專利名稱：近江牡蠣類立克次體內類外膜蛋白的全序列及其亞單位疫苗的制備的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，涉及近江牡蠣類立克次體中一種類外膜蛋白(即類ompH外膜 蛋白)的全序列及其亞單位疫苗的實驗制備技術，本發明的類o卿H外膜蛋白可以用于制備類 外膜蛋白亞單位疫苗。
背景技術：
牡蠣為重要的經濟貝類和海水養殖品種。根據聯合國糧農組織(FA0)的數字顯示，我國 每年牡蠣的產量具全世界首位，達到300萬噸(濕重)，占我國海洋水產養殖總產量(約1000 萬噸)的約三分之一。但是海洋環境的污染、惡化和海洋病害的頻發危及到牡蠣產業的可持 續發展。近江牡蠣體內寄生的類立克次體是引起近江牡蠣大規模死亡的重要病原微生物，目 前還沒有有效的治療措施。類立克次體外膜蛋白具有抗原活性，是抗體的主要作用對象。但 由于現有技術中未能獲得ompH外膜蛋的全序列，沒有表達載體，故難以制備出這種類立克次 體中具有抗原性的類o卿H外膜蛋白亞單位疫苗。發明內容本發明目的是利用基因工程技術制備近江牡蠣類立克次體中具有抗原性的類ompH外膜 蛋白亞單位疫苗。以防治近江牡蠣體內寄生的類立克次體，預防近江牡蠣大規模死亡。為實現上述目的，首先將近江牡蠣類立克次體的類ompH外膜蛋白的基因片段插入克隆和 表達載體，然后轉化相應的宿主細胞中，進行體外原核表達，重組蛋白純化，以純化的重組 蛋白制備疫苗。本發明關于近江牡蠣類立克次體內類外膜蛋白亞單位疫苗的制備方法，包括以下步驟-1、 以近江牡蠣類立克次體特有的基因組DNA為模板，本申請首次設計擴增類ompH外膜 蛋白基因的引物，并首次獲得編碼類ompH外膜蛋白的基因全序列；2、 利用生物技術手段將類orapH外膜蛋白的基因片段克隆到合適的pGEM-Teasy載體 中，轉入相應的大腸桿菌TG I宿主細胞中，獲得表達載體pET-28a(+)-ompH;3、 類ompH外膜蛋白的體外表達，Western-blot, SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳等方法鑒定目 的蛋白；4、利用親和柱分離純化重組表達的蛋白制成亞單位疫苗。 本發明的顯著優點制備得到的這種類外膜蛋白亞單位疫苗具有特異性強、免疫原性好、高度安全性等特點。
具體實施方式
1. 引物設計與合成設計用于擴增類ompH外膜蛋白基因的寡聚核苷酸引物為 SEQNOlPF: 5" GTGAAAAAGTGGTTATTAGCTG 3， PR: 5， TTATTTAACCTGTTTCAGTACG 3，(此引物為本申請首次設計)2. PCR擴增與表達載體的構建以近江牡蠣類立克次體基因組DNA為模板擴增目的片段，PCR擴增的反應條件為95°C 5 min; 35個循環94°C 30 S， 55°C 35 S， 72。C 35 S; 72°C lmin。 PCR產物連入pGEM陽T easy 載體，轉化大腸桿菌TGI，涂布LBA篩選平板，挑若干個克隆進行酶切和PCR鑒定，選一 陽性克隆擴大培養，以堿法抽提質粒.將制備好的質粒以^ mHI和^zoI限制性內切酶雙酶 切，連入經過同樣雙酶切的pET-28a(+)載體的相應位點上，轉化大腸桿菌TGI。 PCR篩選陽 性克隆，經測序鑒定獲得編碼框正確的表達載體pET-28a(+)-ompH。經上述研究獲得1 、來自于近江牡蠣類立克次體內特有的類ompH外膜蛋白的核酸全序列如下 (在現有技術中未曾報導過)SEQN02ACTCTTCCAA AGATATCACT GCCGACGTAC TGAAACAGGT TAAATAA1 、來自于近江牡蠣類立克次體內特有的類ompH外膜蛋白的氨基酸序列如下(本申請首次獲得) SEQN03MAASAGVQAADKIAVVNVSS IFQQLPAREA VAKQLENEFK GRASELQNMERSLQTKMQRL QRDGATMKAS DRSKLEKDVM EQREQFSQKA LAFEQDNRRR QMEERNKILS RIQDAVKSVA SKGGYDVVIH ANAVAYADSS KDITADVLKQ VK3. 重組蛋白的表達與鑒定將上述陽性重組質粒pET-28a(+)-ompH轉化表達宿主菌BL21感受態，涂布LBA平板， 37'C培養過夜。挑取一個單克隆菌落，轉入LBA培養液，37'C振搖培養過夜。