專利名稱：一種從桑葉中提取1－脫氧野尻霉素的方法
技術領域：
本發明涉及植物提取領域，具體涉及一種桑葉有效成分的提取物及制備方法。
背景技術：
桑葉在《本草圖經》中謂之“神仙葉”，具有滋陰補血、疏風散熱、益肝通氣、降壓利尿之功效。桑葉的藥理作用在《本草綱目》、《本草求真》、《食療本草》、《藥茶和藥露》、《中藥方劑學》等書目中均有記載，日本古書《吃茶養生記》記載桑葉有改善“飲水病”(即糖尿病)的作用。由此可見，桑葉其藥用價值及保健功能無淪在我國還是在國外具有悠久的歷史淵源，為我們的開發利用提供了可靠的依據。
桑葉還是國家衛生部門批準的藥食兩用物品，其味苦、甘、寒，入肺經，煎汁代茶能止消渴。目前，盡管我國桑樹資源極為豐富，但主要還是用作養蠶飼料，每年養蠶之余，都有不少桑葉被廢棄.從未來發展趨勢看，開發桑葉保健產品潛力巨大。桑葉中含有的1一脫氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin DNJ)是人體小腸絨毛上的多種α一糖苷酶抑制劑，能阻止淀粉分解成為葡萄糖，競爭性地阻斷小腸粘膜細胞刷狀緣內的麥芽糖酶和蔗糖酶等雙糖水解酶，使攝食的多糖、寡糖和雙糖消化成葡萄糖、果糖等單糖的吸收過程受到阻止，繼而降低血糖濃度，對治療糖尿病及其并發癥具有一定治療作用。
現有的桑葉1一脫氧野尻霉素(DNJ)提取方法主要有兩種，CN1579445A的方法所獲得的桑葉提取物1一脫氧野尻霉素的含量僅為1.0～3.0％，主要通過加入絮凝劑再經醇沉后獲得；CN1430964A的方法獲得了高含量的桑葉總堿及DNJ提取物，但工藝過程較繁瑣，在前處理過程中需提取后先濃縮至提取液至比重1.12-1.20，再加入原生藥量的1-5倍量水溶解，調節pH后再加入絮凝劑靜置12小時，而后續的分離過程也在經過離子交換樹脂除去雜質后，需將樹脂倒出用堿悶置4h后再回流提取，步驟多，操作不便，工業化生產的成本高。
發明內容
本發明的目的在于克服現有技術存在的不足，提供一種更為簡便合理的從桑葉中提取1一脫氧野尻霉素(DNJ)的方法，是用分離方法獲得，可使桑葉提取物含量不低于10％的。
本發明的提取物制備方法通過以下步驟實現(1)將桑葉粉碎成粗粉，用8倍量或以上的水或含水的親水溶劑加熱提取2～3次，親水溶劑可以是甲醇、乙醇、乙腈及丙酮，加熱提取的溫度在50～100℃之間，以回流提取效果最佳；(2)將提取液合并后加入鹽酸、硫酸、硝酸或磷酸中的一種酸化至pH1～3，在10～30℃之間冷卻至沉淀完全，過濾或離心除去沉淀；(3)濾液適當濃縮后通過陽離子交換樹脂，用水或含水的親水溶劑洗至無色后，再用堿性甲醇或乙醇水溶液洗脫至近無色，其中的堿可以為氨水、二乙氨、三乙氨，堿的濃度為10％～50％，水溶液中甲醇或乙醇的濃度為10％～95％；陽離子交換樹脂的型號為001×1.1；001×7；001×14.5或D151型。
(4)收集堿性甲醇或乙醇水溶液的洗脫液，濃縮成浸膏或噴霧干燥，即可得到1-脫氧野尻霉素的含量不低于10％的桑葉提取物。
用本發明方法獲得的這種桑葉提取物，可以加入藥劑學允許的賦形劑制備成藥物制劑，制劑形式包括片劑、膠囊劑、丸劑、顆粒劑、氣霧劑、噴霧劑。
用本發明方法獲得的桑葉提取物1-脫氧野尻霉素(DNJ)，可在制備降低血糖的保健品中應用，經動物實驗證實，對正常小鼠無影響，而對糖尿病模型小鼠具有比較明顯的降血糖作用。
