專利名稱：：原花青素b2在制備防治糖尿病及血管并發癥藥物的應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種原花青素B2在制備防治糖尿病及血管并發癥藥物的應用。技術背景隨著人民生活水平的不斷提高，各種各樣的所謂"富貴病"也在不斷威脅人類健康。糖尿病便是其中的一種具有代表性的終身疾病。最近的流行病調查證實，我國的糖尿病患病率高達10%,已成為繼心腦血管疾病和癌癥之后的第三號殺手。而糖尿病的危害主要來自糖尿病血管并發癥，因此對糖尿病血管并發癥的防治研究極為迫切。糖尿病個體體內蛋白質發生非酶糖基化致使非酶糖基化代謝產物增多，是導致糖尿病血管并發癥的重要原因之一。非酶糖基化代謝產物增多，可以直接促進微血管基底膜增厚，誘導腫瘤生長因子-P(TGF-P)等多種細胞因子表達，刺激細胞外基質增生，還可以通過與非酶糖基化代謝產物受體(RAGE)結合產生一系列反應，最終導致糖尿病血管并發癥的產生["2]。自身氧化在非酶糖基化代謝產物形成的一系列級連反應中具有重要作用，氧化應激增強可以導致非酶糖基化代謝產物生成增加。自由基清除基可以顯著抑制非酶糖基化代謝產物的形成[3]，糖尿病時增強的氧化應激可以加速非酶糖基化代謝產物的形成，進而促進糖尿病血管并發癥的發展。因此抑制非酶糖基化反應，抑制非酶糖基化代謝產物生成是防治糖尿病血管并發癥的新策略。參考文獻1.BrownnleeMvlassaraH,Aminoguanidinepreventsdiabetesinducedarterialwallproteincrosslinking.Science,1986,232:1629-1728.2.SajithlalGB,ChrtthaP,ChandrnkasanG.Theroleofmetal-cat-analyzedoxidationintheformationofadvancedglycationproducts:invitrostudyoncollagen.FreeRadicBiolMed.簡，25:265-269.3.VarvarovskaJ，RacekJ,StozickykyF,etal.ParanletersofoxidativestressinchildrenwithTypeIdiabetesmellitusandtheirrelatives.JDiabetesComplications,2003,17:7-10.
發明內容本發明的目的是提供一種原花青素B2在制備防治糖尿病及血管并發癥藥物的應用。本發明的技術方案概述如下原花青素B2在制備防治糖尿病及血管并發癥藥物的應用。我們觀察到原花青素B2能夠一定程度降低大鼠的血糖濃度，同時更重要的是能夠抑制糖尿病大鼠體內非酶糖基化反應，揭示其控制糖尿病血管并發癥的益處主要來自強大的抗氧化能力和抑制非酶糖基化代謝產物的形成，同時其還具有降低糖尿病大鼠血脂的功效，對控制糖尿病血管并發癥的進展也有很好的協同作用，有助于防治代謝綜合癥。原花青素B2所具有的多方面作用使其在防治糖尿病血管并發癥方面的優勢更加明顯。原花青素高效無毒，安全性極高，因此在臨床防治糖尿病血管并發癥中具有廣闊的應用前景。具體實施方式下面結合具體實施例對本發明作進一步的說明。實施例1原花青素B2降血糖及抑制非酶糖基化的活性測試1.試驗材料動物雄性Wistar大鼠，北京動物中心提供。試劑原花青素B2(天津尖峰天然產物研究開發有限公司自制，純度為98%);鏈尿佐菌素(STZ)、氨基胍(AG)均為美國Sigma公司產品；羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)為美國Sigma公司產品，北京京科公司分裝；儀器DV650全自動生化儀，SHIMAZU1601紫外可見分光光度計，微量移液器，電子分析天平，旋渦混勻器。'2.試驗方法(1)糖尿病動物模型制備180-220g雄性Wistar大鼠90只，適應性喂養三天，隨機選12只大鼠作為正常對照組。余78只大鼠空腹12h后左腹腔注射STZ60mg/kg，注射后均給予正常飲食，12h后測大鼠空腹尾靜脈血糖，血糖〉16.7mmol/L為糖尿病造模成功。取造模成功者60只納入試驗，余棄去。(2)動物分組及喂養將糖尿病大鼠隨機分為5組，空白對照組、AG治療組、原花青素B2低、中和高劑量組，每組12只。