專利名稱：：一種具有抗肺癌作用的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于中藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是涉及一種具有抗肺癌作用且由重樓皂苷提取物和黃芪多糖組成的藥物組合物。
背景技術(shù)：
：中藥重樓為百合科重樓屬CPan》)植物滇重樓CPaW^jrofy//^〃aSmithvar.ya朋a"era&)及七口十一枝花(_Pan\yjw/j^/y^/aSmithvar.c/n'"e"w^(Franch.)Hara)的根莖，具有清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚之功效，用于治療臃腫、咽喉腫痛、毒蛇咬傷、跌打傷痛、涼風(fēng)抽搐等癥?，F(xiàn)代藥理研究表明，該藥具有止血、祛痰和抑菌、鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜、抗早孕殺滅精子及抗細(xì)胞毒等作用，臨床上應(yīng)用于治療功能性子宮出血、神經(jīng)性皮炎和外科炎癥以及腫瘤等病癥，并且都有顯著的療效。民間早已使用中藥重樓用于治療癌癥，如益肺抗瘤飲(重樓、黃芪、北沙參、天冬、女貞子、石上柏等的水煎劑，主治肺癌)、重樓湯(重樓、白花蛇舌草、蒲公英、敗醬草、半枝蓮等的水煎劑，主治肺癌)、止痛抗癌丸(重樓、三七、玄參、蘆根、黃藥子、川烏、冰片等研細(xì)末，過(guò)篩，用大蒜汁將之調(diào)成糊狀，搓丸制成，治療各種癌痛)、蓮花片(重樓、半枝蓮、三七、莪術(shù)、人工牛黃、山慈菇等研細(xì)末，制片劑，治療原發(fā)性肝癌)等藥物都是以重樓作為主要成分而制成。研究表明重樓皂苷是其主要活性成分。但上述這些藥物都是由重樓原料直接制備而成，而不是采用從重樓提取出的重樓皂苷作為有效成分，因而活性低，治療效果不明顯且針對(duì)性不強(qiáng)。黃芪^Astragfl/mw6ra朋ce船(Fisch.)Bge.var(Bge.)Hsiao是祖國(guó)醫(yī)學(xué)中最常用的補(bǔ)益藥之一，有"扶正固本，補(bǔ)中益氣"之功效，常用作腫瘤治療的輔助用藥。黃芪多糖(astragaluspolyaaccharidcs,APS)為其主要有效成分，研究表明黃芪多糖對(duì)機(jī)體的免疫功能具有廣泛的影響，能夠通過(guò)增強(qiáng)宿主免疫反應(yīng)發(fā)揮抗腫瘤作用。但到目前為止重樓和黃芪都是單獨(dú)使用，因此尚未發(fā)現(xiàn)具有抗肺癌作用且由重樓皂苷提取物和黃芪多糖組成的藥物組合物見(jiàn)諸報(bào)導(dǎo)。
發(fā)明內(nèi)容為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種活性高且作用明確的具有抗肺癌作用的藥物組合物。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供的具有抗肺癌作用的藥物組合物由重樓皂苷提取物和黃芪多糖以3:1的重量比混合而成，其中重樓皂苷提取物的提取方法包括按順序進(jìn)行的下列步驟1)將云南產(chǎn)滇重樓的粗粉過(guò)5目篩后分別用4倍體積比的70%85%乙醇浸泡1小時(shí)，然后在85"C的溫度下加熱回流提取3次，每次2小時(shí)，合并提取液并濃縮而得到浸膏；2)將上述浸膏加入到50100倍體積比的0%20%乙醇中并分散均勻，離心，沉淀后再溶解，再離心，重復(fù)2次，合并上清液；3)將上述上清液經(jīng)大孔吸附樹(shù)脂層析柱，所用干樹(shù)脂量按照與浸膏重量比例為4:110:1計(jì)算，上柱流速為13BV/h，洗脫液棄去；用60%80%乙醇洗脫，流速為25BV/h，收集乙醇洗脫液，減壓濃縮真空干燥后即可得到重樓皂苷提取物；所述的黃芪多糖的提取方法包括按順序進(jìn)行的下列步驟1)將黃芪干燥粉碎后加入IO倍水，于8(TC的溫度下提取3次，每次2小時(shí)，提取液過(guò)濾，合并濾液并濃縮至原體積的1/51/6;2)在上述所得濃縮濾液中加入95%的乙醇至醇度達(dá)80%，放置過(guò)夜，將沉淀加水溶解，過(guò)濾，濾液經(jīng)Sevag法除蛋白7次，然后用氨水調(diào)節(jié)pH至8，加入占總液體量3%的30%過(guò)氧化氫后在37'C的水浴中放置12h，過(guò)濾，將濾液置于透析袋中流水透析12h，液體濃縮后再醇沉，放置過(guò)夜，將沉淀用無(wú)水乙醇和丙酮洗滌，干燥后即可得到黃芪多糖。