專利名稱：一種從中藥鉤藤提取液中分離鉤藤總生物堿的方法
技術領域：
本發明涉及一種中藥有效成分的提取分離，特別是涉及一種從中藥鉤藤提取液中提取分 離鉤藤總生物堿的方法，屬中藥領域。
背景技術：
生物堿是自然界中廣泛存在的一大類堿性含氮化合物，是許多中草藥的有效成分，是自 然界中存在的一類重要物質。鉤藤，收載于中國藥典2005年版一部180頁，系茜草科植物鉤 藤Uncaria rhynchophylla (Miq. ) Jack、大葉鉤藤Uncaria macrophylla Wall.、毛鉤藤 Uncaria hirsute Havil.、華鉤藤Uncaria sinensis (Oliv. ) Havil.或無柄果鉤藤Uncaria sessilifructus Roxb.的干燥帶鉤莖枝，又名大鉤丁、雙鉤藤等，是一種常用民間中草藥， 具有清熱平肝、息風定驚等功效。研究表明，鉤藤總堿是其主要有效部位，包括鉤藤堿 (rhynch叩hylline)、異鉤藤堿(Isorhynchophylline)等，臨床制劑已用于頭痛眩暈、感 冒夾驚、驚痢抽搐、妊娠子癇、高血壓等癥的治療。因此，鉤藤總生物堿有效部位制劑臨床 需求量很大。
現階段，中藥生物堿的提取工藝已較成熟，根據生物堿的理化特性，采用適宜的溶劑如 水、酸水、酸醇及堿醇等，利用浸漬、滲漉、煎煮、回流、超聲、酶解等技術將生物堿類成 分提取出來，提取率能達到90%以上。但由于生物堿在中藥中的相對含量較低(多數含量為 0. 01%-1%)，提取時勢必引入大量的其他藥物成分和雜質類成分，要保證最后制劑的安全有效， 必須對其進行精制純化，制備成有效部位甚至有效成分來應用，因此生物堿有效部位的精制 純化技術就顯得十分重要。但由于其他多種成分的并存以及淀粉、樹膠、果膠、粘液質、色 素等雜質的干擾，生物堿有效部位的精制技術一直是中藥現代化的"瓶頸"，嚴重影響了現代 中藥制劑對三效(高效、速效、長效)、三小(劑量小、毒性小、副作用小)、五方便(生產、 運輸、攜帶、貯存、應用方便)的要求。
雖然在教科書及各種文獻中多有提取分離中藥總生物堿的方法，但這些方法僅停留于實 驗室的研究水平，多數是將含有生物堿的溶液過柱后，以氨液或Na0H溶液洗脫，收集洗脫液 后再以有機溶劑萃取生物堿；或者將上過樣品的樹脂以堿液浸泡，然后再用有機溶劑回流提 取生物堿。但這些方法具有步驟繁瑣，有機溶劑用量大、大設備無法實現和生物堿轉移率低 等缺點，因而一直處于實驗室研究水平，不能在大生產中應用。梁勇、溫碧珍在2000年第1 期的《中國熱帶醫學》發表了《鉤藤中總生物堿的提取分離研究》，文中提出了一種最新的從 中藥鉤藤中提取分離總生物堿的技術是用離子交換樹脂法，基本過程為將從鉤藤飲片中提取得到的粗總生物堿溶液，通過陽離子交換樹脂柱吸附后，用氨性乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇，得鉤藤總生物堿。這種方法避免了大量有機溶劑的使用，可以提高生物堿的純度，具有一定的進步性，但仍存在嚴重缺陷試驗中以生物堿水液直接上樣，鉤藤生物堿電離不完全，過柱吸附效果差；采用氨性乙醇溶液作為洗脫劑，洗脫效果不高，導致總生物堿的轉移率低；堿性條件下游離的鉤藤總生物堿需要在乙醇溶液中才有較好的溶解度，但乙醇溶液的使用，會在洗脫液中帶入樹脂單體成分如苯乙烯、二乙烯苯等的殘留，影響制劑安全；同時由于工藝中使用乙醇，還要求樹脂前處理必須增加乙醇處理步驟，后期還要回收乙醇，增加了工藝步驟，提高了生產成本。故為了適應市場及生產，需要一種安全、低成本、收率高的提取分離方法。
