專利名稱：一種制備抗病毒的藥物組合物的方法
技術領域：
本發明屬于醫藥領域技術領域，具體涉及一種包含黃連、龍膽、谷精草、冰片的抗病毒藥物組合物的制備方法。
背景技術：
中醫藥治療的精華在于辨證論治、理法方藥、君臣佐使來提高療效。復方制劑的效果要明確高于單純有效成分提取。但由于中藥化學成分復雜，各種成份的理化反應很難把握。
在藥物組合物制成各種藥劑時，眼用制劑的要求較高，因此中藥復方滴眼液很難滿足澄明度、穩定性的要求。
眼用制劑一般為多劑量包裝，使用過程中很容易染菌變質，其中綠膿桿菌的污染有可能造成嚴重后果，對于眼表疾病，尤其角膜創傷的病人后果更嚴重。因此，對于滴眼劑的無菌要求特別嚴格，以策安全。一般常規眼用制劑加入抑菌劑以防止染菌，但多數抑菌劑對眼粘膜都有刺激性和毒性，對角膜損傷的刺激或毒性更大。而且有研究報道，角膜創傷或眼科手術使用的滴眼劑不宜添加抑菌劑。
眼藥水每次只能滴1-2滴，滴入結膜囊后要流掉2/3以上，滴入的一小部分藥液與淚液混合，通過角膜轉運入眼。所以滴眼的生物利用度甚小。研究表明只要持續保持結膜囊藥物濃度就能大大提高藥物的利用度。
發明人的另一發明專利“一種抗單純皰疹病毒的藥物組合物及其制備方法”，(公告號CN1663585公告日為2005年9月7日)提供一種抗單純皰疹病毒的藥物組合物，是以黃連、龍膽、谷精草和冰片為主原料的提取物組成，黃連的主要成分小檗堿對革蘭氏菌及葡萄球菌、溶血性鏈球菌、肺炎雙球菌、百日咳桿菌等均有較強的抑菌作用，尚具有抗真菌、抗病毒、抗炎作用。龍膽的主要成分龍膽苦苷具有清熱利膽、抑菌作用，能減輕肝細胞壞死和肝細胞病變程度，并具有較強的抗炎活性；谷精草的主要成分為酚類，在試管內對真菌有抑制作用；冰片的主要成分為龍腦、異龍腦，具有防腐、抑菌、抗炎作用，局部可刺激冷覺感受器，具有清涼感，并具有止癢、止痛及輕微的局麻作用。包含黃連、龍膽、谷精草、冰片的藥物組合物對抗病毒尤其是單純皰疹病毒具有較好的效果。此工藝方法制得的滴眼液穩定性不理想，制劑易析出沉淀。
發明內容
本發明旨在將上述發明中公開的包含黃連、龍膽、谷精草、冰片的抗病毒藥物組合物，根據中藥材的藥性作用及理化性質，提供一種工藝穩定、生物利用度高、不含抑菌劑而不易染菌變質的中藥組合物的制備方法。采用本發明方法制成的滴眼液具有無毒、無刺激性及良好的生物相容性外，尚能防止或抑制病原微生物發育生長，在不添加抑菌劑的狀態下也能滿足無菌或達微生物限度要求，同時因為不含抑菌劑，制備的滴眼劑更適合于眼部的應用。
為實現本發明目的采用如下技術方案一種制備抗病毒的藥物組合物的方法，所述的藥物組合物的主要原料為黃連、龍膽、谷精草和冰片，將主要原料的提取物作活性成分混合后，加入藥學上可接收的附加劑制備而成，其特征在于所述黃連采用如下提取方法(1)處方量的黃連加非極性溶劑或水回流提取，合并回流液；
(2)藥液減壓濃縮至浸膏狀；(3)取浸膏在30～60℃石油醚浸泡脫脂，脫脂后加水轉溶過濾，濾液濃縮至生藥量的同倍重量，濃縮液加等重量的聚酰胺拌勻，加在預先以水為溶劑填裝的聚酰胺柱頂，以水洗脫至對碘化鉍鉀無明顯反應，洗脫液減壓濃縮至處方量的1/2重量，冷藏，過濾至澄清。
上述步驟(1)中非極性溶劑優選原藥材的10倍體積量，回流3次，每次90分鐘。
進一步，所述龍膽草的提取步驟如下(1)處方量的龍膽加非極性溶劑或水浸泡，回流提取，合并回流液；(2)藥液減壓濃縮至浸膏狀，濃縮溫度為20～60℃；(3)取浸膏在30～60℃石油醚浸泡脫脂，脫脂后加水轉溶過濾，濾液濃縮至生藥量的同倍重量，濃縮液加等重量的聚酰胺拌勻，加在預先以水為溶劑填裝的聚酰胺柱頂，以水洗脫至薄層鑒別無龍膽苦苷斑點出現，洗脫液減壓濃縮至處方量的1/2重量，冷藏，過濾至澄清。
上述的非極性溶劑為95％的乙醇。本發明組合物由黃連、龍膽、谷精草、冰片四味藥材組成，黃連、龍膽為君藥和臣藥，黃連主要成分小檗堿，龍膽主要成分龍膽苦苷在熱乙醇中溶解度大，且遇熱較穩定，又可避免水溶性雜質，所以優選醇尤其是乙醇作為溶媒提取。