所述的重樓皂苷提取物的收率為9%10%，總皂苷含量為60.6%63.2%，其中重樓皂苷I和重樓皂苷II的量合計(jì)為2%2.5%。所述的黃芪多糖的收率為8%11.3%，多糖含量為81.3%83.7%。本發(fā)明提供的具有抗肺癌作用的藥物組合物是將云南產(chǎn)滇重樓經(jīng)乙醇提取，然后經(jīng)大孔吸附樹(shù)脂乙醇梯度洗脫而得到重樓皂苷提取物，將黃芪經(jīng)水提醇沉除蛋白后得到黃芪多糖，最后將兩種提取物以3:l的重量比混合而制成。經(jīng)體外MTT法活性試驗(yàn)證明，此藥物混合物可顯著抑制LA795肺腺癌細(xì)胞等多種肺癌細(xì)胞株的生長(zhǎng)，ICso可達(dá)26.73^ig/ml;對(duì)荷瘤小鼠試驗(yàn)顯示，抑瘤率可達(dá)55.63%，可明顯抑制荷瘤小鼠皮下移植腫瘤的肺轉(zhuǎn)移和引起腫瘤細(xì)胞的凋亡，并可提高荷瘤小鼠脾指數(shù)與胸腺指數(shù)，且無(wú)明顯毒副作用。另外，與原藥材相比，該藥物組合物活性高且作用明確，并可制備成各種不同的劑型。具體實(shí)施方式1、將云南產(chǎn)滇重樓500g粗粉過(guò)5目篩后分別用4倍體積比的70%和85%乙醇浸泡1小時(shí)，然后在85'C的溫度下加熱回流提取3次，每次2小時(shí)，合并提取液并濃縮而得到浸膏;將上述浸膏加入到100倍體積比的20%乙醇中并分散均勻，離心，沉淀后再溶解，再離心，重復(fù)2次，合并上清液;將上述上清液經(jīng)大孔吸附樹(shù)脂層析柱，所用干樹(shù)脂量按照與浸膏重量比例為5:1計(jì)算，上柱流速為l3BV/h，洗脫液棄去；用60%80%乙醇洗脫，流速為25BV/h，收集乙醇洗脫液，減壓濃縮真空干燥后即可得到重樓皂苷提取物47.1g。2、將黃芪300g干燥粉碎后加入10倍水，于8(TC的溫度下提取3次，每次2小時(shí)，過(guò)濾，合并濾液并濃縮至約500ml;在上述濾液中加入95%的乙醇至醇度達(dá)80%，放置過(guò)夜，將沉淀加水溶解，過(guò)濾，濾液經(jīng)Sevag法除蛋白7次，然后用氨水調(diào)節(jié)pH至8，加入占總液體量3%的30%過(guò)氧化氫后在37。C的水浴中放置12h，過(guò)濾，將濾液置于透析袋中流水透析12h，液體濃縮后再醇沉，放置過(guò)夜，將沉淀用無(wú)水乙醇和丙酮洗滌，干燥后即可得到黃芪多糖25.6g。3、將上述重樓皂苷提取物和黃芪多糖以3:1的重量比混合即可制成本發(fā)明提供的藥物組合物。將上述藥物組合物進(jìn)行抗腫瘤活性試驗(yàn)，其方法和結(jié)果如下一、抗腫瘤活性試驗(yàn)方法1體外抗腫瘤活性試驗(yàn)1.l細(xì)胞株及培養(yǎng)小鼠肺腺癌LA795細(xì)胞株，培養(yǎng)于含10%滅活胎牛血清，100U/mL青霉素，100ug/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，于37"C，5%<:02培養(yǎng)箱及飽和濕度條件下培養(yǎng)，3—4天傳代一次。人肺腺癌A549細(xì)胞株，培養(yǎng)于含10%滅活胎牛血清，100U/mL青霉素，100ug/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，于37。C，5%C02培養(yǎng)箱及飽和濕度條件下培養(yǎng)，3—4天傳代一次。1.2藥物抗腫瘤活性測(cè)定MTT法將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用胰酶消化后配制成濃度為3xlO"個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，接種于96孔酶標(biāo)板，每孔加200faL。24h后換不含血清培養(yǎng)液使細(xì)胞同步化生長(zhǎng)，每孔200pL。