發明內容
本發明的目的是提供一種安全、低成本、高效率的提取分離鉤藤總生物堿的方法。該發明目的是通過如下工藝實現的取鉤藤提取液，調整pH值l至7，濾過，取濾液加
于陽離子交換樹脂柱上，先以水洗脫除雜，再用0.5% 15%酸液洗脫，收集洗脫液，加堿中和，經脫鹽處理，濃縮干燥得鉤藤總生物堿。
在上述工藝過程中，將含有總生物堿的提取液調至合適的酸度后，生物堿電離成為陽離子，非堿性物質不被電離，提取液過陽離子交換樹脂柱后，電離的生物堿有機離子與樹脂柱上的氫離子交換而被牢固地吸附于樹脂柱上。這里提取液的pH值不宜過高或過低，如果過高，提取液呈中性或堿性，生物堿不能電離，也就不能完成樹脂上的交換過程；如果過低，提取液中的氫離子濃度太高，阻礙了樹脂柱上的氫離子解離，同樣不能很好地完成樹脂交換過程，因而實驗中發現調整提取液的pH值為1至7是比較合適的。以水洗脫時，使用的是去離子水，以確保不引入新的離子干擾，洗脫時那些沒有被樹脂吸附的非堿性物質就很容易被水洗脫下來，從而與被吸附在樹脂柱上生物堿有機離子分離了。此后再加較高濃度的酸液進行洗脫，由于此時酸液中的氫離子濃度很高，就會競爭性地與樹脂相結合，從而將吸附在樹脂柱上的生物堿有機離子交換下來，溶解在酸洗脫液中，流出樹脂柱，完成生物堿的富集過程。之后，在洗脫液中加入堿中和掉多余的酸，再經常規脫鹽處理，即可得到純度較高的鉤藤總生物堿了。
該工藝過程與現有技術相比，工藝流程簡單，不使用有機溶劑、無樹脂單體成分殘留、生物堿轉移率高；其重要的貢獻還在于，打破了傳統理論認為的離子交換能力順序規律，艮P:Ca2+>K+^NH4+〉Na+〉H+。正是在這一傳統理論的影響下，所有關于鉤藤總生物堿的離子交換樹脂分離法中都是堿液或氨液進行洗脫，或者先用堿液中和樹脂柱再用有機溶劑回流提取理 論上已經游離的生物堿，而實際應用中的效果非常不理想且不適于大生產。在本發明的技術 方案中，雖然氫離子的交換能力是最弱的，但通過提高酸洗脫液中氫離子的濃度，從而抵消 了其交換能力弱的缺點，同時在酸性條件下，可以使交換下來的生物堿迅速溶解到酸液中， 并被沖出柱子，由此保證了生物堿的洗脫效果。并且，以酸液進行洗脫，在洗脫的同時，也 使陽離子交換樹脂柱得以再生，從而可以循環使用，減少了堿液洗脫后再生樹脂柱的過程， 降低了成本。本發明的技術完全突破了現有技術中以堿液洗脫的傳統觀念和工藝過程，取得 了意想不到的效果，極大的提高了鉤藤總生物堿的得率，使陽離子交換樹脂在工業生產中用 于精制分離鉤藤總生物堿成為可能。
基于上述工藝過程，發明人又進行了進一步的研究，細化各步驟的參數，篩選出最優方 案，具體內容如下
1、 上柱前調整藥液的pH值范圍優選為2至5，效果更加明顯。
2、 所用的陽離子交換樹脂可以是大孔型或凝膠型強酸型離子交換樹脂，在實際使用時可
以根據情況處理成氫型、鈉型或銨型中的任一種。