谷精草成分國內外尚無文獻報告，國內外文獻報道較少，主要含酚類、黃酮類(CA1991；115110604a)，可溶于水及醇，由于谷精草含有葉綠素，較優選以水提取。本發明的谷精草提取步驟如下(1)處方量的谷精草加水或甲醇或乙醇中浸泡，煎煮；(2)藥液濃縮至谷精草原藥重量，冷藏，過濾除雜；
(3)濃縮液加等重量的聚酰胺拌勻，加在預先以水為溶劑填裝的聚酰胺柱頂，以水洗脫，收集PH4.5～5.0洗脫液，洗脫液減壓濃縮。
本發明所述藥物組合物制備為滴眼劑的步驟包括將黃連、龍膽和谷精草提取物加水轉溶混合后冷藏，經離心后取上清液，加等滲劑、增黏劑和穩定劑和處方量的冰片，調節藥液的PH值為5.5～6.8，過濾，濾液充氮、滅菌分裝；所述組成和含量百分比為黃連提取物 相當于黃連的處方量龍膽提取物 相當于龍膽的處方量谷精草提取物相當于谷精草的處方量冰片處方量穩定劑 0.1％等滲劑 2.0％增黏劑 3.0％
注射用水 加至 1000ml。
所述等滲劑選自Nacl、硼酸、葡萄糖、硼砂和甘露醇；優選為甘露醇。
所述增黏劑選自甲基纖維素、聚乙烯酸、聚乙二醇、羥丙基乙基纖維素、聚維酮，優選為聚維酮。
所述穩定劑選自EDTA.2Na、亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、焦亞硫酸、硫代硫酸鈉，優選為EDTA.2Na。
本發明提供的制備方法制得的以黃連、龍膽、谷精草、冰片為主要原料的藥物組合物，無菌、毒性與刺激性，不含抑菌劑，用藥安全，且具有高的穩定性。本發明制備方法相比現有的提取工藝具有如下有益效果(1)以非極性溶劑提取黃連中主要成分小檗堿和龍膽中主要成分龍膽苦苷，提高了有效成份的提取率，最大限度減少了水溶性雜質。
(2)本制備方法采用聚酰胺柱層析，有效地確保了制劑的澄清度且不影響藥效。
(3)不添加抑菌劑達菌桿要求，避免抑菌劑影響澄清度以及對眼部的刺激，有利于角膜的修復。
說明書附1為實施例1的黃連提取工藝流程圖；圖2為實施例1的龍膽提取工藝流程圖；圖3為實施例1的谷精草提取工藝流程圖；圖4為實施例1制備滴眼劑的工藝流程圖。
具體實施例方式
本發明的抗病毒藥物組合物由黃連、龍膽、谷精草、冰片四味藥材分別提取精制而成，具有清熱解毒，退赤消腫功效，臨床用于治療急性結膜炎及病毒性角膜炎。其中黃連為君藥，小檗堿為本品的主要有效成分之一。小檗堿具有清熱解毒、抑菌、抗真菌、抗病毒、抗炎等多種生理活性；龍膽為臣藥，龍膽苦苷為主要有效成分，具有明顯的抗炎作用及不同程度抑菌作用；谷精草主要成分為酚類，可能具有增強局部血流量，改善微循環作用；冰片成分為龍腦，具有防腐、抑菌、抗炎作用。本發明的制備方法制得的滴眼劑或噴劑或貼劑，測其小檗堿、龍膽苦苷各自的總固體量及主要活性成分含量、制劑澄明度和毒性和刺激性，結果證明。制備的各種劑型尤其是滴眼液無毒、無刺激性及良好的生物相容性，而且防止或抑制病原微生物發育生長，在不添加抑菌劑的狀態下也能滿足本品無菌或達微生物限度要求，更適合于眼部的應用。
本發明以下的實驗例采用如下檢測方法(1)黃連工藝總固體測定精密稱取10g藥材(黃連)9份，回流提取、濾過，合并濾液，減壓回收乙醇(60℃)，殘液置蒸發皿中水浴蒸干后，按中國藥典2000年版一部規定方法烘干恒重，于天平上稱重，計算總固體量。
小檗堿含量測定供試液的制備精密稱取黃連總固體0.1g，加水溶解，定容至100ml，從中取2ml離心(10,000r/min，5min)，上清液即為供試液。
色譜條件色譜柱Eclipse-XDB-C18(150×4.6mm)5m流動相乙晴一水一十二烷基硫酸鈉(500∶500∶1g)檢測波長254nm柱溫18℃流速1.5ml/min經系統適用性試驗、耐用性實驗以及流動相實驗(流速對主成分分離影響實驗、流動相以及流動相比例對主成分影響、柱溫對主成分離的影響以及PH值對主成分小檗堿的保留時間及與其他峰的分離度)，確定上述條件，流動相的pH值、流速及柱溫影響較小，也顯示本條件的耐用性較差，須嚴格按照所定條件進行試驗。
