專利名稱：：懸浮培養原生植株藥用有效成份的鐵皮石斛胚狀體工藝的制作方法懸浮培養原生植株藥用有效成份的鐵皮石斛胚狀體工藝
技術領域：
-本發明屬于生物
技術領域：
。本發明涉及一種高等植物生物技術克隆工程，特別是針對像鐵皮石tf這種在自然環境中生長十分緩慢，對環境條件要求十分苛刻，生物量十分低下，目前自然資源十分枯竭、瀕滅而名貴的中藥材。技術背景"21世紀是生物技術的世紀"。隨著城市化進程的迅速發展和人口的不斷增長，生態環境的不斷退化，使許多名貴中藥材資源枯竭和瀕滅。尤其像鐵皮石斛這類，生長緩慢、對環境要求十分苛刻、生物量又及其低下的物種更是"首當其沖"。雖然從上個世紀80年代開始，人們試圖用種子繁殖，人工栽培等手段或通過組織培養，誘導種子原莖球來擴增植株，再進行人工引種栽培等方法，擴大鐵皮石斛的生產。但是迄今成效甚微。本發明根據高等植物細胞的兩個全能性植物細胞具有分化成完整植株的全能性和植物細胞能合成原生植株藥用有效成份的全能性。根據這樣的理論基礎，針對鐵皮石斛這一具體物種，發明了一整套從鐵皮石斛原生植株成株莖段休眠芽上直接誘導出胚狀體，從源頭上保證了藥材的"原汁原味"。本發明有別于通常的組織培養中使用的脫分化和再分化手段篩選后代的做法。一般地說，凡通過脫分化過程容易引起遺傳變異，較難保證藥材的"地道"標準。利用本發明的鐵皮石斛胚狀體懸浮培養技術工藝，其生長速率達到8.49.2毫克/克天；相當于自然生長速度的1300倍以上。"固液比"達到25~35%，每10天收獲一次得千率10%以上。經胚狀體細胞核DNA與原生植株細胞核DNA對比檢測，兩者的DNA完全相同。其遺傳穩定性可靠。通過實施本發明的技術工藝，使鐵皮石斛的生物培養規模從實驗水平向工廠化生產規模轉化提供了物質保證。
發明內容本發明公開了直接從鐵皮石斛原生植株成株莖段的休眠芽上誘導出胚狀體的技術工藝。有別于通過脫分化、細胞再分化成芽簇或植株的過程。鐵皮石斛帶休眠芽莖段,經常規滅菌后，在超凈臺上切取帶節的切段，插入到1/2MS.礦物鹽類成份2.5%蔗糖和0.5%麥芽糖為炭源、5%香蕉汁、4.5克/升瓊脂粉、PH5.8、NAA、BA適量的固體培養基上。29'C土1，自然室內光照條件，經4550天后，在休眠芽上生長出淺綠色的起始胚狀體。等到起始胚狀體"球"長到黃豆粒大小時，小心地、及時地將胚狀體球剝離外植體，放在相同的上述培養基上擴增。達到足夠數量后，轉入到上述培養基去掉瓊脂粉的液體培養基中，進行懸浮培養，每個150毫升三角瓶裝液75毫升，每瓶按5%(\￥/\￥)接種率接種；每7天繼代一次；經3-4次繼代后；進入篩選程序，從培養物中不斷挑選出那些生長緊密、呈圓球狀、淺綠色、增殖速度快的胚狀體"球"，淘汰那些長成叢芽狀或芽簇狀的培養物。通過3~4個月的連續篩選，最終達到每10天收獲一次，其"固液比，，達到25~35%，多糖含量達到16%以上；"比生物生長速率"達到8.4~9.2毫克/克天；并能保持周年穩定的成熟系。本發明公開了一種通過鐵皮石斛原生植株成株莖段上的休眠芽，直接誘導出胚狀體，在人工控制條件下，促進它的無限增殖，其遺傳穩定性，經DNA檢測完全與原植株相同。按本發明的技術工藝可以生產出符合鐵皮石斛原生植株藥用有效成本的干粉，擴大市場供應量，滿足人們的需要。實施案例下面結合實施案例，對本發明作進一步的描述，但不是限制本發明的局限性。附圖1，鐵皮石斛懸浮培養胚狀體生產原生植株藥用有效成干粉技術工藝流程圖實施例l.鐵皮石斛胚芽的懸浮培養(見附圖l)1.