之任一所述的藥品，其可進一步包括阻斷病毒侵染細胞的融合蛋白的容器，所述融合蛋白包含HR1和至少兩個HR2。17.前述權利要求之任一所述的藥品，其可進一步包括標簽。18.—種抑制病毒復制的核酸，其包含編碼RNA干涉序列的單鏈正義核酸序列及其反義序列，所述正義核酸序列及其反義序列通過接頭核酸相連。19.前述權利要求之任一所述的核酸，其中編碼RNA干涉序列的核酸序列是衍生自乙型肝炎病毒的X抗原、S抗原、核心蛋白C或聚合酶P的RNA干涉序列的核酸序列，或是衍生自人免疫缺陷病毒的tat基因的RNA干涉序列的核酸序列，優選編碼RNA干涉序列的核酸序列如SeqIDNo:62-67、68和71之任一所示。20.前述權利要求之任一所述的核酸，其序列如SeqIDNo:20-21、22和23之任一所示。21.—種引發針對病毒的免疫應答的疫苗，其包含病毒抗原、病毒抗原表位或編碼其的核酸序列，并包含非特異性免疫刺激蛋白或編碼其的核酸序列。22.前述權利要求之任一所述的疫苗，其是DNA疫苗，或是重組病毒疫苗，優選是重組痘苗病毒疫苗。23.前述權利要求之任一所述的疫苗，其中病毒抗原或病毒抗原表位選自乙型肝炎病毒的核心抗原、膜抗原、T細胞表位，或選自人免疫缺陷病毒的結構抗原，優選選自如SeqlDNo:4-6、72-76、58、69、70、59-61所示的序列或其編碼序列。24.前述權利要求之任一所述的疫苗，其中非特異性免疫刺激蛋白選自IFN(干擾素)、gp96(熱休克蛋白)、MHC-1類分子、卩2-微球蛋白。25.前述權利要求之任一所述的疫苗，其為編碼包含病毒抗原表位、和MHC-1類分子、p2-微球蛋白的單鏈三聚體融合蛋白的DNA疫苗。26.—種阻斷HIV侵染細胞的融合肽，其包含HR1和至少兩個HR2。27.前述權利要求之任一所述的融合蛋白，其中HR1的氨基酸序列為SGIVQQQNNLLRA正AQQHLLQLTVWGIKQLQAR;和/或，HR2的氨基酸序列為WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL。28.前述權利要求之任一所述的融合蛋白，其序列如扭12丄1-HR1-L2-HR2所示，其中Ll和L2分別獨立地為接頭肽。29.編碼前述權利要求之任一所述的融合蛋白的核酸。30.—種載體，其包含前述權利要求之任一所述的核酸。31.—種細胞，其包含前述權利要求之任一所述的載體，或轉染或轉化有前述權利要求之任一所述的核酸。32.權利要求31中所述的細胞，當它用于HIV-I的治療時，可以是以能夠產生以前述融合蛋白為活性的干細胞或體內共生菌如乳酸桿菌以及產單核細胞李斯特菌。33.治療病毒感染的方法，其包括給藥前述權利要求之任一所述的核酸、疫苗、融合蛋白或載體。34.權利要求33所述的方法，其中病毒是肝炎病毒或免疫缺陷病毒，優選是HBV或HIV-1。35.前述權利要求之任一所述的核酸、疫苗、融合蛋白或載體在制備治療病毒感染的藥物中的應用。36.權利要求35所述的應用，其中病毒是肝炎病毒或免疫缺陷病毒，優選是HBV或HIV-1。全文摘要本發明涉及治療病毒感染的方法及其中所用的藥物。更特別地，本發明涉及治療肝炎病毒或免疫缺陷病毒感染的方法以及其中所用的核酸、疫苗、融合蛋白、載體或細胞。文檔編號A61K39/29GK101314047SQ20071009998公開日2008年12月3日申請日期2007年6月1日優先權日2007年6月1日發明者劉長梅,張玉霞,波田,福高申請人:中國科學院微生物研究所