本制備方法通過回收率試驗(準確度試驗)，考察其它三主要原料以及輔料對小檗堿的影響，平均回收率為100％。精密度試驗確定本高效液相法檢測小檗堿準確、可靠、穩定性好。
(2)龍膽提取工藝總固體測定精密稱取10g藥材(龍膽)，按實驗設計進行回流提取、濾過，合并濾液，減壓回收乙醇(50℃)，殘液置蒸發皿中水浴蒸干后，按中國藥典2000年版一部規定方法烘干恒重，于天平上稱重，計算總固體量。
龍膽苦苷含量測定供試液的制備精密稱取龍膽總固體0.1g，加水溶解，定容至100ml，從中取2ml離心(10,000r/min，5min)，上清液即為供試液。
色譜條件色譜柱Eclipse-XDB-C18(250×4.6mm)5μm流動相乙腈水(20∶80)檢測波長270nm柱溫25℃流速1.0ml/min在含量測定系統適用性試驗中，對照品5次重復進樣峰面積的RSD％達到1.0％以下，符合精密度的要求，本制備方法通過回收率試驗(準確度試驗)考察其它三主要原料以及輔料對龍膽苦苷的影響，平均回收率可到99.33％，精密度試驗確定本高效液相法檢測龍膽苦苷準確、可靠、穩定性好。
實施例1滴眼劑的制備方法本實施例處方量為黃連1.2Kg；龍膽草1.2Kg；谷精草1.0Kg；冰片適量。
投料生藥黃連為炮制切薄片；龍膽為炮制切段；谷精草為炮制后切段。
黃連提取工藝，參見
圖1(1)醇熱提取按處方量稱取黃連，加95％乙醇12L浸泡45min，加熱回流90min，共回流提取3次，每次均加藥材的10倍量溶劑。
(2)分離經提取后將藥渣和提取液通過壓濾，可擠出藥渣內所吸附的藥液，合并3次提取液，再通過壓濾進一步除去藥液中的混懸物，以提高提取藥液的澄清度。
(3)濃縮；取分離所得藥液置濃縮鍋中于60℃減壓濃縮至浸膏狀(除盡乙醇)。
(4)精制a.脫脂取浸膏，加30～60℃石油醚浸泡過夜，傾出石油醚(石油醚可回收重復利用)，浸膏揮盡殘留石油醚。
b.轉溶取上述浸膏，加水轉溶，冷藏過夜，濾液濃縮至生藥量的1∶1。
c.柱層析濃縮液加聚酰胺粉(1∶1)拌勻，加在預先以水為溶劑填裝的5.3×59cm的聚酰胺柱頂。用水洗脫至對碘化鉍鉀幾無反應，洗脫液于60℃減壓濃縮至處方量的1/2，冷藏過夜，過濾至澄清，即得P1，測定小檗堿含量為6％。
龍膽提取工藝，參見圖2(1)醇熱提取 按處方量稱取龍膽，加95％乙醇12L浸泡45min，以下同黃連提取方法。不同的是回流時間為60min，回流2次，濃縮溫度為50℃。
(2)分離 同黃連提取分離方法。
(3)濃縮 同黃連濃縮方法。
(4)精制a.脫脂同前。
b.轉溶同前。
c.柱層析濃縮液加聚酰胺粉(1∶1)拌勻，加在預先以水為溶劑填裝的5.3×59cm的聚酰胺柱頂。用水洗脫至薄層鑒別無龍膽苦苷斑點出現，洗脫液50℃減壓濃縮至處方量的1/2，冷藏過夜，過濾至澄清，即得P2，測定龍膽苦苷含量3.1mg％。
谷精草提取工藝，參加圖3
(1)水提取按處方量稱取谷精草，加水浸洗1次，浸泡2h，煎煮60min，共3次，每次加水量為20體積倍量。
(2)分離經提取后將藥渣和提取液通過壓濾，可擠出藥渣內所吸附的藥液，合并3次提取液，再通過壓濾進一步除去藥液中的混懸物，以提高藥液的澄清度。
(3)濃縮取分離所得藥液置濃縮鍋中于60℃減壓濃縮至1∶1濃縮液，冷藏過夜，過濾，進一步除去葉綠素等雜質。
(4)精制濃縮液通過聚酰胺柱(同黃連提取方法)，用水洗脫，收集pH4.5～5.0洗脫液，并于60℃減壓濃縮，即得P3。
制備滴眼液，參見圖4黃連提取物(P1相當于生藥1.2Kg)龍膽提取物(P2相當于生藥1.2Kg)谷精草提取物(P3相當于生藥1Kg)冰片 0.3KgEDTA·2Na0.1％甘露醇 2.0％
聚維酮(PVP) 3.0％注射用水 加至 1000ml取P1、P2、P3加水轉溶后的混合藥液，分裝預鹽水瓶中，密封，100℃，加熱30min，冷至室溫，置5℃以下冷藏3天。