3、 所用陽離子交換樹脂柱的柱徑與柱高之比并無一定之規，但考慮生產實際，柱徑柱 高=1: 5 1: IO時可以取得最好的效果。
4、 給樹脂柱上樣的藥液濃度為每ml相當于生藥0. 1 3g，具體情況可以根據藥液的前 處理方式決定，如果是采用浸漬、滲漉等方式，得到的藥液就會比較稀；而如果是回流提取、 煎煮等方式，尤其是經過濃縮處理，藥液的濃度就會比較大，但只要是在這個范圍內，都能 實現上樣。同時，上樣速度也根據藥液的濃度進行適時調整，基本滿足在0. 5 5倍柱體積/ 小時即可。
5、 上樣方式一般選擇為從柱上端上樣，藥液靠自流力而流過整個柱子；發明人發現，如 果逆流上樣，即將藥液從柱子底端上樣，通過一定的壓力，使藥液注滿整個柱子，這種上樣 方式可以發揮柱子的最大交換效率，也避免了從上端上樣時由于生物堿交換不完全而發生的 提前穿透問題。這一點也是發明人創造性的發現。
6、 洗脫所用的酸液優選為鹽酸溶液或硫酸溶液，其濃度均優選為3% 6%。
7、 洗脫時洗脫液的流速不宜過快或過慢，如果過快，則氫離子與生物堿有機離子的交換 不充分，酸液浪費較多；如果過慢，則解離下來的生物堿有機離子可能又重新吸附回樹脂柱 上，影響洗脫效率。實驗發現，洗脫速度保持在2 6倍柱體積/小時為宜。進一步優選，洗 脫速度保持在4 6倍柱體積/小時最好。
8、 發明人還發現，如果想更高地提高洗脫效率，可以在水洗脫除雜后，不立即進行酸液洗脫，而是先在樹脂柱中充滿酸液并靜置2小時以上， 一般不需超過12個小時，再進行洗脫。
經過靜置后，大量的生物堿有機離子已被氫離子交換下來，或者處于半吸附半解離的狀態，此時進行洗脫，生物堿富集效果明顯，洗脫效率明顯提高。
9、 為了進一步提高洗脫效率，還可以在洗脫用的酸液中加入少量NH4C1、 NaCl或CaCl2，加入量不宜過少或過多，如果過少，則起不到作用；如果過多，則因鹽濃度過高易鹽析而影響生物堿有機離子的溶解度。實驗發現，洗脫液中以腿4+、 Na+或C^+濃度為().1 lmol/L時為佳，進一步優選，NH4+、 Na+或Ca2+的濃度為0. 1 0.3mol/L時最好。
10、 工藝中所說的脫鹽方法可以是透析法除鹽、膜濾過除鹽以及其他各種藥物生物領域常規的除鹽方法，目前這些方法都已經比較成熟，并可以管道化生產。
11、 該方法中所說的鉤藤提取液可以通過浸漬、滲漉、超聲、微波或煎煮中的任一種方式提取制得，并且提取的溶媒可以是水、酸水、乙醇溶液、酸性乙醇溶液中的任一種，但都屬于目前中藥領域的常規提取方法。區別點在于，如果是用浸漬或滲漉方法制得，可以直接上樣；如果是用其他方法提取得到的，還要經過醇沉、過濾或離心除雜等步驟，以保證上樣的順利。
需要說明的是，上述優選的技術參數，可以根據實際情況的需要，與基本工藝進行任意組合，且均能取得良好的效果，解決技術問題，達到本發明的目的。下面通過對比實驗來說明本發明的優點。一、實驗方案-
取鉤藤飲片1500g，加pH-4的酸水煎煮2次，每次10倍量，煎煮2小時，合并煎煮液，離心，濾液稀釋至3000ml并調節pH-3，均分成三份，分別按以下步驟處理-
① 根據現有技術，取上述提取液1000ml，上陽離子交換樹脂(001X7，氫型，徑高比l:5)，以去離子水洗至注出液無色，再用氨性乙醇洗脫，洗脫速度為5倍柱體積/小時，至生物堿檢査為陰性，收集這部分洗脫液，回收乙醇，得鉤藤總生物堿。