本發明的有益之處是提出了在提取過程中進行酸化處理，后冷卻除去雜質的步驟具有重要作用，由于不需要加入絮凝劑，在降低成本、提高含量的同時保證了后處理過程中沒有外源性的物質帶入，在將酸化液濃縮后直接采用國產離子交換柱層析進行分離，大大降低了成本。本發明方法設計合理，操作簡便，無需特殊設備，非常適合工業化生產。
具體實施例方式
本發明結合具體實施例作進一步說明。
實施例1 桑葉提取物的制備取桑葉藥材200g左右粉碎，加3升水，回流提取2.5小時，過濾后濾渣再加3升水回流2小時，合并濾液，共5.2L。將此提取液用6N的鹽酸酸化至pH1～3后在-8℃冷藏2h，過濾除去沉淀，濾液濃縮至2L后通過陽離子交換樹脂001×1.1，用水洗至無色后，再加入氨水至50％乙醇水溶液中使氨水含量達50％洗脫，收集此部分洗脫液，濃縮成浸膏得1.8g，用HPLC法測定1-脫氧野尻霉素的含量為11.8％。
實施例2 桑葉提取物的制備取500克左右藥材粉碎，加5升30％的甲醇回流提取2小時，過濾后濾渣再加4升30％的乙醇回流2小時，合并濾液，共8.2L。將此提取液用5N的硫酸酸化至pH1～3后在-15℃冷藏2h，過濾除去沉淀，濾液濃縮至5L后通過陽離子交換樹脂001×7，用水洗至中性后再用30％甲醇洗至無色，繼而加入二乙氨至70％甲醇水溶液使其含量達20％洗脫，收集此部分洗脫液，濃縮成浸膏得4.1g，用HPLC法測定1-脫氧野尻霉素的含量為13.1％。
實施例3 桑葉提取物的制備取桑葉藥材1kg左右粉碎，加8升20％的丙酮，回流提取2.5小時，過濾后濾渣再加8升20％的丙酮回流2小時，合并濾液，共12.6L；將此提取液用5N的磷酸酸化至pH1～3后在-30℃冷藏2h，過濾除去沉淀，濾液濃縮至6L后通過陽離子交換樹脂001×14.5，用水洗至中性后再用60％丙酮洗至無色，繼而加入二乙氨至60％甲醇水溶液使其含量達30％洗脫，收集此部分洗脫液，濃縮成浸膏得9.6g，用HPLC法測定1-脫氧野尻霉素的含量為12.6％。
實施例4 桑葉提取物的制備取桑葉藥材1kg左右粉碎，加10升10％的乙腈，回流提取2小時，過濾后濾渣再加8升10％的乙腈回流2小時，合并濾液，共15.6L；將此提取液用5N的磷酸酸化至pH1～3后在-30℃冷藏2h，過濾除去沉淀，濾液濃縮至6L后通過陽離子交換樹脂D151，用水洗至中性后再用60％乙腈洗至無色，繼而加入三乙氨至70％甲醇水溶液使其含量達10％洗脫，，收集此部分洗脫液，濃縮成浸膏得11.2g，用HPLC法測定1-脫氧野尻霉素的含量為10.9％。
實施例5桑葉提取物的制備取桑葉藥材1kg左右粉碎，加8升50％的乙醇，回流提取2小時，過濾后濾渣再加6升10％的乙腈回流2小時，合并濾液，共11L；將此提取液用6N的硝酸酸化至pH1～3后在-30℃冷藏2h，過濾除去沉淀，濾液濃縮至6L后通過陽離子交換樹脂001×7，用水洗至中性后再用60％乙醇洗至無色，繼以50％氨水乙醇溶液洗脫，收集此部分洗脫液，濃縮成浸膏得12.3g，用HPLC法測定1-脫氧野尻霉素的含量為12.4％。