冷藏液離心(4,000r/min)后分離上清液，加甘露醇及EDTA·2Na，加熱使溶解，冷至室溫，加入聚維酮溶解后，再加入預溶于無水乙醇中的冰片，攪勻，調pH至5.5～6.8，過濾，濾液充氮，分裝，滅菌(100℃×30min)。
滅菌藥液置無菌室過濾(0.8μm微孔濾膜)，無菌分裝，即得成品(每瓶5ml)，按標準要求進行檢漏和質檢。
滴眼液的穩定性試驗滴眼液(250ml，100℃×30min滅菌)常溫放置三個月未見澄明度改變；pH下降幅度不大(從考察前pH6.3降至pH5.9)；外觀色澤無明顯改變；三批樣品薄層色譜鑒別活性成分小檗堿和龍膽苦苷斑點無改變，測三批主要活性成分小檗堿含量(mg/ml)1.2428、1.3018、1.1385，均在限度以上(不低于1mg/ml)。
而在相同條件下，采用配比量的黃連經鹽酸溶液，浸泡煎煮同樣時間而制得藥物組合物的活性成分的小檗堿含量(mg/ml)為0.9921、1.0210、0.9741。
滴眼液的細菌數檢測細菌數≤100個/ml，無霉菌(酵母菌)，銅綠假單胞桿菌和黃色金葡萄菌。
實驗證明考察表明，本發明制備的滴眼液在常溫下較穩定，制備工藝合理、穩定且提高了活性成分的提取率，而且在不添加抑菌劑達到菌桿要求。
實施例2本實施例黃連、龍膽提取工藝相同于實施例1，不同的是谷精草采用常規水煎煮提取方法。另外以下條件和用量做出變化1、溶劑濃度改變含黃連的復方中藥制劑一般使用水和一定濃度的乙醇提取，本發明方法為加熱提取，本實施例以水、50％乙醇、95％乙醇作為溶劑分別總固體浸出量及溶液澄明度。
按處方比例稱取干燥藥材，黃連、龍膽各10g，分別加12倍量水、50％乙醇、95％乙醇，浸泡30min后加熱回流提取1.5h，冷至室溫，過濾，濾液分別減壓濃縮(60℃)至干，真空干燥24h，精密稱量即得總固體浸出量；分別稱取固體1g，加水溶解，冷藏過夜，過濾，定容至50ml，密封，100℃×30min，室溫存置3天，觀察溶液觀察溶液澄明度。
本試驗通過設計以水、50％乙醇、95％乙醇3種具有代表性溶劑的總固體浸出量及溶液澄明度。結果見下表1。
表1
注+++溶液渾濁，無沉淀，++溶液澄清；-溶液澄清度極好。
結果處方藥材黃連以50％乙醇浸出率(總固體量)最高，水次之，95％乙醇浸出率較低，溶液澄明度則以95％乙醇最佳；而95％乙醇提取制成水溶液的小檗堿含量達2mg/ml以上(HPLC法)即達到鹽酸小檗堿的飽和溶解度(1∶500)，足以發揮治療作用，并能確保滴眼劑的澄明度，因此選擇95％乙醇作為提取溶劑。龍膽也以95％乙醇為佳(HPLC法，0.5mg/ml)，水轉溶后的澄清度也比其他溶劑好。
2、黃連(P1)提取工藝中熱非極性溶劑的提取時間、次數和溶劑量改變提取時間分別取60、90、120min，提取次數為1、2、3次和溶劑量為8、10、12倍。其它相同于實施例1中黃連提供工藝方法，測得總固體量和小檗堿含量如表2所示實驗結果見下表2
表2
從表2中可看出，采用黃連加12倍乙醇，回流3次，每次90分鐘，總固體高；采用黃連加10倍乙醇，回流3次，每次90分鐘小檗堿含量高。
從實際工藝考察，藥材乙醇10倍量，回流3次，每次90分鐘即實施例1中的條件，方案最佳。即按處方比例準確稱取黃連藥材，加10倍量乙醇浸泡30min后，加熱回流1h，重復回流3次，過濾，合并濾液，減壓濃縮(60℃)，除盡乙醇，加水轉溶，冷藏24h，過濾，濾液過聚酰胺柱，水洗至顏色極淡為止(對碘化鉍鉀幾無反應)，減壓濃縮至處方量的1/2，即得p1(總生物堿)。以最優選的工藝重復實驗，結果如下表3表3最優工藝重復試驗結果(n＝3)
實施例3本實施例黃連、龍膽提取工藝和谷精草工藝均相同于實施例1，另外以下條件和用量做出變化1、溶劑濃度改變本實施例黃連、龍膽、谷精草提取工藝相同于實施例1，不同的是以下條件和用量的變化龍膽(P2)提取工藝中熱非極性溶劑的提取時間、次數和溶劑量改變。
