專利名稱：一種組織工程血管的構建方法
技術領域：
本發明涉及一種組織工程血管的構建方法，更具體地說是一種自體活組織材料體 外構建血管移植物的方法，屬于組織工程領域。
技術背景目前，心血管疾病已經成為嚴重危害人類健康的疾病之一，特別是血管閉塞性疾 病最終必須依靠外科手術的方法置換病變血管。目前常用的血管移植材料包括以不可 降解的人工合成材料制作的人工血管、以及經過不同方法處理過的同種或異種血管和 自體血管。人工血管材料的主要問題是存在血栓形成、凝血問題；同種或異種血管主 要存在排異反應、鈣化、耐久性差等問題。自體血管目前仍然是中小血管移植材料的 主要來源，但自體血管來源受限，數量有限，特別是老年患者、腎臟疾病患者、糖尿 病、高血壓患者中，可移植的無病變血管更顯稀少，尤其是在需要多支旁路或在手術 病人中，更是如此。雖然經過多年的努力，但目前仍未獲得突破性進展。近年來，組織工程學方法的提出，有望徹底的解決這些問題，其原理是應用細胞 種植的方法，將病人的活細胞在體外培育成為有活性的組織，再植入到病人體內，活 細胞分泌細胞外基質成分逐漸改造，最終實現活組織器官的再生。傳統的組織工程技術以可降解的高分子材料為支架，但高分子材料存在力學性能 差、難以塑形、降解產物在局部存在不同程度的毒性等缺點。因此，生物來源的材料 越來越受到重視。以膠原基架為代表的重組細胞外基質材料在生物相容性上具傳統材 料無法比擬的優勢，然而在力學性能、順應性等方面存在的問題極大的制約了這類材 料在組織工程中的廣泛應用。異種或異體來源的脫細胞材料在力學強度、順應性上存 在著特有的優勢，但同時存在傳染疾病、抗原殘留等問題。此外，組織鈣化已經成為 制約此類材料應用的重要原因。近年來，受體自身來源的組織材料以其獨具的優勢， 引起了人們的注意。 發明內容本發明要解決的技術問題是提供一種以自體活組織材料構建組織工程血管移植材料 的方法，在體外應用該方法可以構建適合于作為血管移植材料的組織工程血管移植物。 為實現上述目的，本發明采用以下技術方案(見圖l):一種組織工程血管的構建方法，包括如下步驟 (1 )將管狀自體活組織基架材料在體外無菌條件下連接于持續灌流的生物反應器 內，管腔外貯滿培養液；血管培養生態模擬系統分內循環和外循環，分別由兩臺多檔 可調蠕動泵驅動。反應器參照文獻設計(見圖2)(參見Mali JW, Philipp AW， Rademacher A， et al. Re-endothelialization of punctured ePTFE graft: an in vitro study under pulsed perfusion condition. Nephrol Dial Transplant, 2004， 19:61-67.)。內夕卜循環分另U充盈自行配置的內循環培養液和外循環培養液。圖中(A)內循環的蓄液瓶；(B)內循環的蠕 動泵，液流方向如箭頭所示；(C)內循環的液容；(D)反應器的灌流室；(E)外 循環的蠕動泵；(F)外循環的蓄液瓶。al、 a2分別為內循環和外循環的氣體交換進 氣道，bl、 b2分別為內循環和外循環的氣體交換排氣道，均接有孔徑小于0.2um的 針式微孔濾器，過濾除菌。(2) 將體外培養獲得的自體內皮細胞以M199懸浮，或將骨髓單個核細胞誘導生成 的自體內皮樣細胞以內皮祖細胞誘導培養液懸浮，按高密度種植法接種于管腔內表面；(3) 待內皮細胞或者內皮樣細胞黏附后接通管腔內循環和外循環，并模擬血液循 環逐漸給予適當的剪切力刺激(5~15dyn/cm2)，壓力95/55mmHg，于37°C 5%二氧 化碳培養箱內培育5 7天，獲得組織工程血管樣復合物。所述自體活組織基架材料的構建方法以微創小切口技術將適合長度的醫用硅膠 管埋植入實驗動物腹腔或皮下，做為異物模型，2~3周后，以無菌手術的方法將自體 活組織包裹形成的硅膠管莢囊完整取出。