實施例6本發明含量測定方法采用高效液相法，包含以下步驟HPLC條件C18柱，柱溫30℃，流動相為乙腈∶0.1％醋酸水溶液(35∶65)，流速0.8ml/min，檢測波長254nm；柱前衍生化反應在1.5ml的離心管中進行。精密稱取適量樣品以蒸餾水定容至100ml，取20μl樣品溶液，加入硼酸鹽緩沖溶液(pH＝8.5)20μl，再加入40μl 5mmol/L的FMOC-Cl(芴甲氧酰氯)的乙腈溶液，振搖，室溫下反應20分鐘，再加入20μl 0.1mol/L的甘氨酸水溶液使剩余的衍生化試劑反應完全，10分鐘后加入400μl 0.1％醋酸水溶液。
標準曲線的制備精密稱取1-脫氧野尻霉素標準品適量，以蒸餾水定容至100ml即得標準溶液，用蒸餾水將母液稀釋成不同濃度的標準溶液系列，分別取10μl標準溶液同上述衍生化步驟衍生并進液相測定峰面積，以標準品質量為橫坐標，峰面積為縱坐標計算標準曲線。
實施例7 片劑取上述1～5任一實施例方法獲得的桑葉提取物30g，粉碎后過80目篩，與淀粉60g混勻，加10％淀粉漿10g制成軟材加入硬脂酸鎂1g，干淀粉10g混勻后壓制成1000片，即得。每片含桑葉提取物30mg。
實施例8 膠囊劑取上述1～5任一實施例方法獲得的桑葉提取物30g，粉碎后過80目篩，加10％淀粉漿制成軟材，用14目篩制粒后，置60℃～70℃干燥后于12目篩整粒，套入1號空心膠囊中。共裝1000粒，每粒膠囊含桑葉提取物30mg。
實施例9 丸劑取上述1～5任一實施例方法獲得的桑葉提取物30g，粉碎后過80目篩，適量蜂蜜作黏合劑泛制成丸。
實施例10 顆粒劑取上述1～5任一實施例方法獲得的桑葉提取物30g，粉碎后過80目篩，加10％淀粉漿制成軟材，用14目篩制粒后，置60℃～70℃干燥后于12目篩整粒，分裝，密封，包裝即得。
實施例11 噴霧劑取上述1～5任一實施例方法獲得的桑葉提取物30g，粉碎后過80目篩，適量水溶解，滅菌后灌裝。
實施例12DNJ提取物對正常小鼠血糖水平的影響正常小鼠隨機分為5組，每組10只，DNJ提取物低、中、高劑量組分別給予200、400、800mg/kg，陰性對照組給予0.5％CMC-Na 20ml/kg，陽性對照組給予格列齊特100mg/kg，每天1次灌胃給藥，連續3天，于末次給藥前禁食12h，于給藥前和給藥后1、2h尾靜脈取血，3000rpm×10min，分離血清，用葡萄糖氧化酶法測定血糖值。
對正常小鼠給藥3天，末次給藥后1h后，與陰性對照組比較，DNJ提取物400、800mg/kg劑量組有明顯的降血糖作用(P＜0.05和P＜0.01)，陽性對照藥格列齊特100mg/kg組也具有明顯的降血糖作用(P＜0.001)；末次給藥后2h后，與陰性對照組比較，陽性對照組仍具有顯著的降血糖作用(P＜0.001)，而DNJ提取物的降血糖作用不明顯(P＞0.05)。
實施例13 DNJ提取物對正常小鼠注射葡萄糖引起高血糖的影響正常小鼠隨機分為5組，每組10只，禁食12小時后灌胃給藥，DNJ提取物低、中、高劑量組分別給予200、400、800mg/kg，陰性對照組給予0.5％CMC-Na20ml/kg，陽性對照組給予格列齊特100mg/kg，給藥1h后，每只小鼠腹腔注射葡萄糖2g/kg，注射葡萄糖1h后，小鼠摘眼球取血，3000rpm×10min，分離血清，用葡萄糖氧化酶法測定血糖值。
正常小鼠灌胃給藥1h后再腹腔注射葡萄糖2g/kg，1h后測定血糖值。與陰性對照組比較，DNJ提取物400、800mg/kg劑量組有明顯的降血糖作用(P＜0.001和P＜0.01)，陽性對照藥格列齊特100mg/kg組也具有明顯的降血糖作用(P＜0.001)。