提取時間分別取60、90、120min，提取次數為1、2、3次和溶劑量為8、10、12倍。其它相同于實施例1中黃連提供工藝方法，測得總固體量和小檗堿含量如表2所示實驗結果見下表4表4
從表4中可看出，采用龍膽加8倍乙醇，回流3次，每次120分鐘，總固體高；采用龍膽加8倍乙醇，回流1次，每次60分鐘龍膽苦苷含量高。但是由于龍膽苦苷受熱不穩定，并從實際工藝考察，采用藥材乙醇10倍量，回流2次，每次60分鐘為最佳。
最優工藝重復試驗，按處方比例準確稱取龍膽藥材(10g，3份)，分別加10倍量乙醇浸泡30min后，加熱回流1h，重復回流2次，過濾，合并濾液，減壓濃縮(50℃)，除盡乙醇，加水轉溶，冷藏24h，過濾，濾液過聚酰胺柱，水洗至薄層層析無龍膽苦苷斑點為止，減壓濃縮至處方量的1/2，即得P2(龍膽苦苷等)。試驗結果，見表5表5最優工藝重復試驗結果(n＝3)
從實驗結果看，提取時提取時間、次數和溶劑用量對龍膽苦苷的提取率有顯著影響，其中提取時間影響較大，次之提取次數。由于龍膽苦苷為裂環環烯醚萜苷衍生物，其水溶性苷類易被水解，受熱能促進水解或分解，總固體的得率與有效成份龍膽苦苷無相關性，所以出現總固體得率高的樣品龍膽苦苷含量低的原因。根據實驗證明提取時間對龍膽苦苷的得率或含量的影響有顯著性意義，提取次數次之，而醇溶媒的用量影響較小。根據重復試驗結果，并從整體工藝考察，提取龍膽的優選工藝條件為藥材乙醇10倍量，回流2次，每次60分鐘。
實施例4本實施例主要變化谷精草提取工藝條件。
谷精草具有疏散風熱，明目，退翳等作用。用于治療目疾，自《開寶本草》、《本草綱目》即有記載。谷精草為谷精草科植物Eriocaulon buergerianum Koern的干燥帶花莖的頭狀花序。有關谷精草的化學成分初步試驗為酚類成分，但至今尚未清楚，也未見谷精草有效成份等研究報告。由于本發明滴眼液君藥黃連主成分小檗堿為季銨生物堿對酸堿敏感，遇酸性物質易發生沉淀反應，因此，本發明谷精草提取工藝主要以提取谷精草中水溶性酚類成分及這些未知成分與本發明藥物組合物中其它已知成分配伍后對滴眼液的澄明度影響為考察指標。盡管不能定量反映谷精草最佳工藝條件，但從控制滴眼劑澄明度，能確保制劑質量，以求整體工藝穩定、可行。
根據谷精草中可能有水溶性酚類成分及葉綠素，采用水為提取溶媒。
按處方比例稱取干燥藥材各9份，黃連和龍膽按實施例1所述工藝分別制備，谷精草按一般水提法，谷精草加水煎煮2次，每次1h，合并煎液，濾過，濾液濃縮至每毫升含藥材1g，冷藏過夜，離心，除去葉綠素等雜質，離心液加石油醚于30～60℃脫脂，脫脂后濃縮液繼續減壓于60℃濃縮成浸膏加水溶解，加在預先以水為溶劑填裝的聚酰胺柱頂(50g生藥水提取物，30～60目的聚酰胺粉25g，裝入2.5cm×30cm玻璃柱)。依次以水、30％乙醇、50％乙醇、80％乙醇、95％乙醇洗脫，水洗脫收集pH3.5～4.0和pH4.5～5.0兩份(簡稱酸性水和中性水)，每份約80ml；其它每種溶劑洗至約80ml時換下種溶劑。含乙醇溶劑分別減壓(60℃)濃縮除盡乙醇，加水轉溶，冷藏過夜，濾過，澄清液供如下試驗用。
取每份洗脫液2ml，分別進行鞣質、蛋白質、草酸鹽等檢查，結果見表6。
表6谷精草提取液影響質量項目檢查
+++沉淀明顯，呈色明顯；++中等程度呈色；-對澄清度無影響。
草酸鹽用1％氯化鈣、氯化鋇試液檢查；蛋白質30％磺基水楊酸試液或鞣酸試液；鞣質(酚類)1％三氯化鐵試液、香草醛-鹽酸試劑及0.1％咖啡堿水溶液。
表6提示，谷精草水提液含有機酸，主要為草酸鹽，試驗證明氯化鋇試液產生的白色沉淀為不溶于稀醋酸的草酸鋇。中性水洗脫液及各濃度乙醇洗脫液均對三氯化鐵試液呈明顯反應，經香草醛-鹽酸試劑及咖啡堿排除試驗表明，樣品對三氯化鐵顯色反應主要是酚類，說明谷精草酚類成分可被聚酰胺吸附，可用水和不同濃度的乙醇洗脫。
處方各組分配伍對澄清度的影響取每份洗脫液10ml，分別加入黃連、龍膽提取液，觀察對澄清度的影響，結果見表7。