鐵皮石斛外植體釆集、滅菌采集野外生長的鐵皮石斛植株成年莖段，一般帶有7~10節(葉)莖段。先用自來水沖洗干凈，用眼科尖頭鑷子仔細地剝去葉片和葉鞘，用手術刀切成帶34節切段、50%乙醇、浸潤35秒鐘，放入用無菌水新配的0.1%升汞溶液中，15~17分鐘；然后轉入到同樣用滅菌水新配制的飽和次氯酸鈉或飽和次氯酸鈣溶液中78分鐘；在超凈臺上，用滅菌水沖洗后，浸泡在滅菌水中約20分鐘；放到滅菌吸水紙上吸干多余的水份；用滅菌刀片切取帶節莖段，節的上下各留0.5公分，然后按生物學上的上下極插入到誘導胚狀體的固體培養基上；每個150毫升的三角瓶，裝量75毫升，每瓶插一段。2.起始胚狀體的誘導培養基經1.1大氣壓12rC、21分鐘滅菌，(成份表1/2MS.礦物鹽類成份，2.5%蔗糖和0.5%麥芽糖為炭源、5%香蕉汁、4.5克/升瓊脂粉、PH5.8、NAA、BA適量的固體培養基)接種好外植體三角瓶放在29'C±1，自然室內光照條件下，經4550天培養后，起始胚狀體在莖段休眠芽上長出。等到黃豆粒大小時，小心地、及時地將胚狀體"球"剝離的外植體，將剝離的胚狀體球，轉入到上述相同的新配的培養基上，每個三角瓶中，按等邊三角形放置3個胚狀體球，以利于形成"條件培養基"，進一步促進胚狀體球的增殖。3.胚狀體懸浮培養基及篩選程序A.懸浮培養基上述固體培養基中去除瓊脂粉即成液體培養基，同上述一樣條件滅菌；B.胚狀體懸浮培養等在上述固體培養基中長成足夠量的胚狀體后，將胚狀體按5%(W/W)接種率，接種到150毫升三角瓶，裝液量75毫升；三角瓶用鋁鉑紙封口，放到90轉/分回轉式搖床上，29'C士1，自然室內光照條件進行懸浮培養，每7天繼代一次；3-4次繼代后進入篩選培養程序。注意每次繼代時，倒掉一半老的培養基，補充一半新鮮培養基，以利于形成"條件培養基"，促進懸浮培養基胚狀體快速增長。C.符合懸浮培養胚狀體的篩選經過3-4次繼代后，進入篩選程序；仔細挑選那些結構緊密，呈球狀的、淺綠色、增殖快的胚狀體"球"，及時淘汰那些長成叢芽狀或芽簇狀的培養物。通過3-4個月的不斷挑選，使每個500毫升三角瓶、200毫升液量中的培養物，在形態上一致，色澤上相似，結構上緊密，培養液清澈的培養體系。D."比生物生長速率"，"固液比"，"DNA對比檢測"，"多糖含量檢測"，得干率檢測，達到C項中所述的培養體系后進入各項檢測。"比生物生長速率"(簡稱"生長速率")檢測-資料顯示，高等植物組織培養要達到工廠化生產，其生長速率起碼達到5.7毫克/克*天；即，培養物鮮重增長達到每克(毫升)培養，每天增加5.7毫克以上；本發明在實施過程經檢測，其生長速率達到8.4毫克/克天；為了保證鐵皮石斛多糖含量每10天收獲一次。計算公式(收獲量一接種量)+培養重量+收獲時培養天數=生長速率；固液比測定培養鮮重+(培養基重+鮮重)=25~35%得千率檢測絕對干重+收獲鮮重=10%實施例2.胚狀體無菌干粉生產(見附圖1)為了使鐵皮石斛多糖含量達到16%以上，胚狀體成品收獲周期為10天。收獲的胚狀體成品，經超凈水沖洗掉外表的培養基后，放置到達標的GMP認證的房中，在室溫2527'C，薄層晾千至鮮重含水的5%左右，放入到55'C烘箱中，烘至絕對干重(超過65'C以上，會造成鐵皮石斛胚狀體中許多生理活性成份的變性和轉失)。超級粉碎后，定量包裝，經醫用鈷室滅活菌，即成胚狀體無菌干粉。實施例3.