實施例14 DNJ提取物對正常小鼠淀粉耐量的影響正常小鼠隨機分為5組，每組10只，禁食12小時后灌胃給藥，DNJ提取物低、中、高劑量組分別給予50、100、200mg/kg，陰性對照組給予0.5％CMC-Na 20ml/kg，陽性對照組給予阿卡波糖20mg/kg，給藥0.5h后，每只小鼠以可溶性淀粉5g/kg灌胃，分別于給藥前，給淀粉后0.5、1、2h尾靜脈取血，3000rpm×10min，分離血清，用葡萄糖氧化酶法測定血糖值。
正常小鼠灌胃給藥0.5h后可溶性淀粉5g/kg灌胃，與陰性對照組比較，DNJ提取物100mg/kg劑量組于給淀粉后1h有明顯的降血糖作用(P＜0.05)，陽性對照藥阿卡波糖20mg/kg組在給淀粉后0.5h和1h均有明顯的降血糖作用(P＜0.05和P＜0.01)。
權利要求
1.一種從桑葉中提取1-脫氧野尻霉素的方法，是將桑葉粉碎成粗粉，用水或含水的親水溶劑加熱提取，其特征是通過以下步驟實現(1)將桑葉粉碎成粗粉，用水或含水的親水溶劑加熱提取2～3次，加熱提取的溫度在50～100℃之間；(2)將提取液合并后加入無機酸酸化至pH1～3，在10～-30℃之間冷卻至沉淀完全，過濾或離心除去沉淀；(3)濾液濃縮后通過陽離子交換樹脂，用水或含水的親水溶劑洗至無色后，再用堿性甲醇或乙醇水溶液洗脫至近無色；(4)收集洗脫液，濃縮成浸膏或噴霧干燥，即得到1-脫氧野尻霉素的含量不低于10％的桑葉提取物。
2.根據權利要求1所述的一種從桑葉中提取1-脫氧野尻霉素的方法，其特征是步驟(2)中的無機酸選用鹽酸、硫酸、硝酸或磷酸中的一種。
3.根據權利要求1所述的一種從桑葉中提取1-脫氧野尻霉素的方法，其特征是步驟(3)中的堿性水溶液選用氨水、二乙氨、三乙氨中的一種，堿的濃度為10％～50％，水溶液中甲醇或乙醇的濃度為10％～95％。
4.根據權利要求1所述的一種從桑葉中提取1-脫氧野尻霉素的方法，其特征是親水溶劑選用甲醇、乙醇、乙腈或丙酮中的一種。
5.根據權利要求1所述的一種從桑葉中提取1-脫氧野尻霉素的方法，其特征是獲得的桑葉提取物與藥劑學允許的賦形劑制備成藥物制劑，制劑形式包括片劑、膠囊劑、丸劑、顆粒劑、氣霧劑、噴霧劑。
6.根據權利要求1所述的方法獲得的桑葉提取物1-脫氧野尻霉素在制備降低血糖的保健品中應用。
全文摘要
本發明提供一種從桑葉中提取1一脫氧野尻霉素(DNJ)的方法，是通過在桑葉的提取液中加入無機酸酸化處理，經冷卻除去雜質，再經過柱層析獲得。可使桑葉提取物含量不低于10％。用本發明方法獲得的桑葉提取物經動物實驗證實，對正常小鼠無影響，而對糖尿病模型小鼠具有比較明顯的降血糖作用，可在制備降低血糖的保健品中應用。本發明方法由于不需要加入絮凝劑，在降低成本、提高含量的同時保證了后處理過程中沒有外源性的物質帶入，在將酸化液濃縮后直接采用國產離子交換柱層析進行分離，大大降低了成本。本發明方法設計合理，操作簡便，無需特殊設備，非常適合工業化生產。
文檔編號A61K31/445GK101020655SQ200710067498
公開日2007年8月22日 申請日期2007年3月15日 優先權日2007年3月15日
發明者周長新, 莫建霞, 翁林佳, 肖昌錢, 張相宜 申請人:浙江大學