取適量菌液， 按1:100擴大培養至OD60Q為0.4-0.5時，將菌液分為若干等份，不加或分別加入IPTG，使 其終濃度在0-1.0 mmol/L，繼續培養6h，離心收集細菌。細菌經超聲波裂解后，離心分離上 清液和沉淀，分別上樣，進行SDS-PAGE電泳。4. 重組蛋白的純化與抗體制備利用組氨酸親和層析柱對表達產物進行分離純化。以上述方法大量制備超聲裂解的菌液， 離心分離上清液，進行蛋白的純化和洗脫操作，12%的SDS-PAGE電泳鑒定。挑選體重約1.5 kg的健康日本大耳白雄兔進行免疫。經過一次初始免疫和兩次加強免疫 后，頸動脈取血，分離血清，存儲于-80。C。5. 蛋白質定量與抗體效價的檢測按Brad-ford法對蛋白進行定量(Brad化rd MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 1976， 72: 248-254)。免疫后的兔血清用ELISA方法檢測效價，具體操作如下(1) 包被與封閉用包被緩沖液將蛋白稀釋至l-10pg/ml。在每個聚苯乙烯酶標板的反應 孔中加0.1ml， 4'C過夜。棄去孔內溶液，5。/。的脫脂奶粉封閉2h，用PBST洗3次，每 次3 min(2) 加樣加指定稀釋倍數的待檢樣品(待檢測的抗血清稀釋于PBST)0.1ml于上述已包 被的反應孔中，置37。C孵育lh， PBST洗3次，每次3min(同時做空白孔，陰性對照孔 及陽性對照孔)(3) 加酶標抗體于各反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標抗體O.lml， 37。Clh， PBST洗3 次，每次3min。(4) 加底物液顯色于各反應孔中加入新鮮配制的OPD底物溶液0.1ml， 37'C顯色10-30 分鐘。(5) 終止反應于各反應孔中加入2M反應終止液0.05ml。(6)結果分析用酶標儀4卯nm測各孔OD值，大于規定的陰性對照OD值的2.1倍， 即為陽性。計算抗體效價公式(樣本OD值-空白對照OD值)/(陰性對照OD值-空白對 照OD值)。 6. Western蛋白印跡Western蛋白印跡操作按文獻(Sambrook J, Russell DW著.黃培堂等譯.分子克隆實驗指 南，第3版.北京科學出版社，2002. (Sambrook J,Russell D W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual,3rd ed.New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001》，具體如下(1) 蛋白質樣品進行SDS-PAGE電泳(2) 轉膜(電轉)電泳結束后將膠條割至合適大小，浸入轉膜緩沖液平衡20min。預先 裁好與膠條同樣大小的濾紙和PVDF膜，浸入轉膜緩沖液中15min。轉膜裝置的搭建 按從下至上順序依次為陰極塑料板、3層濾紙、PVDF膜、凝膠、3層濾紙、陽極塑料板， 濾紙、凝膠、膜精確對齊，每一步去除氣泡，吸干多余的液體。恒壓38V，轉移3h。(3) 免疫雜交反應 a用PBST洗膜，5minx3次。 b加入封閉液，平穩搖動，室溫2h。 c棄封閉液，用PBST洗膜，10minx3次。d將膜轉入一抗雜交液(抗血清按預定比例稀釋于封閉液)，室溫雜交2h。陰性對照中 以免疫前的血清取代一抗，其余步驟與實驗組相同。 e棄雜交液，用PBST洗膜，10minx3次。f將膜轉入二抗雜交液(辣根過氧化物酶偶聯的二抗按合適稀釋比例稀釋于PBST)，平 穩搖動，室溫2h。g棄雜交液，用PBST洗膜，10minx3次。h加入顯色液，避光顯色至出現條帶時放入雙蒸水中終止反應。
具體實施例方式