鐵皮石斛胚芽生物活性測定按陰虛動物模型法測定鐵皮石斛的功效(徐叔云主編藥理實驗方法學，人民衛生出版社，1982年出版，第562頁).取體重為20~25克雌性正常小鼠140只，飼養適應一周后，均分為7組，各組分開詞養，并在鼠體上進行染色標記，以區分各組別。給服9天中藥后，進行45t)高溫處理30分鐘后，各組存活小鼠數量。<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>將以上5組實驗動物分別進行藥物灌胃。藥物為甲狀腺(3mg/d/只)、利血(0.02mg/d/只)、生理鹽水適量。每天一次，連續5天。待造型完成三天后，實驗組加灌石斛提取液(灌胃)，劑量為3.5和7.0克/kg/d,對照組給以等量水，連續9天。待最后一次給藥30分鐘后，將5個組的小白鼠同時置于幾個45'C的烘箱中，進行耐高溫實驗。待37分鐘后，打開烘箱，記錄各組的死亡率。按卡方檢驗法進行統計學處理.與對照組相比，鐵皮石斛組培鮮品和千品均可保護陰虛動物在高溫下死亡，其效果與野生鐵皮石斛千品相當.實施例4.鐵皮石斛胚芽的多糖測定一、實驗方法1、試劑配制(1)乙酵溶液(80%)，20ml水中加入無水乙醇80ml。(2)苯酚溶液稱取精制苯酚5.0克，加入水中溶解并稀釋至100ml,混勻，備用(溶液置4'C冰箱可保存一個月)。(3)濃硫酸備用。(4)葡萄糖標準儲備液精密稱取在105t:干燥至恒重的葡萄糖標準品1.0080g，加水溶解并定容至100ml，混勻，置4。C冰箱保存。此溶液每ml含10.080mg葡萄糖。(5)葡萄糖標準使用溶液吸取葡萄糖標準儲備液2.00ml,置于100ml容量瓶中，加水至刻度，混勻，置于4'C冰箱中保存。2、實驗方法(1)葡萄糖標準曲線制備精密吸取葡萄糖標準使用液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，(相當于葡萄糖0，0.04032，0.08064,0.12096，0.16128，0.2016mg)分別置于25ml比色管中準確補充水至2.0ml，加入苯酚溶液2.0ml，在旋轉混勻器上混勻，小心加入濃硫酸10ml，于旋轉混勻器上小心混勻，置沸水浴中煮沸15min，冷卻后用分光光度計在490mn波長處以試劑空白溶液為參比，lcm比色皿測定吸光度值。以葡萄糖質量為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪標準曲線。由標準曲線回歸曲線方程圖得相關系數。樣品測定a.樣品提取鐵皮石斛胚芽在60'C烘箱中烘干，粉碎，稱取約0.1g備用。石斛粉經95%乙醇提取后，按20倍體積水加溫9(TC，l小時。趁熱過濾，收取濾液，減壓濃縮，加4倍體積無水乙醇混勻，4000rpm，15min離心，沉淀用80%乙醇洗2遍，最終沉淀物溶于50ml水即為石斛粗多糖溶液。b.多糖測定精密取多糖溶液2.0ml置于25ml比色管中，加入苯酚溶液2.0ml，在旋轉混勻器上混勻后，小心加入濃硫酸10.0ml后混勻，置于水浴中煮沸10mim冷卻，室溫用分光光度計在490nm波長處，以試劑空白為參比，lcm比色皿測定葡萄糖標準溶液和樣品(按倍比稀釋至合適濃度)吸光度值，做葡萄糖標準曲線圖'計算樣品中c.計算方法根據樣品的OD值從標準曲線中査出相應的葡萄糖含量，乘以稀釋倍數，換箅成總多糖含量，再除以烘千樣品的干重，即為每克干重樣品中含粗多糖的含量，單位為mg/g。