表7組分配伍對澄清度的影響
-澄清度無影響。
表7表明，酸性水顯混濁是由所含草酸和其它提取液少量金屬離子如Ca2+引起；乙醇洗脫液的某些酸性酚類成分和黃連中小檗堿可發生沉淀反應，并出現明顯沉淀；由于小檗堿為季銨(堿)型生物堿，成鹽方式和pH有關，因而混合液可以隨著放置時間而逐漸形成沉淀。龍膽提取液與樣品液配伍后外觀無影響。
實施例5主原料提取物合成組合物的工藝對主成分的影響樣品制備按實施例1所述的工藝提取加水轉溶的混合物(黃連、龍膽、谷精草)30ml，均分4份，照下述方法分別處理樣品A未處理置水浴，70℃減壓濃縮至干；樣品B離心(10,000r/min)后，上清液于70℃減壓濃縮至干；樣品C減壓濃縮至1/2體積，加入2％殼聚糖溶液，置80℃水浴加熱片刻，冷至室溫，過濾，濾液減壓于70℃濃縮至干；
樣品D水轉溶后分別經聚酰胺處理后的混合液(與上述樣品藥材量相等，P1+P2+P3)，減壓濃縮至干。
樣品測定取上述樣品分別加入10ml乙醇，超聲提取5分鐘，離心(4,000r/min，5min)后，注入液相色譜儀，按前述色譜條件測定小檗堿含量，結果見表8。
表8
對澄清度的影響按上述樣品處理方法，另取4份樣品分別加水溶解，冷藏過夜，過濾，濾液裝瓶密封，100℃加熱30min，室溫放置3天，觀察澄清度，結果見表9。
表9
+++，溶液混濁，并出現沉淀++，溶液混濁，少量沉淀±，溶液澄清；實驗結果表明，殼聚糖處理樣品(C)的小檗堿含量損失大，由于小檗堿為季銨堿而殼聚糖為含有酸性基團大分子，可能形成低水溶性沉出，造成小檗堿含量明顯降低；樣品(A)、(B)由于雜質影響，使澄清度明顯下降，而樣品(D)小檗堿含量雖偏低，經處方藥材計仍可達到小檗堿的飽和溶解度(2mg/ml)，本發明方法(D)為最佳工藝方法。
實施例6滴眼劑的制備本發明組合物提取部位主要為水溶性生物堿(季銨衍生物)、環烯醚萜苷及酚類等，故采用注射用水。注射用水應符合中國藥典二部要求，其中pH應為5.0～7.0，氨不超過0.00002％，每1ml細菌內毒素含量不超過0.25EU。
制備滴眼劑添加等滲、等張調節劑、穩定劑和增黏劑等輔料。
本發明制備方法甘露醇為等滲調節劑，處方藥材主成分的性質及產生的滲透壓(127mOsm·L-1)，甘露醇具有絡合作用，可作為抗氧增效劑。由于本發明藥物組合物中主要成分小檗堿易氧化，龍膽苦苷易水解，因此甘露醇除調節滲透壓，滴眼時產生清涼感外，尚能增加制劑的穩定性。產品用冰點下降法測定滲透壓為270mOsm·L-1～335mOsm·L-1。
本發明制備方法需要根據主要成分的理化性質及其在水溶液的溶解性、穩定性、生理適應性和發揮最佳效能(療效)調節pH，黃連中生物堿(小檗堿、黃連堿、巴馬亭)pH偏酸(＜5)在水中溶解度極低(冷水中微溶或極微溶)，但隨著pH的增高(＞6.5)季銨堿的離子化程度增加，水溶性也明顯增大，而親脂性也相對比鹽酸鹽或硫酸鹽(小檗堿)強，有利于眼部吸收和療效的發揮；龍膽苦苷為裂環環烯醚萜苷，苷元具有縮醛結構，化學性質活潑，易被水解、分解或聚合，溶液pH＞7加速苷的水解，隨著pH增大可出現內酯環開裂、雙鍵移位反應，而pH7附近水解緩慢。因此，本發明制備方法在合成滴眼劑的工藝步驟中pH應控制在5.5～6.8。
本發明制備滴眼液工藝中需加增黏劑，旨在增加有效成分的穩定性和藥液的粘度，使藥物與角膜接觸時間延長，又能減低藥物的刺激性，從而有利于藥物的吸收。
實驗一、取實施例1所述的黃連、龍膽和谷精草提取步驟制備的提取物，轉溶后加入處方量的冰片，取藥液200ml，均分四份樣品，按下述方法分別處理樣品編號(1)加入2％(w/v)聚乙烯醇PVA(1750±50)，攪勻，微孔濾膜(孔徑0.8μm)濾過至清；樣品編號(2)加入2％聚維酮PVP，攪拌溶解(PVP K-30，構自上海伯奧生物有限公司)，攪拌溶解，微孔濾膜過濾至清；樣品編號(3)加入0.5％甲基纖維素(400rps，英國進口分裝)，攪拌至溶解，微孔濾膜過濾至清；樣品編號(4)不加附加劑；與上述樣品相同處理。將所有樣品封口、滅菌(100℃，30min)，室溫放置三個月觀察澄清度。