剪除封閉莢囊的兩端后，抽出硅膠管后，形 成管狀自體活組織結構，作為組織工程血管構建的基架材料。本發明首先以異物植入體內，誘導機體產生包裹反應，以構建可供組織工程應用 的血管基架材料(一般來說肌性管道及囊性器官的構建都適宜用此方法)。同時在體 外擴增培養自體血管內皮細胞或將骨髓來源的間充質細胞向內皮方向誘導，作為種子 細胞。然后在靜態或旋轉條件下，將種子細胞接種于血管基架材料的內表面。接著在 體外持續灌流情況下，給以脈動和搏動刺激，在保證基架材料存活的基礎上，促進活 細胞的成熟和分化。最終形成可供移植的血管樣移植材料，達到應用組織工程技術構 建血管移植材料的目的。我們以自體活組織為基架構建的組織工程血管移植材料移植到細胞供體的股動 脈，l個月后隨訪，無明顯阻塞及血栓形成，組織學發現內膜無明顯增生表現。本發明的優點是首次嘗試了以自體活組織作為組織工程基架材料構建組織工程4器官，在保證自體活組織材料存活的基礎上，在材料表面進行了細胞種植的研究。自 體來源的活組織基架管具有完美的細胞相容性和足夠的力學強度，且所構建的器官可 完全排除異種、異體免疫排斥反應發生的風險,克服了異源性材料引起免疫排斥及炎癥 反應等缺陷。本發明所需時間較短，遠遠低于同類技術所需時間的3 6個月的周期。下面結合具體實施方式
對本發明作進一步說明，并非對本發明的限定，依照本領 域公知的現有技術，本發明的實施方式并不限于此，因此凡依照本發明公開內容所作 出的本領域的等同替換，均屬于本發明的保護范圍。
圖1為本發明基本原理的示意圖，將種植于腹腔內獲得的自體活組織生物管連接于體外反應器，于管腔面種植內皮細胞，形成類似血管樣結構。 圖2為本發明所使用的反應器及血管生物模擬系統的示意圖。 圖3為自體活組織生物管的HE染色400倍普通光鏡照片。 圖4為經本發明構建的組織工程化血管復合物的HE染色400倍普通光學顯微鏡照片。 圖5為種植細胞后的自體活組織生物管Masson染色的200倍普通光學顯微鏡照片。 圖6為天然血管的Masson染色的200倍普通光學顯微鏡照片。 圖7為經本發明方法構建的組織工程化血管復合物的地衣紅法彈力纖維染色的200倍普通光學顯微鏡照片。圖8為天然動脈血管的彈力纖維染色的200倍普通光學顯微鏡照片。圖9為未種植細胞前的新鮮自體活組織生物管表面結構的200倍掃描電鏡照片。可見大量纖維結構及細胞外基質成分，偶見血細胞及成纖維細胞突起。圖10為旋轉高密度法接種內皮6小時后管腔內表面的200倍掃描電鏡照片。圖11為圖IO放大至IOOO倍的掃描電鏡照片。可見管腔內表面大量細胞黏附，多數細胞仍呈圓形，部分細胞伸展黏附呈梭形。圖12為靜態種植24小時后管腔內表面的200倍掃描電鏡照片。圖13為圖12放大至IOOO倍的掃描電鏡照片。可見黏附細胞貼壁生長，伸展，局部有一定的極向性，但總體極性不明顯。圖14為給予漸增的剪切力刺激后，種植72小時后管腔內表面的200倍掃描電鏡照片。圖15為圖14放大至IOOO倍的掃描電鏡照片。可見細胞生長極向性明顯，細胞長 軸普遍沿液流方向排列，可見細胞間有匯合生長趨勢。圖16為動態灌流培養達5天時，管腔內表面的200倍掃描電鏡照片。圖17為圖16放大至IOOO倍的掃描電鏡照片。可見細胞極向性明顯，細胞排列緊密，管腔內表面光滑，細胞生長匯合。圖18為天然犬股動脈血管內腔面200倍掃描電鏡照片。圖19為圖18放大至IOOO倍的掃描電鏡照片。可見細胞匯合生長，表面光滑，細 胞排列極向性明顯。圖20為本方明構建的組織工程化血管樣復合物的平滑肌特異性肌動蛋白(SM-ci-actin)免疫組化染色的400倍普通光學顯微鏡照片。圖21為天然股動脈的SM- a -actin免疫組化染色的400倍普通光學顯微鏡照片。 