第三天加含不同濃度藥物及相應(yīng)溶劑對(duì)照的新鮮培養(yǎng)液，每孔加200pL，受試藥設(shè)8個(gè)劑量組，每組設(shè)8個(gè)平行孔，于37^C培養(yǎng)24h后，每孔加無(wú)血清無(wú)酚紅培養(yǎng)液新鮮配制的0.5mg/mLMTT100pL，繼續(xù)培養(yǎng)4h，然后，每孔加100pLDMSO溶解MTT甲簪顆粒，用微型振蕩器振蕩混勻后，于酶標(biāo)儀上測(cè)定光密度值(OD)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，取平均值。以溶劑對(duì)照處理腫瘤細(xì)胞為對(duì)照組，由OD值計(jì)算抑制率，公式為細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=(對(duì)照組OD值一實(shí)驗(yàn)組OD值)/對(duì)照組ODX100%，并由此求得ICso(半數(shù)抑制率)，ICscr細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率為50%的藥物濃度。2體內(nèi)抗腫瘤活性試驗(yàn)2.1動(dòng)物造模取接種LA795肺腺癌細(xì)胞后第6—8天腫瘤生長(zhǎng)良好的T739荷瘤鼠，拉斷頸椎處死小鼠，在無(wú)菌條件下剝離腫瘤，選擇新鮮無(wú)壞死的瘤組織剪碎置玻璃研磨器中，加適量生理鹽水輕輕研磨制備成瘤細(xì)胞懸液，細(xì)胞篩過(guò)濾后加生理鹽水稀釋、計(jì)數(shù)，調(diào)配成細(xì)胞濃度為1000萬(wàn)/毫升的細(xì)胞懸液，0.2ml/每只，2"06在冰浴條件下接種于健康小鼠右前肢腋窩皮下。2.2動(dòng)物分組及給藥接種當(dāng)天將造模T739小鼠隨機(jī)分為8組，開(kāi)始給藥，每日l(shuí)次(1)模型組，灌服生理鹽水，每只0.2ml;(2)化療組，按20mg/kg'bw腹腔注射環(huán)磷酰胺；(3)重樓皂苷高劑量組按400mg/kg*bw灌服；(4)重樓皂苷低劑量組按200mg/kg'bw灌服；(5)黃芪多糖高劑量組按200mg/kg*bw灌服；(6)黃芪多糖低劑量組按100mg/kg*bw灌服；(7)藥物組合物高劑量組按400mg/kg'bw灌服;(8)藥物組合物低劑量組按200mg/kg'bw灌服。給藥兩周，于給藥后第15天將小鼠處死，解剖取其瘤組織、肝、脾、腎、心、腦、肺、胸腺、胃、回腸、結(jié)腸。剝?nèi)×鼋M織，稱質(zhì)量，測(cè)定抑瘤率抑瘤率(％)=(1-給藥組平均瘤質(zhì)量/對(duì)照組平均瘤質(zhì)量)X100%。將摘取的胸腺和脾臟稱質(zhì)量，以胸腺和脾臟質(zhì)量(mg)與體質(zhì)量(g)之比作為胸腺和脾指數(shù)。將取下的組織保存于10%中性福爾馬林中，并做石蠟切片，進(jìn)行常規(guī)HE染色，其中瘤組織亦做TUNEL染色，觀察細(xì)胞凋亡。二、抗腫瘤活性試驗(yàn)結(jié)果表1重樓皂苷提取物和黃芪多糖藥物組合物體外抗腫瘤活性試驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表2重樓皂苷提取物和黃芪多糖藥物組合物對(duì)荷瘤小鼠抑瘤率試驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表3重樓皂苷提取物和黃芪多糖藥物組合物對(duì)荷瘤小鼠免疫器官重量指數(shù)比較組別劑量(mg/kg'bw)脾臟指數(shù)(mg/g)胸腺指數(shù)(mg/g)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表4各組織HE染色及瘤組織TUNEL染色結(jié)果組別主耍組織HE染色結(jié)果瘤組織HE染色及TUNEL結(jié)果豐莫型纟且肝組織、肺組織內(nèi)多散在瘤栓與轉(zhuǎn)移灶。瘤組織內(nèi)中央有大片壞死，壞死周心、腦、肝、腎、胃、回腸、結(jié)腸結(jié)構(gòu)正常。圍有少量細(xì)胞凋亡。4t療會(huì)且肺組織內(nèi)有較多瘤栓與轉(zhuǎn)移灶。肝組織極少瘤組織中有分布均勻的廣泛小灶性瘤栓與轉(zhuǎn)移灶。