A她^m樣品OZ)值x稀釋倍數x樣品總體積二、鐵皮石斛多糖測定結果實驗對不同培養天數的鐵皮石斛胚芽和細胞團及其培養上清中的多糖含量進行了定量測定.結果表明所測材料中的多糖含量穩定，其中13至20天的胚芽多糖含量為136-161mg/g千重；占總量的10-16%。實施例5.鐵皮石斛胚芽與野生鐵皮石斛DNA圖譜的比較通過一種源于植物線粒體序列而區分不同植物的方法，步驟為從野生鐵皮石斛鮮品和干品及鐵皮石斛胚芽鮮品和干品植物組織中提取植物基因組DNA和線粒體DNA，從GENEBANK査找摸式植物線粒體序列，運用序列分析軟件進行序列比較,找出相對保守的序列，對這些保守序列進行網上査詢，遵循引物設計原則，運用引物設計軟件設計出59對引物；以提取的植物基因組DNA和線粒體DNA為模板，對比度所設計的引物進行聚合酶鏈式反應；運用聚丙烯酰胺凝膠電泳對聚合酶鏈式反應的結果檢測并分析。結果顯示使用模板3次和59對引物以復合PCR技術擴增線粒體基因5'及3'非編碼區序列，野生鐵皮石斛鮮品和干品及鐵皮石斛胚芽鮮品和干品樣本多態性完全相同。權利要求1.一種經體外懸浮培養獲得的鐵皮石斛胚芽，其培養過程是鐵皮石斛帶休眠芽莖段，經常規滅菌后，在超凈臺上切取帶節的切段，插入到1/2MS.礦物鹽類成份2.5％蔗糖和0.5％麥芽糖為炭源、5％香蕉汁、4.5克/升瓊脂粉、PH5.8、NAA、BA適量的固體培養基上。29℃±1，自然室內光照條件，經45～50天后，在休眠芽上生長出淺綠色的起始胚狀體。等到起始胚狀體“球”長到黃豆粒大小時，小心地、及時地將胚狀體球剝離外植體，放在相同的上述培養基上擴增。達到足夠數量后，轉入到上述培養基去掉瓊脂粉的液體培養基中，進行懸浮培養，每個150毫升三角瓶裝液75毫升，每瓶按5％(W/W)接種率接種；每7天繼代一次；經3-4次繼代后；進入篩選程序，從培養物中不斷挑選出那些生長緊密、呈圓球狀、淺綠色、增殖速度快的胚狀體“球”，淘汰那些長成叢芽狀或芽簇狀的培養物。通過3～4個月的連續篩選，最終達到每10天收獲一次，其“固液比”達到25～35％，多糖含量達到16％以上；“比生物生長速率”達到8.4～9.2毫克/克·天；并能保持周年穩定的成熟系。2.權力要求1中所述鐵皮石斛胚芽的培養體系，其"固液比"為25~35%,"比生物生長速率"達到8.4~9.2毫克/克天。3.權力要求1中所述鐵皮石斛胚芽，其多糖含量達為16%以上。4.權力要求l中所述鐵皮石斛胚芽，其DNA圖譜與野生鐵皮石斛相同。5.用權力要求l中所述鐵皮石斛胚芽制備的干品，用于中草藥的配伍。6.用權力要求1中所述鐵皮石斛胚芽制備的干粉，用于食品添加劑。7.用權力要求l中所述鐵皮石斛胚芽制備的干粉，用于飲料的制備。全文摘要采用野外生長的鐵皮石斛成株莖段休眠直接誘導胚狀體，在1/2MS礦物成份，CH1000毫克/升(1/2MS.礦物鹽類成份2.5％蔗糖和0.5％麥芽糖為炭源、5％香蕉汁、B150mg/L、B650mg/L、NAA、BA適量的固體培養基)在90轉/分回轉式搖床上，29℃±1，自然室內光照條件下，經3-4個月連續篩選，獲得8.4～9.2毫克/克·天，固液比達到25～35％，培養的胚狀體細胞核DNA與原生植株細胞核DNA對比完全相同，多糖含量達16％以上，得干率10％以上的技術工藝流程，其上述技術參數周年穩定。文檔編號A61K36/88GK101245334SQ20071006400公開日2008年8月20日申請日期2007年2月16日優先權日2007年2月16日發明者曹興華申請人:曹興華;馬興凱