取上述樣品各10ml，水浴(70℃)減壓至干，分別加入10ml乙醇，超聲提取5分鐘，，離心(4,000r/min，5min)后，注入液相色譜儀，按前述色譜條件測定小檗堿含量如下表10。
表10
結果試驗證明，樣品編號(1)、(3)、(4)中的沉淀主要是小檗堿，由于小檗堿在水中溶解小，在滅菌、貯存過程中產生沉淀，增黏劑PVA和甲基纖維素明顯影響溶液的澄清度，而PVP(樣品編號2)可能通過絡合增加小檗堿在水溶液中的溶解度，因此，樣品編號(2)加增黏劑PVP不僅能增加藥液的粘度，尚能使產品的穩定性明顯改善。
由于本發明藥物組合物中主成分為季銨生物堿，在堿性溶液中對熱和光、氧、金屬離子存在時很不穩定，易發生氧化、分解反應，而抗氧劑特別無機硫化物(亞硫酸鹽類)、有機硫化物(半胱氨酸等)，易與滴眼劑中其他成分主要是龍膽苦苷(含雙鏈和內酯環)發生加成反應，導致產生人為產物。因此選用EDTA-Na2、亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、焦亞硫酸、硫代硫酸鈉作為穩定劑，優選EDTA2Na作為穩定劑，產品在滅菌前充氮氣，置換空氣，從而達到阻止或延緩氧化降解反應的進行。
實施例7～12取黃連、龍膽、谷精草和冰片，黃連8KG、龍膽草8KG、谷精草30～7KG、冰片0.2KG。
黃連采用如下提取方法黃連加非極性溶劑浸泡45min，回流提取，合并回流液，溶劑為原藥材的10倍體積量，回流3次，每次90分鐘。本發明實施例7～11非極性溶劑為甲醇、乙酸乙酯、乙醚，實施例12采用水回流提取。提取后藥渣和提取液可通過壓濾，除去藥液中混懸物；溶劑量選10倍生藥體積量，加熱回流90min，回流3次。
藥液減壓濃縮至浸膏狀，除盡乙醇，浸膏在30～60℃的石油醚浸泡脫脂，脫脂后加水轉溶過濾，濾液濃縮至生藥量的同倍重量，濃縮液加大致等重量的聚酰胺拌勻，加在預先以水為溶劑填裝的聚酰胺柱頂，以水洗脫至對碘化鉍鉀無明顯反應，洗脫液減壓濃縮至處方量的1/2重量，冷藏，過濾至澄清。
龍膽草的提取處方量的龍膽加非極性溶劑浸泡45min，回流提取，合并回流液，提取后藥渣壓濾，合并提取液，除去藥液中混懸物；本發明實施例7～11非極性溶劑為甲醇、乙酸乙酯、乙醚。非極性溶劑或水用量為10倍，回流時間為60min，回流2次。
藥液減壓濃縮至浸膏狀，濃縮溫度為20～60℃，非極性溶劑或水取浸膏在30～60℃石油醚浸泡脫脂，脫脂后加水轉溶過濾，濾液濃縮至生藥量的同倍重量，濃縮液加大約等重量的聚酰胺拌勻，加在預先以水為溶劑填裝的聚酰胺柱頂，以水洗脫至薄層鑒別無龍膽苦苷斑點出現，洗脫液減壓濃縮至處方量的1/2重量，冷藏，過濾至澄清。
谷精草的提取處方量的谷精草加水或甲醇或乙醇中浸泡1次，浸泡2h，煎煮60min，共3次，每次加溶劑量為20倍量，藥渣和提取液壓濾，合并提取液，除去藥液中混懸物。
藥液濃縮至谷精草原藥重量，冷藏，過濾除雜；濃縮液加等重量的聚酰胺拌勻，加在預先以水為溶劑填裝的聚酰胺柱頂，以水洗脫，收集PH4.5～5.0洗脫液，洗脫液減壓濃縮。
制備滴眼劑或者其它注射等劑型將黃連、龍膽和谷精草提取物加水轉溶混合后冷藏，經離心后取上清液，加輔料和處方量的冰片，調節藥液的PH值為5.5～6.8，過濾，濾液充氮、滅菌分裝；實施例7～17的等滲劑選自NaCl、硼酸、葡萄糖、硼砂和甘露醇；增黏劑選自甲基纖維素、聚乙烯酸、聚乙二醇、羥丙基乙基纖維素、聚維酮；穩定劑選自EDTA.2Na、亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、焦亞硫酸、硫代硫酸鈉。實驗例的結果分析見下表11表11
權利要求