空白對照組用自來水灌胃，AG治療組用150mg/kg.d的AG灌胃，原花青素B2低、中和高劑量組分別用50、100、150mg/(kg.d)的原花青素B2進行灌胃，每日下午4時灌胃1次，各組均給予標準飼料常規喂養，自由進食及飲水，不使用胰島素。在喂養過程中，各組大鼠均有正常死亡，試驗開始時各組具有12只大鼠，試驗結束時，各組均有10只大鼠。(3)標本取材喂養12周后，大鼠空腹6h，稱體重，2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，挖眼球取血5ml備用。另剖腹取出大鼠雙腎，雙腎去除包膜稱重。取部分腎臟置入液氮中冷凍。(4)腎皮質中體內非酶糖基化終產物(AGEs)的檢測用熒光法測AGEs。取腎皮質0.5g，剪成小塊，加生理鹽水lml磨成勻槳，2500r/min離心10min，棄上清，在沉淀中加入氯仿-甲醇(2:1)5ml去脂，4'C振搖過夜。4000r/min離心15min，棄上清，留沉淀，用2ml甲醇及0.5ml蒸餾水沖洗沉淀。3000r/min離心7min，重復沖洗3次。新鮮配置O.lmol/LHEPES緩沖液用總量為225ml的蒸餾水溶解NaCl9.36g，KCl0.433g，Na2HPO4.2H2O0.158g，葡萄糖1.17g，HEPES5.85g，用lmol/LNaOH調節pH值至7.05，再用蒸餾水定容至250ml。將沉淀顆粒懸浮在含有2ml的HEPES緩沖液的試管中，每試管加入280uIV型膠原酶，并作空白膠原酶對照管，37。C恒溫震蕩24h后，3500r/min離心15min，上清液即為被膠原酶消化的腎皮質膠原。用熒光光度計在激發波長370nm、發射波長440nm處測定熒光強度，其數值用空白膠原酶校正。然后用氯胺T法測定消化液中的羥脯氨酸含量。AGEs含量以每毫克羥脯氨酸(Hyp)所含熒光強度為一個單位(AU/mgHyp)表示。(5)血糖的檢測取上述大鼠自凝血2ml，利用全自動生化儀測定血糖。3.試驗結果(1)各組實驗大鼠形態、腎重、體重及腎重/體重的比較所有成模糖尿病大鼠均出現多飲、多食、多尿的表現，由于消瘦及多食逐漸呈小頭大腹的形態，與正常對照組相比，毛色暗淡無光澤，尾靜脈采血后傷口不易愈合。糖尿病大鼠12周時體重較正常對照組顯著降低，腎重/體重比值明顯升高；AG治療組和B2各劑量組的腎重/體重比值比對照組低(P<0.01)，結果見表2。表2各組大鼠體重、腎重、腎重/體重比較(x±s)組別鼠數(只)腎重(g)體重(g)'腎重/體重(xl(T2)正常對照組102.79±0.87399.4±71.60.69±0.12空白對照組103.48±0.52302.1±28.51.15土0.83"AG治療組102.35±0.76317.5±54.80.74±0.39**原花青素B2102.98±0.33331.7±43.60.89±0.46*低劑量組原花青素B2103.11±0.82336.9±67.30.92±0.22中劑量組原花青素B2102.87±0.45333.2±27.30.86±0.34高劑量組注方差分析與t檢驗，與正常對照組比較，*P<0.05，**P<0.01,與空白對照組比較,均為P<0.01。(2)血清血糖及腎皮質AGEs:試驗結束時，各試驗組血糖值僅B2高劑量組與空白對照組存在顯著性差異。同時AG治療組、原花青素B2各劑量組與正常對照組、空白對照組相比，大鼠腎皮質AGEs均有非常顯著性差異(**P<0.01)，AG治療組AGEs低于原花青素B2低劑量組(AP<0.05)，原花青素B2高劑量組低于原花青素B2低劑量組(#P<0.01)，原花青素B2中、高劑量組之間以及與AG治療組相比較無顯著性。(見表3)表3各組大鼠的血糖及腎皮質AGEs測定結果組別鼠數(只)血糖(mmol/L)AGEs(AU/mgHyp)正常對照組105.68±0864.95±1.87空白對照組1031.28±6.8518.13士4.72"AG治療組1025.7±5.3110.91±3.09**原花青素B2低劑量組1021.87±4.7216.21i3.11**A原花青素B2中劑量組1018.84±4.3113.46±2.31**原花青素B2高劑量組1012.39土1.79"11.27±2.15***結果顯示B2高劑量組具有一定的降血糖功效，同時高中低劑量組均能抑制腎皮質AGEs的形成，從而抑制非酶糖基化，防治糖尿病血光綜合癥的發生。