圖22為本方明構建的組織工程化血管樣復合物的第W因子相關抗原免疫組化染色的400倍普通光學顯微鏡照片。圖23為天然動脈的第VDI因子相關抗原免疫組化染色的400倍普通光學顯微鏡照片。 圖24為以PKH-26標記的內皮細胞種植后，血管內腔面的激光共聚焦顯微鏡200倍照片。圖25為圖24標本的激光共聚焦顯微鏡400倍照片。圖26為圖24標本的橫切面激光共聚焦顯微鏡200倍照片。圖27為圖24標本的橫切面激光共聚焦顯微鏡的400倍照片。可見熒光標記的細 胞種植并鋪展生長于管腔內表面，呈單層排列。圖28為未種植細胞的自體活組織生物管與血小板作用后的內表面的1000倍掃描 電鏡照片。未種植內皮細胞的組織表面可見明顯的血小板黏附聚集，呈團狀，難于分 辨單個血小板的形態。圖29為種植內皮細胞后的組織工程復合物與血小板作用后的內表面1000倍掃描 電鏡照片。種植內皮細胞的組織工程復合物表面幾乎無明顯血小板黏附，表面依然保 持光滑。圖30為本發明構建的組織工程化血管復合物內表面的6000倍透射電鏡照片。可見內皮細胞間有緊密連接形成，細胞表面有絨毛樣結構。圖31為本發明構建的組織工程化血管復合物管壁細胞的20，000倍透射電鏡照片。 圖32為本發明構建的組織工程化血管復合物管壁細胞的30，000倍透射電鏡照片。可見細胞膜表面可見多個致密斑、細胞內可見成束的細絲樣結構及吞飲小泡、細胞表面被覆蛋白多糖等細胞外基質。
具體實施方式
實施例1.一. 試劑和材料1. 磷酸鹽緩沖液(PBS液)市售PBS粉末(Gibco) —小包，溶于1000ml蒸 餾水中，調整pH7.2，過濾除菌后，分裝，置4'C備用。2. M199培養液市售M199粉末(Gibco) —小袋，加碳酸氫鈉1.2g， 1.5mol/L HEPES 10ml，三蒸水加至1L，調節pH至7.2，過濾除菌，按250ml分裝，置4。C貯存備用。3. DMEM培養液市售DMEM粉末(Gibco)—小袋，加碳酸氫鈉1.2g， 1.5mol/L HEPES 10ml，三蒸水加至1L，調節pH至7.2，過濾除菌，按250ml分裝，置4'C貯 存備用。4. 內皮細胞及內循環培養液含15 20。/。FBS和0.1mg/ml的內皮細胞生長補充物 (ECGS，購自中日友好醫院臨床醫學研究所)的M199培養液。5. 外循環培養液含20%胎牛血清(FBS, Gibco) 、 2ng/ml堿性成纖維細胞生 長因子(b-FGF, PeproTech) 、 50ng/ml血小板衍生生長因子-BB (PDGF-BB， PeproTech) 、 10ng/ml胰島素樣生長因子(IGF, PeproTech) 、 0.5ng/ml表皮細胞生 長因子(EGF， PeproTech)的DMEM溶液。6. 內皮祖細胞誘導培養液將購自美國Canbrex bio science valkersville公司的 EBM-2加EGM-2MV SingleQuots無菌條件下按說明書混合，分裝后置4。C保存。7. 0.05。/。胰蛋白酶-0.53mmol/L EDTA.4Na溶液:胰蛋白酶(1: 250) (Gibco) 0.5g， EDTA.4Na0.2g，加無Ca2+、 Mg2+BSS加至1L，過濾除菌，分裝小瓶，.20。C保 存。8. 醫用硅膠管選擇直徑4mm的醫用中空硅膠管，分別剪裁為長度2cm、 4cm、 6cm的小段，密封包裝后環氧乙烷消毒滅菌，室溫空氣中放置1周后備用。9. 青霉素/鏈霉素溶液(100倍濃度)青霉素1.0 106IU,鏈霉素lg，加0.9%生理 鹽水至100ml，過濾除菌，分裝小瓶，置-2(TC保存。10. 0.1%膠原酶溶液市售IV型膠原酶(Sigma) 100mg，加PBS溶液至100ml， 過濾除菌，分裝置-2(TC保存。