專利名稱：青蒿素及其衍生物與抗菌藥物的聯合應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及藥物應用領域，尤其涉及青蒿素及其衍生物的抗菌應用。
背景技術：
感染性疾病是由于病原微生物侵入體內，在體內大量地繁殖所引起的疾病，是臨床病人死亡的重要原因之一。造成患者死亡的原因其一是細菌大量繁殖釋放毒素導致組織器官的損傷；其二是細菌成分通過激活免疫細胞，誘導TNF-α、IL-1、IL-6、NO等致炎細胞因子釋放，引起多種炎癥介質所形成的瀑布效應，可使炎癥反應擴大甚至失去控制，最終導致以細胞自身性破壞為特征的全身性炎癥即膿毒癥的發生。細菌感染曾是人類第一死因，抗生素的發明帶給了人類希望之光。但抗生素的普遍使用使越來越多的細菌產生了耐藥性，如果不解決抗生素濫用的問題，等待人類的將是下一次黑暗。
青蒿提取物用來治療瘧疾相關的發熱已經有一千多年的歷史，除傳統的抗瘧作用外，青蒿類物質還具有其它方面的作用，如平喘、抗癌、抗血吸蟲及對免疫系統的調節等。國內外有關青蒿素及其衍生物的研究很多，但研究范圍主要集中在抗瘧、抗癌、抗血吸蟲的作用及其機制上。
青蒿琥酯(Artesunate)，化學名為二氫青蒿素-1，2-α-琥珀酸單酯，分子式為C19O8 H28，分子量384，是具有倍半萜結構的抗瘧藥青蒿素的衍生物。青蒿琥酯是新型的抗瘧藥，較之青蒿素，青蒿琥酯可配制成任何常規的制劑形式，包括固體和液體形式，給藥非常方便。青蒿琥酯作為抗瘧藥，不但效價高，而且不易產生耐受性。
對青蒿素及其衍生物的抗炎作用已有報道，研究發現青蒿素可抑制LPS/TNF-α誘導性NO合酶的合成及NF-κB的激活；青蒿琥酯對LPS及合并干擾素刺激小鼠腹腔巨噬細胞NO的合成有明顯的抑制作用；青蒿琥酯對LPS刺激的小鼠巨噬細胞RAW264.7也具有相似的保護作用；譚余慶等還發現青蒿提取物、青蒿素可降低內毒素休克小鼠LPO、ACP、內毒素、TNF-α、P450濃度，升高SOD活性，降低小鼠死亡率，延長小鼠的平均生存時間，對小鼠肝、肺組織形態也有一定的保護作用；王俊等發現青蒿素能抑制CpGODN、LPS、熱滅活的EC誘導細胞釋放炎癥因子，并對膿毒癥模型小鼠具有顯著保護作用。但是青蒿琥酯是否具有抗菌作用，是否能改善細菌對抗生素的耐藥，增強抗生素的抗菌效力和對細菌導致的感染是否有效，未見報告。我國是青蒿素和其衍生物的主要生產地，由于該藥物療效高、毒性低，WHO已經將青蒿素列為世界治療瘧疾的主要藥物，我國正在擴大青蒿種植和青蒿素生產，因此擴寬青蒿素類衍生物的適應癥，將其應用于細菌感染疾病的防治，無疑對提高青蒿素類衍生物的利用、增加其經濟價值并改善抗生素濫用所導致的耐藥現象具有重要意義。
發明內容
本發明的目的在于將青蒿素及其衍生物，特別是青蒿琥酯應用到抗菌領域，不僅拓寬青蒿素及其衍生物，特別是青蒿琥酯的用途，而且可以減輕現有抗菌藥物的濫用及其導致的耐藥現象。
基于上述目的，本發明使用的技術方案是將青蒿素及其衍生物中的一種與抗菌藥物中的一種進行聯合應用，該應用不是做為疾病的治療方法的應用，而是在配備治療疾病(抗菌)的藥物中的應用，其中上述兩種成分的比例為1∶1～4096∶1，上兩種成分可以制備成組合物，也可以是兩種單獨的藥劑。上述兩種成分能夠產生協同抗菌效力，能夠降低抗菌藥物的最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)。