實施例2(1)提取500g葡萄籽中加入2000g的水常壓95"C溫浸提取5次，提取時間分別為5、4、3、2、l小時，過濾，濾網的目數為120，提取液合并靜置至溫度低于50度，棄沉淀，得上清液；(2)大孔樹脂吸附分離將(1)中提取液經HP20型大孔樹脂吸附，用水、體積百分比濃度為10%、30%、50%、70%、95%的乙醇水溶液梯度洗脫，每250ml作為一個接收體積，通過薄層層析方法并結合分析型HPLC檢測，收集富含原花青素B2的組分，將其合并，在溫度560。C,真空度為0.060.08MPa減壓濃縮，糖度為40，得原花青素B2的富集物；(3)聚酰胺樹脂分離:大孔樹脂吸附分離后得到的原花青素B2'的富集物分散至水中(1:4)進行聚酰胺樹脂分離，用水、體積百分比濃度為20%、50%、70%、95%的乙醇水溶液，通過薄層層析等方法并結合分析型HPLC檢測，收集富含原花青素B2的組分，將洗脫液在溫度^6(TC，真空度為0.060.08MPa減壓濃縮，糖度為10，得原花青素B2的富集物。原花青素B2的含量為37.4%。(4)ODS中低壓柱層析分離將通過聚酰胺分離后富含原花青素B2的組分進行ODS中低壓柱層析，用水、體積百分比為10%、20%、30%、40%、50%的甲醇水溶液梯度洗脫，每50ml作為一個接收體積，通過薄層層析等方法并結合分析型HPLC檢測，以原花青素B2純品作為對照品，收集富含原花青素B2的組分，并將其在溫度56(TC，真空度為0.060.08MPa減壓濃縮，糖度為10,用實施例1的方法測定原花青素B2的含量為75.3%。(5)SephadexLH-20進行純化將(4)中得到的含有原花青素B2的組分進行SephadexLH-20柱層析純化，用體積百分比30%的甲醇進行洗脫，每10ml作為一個接收體積，通過薄層層析等方法并結合分析型HPLC檢測，以原花青素B2純品作為對照品，收集富含原花青素B2的組分，將洗脫液在溫度S6(TC，真空度為0.06-0.08MPa減壓濃縮，得到糖度為20的組分，冷凍干燥得到原花青素B2(260mg)。利用ESI-MS、^-NMR和UC-NMR等光譜手段并于文獻數據進行對照，鑒定了根據上述方法分離得到的原花青素B的結構。在此基礎上利用標準品(美國CHROMDEX公司購買)進行標定，測定原花青素素B2含量為98%。原花青素B2淡黃色粉末，聚酰胺薄膜以正丁醇-醋酸-水(4:1:3)展開，Rf為0.3，5%三氯化鐵乙醇溶液顯單一藍色斑點。陰離子ESI-MS中給出了準分子離子峰[M-H]'577和[M-H+C1]—612，其^-NMR(300MHz，inDMSO)中信號交疊較嚴重，其"C-NMR(75MHz，inDMSO)中信號清晰，與文獻相對照進行了全歸屬，鑒定為原花青素B2，結果見下表。表l本發明中化合物的。C-NMR數據<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>本實施例中的原料還可以選松科松屬植物的根、樹皮、葉；或薔薇科植物的根、莖、葉、果實、種子；或葡萄科葡萄屬植物的根、莖、果實、種子；或豆科植物的莖或種皮為原料。權利要求1.原花青素B2在制備防治糖尿病及血管并發癥藥物的應用。全文摘要本發明公開了一種原花青素B2在制備防治糖尿病及血管并發癥藥物的應用，實驗證明原花青素B2能夠一定程度降低大鼠的血糖濃度，同時更重要的是能夠抑制糖尿病大鼠體內非酶糖基化反應，揭示其控制糖尿病血管并發癥的益處主要來自強大的抗氧化能力和抑制非酶糖基化代謝產物的形成，同時其還具有降低糖尿病大鼠血脂的功效，對控制糖尿病血管并發癥的進展也有很好的協同作用，有助于防治代謝綜合癥，原花青素B2所具有的多方面作用使其在防治糖尿病血管并發癥方面的優勢更加明顯，原花青素高效無毒，安全性極高，因此在臨床防治糖尿病血管并發癥中具有廣闊的應用前景。文檔編號A61P3/00GK101125139SQ20071006121公開日2008年2月20日申請日期2007年9月28日優先權日2007年9月28日發明者劉岱琳,於洪建申請人:天津市尖峰天然產物研究開發有限公司