二. 方法(一)內皮細胞體外培養無菌手術條件下，切取實驗動物頸外靜脈血管組織約10cm，以0.1%的膠原酶腔 內灌注消化后收集細胞，離心洗滌后，以1X10e個/ml細胞密度接種于預先以明膠鋪 底的培養瓶，加入20%胎牛血清、0.1mg/ml血管內皮生長補充物(ECGS) 、 200U/ml 青霉素、0.2ug/ml鏈霉素的M199培養液，37°C 5%C02培養箱內帖壁培養，取第二 到六代細胞用于實驗。實驗細胞留取樣本進行VI因子、CD31免疫組織化學染色鑒定。骨髓間充質細胞向內皮的誘導培養與鑒別試驗動物麻醉后，無菌條件下抽取骨髓lOml。以PBS 1: l稀釋后，鋪于密度為 1.073的淋巴細胞分離液表面，室溫下2000轉離心20分鐘，吸取單個核細胞層，以 PBS液稀釋后1500轉離心洗滌5 10分鐘，以EBM-2 EGM-2V培養液懸浮，計數并 調整細胞密度，按5X10S/cr^接種于預先以纖維連接蛋白(Fn)鋪底的培養瓶內，置 于37°C 5%C02飽和濕度的培養箱內培養，誘導骨髓基質干細胞定向分化為內皮細 胞。接種培養后每2~3天換液一次，相差顯微鏡下觀察細胞形態，待細胞長滿瓶底80% 時用0.05y。胰蛋白酶-0.53mmol/LEDTA.4Na (Gibco)溶液消化傳代。第二代細胞種植 于蓋玻片上，進行V111因子、CD31、 FLK-1免疫組化染色鑒定。(二) 自體活組織生物材料的獲得實驗動物麻醉后，無菌條件下，作一長l 2cm切口，將適合長度的醫用硅膠管埋 植入實驗動物腹腔內或背部皮下。2~3周后，同樣以微創的方法將腹膜或皮下組織包 裹的硅膠管莢囊完整取出。于無菌條件下適當修整后，剪除封閉莢囊的兩端后，抽出 硅膠管后，形成管狀結構。(三) 自體活組織基架管的體外培養及細胞種植 將獲得的自體活組織生物材料管以3-0絲線無菌條件下連接于體外持續灌流的血管生物反應器內，管腔外腔注滿外循環液，采用高密度種植法將體外培養獲得的自體 頸靜脈內皮細胞以內循環培養液懸浮，按5X106/1111濃度接種于試驗管腔內，于二氧 化碳溫箱內(5%C02 37°C)以手工翻轉或勻速緩慢旋轉孵育2 4小時，以使細胞充分 黏附，然后接通內循環和外循環，首先靜態培養24小時，然后模擬血液循環，調節灌 流速度，3天內逐漸由增加到3~9ml/s，剪切力剌激(5~15dyn/cm2)，壓力95/55mmHg。 于二氧化碳培養箱內繼續培育至5天，即得組織工程血管。實施例2.結果評價對實施例1涉及的新鮮自體活組織生物管及組織工程血管分別留取標本，依下法進行力學測定和生物學檢測。 一.方法(一) 力學檢測1. 斷裂拉伸強度的測定將標本裁成板材狀，在拉力機上將其拉斷，所測的最大 拉力除以實驗材料的橫截面積，即為標本的材料拉伸強度，表示自體活組織材料的抗 拉伸能力。2. 斷裂伸長率的測定將標本裁成板材狀，在拉力機上將其拉斷，記錄樣品從被 拉伸到被拉斷的長度變化，除以樣品的原始長度，所的百分比即為標本材料的斷裂伸 長率，表示材料的變形能力。3. 標本的爆破強度測定將自體活組織管標本連接于爆破壓測量表，游離端封閉， 裝置內充盈PBS液，調節加壓螺栓壓縮腔內液體，以壓力表記錄管道系統內增加的壓 力。爆破壓被定義為管型材料破裂前所達到的最高壓力，表示材料對壓力變化的耐受 能力。4. 標本的縫合強度測定實驗標本一端夾在拉力機上，另一端以6-0的尼龍縫線連接于拉力機的另一個夾具上。然后以lmm/min的速度勻速牽拉，記錄完全斷裂時的 拉力。表示材料的可縫合性。(二) 生物學檢測1. 標本的基本結構用10%的中性福爾馬林固定標本，石蠟包埋，切成4微米厚的薄片，經二甲苯脫蠟、系列酒精脫水、蘇木素-伊紅染色，觀察標本的大致細胞組成和排列分布。2. 