② 根據本發明的技術，取上述提取液1000ml，上陽離子交換樹脂(001X7，氫型，徑高比h 5)，以去離子水洗至注出液無色，再用3%鹽酸溶液洗脫，洗脫速度為5倍柱體積/小時，至生物堿檢查為陰性，收集酸洗脫液，用氫氧化鈉中和至中性，除鹽，濾液濃縮干燥得鉤藤總生物堿。
③ 根據本發明的技術，取上述提取液1000ml，上陽離子交換樹脂(001X7，氫型，徑高比l: 8),逆流上樣，以去離子水洗至注出液無色，加0.1mol/L的NaCl的3X鹽酸溶液至全柱，靜置2個小時，再用上述溶液以5倍柱體積/小時的速度洗脫，至生物堿檢查為陰性，收集這部分洗脫液，用氫氧化鈉中和至中性，除鹽，濾液濃縮干燥得鉤藤總生物堿。
二、 結果計算分別稱量三種工藝所得鉤藤總生物堿的重量，并與藥材量相除，得總生物堿的收率；以酸堿滴定法對三種方法所得總生物堿進行含量測定，計算總生物堿的純度。
三、 結果對比，見下表
三種工藝的效果評價表
工藝1工藝2工藝3
收率0. 5%1.0%1.2%
純度63%86%85%
成本步驟多，使用乙醇作為洗 脫劑，成本高不用有機溶劑，成本低不用有機溶劑，且酸洗脫 液的用量減少，成本更低
時間周期長，至少需8小時周期短，僅需要5小時周期短，僅需要4.5小時
安全性用氣相色譜測得提取物 中含有苯乙烯、二乙烯苯無樹脂單體殘留物無樹脂單體殘留物
復雜程度需用乙醇預處理樹脂柱， 洗脫后還要再生樹脂柱； 洗脫時間長；洗脫效率較 低；洗脫產物需回收乙醇過程簡單，只需正常預處 理樹脂柱，在酸洗脫的同 時也再生了樹脂柱過程簡單，只需正常預處 理樹脂柱，在酸洗脫的同 時也再生了樹脂柱
由以上對比結果可見，本發明的技術方案可以解決現有技術中的不足，并顯著地提高產品的質量、降低成本、提高安全性和生產可行性，本發明達到了發明目的。
具體實施方式
實施例h
取鉤藤飲片1000g，加水煎煮2次，每次10倍量，煎煮2小時，合并煎煮液，離心，調節pH二3，離心，上清液以4倍柱體積/小時通過陽離子交換樹脂(001X7，氫型，徑高比l:8),水洗至流出液無顏色，再用15%鹽酸溶液洗脫，洗脫速度為2倍柱體積/小時，至生物堿檢查為陰性(流出液滴加10%硅鎢酸無沉淀)，收集這部分洗脫液，用氫氧化鈉中和至中性，除鹽，濾液濃縮干燥得鉤藤總生物堿。實施例2:
取鉤藤飲片1000g，加p^5的酸水滲漉，合并滲漉液加水稀釋至10000ml，離心，調節pH=l，離心，上清液以5倍柱體積/小時通過陽離子交換樹脂(Doulex 50，鈉型，徑高比1:5)，水洗至流出液無顏色，再用5%鹽酸溶液洗脫，洗脫速度為4倍柱體積/小時，洗脫2倍柱體積后浸泡5小時，再洗脫至生物堿檢査為陰性(流出液滴加10%硅鎢酸無沉淀)，收集這部分洗脫液，用氫氧化鈣中和至中性，除鹽，濾液濃縮干燥得鉤藤總生物堿。實施例3:
取鉤藤飲片5kg，加70%乙醇超聲提取兩次，每次加5倍量，超聲0. 5小時，合并提取液， 離心，回收乙醇，加水至5000ml，調節pH4，離心，上清液以2倍柱體積/小時通過上陽離 子交換樹脂(001X10，鈉型，徑高比1: 7)，水洗至流出液無顏色，再用1%鹽酸溶液(含 1%的氯化鈉)洗脫，洗脫速度為5倍柱體積/小時，至生物堿檢查為陰性(流出液滴加10%硅 鎢酸無沉淀)，收集這部分洗脫液，用氫氧化鈉中和至中性，除鹽，濾液濃縮干燥得鉤藤總生 物堿。 實施例4:
取鉤藤飲片10kg，加水煎煮2次，每次10倍量，煎煮2小時，合并煎煮液，濾過，濾 液濃縮至相對密度為1. 1(60。C)，加乙醇至濃度為7(W，靜置，上清液回收乙醇，加水至3000ml， 調節pH=4，離心，上清液以3倍柱體積/小時通過上陽離子交換樹脂(AmberliteIR-120，氨 型，徑高比l: 9)，水洗至流出液無顏色，再用10%鹽酸溶液洗脫，洗脫速度為6倍柱體積/ 小時，至生物堿檢査為陰性(流出液滴加10%硅鎢酸無沉淀)，收集這部分洗脫液，用氫氧化 鈉中和至中性，除鹽，濾液濃縮干燥得鉤藤總生物堿。 實施例5:
取鉤藤飲片10kg，加水煎煮2次，每次10倍量，煎煮2小時，合并煎煮液，濾過，濾 液濃縮至相對密度為1. 1(60°0，加乙醇至濃度為70%，靜置，上清液回收乙醇，加水至5000ml， 調節pH-5，離心，上清液以3倍柱體積/小時通過上陽離子交換樹脂(D001X4，氫型，徑高 比l: 10)，水洗至流出液無顏色，再用3%鹽酸溶液洗脫，洗脫速度為3倍柱體積/小時，至 生物堿檢查為陰性(流出液滴加10%硅鉤酸無沉淀)，收集酸洗脫液，用氫氧化鈉中和至中性， 除鹽，濾液濃縮干燥得鉤藤總生物堿。 實施例6:
取鉤藤飲片2000g，加pH3的鹽酸溶液，微波提取2次，每次加5倍體積微波提取0. 5 小時，濾過，濾液加水稀釋至1600ml，調節pH:6，離心，上清液以2倍柱體積/小時通過上 陽離子交換樹脂(Doulex50，氫型，徑高比l: 6)，水洗至流出液無顏色，再用2%鹽酸溶液 (含0.2mol/L的氯化氨)洗脫，洗脫速度為5倍柱體積/小時，至生物堿檢査為陰性(流出 液滴加10%硅鎢酸無沉淀)，收集這部分洗脫液，用氫氧化鈉中和至中性，除鹽，濾液濃縮干 燥得鉤藤總生物堿。實施例7:
取鉤藤飲片10kg，加水煎煮2次，每次10倍量，煎煮2小時，合并煎煮液，濾過，濾液濃縮至相對密度為1.1(60。C)，加乙醇至濃度為70%,靜置，上清液回收乙醇,加水至4000ml，調節pH4，離心，上清液以0.5倍柱體積/小時通過上陽離子交換樹脂(AmberliteIR-120，氫型，徑高比1: 6)，水洗至流出液無顏色，再用0. 5%硫酸溶液(含lmol/L的氯化鈉)洗脫，洗脫速度為5倍柱體積/小時，至生物堿檢査為陰性(流出液滴加10%硅鎢酸無沉淀)，收集這部分洗脫液，用氫氧化鈉中和至中性，除鹽，濾液濃縮千燥得鉤藤總生物堿。實施例8:
取鉤藤飲片10kg，加水煎煮2次，每次10倍量，煎煮2小時，合并煎煮液，濾過，濾液濃縮至相對密度為1.1 (6(TC)，加乙醇至濃度為70%，靜置，上清液回收乙醇，加水至10000ml,調節p&3，離心，上清液以3倍柱體積/小時通過上陽離子交換樹脂(001X5，氫型，徑高比l: 8)，水洗至流出液無顏色，再用2%鹽酸溶液(含0.3mol/L的氯化鈣)洗脫，洗脫速度為6倍柱體積/小時，至生物堿檢查為陰性(流出液滴加10%硅鉤酸無沉淀)，收集這部分洗脫液，用氫氧化鈉中和至中性，除鹽，濾液濃縮千燥得鉤藤總生物堿。實施例9:
取鉤藤飲片1000g，加水煎煮2次，每次10倍量，煎煮2小時，合并煎煮液，濾過，濾液濃縮至相對密度為1. 1(6(TC)，加乙醇至濃度為70%，靜置，上清液回收乙醇，加水至1000ml,調節pH:3，離心，上清液以3倍柱體積/小時通過上陽離子交換樹脂(Doulex 50，氫型，徑高比l: 8)，水洗至流出液無顏色，再用4%硫酸溶液洗脫，洗脫速度為4倍柱體積/小時，至生物堿檢查為陰性(流出液滴加10%硅鎢酸無沉淀)，收集酸洗脫液，用氫氧化鈉中和至中性，除鹽，濾液濃縮干燥得鉤藤總生物堿。
權利要求
1、一種從中藥鉤藤提取液中分離鉤藤總生物堿的方法，其特征在于該方法為取鉤藤提取液，調整pH值1至7，濾過，取濾液加于陽離子交換樹脂柱上，先以水洗脫除雜，再用0.5％～15％酸液洗脫，收集洗脫液，加堿中和，經脫鹽處理，濃縮干燥得鉤藤總生物堿。
2、 如權利要求1所述的分離鉤藤總生物堿的方法，其特征在于上柱前調整藥液的pH值 范圍為2至5。
3、 如權利要求1所述的分離鉤藤總生物堿的方法，其特征在于所用陽離子交換樹脂可以 是大孔型或凝膠型強酸性離子交換樹脂。
4、 如權利要求3所述的分離鉤藤總生物堿的方法，其特征在于所用陽離子交換樹脂柱的柱徑柱高=1: 5 1: 10。
5、 如權利要求1所述的分離鉤藤總生物堿的方法，其特征在于該方法中上樣藥液的濃度為每ml相當于生藥0. 1 3g，上樣速度為0. 5 5倍柱體積/小時。
6、 如權利要求5所述的分離鉤藤總生物堿的方法，其特征在于上樣方式優選為逆流上樣。
7、 如權利要求1所述的分離鉤藤總生物堿的方法，其特征在于該方法中洗脫用的酸液是 3% 6%的鹽酸溶液或3% 6%的硫酸溶液。
8、 如權利要求7所述的分離鉤藤總生物堿的方法，其特征在于洗脫速度為2 6倍柱體 積/小時。
9、 如權利要求8所述的分離鉤藤總生物堿的方法，其特征在于洗脫速度為4 6倍柱體 積/小時。
10、 如權利要求1所述的分離鉤藤總生物堿的方法，其特征在于在水洗脫除雜后，可以 先在樹脂柱中充滿洗脫用酸液并靜置2 12個小時，再進行洗脫。
11、 如權利要求7所述的分離鉤藤總生物堿的方法，其特征在于洗脫用的酸液中還可以 加入0. 1 lmol/L的NHX1、 NaCl或CaCl2。
12、 如權利要求11所述的分離鉤藤總生物堿的方法，其特征在于酸液中鹽的濃度優選為 0. 1 0. 3mol/L。
13、 權利要求1 12中任何一項所述的方法制備的鉤藤總生物堿。
全文摘要
本發明公開了一種分離中藥總生物堿的方法，尤其是一種從中藥鉤藤提取液中分離總生物堿的方法，屬中藥領域。該方法包括如下技術方案取鉤藤提取液，調整pH值1至7，濾過，取濾液加于陽離子交換樹脂柱上，先以水洗脫除雜，再用0.5％～15％酸液洗脫，檢查無生物堿為止，收集洗脫液，加堿中和，經脫鹽處理，濃縮干燥得鉤藤總生物堿。該方法克服了現有技術提取率低、有機溶劑用量大、工藝復雜、無法大生產等不足，可以高效率地從鉤藤提取液中分離高純度的鉤藤總生物堿。
文檔編號A61K36/74GK101491610SQ20071009844
公開日2009年7月29日 申請日期2007年4月18日 優先權日2007年4月18日
發明者劉英輝, 蓉 李, 王廣錄 申請人:北京和潤創新醫藥科技發展有限公司