上述菌包括革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌；上述衍生物包括二氫青蒿素、蒿甲醚、蒿乙醚和青蒿琥酯；上述抗菌藥物包括β-內酰胺類抗生素(青霉素類、頭孢菌素類、非典型β-內酰胺類抗生素)、氨基糖苷類、克林霉素類、喹諾酮類的藥物，在一較佳實施例中，上述抗菌藥物為青霉素G、氨芐西林、頭孢呋辛、頭孢匹胺、慶大霉素、克林霉素、洛美沙星、加替沙星、舒氨西林和泰能，優選為慶大霉素、舒氨西林、頭孢匹胺和加替沙星。
上述應用優選為青蒿琥酯與抗菌藥物的聯合應用。
青蒿琥酯單獨使用可抑制革蘭陰性菌和革蘭陽性菌的生長，與抗菌藥物聯合應用后可明顯增強抗菌藥物的抗菌效力，減少抗菌藥物的使用劑量；實驗表明青蒿素及青蒿琥酯與抗菌藥物聯合應用可明顯降低細菌(包括革蘭陰性、陽性菌)攻擊小鼠死亡率，顯著抑制小鼠血清LPS含量和細胞因子TNF-α釋放。
本發現人對青蒿琥酯體內外的抗菌和抗炎作用進行了研究。
首先，本研究人員對本青蒿琥酯的體外抗菌作用進行了藥理學分析，并與抗生素聯合應用后發現青蒿琥酯單獨使用可抑制革蘭陰性菌和革蘭陽性菌的生長，與抗生素聯合應用后可明顯增強抗生素的抗菌效力，減少抗生素的使用劑量；其次，青蒿琥酯與抗生素聯合應用和可明顯降低細菌(包括革蘭陰性、陽性菌)攻擊小鼠死亡率，顯著抑制小鼠血清LPS含量和細胞因子TNF-α釋放。
因此本發明拓寬了青蒿素及其衍生物，特別是青蒿琥酯的用途，提高了抗菌藥物的抗菌效力，減輕了抗菌藥物濫用和導致的耐藥現象。
圖1表示青蒿琥酯協同慶大霉素、頭孢匹胺、舒氨西林對大腸埃希菌ATCC35218的聯合抑菌曲線；圖2表示青蒿琥酯協同氨芐西林、加替沙星、舒氨西林對金葡菌ATCC25923的聯合抑菌曲線；圖3表示青蒿琥酯協同慶大霉素、加替沙星、舒氨西林對大腸埃希菌臨床分離株的聯合抑菌曲線。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明作進一步的說明，但所述實施例僅用于說明本發明而不是限制本發明。
青蒿琥酯(AS)與抗菌藥物按照表1、表2中的配比，能夠產生協同抗菌效力，降低抗菌藥物的最低抑菌濃度和最低殺菌濃度。
實驗例1本實驗例在于研究青蒿琥酯與十種抗菌藥物對不同細菌的MIC(最低抑菌濃度)和MBC(最低殺菌濃度)采用微孔稀釋法，調整細菌濃度為105CFU/ml，接種于96孔無菌培養板內，青蒿琥酯和青霉素鈉、氨芐西林等10種抗菌藥物分別以生理鹽水稀釋為5.14mg/ml。加入各種藥物至含細菌培養孔內，依次倍比稀釋，第1～10孔藥物的最終濃度依次為256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5ug/ml。置37℃培養箱孵育24h和48h，讀取陽性和陰性對照孔，陰性對照孔清亮，陽性對照孔混濁。藥物對細菌的MIC為24h后抑制細菌肉眼可見生長的最低藥物濃度，藥物對細菌的MBC為48h后抑制細菌肉眼可見生長的最低藥物濃度。此次實驗結果表明青蒿琥酯單獨使用不能完全抑制細菌生長，并觀察了不同抗菌藥物對該五種細菌的抑菌效力。(見表3)。
表310種抗菌藥物和AS的單獨使用時對不同細菌的MIC及MBC
實驗例2本實驗例在于研究青蒿琥酯與抗菌藥物聯合應用后對大腸埃希菌MIC和MBC的影響。