標本的纖維結構用10%的中性福爾馬林固定標本，石蠟包埋，切成4微米 厚的薄片，經二甲苯脫蠟、系列酒精脫水、Masson染色及地衣紅法彈力纖維染色，觀 察標本的纖維排列和組成。3. 標本的表面結構標本用2.5%戊二醛和1%鋨酸雙重固定，乙醇逐級脫水，二 氧化碳臨界點干燥,真空噴金，掃描電鏡(SEM)觀察生物管內腔面的超微結構。4. 標本的免疫組化染色檢査用中性福爾馬林固定標本，石蠟包埋，切成4微 米厚的薄片，經二甲苯脫蠟、系列酒精脫水，抗原修復，按二步法依次加一抗及二抗 后，滴加顯色劑顯色，蘇木素復染，觀察特定VII因子、a-actin的表達情況。5. 內皮細胞的熒光標記示蹤用PKH26-GL預標記內皮細胞，按3X1(^M劑量標記1X10"個細胞。按前述方法將標記的內皮細胞種植于自體活組織血管基架材料的表面。所得組織管行2.5%的戊 二醛固定。將管樣結構修剪為片狀，內腔面朝下，置于熒光共聚焦顯微鏡下觀察，并 攝像。同時取部分標本，以OCT膠包埋，液氮冰凍15秒，冰凍切片機內-25'C切片， 厚度為8um，載玻片上甘油指甲油封片后，置共聚焦顯微鏡下觀察。6. 血小板黏附試驗以置入反應器經相同條件處理而未種植內皮細胞的基架管為對照，將血小板懸液 與種植內皮后的血管樣類似物靜態孵育，2小時后取出，以PBS沖洗管腔面3遍，2.5% 戊二醛固定后，行SEM觀察。7. 組織工程血管的透射電鏡觀察將2.5%戊二醛固定過夜的標本，PBS沖洗3次后，1%的四氧化鋨4'C媒染固定 30min，丙酮系列脫水，環氧樹脂包埋，半薄切片制備，甲苯胺藍染色，選擇興趣區 域，切成8納米的超薄切片，電鏡下觀察。本組試驗標本均送首都醫科大學附屬天壇 醫院電子顯微鏡室完成。三.實驗結果(一) 力學檢測結果1. 斷裂拉伸強度新鮮自體活組織管拉伸強度4.7士2.3MPa，培養后血管類似物 為4.5土1.8MPa，統計學無顯著差異。2. 斷裂伸長率新鮮自體活組織管的斷裂伸長率為34.2±8.3%，培養后血管類 似物為33.1±10.2%，統計學無明顯差異。3. 爆破強度新鮮自體活組織管的爆破強度1100土187mmHg，種植細胞后的組 織工程血管復合物為1070土115mmHg，統計學無顯著差異。4. 縫合耐受強度新鮮活組生物管的縫合耐受強度為2.5士0.3N，種植細胞后的 組織工程血管復合物為2.4士0.7N，統計學無顯著差異。(二) 生物學檢測結果1. 基本結構新鮮自體活組織生物管的普通HE染色染色顯示由大量呈同心圓狀排列的梭形細胞構成，細胞呈長梭形，內層較外層細胞稀薄，管壁內可見少量炎性細胞浸潤(見圖3)。種植后的組織工程復合物可見管腔內表面單層扁平細胞覆蓋，管壁亦 由大量同心圓狀排列的梭形細胞組成，而炎性細胞明顯減少，僅偶見(見圖4)。2. 纖維結構種植細胞后的組織工程復合物經Masson染色可見膠原纖維呈波浪 狀排列，類同心圓樣結構，其間可見平滑肌樣細胞，與天然血管結構相似(見圖5、6)。兩者相比較可以看出，兩者的細胞外基質成分均有大量的膠原纖維構成，呈同心圓樣 排列，膠原纖維成波浪狀排列，圖中染為藍色；纖維間可見的細胞結構，平滑肌細胞 染成發紫紅色；但圖6中表層細胞下可見明顯的連續的基底膜結構形成，圖中呈粉紅 色線狀，而圖5中無此結構。地衣紅法彈力纖維染色可見組織工程復合管中無明顯彈 力板樣結構(見圖7、 8)。兩者相比較可以看出，圖7中無明顯的彈力纖維板樣結構 形成，而圖8中可見明顯的彈力纖維板樣結構。3. 表面結構新鮮自體活組織生物管表面可見纖維狀結構，及大量的細胞外基質 成分，偶見血細胞成分及成纖維細胞突起(見圖9)。種植細胞后的組織工程復合物 表面由內皮細胞覆蓋，且細胞隨液流方向規律排列，且隨時間延長而漸趨匯合，表面 光滑，與天然血管類似(見圖10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19)。