1、類ompH重組蛋白的表達與鑒定將陽性pET-28a(+)-ompH重組質粒轉化表達宿主菌BL21感受態，涂布LBA平板，37。C 培養過夜。挑取一個單克隆菌落，轉入LBA培養液，37t;振搖培養過夜。取適量菌液，按1:100 擴大培養至OD6oo為0.4-0.5時，將菌液分為若干等份，不加或分別加入IPTG，使其終濃度 在0-1.0 mmol/L，繼續培養6h，離心收集細菌。細菌經超聲波裂解后，離心分離上清液和沉淀，分別上樣，進行SDS-PAGE電泳。2、利用親和柱分離純化重組表達的蛋白和抗類ompH重組蛋白抗體的制備(1) 蛋白純化① 表達His-o即H的菌液100ml， 10000Xg，離心10分鐘；分別加入4mlPBS，超聲破碎 50次，每次3秒；加入PMSF之終濃度lOmmol混勻，10000 Xg，離心10分鐘；上清液經0. 22 y的濾器過濾，至于冰上待用。② 每4ml的濃縮樣品加入lml Ni-NTA漿液，混合均勻裝柱，收集流出液。③ 用洗脫液洗脫結合的蛋白，每次500^1，洗4次，收集洗脫液。從親和柱分離純化來的 重組表達的蛋白經免疫原性分析即可制成亞單位疫苗。(2) 免疫動物將純化的蛋白濃度調制2嗎Ad，與等量的弗氏完全佐劑混合，乳化，注射免疫家兔。于 兩周后再以弗氏完全佐劑乳化純化的蛋白，進行加強免疫。再兩周后，耳靜脈取2毫升血， 檢測抗體效價。(3) 抗體效價檢測用間接ELISA技術測定抗體效價及最佳工作濃度。間接ELISA操作包被液稀釋抗原一抗原包備一洗板一加入不同稀釋倍數的一抗一洗板 —加入酶標二抗一洗板一加入底物顯色液一終止反應一酶標儀檢測。序列表 SEQNOl 〈110〉浙江大學〈120〉近江牡蠣類產克次體內類外膜蛋白序列及其亞單位疫苗的制備 〈160〉 3 〈210〉 1 〈211〉 45 〈212〉 DNA〈213〉近江牡蠣類立克次體內類外膜蛋白 〈221〉本發明設計寡聚核苷酸引物〈223〉來自近江牡蠣類立克次體內類外膜蛋白 〈400〉 1GTGAAAAAGT GGTTATTAGC TGTTATTTA ACCTGTTTCA GTACGSEQN02 〈211〉 489 〈212〉 DNA〈213〉近江牡蠣類立克次體內類外膜蛋白 〈221〉核酸全序列〈223〉來自近江牡蠣類立克次體內類外膜蛋白 〈400〉 2TGAAACAGGT TAAATAASEQN03 〈211〉 152 〈212〉 DNA〈213〉近江牡蠣類立克次體內類外膜蛋白 〈221〉氨基酸序列〈223>來自近江牡蠣類立克次體內類外膜蛋白 〈400〉 360 120SKGGYDVVIH ANAVAYADSS KDITADVLKQ VK 15權利要求
1. 用于擴增近江牡蠣類立克次體內的類ompH外膜蛋白基因的寡聚核苷酸引物為SEQNO1PF5’GTGAAAAAGTGGTTATTAGCTG 3’PR5’TTATTTAACCTGTTTCAGTACG 3’
2、 近江牡蠣類立克次體內的類ompH外膜蛋白的核酸全序列為SEQN02。
3、 近江牡蠣類立克次體內的類ompH外膜蛋白的氨基酸序列SEQN03。
4、 近江牡蠣類立克次體內的類外膜蛋白亞單位疫苗的制備方法，其特征包括以下內容(1) 以近江牡蠣類立克次體特有的基因組DNA為模板，設計擴增權利要求1所述的類ompH外膜蛋 白基因的引物，獲得權利要求2所述的編碼類ompH外膜蛋白的基因全序列SEQNOl; (2)將 類ompH外膜蛋白的基因片段克隆到合適的pGEM-T easy載體中，轉入相應的大腸桿菌TG I 宿主細胞中，獲得表達載體pET-28a(+)-ompH; (3)類ompH外膜蛋白的體外表達， Western-blot, SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳等方法鑒定重組類ompH外膜蛋白；(4)利用親和柱 分離純化重組類ompH外膜蛋白，制成亞單位疫苗。
全文摘要
本發明涉及近江牡蠣類立克次體中一種類ompH外膜蛋白的全序列，本發明的類ompH外膜蛋白可以用于制備類外膜蛋白亞單位疫苗，目的是用于預防近江牡蠣類立克次體病。本發明主要技術要點1.以近江牡蠣類立克次體特有的基因組DNA為模板，設計擴增類ompH外膜蛋白基因的引物，獲得編碼類ompH外膜蛋白的基因全序列；2.利用生物技術手段將類ompH外膜蛋白的基因片段克隆到合適的pGEM-T easy載體中，轉入相應的大腸桿菌TG I宿主細胞中，獲得表達載體pET-28a(+)-ompH；3.類ompH外膜蛋白的體外表達，Western-blot，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳等方法鑒定目的蛋白；4.利用親和柱分離純化重組類ompH外膜蛋白，制成亞單位疫苗。
文檔編號A61K39/00GK101219214SQ20071006787
公開日2008年7月16日 申請日期2007年4月6日 優先權日2007年4月6日
發明者吳信忠, 朱保建 申請人:浙江大學