采用棋盤式微孔稀釋法，調整細菌濃度為105CFU/ml，接種于96孔無菌培養板內，將對五種細菌中等敏感的抗菌藥物用低于MIC的劑量與不同濃度青蒿琥酯分別配伍，觀察配伍后的藥物對大腸埃希菌的MIC和MBC。此次實驗結果表明青蒿琥酯單獨使用雖不能完全抑制細菌生長，但與抗菌藥物聯合應用后可明顯降低抗菌藥物的MIC和MBC，說明青蒿琥酯與抗菌藥物協同后對細菌有協同的抑菌效力。(見表4)。
表4各抗菌藥物與青蒿琥酯協同后的最低抑菌濃度
實驗例3本實驗例在于研究青蒿琥酯與1/2MIC濃度的不同抗菌藥物協同后對大腸埃希菌生長的抑制強度。
調整細菌濃度為106CFU/ml，測定菌液OD600為0.002(1OD＝5×108CFU/ml)，參照實驗例1結果，分別單獨加入終濃度為256μg/ml青蒿琥酯或1/2MIC濃度的抗菌藥物，以及同時加入256μg/ml青蒿琥酯和1/2MIC濃度的抗菌藥物后，至于37℃恒溫搖床150rpm振搖，分別測定1、3、5、7、9、12、16、24h時菌液的OD值，計算各時間點的細菌量。研究結果表明青蒿琥酯256μg/ml可使大腸埃希菌ATCC35218，金黃色葡萄球菌ATCC25923和大腸埃希菌臨床分離株生長速度明顯減慢，與單獨使用抗菌藥物相比，聯合了青蒿琥酯后明顯抑制細菌生長，抑制程度比單獨使用抗菌藥物或青蒿琥酯均強(圖1、2、3)。
實驗例4本實驗例在于研究青蒿琥酯聯合應用抗菌藥物對革蘭陰性細菌攻擊小鼠的保護作用清潔級昆明種小白鼠70只(重慶醫科大學實驗動物中心提供)，體重19.9±0.5g/只，雌雄各半，隨機分為對照組、青蒿琥酯組、大腸埃希菌組，大腸埃希菌+慶大霉素組，青蒿琥酯(1.5、5、15mg/kg)+慶大霉素+大腸埃希菌組。每組10只動物。對照不給予任何試劑；青蒿素組肌肉注射15mg/kg的青蒿琥酯；大腸埃希菌組，給予0.8×106/kg活的大腸埃希菌ATCC35218；大腸埃希菌+慶大霉素組，給予慶大霉素0.5mg/kg肌肉注射后給予活大腸埃希菌ATCC35218；慶大霉素+青蒿琥酯+大腸埃希菌組，在給予青蒿琥酯后，立即給予慶大霉素及大腸埃希菌。給藥完畢后給予正常飲食和飲水，觀察7天內小鼠一般情況及死亡率(表5)。結果顯示青蒿琥酯協同抗菌藥物后可明顯降低小鼠的死亡率，表明對青蒿琥酯與抗菌藥物聯合后出現協同保護作用。
表5青蒿琥酯協同慶大霉素對大腸埃希菌ATCC35218攻擊小鼠的保護作用
實驗例5本實驗例在于研究青蒿琥酯聯合應用抗菌藥物對革蘭陽性細菌攻擊小鼠的保護作用清潔級昆明種小白鼠70只(重慶醫科大學實驗動物中心提供)，體重19.9±0.5g/只，雌雄各半，隨機分為對照組、青蒿琥酯組、金葡菌組，金葡菌+加替沙星組，青蒿琥酯(5、15、45mg/kg)+加替沙星+金葡菌組。每組10只動物。對照不給予任何試劑；青蒿素組肌肉注射45mg/kg的青蒿琥酯；金葡菌組，給予1.0×107/kg活的金葡菌ATCC25923；金葡菌+加替沙星組，給予加替沙星0.5mg/kg肌肉注射后給予活金葡菌ATCC25923；加替沙星+青蒿琥酯+金葡菌組，在給予青蒿琥酯后，立即給予加替沙星及金葡菌。給藥完畢后給予正常飲食和飲水，觀察7天內小鼠一般情況及死亡率(表6)。結果顯示青蒿琥酯協同抗菌藥物后可明顯降低小鼠的死亡率，表明對青蒿琥酯與抗菌藥物聯合后出現協同保護作用。
表6 青蒿琥酯協同加替沙星對金葡菌ATCC25923攻擊小鼠的保護作用
實驗例6本實驗例在于研究青蒿琥酯對滅活大腸埃希菌攻擊小鼠的保護作用。