4. 免疫組化染色種植細胞后的組織工程血管復合物具有與天然血管類似的結構，管壁均含有大量的a-actin陽性細胞，內腔面被覆單層細胞，VIII因子染色陽性(見圖 20、 21、 22、 23)。可以看出，本發明構建的組織工程樣血管復合物與天然血管類似， 內腔面被覆的單層細胞染色陽性，呈棕黃色。5. 內皮細胞的熒光標記示蹤顯示PKH26示蹤免疫熒光陽性的細胞被覆于組織 工程血管復合物內腔面，共聚焦顯微鏡顯示內腔面被覆細胞彼此匯合，幾乎覆蓋全部 內腔面，橫切面上可見熒光標記陽性的細胞呈單層狀，局限被覆于管腔內表面(見圖 24、 25、 26、 27)。6. 血小板黏附實驗種植內皮細胞后的組織工程復合物表面幾乎無明顯血小板黏 附，而在反應器內經同樣條件處理的未種植細胞的自體活組織生物管表面，則可見明 顯的血小板黏附聚集成團，難于分辨單個血小板的形態(見圖28、 29)。7. 透射電鏡檢測種植的內皮細胞呈單層排列于管腔表面，細胞間有緊密聯結， 可見細胞表面有微絨毛樣結構(見圖30)。內皮下管壁中層細胞具有明顯的平滑肌樣 結構，如成束的細絲狀結構、吞飲小泡、細胞表面被覆的蛋白多糖等細胞外基質成分(見圖31、 32)。
權利要求
1. 一種組織工程血管的構建方法，包括如下步驟(1)將管狀自體活組織基架材料在體外無菌條件下連接于持續灌流的生物反應器內，管腔外貯滿培養液，血管培養生態模擬系統分內循環和外循環；(2)將體外培養獲得的自體內皮細胞以M199懸浮，或將骨髓單個核細胞誘導生成的自體內皮樣細胞以內皮祖細胞誘導培養液懸浮，按高密度種植法接種于管腔內表面；(3)待內皮細胞或者內皮樣細胞黏附后接通管腔內循環和外循環，并模擬血液循環，調節灌流速度，給予適當的壓力刺激、剪切力刺激，于二氧化碳培養箱內培育5～7天，獲得組織工程血管樣復合物。
2. 根據權利要求1所述的一種組織工程血管的構建方法，其特征在于所述自體 活組織基架材料的構建方法為以微創小切口技術將適合長度的醫用硅膠管埋植入實 驗動物腹腔或皮下，做為異物模型，2~3周后，以無菌手術的方法將自體活組織包裹 形成的硅膠管莢囊完整取出；剪除封閉莢囊的兩端后，抽出硅膠管后，形成管狀自體 活組織結構，作為組織工程血管構建的基架材料。
3. 根據權利要求1所述的一種組織工程血管的構建方法，其特征在于所述壓力 為95/55mmHg 。
4. 根據權利要求1所述的一種組織工程血管的構建方法，其特征在于所述剪切 力刺激為5 15dyn/cm2。
5.據權利要求1所述的一種組織工程血管的構建方法，其特征在于所述調節 灌流速度為3天內逐漸增加到3 9ml/s。
全文摘要
本發明涉及一種組織工程血管的構建方法，屬于組織工程領域。一種組織工程血管的構建方法，包括如下步驟(1)將管狀自體活組織基架材料在體外無菌條件下連接于持續灌流的生物反應器內，管腔外貯滿培養液；(2)將體外培養獲得的自體內皮細胞以M199懸浮，或將骨髓單個核細胞誘導生成的自體內皮樣細胞以內皮祖細胞誘導培養液懸浮，按高密度種植法接種于管腔內表面；(3)待內皮細胞或者內皮樣細胞黏附后接通管腔內循環和外循環，并模擬血液循環給予適當的壓力刺激、剪切力刺激，于二氧化碳培養箱內培育5～7天。本發明的優點是具有完美的細胞相容性和足夠的力學強度，克服了異源性材料引起免疫排斥及炎癥反應等缺陷，制備需時間較短。
文檔編號A61L27/00GK101259292SQ200710064210
公開日2008年9月10日 申請日期2007年3月6日 優先權日2007年3月6日
發明者俞衡錫, 吳應鋒, 崔世軍, 建 張, 東 徐, 李學鋒, 李建新, 濤 羅, 谷涌泉, 郭連瑞, 兵 陳, 陳曉松, 齊力行 申請人:首都醫科大學宣武醫院