1.一種制備抗病毒的藥物組合物的方法，所述的藥物組合物的主要原料為黃連、龍膽、谷精草和冰片，將主要原料的提取物作活性成分混合后，加入藥學上可接收的輔料制備而成，其特征在于所述黃連采用如下提取方法(1)處方量的黃連加非極性溶劑或水回流提取，合并回流液；(2)藥液減壓濃縮至浸膏狀；(3)取浸膏在30～60℃石油醚浸泡脫脂，脫脂后加水轉溶過濾，濾液濃縮至生藥量的同倍重量，濃縮液加等重量的聚酰胺拌勻，加在預先以水為溶劑填裝的聚酰胺柱頂，以水洗脫至對碘化鉍鉀無明顯反應，洗脫液減壓濃縮至處方量的1/2重量，冷藏，過濾至澄清。
2.如權利要求1所述制備抗病毒的藥物組合物的方法，其特征是所述步驟(1)中非極性溶劑或水用量為原藥材的10倍量，回流3次，每次90分鐘。
3.如權利要求1所述制備抗病毒的藥物組合物的方法，其特征是所述龍膽草的提取步驟如下(1)處方量的龍膽加非極性溶劑或水浸泡，回流提取，合并回流液；(2)藥液減壓濃縮至浸膏狀，濃縮溫度為20～60℃；(3)取浸膏在30～60℃石油醚浸泡脫脂，脫脂后加水轉溶過濾，濾液濃縮至生藥量的同倍重量，濃縮液加等重量的聚酰胺拌勻，加在預先以水為溶劑填裝的聚酰胺柱頂，以水洗脫至薄層鑒別無龍膽苦苷斑點出現，洗脫液減壓濃縮至處方量的1/2重量，冷藏，過濾至澄清。
4.如權利要求3所述制備抗病毒的藥物組合物的方法，其特征是所述龍膽草的提取步驟中，非極性溶劑或水用量為龍膽草的10倍量，回流次數2次，回流60分鐘。
5.如權利要求1～4之一所述制備抗病毒的藥物組合物的方法，其特征是所述非極性溶劑為95％的乙醇。
6.如權利要求1～4之一所述制備抗病毒的藥物組合物的方法，其特征是所述谷精草的提取步驟如下(1)處方量的谷精草加水或甲醇或乙醇中浸泡，煎煮；(2)藥液濃縮至谷精草原藥重量，冷藏，過濾除雜；(3)濃縮液加等重量的聚酰胺拌勻，加在預先以水為溶劑填裝的聚酰胺柱頂，以水洗脫，收集PH4.5～5.0洗脫液，洗脫液減壓濃縮。
7.如權利要求6所述制備抗病毒的藥物組合物的方法，其特征是藥物組合物制備為滴眼劑的步驟包括將黃連、龍膽和谷精草提取物加水轉溶混合后冷藏，經離心后取上清液，加等滲劑、增黏劑和穩定劑和處方量的冰片，調節藥液的PH值為5.5～6.8，過濾，濾液充氮、滅菌分裝；所述組成和含量百分比為黃連提取物相當于黃連的處方量龍膽提取物相當于龍膽的處方量谷精草提取物 相當于谷精草的處方量冰片 處方量穩定劑0.1％等滲劑2.0％增黏劑3.0％注射用水 加至1000ml。
8.如權利要求7所述制備抗病毒的藥物組合物的方法，所述等滲劑選自Nacl、硼酸、葡萄糖、硼砂和甘露醇。
9.如權利要求7所述制備抗病毒的藥物組合物的方法，其特征是所述增黏劑選自甲基纖維素、聚乙烯酸、聚乙二醇、羥丙基乙基纖維素、聚維酮。
10.如權利要求7所述制備抗病毒的藥物組合物的方法，其特征是所述穩定劑選自EDTA.2Na、亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、焦亞硫酸、硫代硫酸鈉。
全文摘要
一種制備抗病毒的藥物組合物的方法，主要原料為黃連、龍膽、谷精草和冰片，將其提取物作活性成分混合后，加入藥學上可接收的輔料制備而成，黃連的提取方法為處方量的黃連加非極性溶劑或水回流提取，合并回流液；藥液減壓濃縮至浸膏狀；取浸膏在30～60℃石油醚浸泡脫脂，脫脂后加水轉溶過濾，濾液濃縮至生藥量的同倍重量，濃縮液加等重量的聚酰胺拌勻，加在預先以水為溶劑填裝的聚酰胺柱頂，以水洗脫至對碘化鉍鉀無明顯反應，洗脫液減壓濃縮至處方量的1/2重量，冷藏過濾至澄清。本發明工藝穩定、生物利用度高，制成滴眼液無毒、無刺激性及生物相容性良好，能防止或抑制病原微生物發育生長，不添加抑菌劑的狀態下也能滿足無菌要求。
文檔編號A61P27/02GK101019967SQ20071006724
公開日2007年8月22日 申請日期2007年2月9日 優先權日2007年2月9日
發明者鐘良玉, 陳紅梅 申請人:杭州市中醫院