清潔級昆明種小白鼠60只(重慶醫科大學實驗動物中心提供)，體重19.9±0.5g/只，雌雄各半，隨機分為對照組、青蒿琥酯組、滅活大腸埃希菌組，青蒿琥酯(5、15、45mg/ml)+滅活大腸埃希菌組。每組8只動物。對照不給予任何試劑；青蒿琥酯組肌肉注射給予45mg/kg的青蒿琥酯，4h，24h，48h后重復給藥一次；滅活大腸埃希菌組，給予1.25×1011/kg的滅活大腸埃希菌ATCC35218；青蒿琥酯+滅活大腸埃希菌組，在肌肉注射給予青蒿琥酯后，立即給予滅活大腸埃希菌ATCC35218，4h、24h、48h后重復肌肉注射給藥青蒿琥酯1次。給藥完畢后給予正常飲食和飲水，觀察7天內小鼠一般情況及死亡率(表7)。結果顯示青蒿琥酯可降低小鼠的死亡率，表明對致炎因子攻擊的小鼠具有保護作用。
表7青蒿琥酯對滅活大腸埃希菌攻擊小鼠的保護作用
*p＜0.5；**p＜0.01vsE.coli實驗例7本實驗例在于研究青蒿琥酯對滅活大腸埃希菌攻擊小鼠血清細胞因子釋放影響清潔級昆明種小白鼠40只(重慶醫科大學實驗動物中心提供)，體重19.9±0.5g/只，雌雄各半，隨機分為對照組、青蒿琥酯組、滅活大腸埃希菌組、青蒿琥酯(5、15、45mg/kg)+滅活大腸埃希菌組，每組動物3只。對照不給予任何試劑。青蒿琥酯組肌肉注射給予45mg/kg的青蒿琥酯；青蒿琥酯(5、15、45mg/kg)+滅活大腸埃希菌組給予青蒿琥酯后立即給予滅活大腸埃希菌ATCC35218；給藥完畢4h后摘眼球取血立即離心留置上清保存于-20℃，待測定細胞因子TNF-α(表8)。結果顯示青蒿琥酯可顯著降低滅活大腸埃希菌攻擊小鼠血清細胞因子釋放。
表8青蒿琥酯降低滅活大腸埃希菌ATCC35218攻擊小鼠血清細胞因子TNF-α釋放(n＝6，
)
*p＜0.5；**p＜0.01vsE.coli本發明將青蒿琥酯與抗菌藥物的聯合應用，提高了抗生素的抗菌效力，將青蒿琥酯與抗生素聯合應用還可以預防、治療細菌感染。
本領域技術人員可以根據本發明所述內容，將青蒿素及其衍生物與抗菌藥物的聯合同樣可以達到本發明所述效果。
權利要求
1.青蒿素及其衍生物中的一種與抗菌藥物中的一種的聯合應用，其能夠產生協同抗菌效力，降低抗菌藥物的最低抑菌濃度和最低殺菌濃度。
2.根據權利要求1所述的應用，其中青蒿素及其衍生物中的一種與抗菌藥物中的一種的質量比為1∶1～4096∶1。
3.根據權利要求1所述的應用，上述菌為革蘭陽性菌或革蘭陰性菌。
4.根據權利要求1所述的應用，上述衍生物為二氫青蒿素、蒿甲醚、蒿乙醚和青蒿琥酯。
5.根據權利要求4所述的應用，該應用為青蒿琥酯與一種抗菌藥物的聯合應用。
6.根據權利要求1所述的應用，上述抗菌藥物為β-內酰胺類抗生素、氨基糖苷類、克林霉素類和喹諾酮類抗菌藥物。
7.根據權利要求6所述的應用，上述抗β-內酰胺類抗生素包括青霉素類、頭孢菌素類和非典型β-內酰胺類抗生素。
全文摘要
本發明公開了一種現有的抗瘧藥青蒿素及其衍生物二氫青蒿素、蒿甲醚、蒿乙醚、青蒿琥酯新的用途，即，與抗菌藥物聯合應用抑制細菌生長，增強抗菌藥物抗菌效力。尤其是使得青蒿琥酯除作為治療瘧疾藥物外，能夠在預防及治療細菌感染性疾病中得到應用。
文檔編號A61P31/00GK101020056SQ20071007825
公開日2007年8月22日 申請日期2007年3月2日 優先權日2007年3月2日
發明者周紅, 李斌, 鄭江 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學