心、腦、肝、腎、胃、回腸、壞死，壞死灶周圍細(xì)胞凋亡明顯，結(jié)腸結(jié)構(gòu)正常。凋亡細(xì)胞數(shù)量多。重樓皂苷高劑量組肝組織、肺組織內(nèi)瘤栓和轉(zhuǎn)移灶皆很少，瘤組織內(nèi)有小灶性壞死，壞死小灶瘤栓中瘤細(xì)胞多有變性并伴有壞死。心、周圍多細(xì)胞變性。整個(gè)瘤組織細(xì)胞腦、肝、腎、胃、冋腸、結(jié)腸結(jié)構(gòu)正常。凋亡數(shù)量多。重樓皂苷低劑量組基本同重樓皂苷高劑量組。黃芪多糖髙劑量組肺組織、肝組織內(nèi)有較多瘤栓與轉(zhuǎn)移灶。瘤組織中凋亡細(xì)胞數(shù)量少。心、腦、肝、腎、胃、回腸、結(jié)腸結(jié)構(gòu)正常。黃芪多糖低劑量組基本同黃芪多糖高劑量組。藥物組合物高劑量組肝組織、肺組織內(nèi)很難發(fā)現(xiàn)瘤栓和轉(zhuǎn)移灶，瘤組織內(nèi)有小灶性壞死，壞死小灶心、腦、肝、腎、胃、回腸、結(jié)腸結(jié)構(gòu)正常。整個(gè)瘤組織細(xì)胞凋亡數(shù)量多。藥物組合物低劑量組基本問(wèn)藥物組合物a劑量組。三、結(jié)論經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明提供具有抗肺癌作用的藥物組合物具有較高的抗腫瘤活性，對(duì)LA795肺腺癌細(xì)胞的ICso為26.73嗎/mL，對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞的IC50為28.99pg/mL，對(duì)T739荷瘤小鼠的抑瘤率可達(dá)到55.63%，可明顯抑制荷瘤小鼠皮下移植腫瘤的肺轉(zhuǎn)移和引起腫瘤細(xì)胞的凋亡，并可提高荷瘤小鼠脾指數(shù)與胸腺指數(shù)。組織病理學(xué)鑒定表明，對(duì)心、腦、肺、肝、腎、胃、回腸、結(jié)腸無(wú)明顯毒性。權(quán)利要求1、一種具有抗肺癌作用的藥物組合物，其特征在于所述的具有抗肺癌作用的藥物組合物由重樓皂苷提取物和黃芪多糖以3∶1的重量比混合而成，其中重樓皂苷提取物的提取方法包括按順序進(jìn)行的下列步驟1)將云南產(chǎn)滇重樓的粗粉過(guò)5目篩后分別用4倍體積比的70％～85％乙醇浸泡1小時(shí)，然后在85℃的溫度下加熱回流提取3次，每次2小時(shí)，合并提取液并濃縮而得到浸膏；2)將上述浸膏加入到50～100倍體積比的0％～20％乙醇中并分散均勻，離心，沉淀后再溶解，再離心，重復(fù)2次，合并上清液；3)將上述上清液經(jīng)大孔吸附樹(shù)脂層析柱，所用干樹(shù)脂量按照與浸膏重量比例為4∶1～10∶1計(jì)算，上柱流速為1～3BV/h，洗脫液棄去；用60％～80％乙醇洗脫，流速為2～5BV/h，收集乙醇洗脫液，減壓濃縮真空干燥后即可得到重樓皂苷提取物；所述的黃芪多糖的提取方法包括按順序進(jìn)行的下列步驟1)將黃芪干燥粉碎后加入10倍水，于80℃的溫度下提取3次，每次2小時(shí)，提取液過(guò)濾，合并濾液并濃縮至原體積的1/5～1/6；2)在上述所得濃縮濾液中加入95％的乙醇至醇度達(dá)80％，放置過(guò)夜，將沉淀加水溶解，過(guò)濾，濾液經(jīng)Sevag法除蛋白7次，然后用氨水調(diào)節(jié)pH至8，加入占總液體量3％的30％過(guò)氧化氫后在37℃的水浴中放置12h，過(guò)濾，將濾液置于透析袋中流水透析12h，液體濃縮后再醇沉，放置過(guò)夜，將沉淀用無(wú)水乙醇和丙酮洗滌，干燥后即可得到黃芪多糖。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有抗肺癌作用的藥物組合物，其特征在于所述的重樓皂苷提取物的收率為9%10%，總皂苷含量為60.6%63.2%，其中重樓皂苷I和重樓皂苷II的量合計(jì)為2%2.5%。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有抗肺癌作用的藥物組合物，其特征在于所述的黃芪多糖的收率為8%11.3%，多糖含量為81.3%83.7%。全文摘要一種具有抗肺癌作用的藥物組合物。其由重樓皂苷提取物和黃芪多糖以3∶1的重量比混合而成。本發(fā)明的藥物組合物是將重樓經(jīng)乙醇提取，然后經(jīng)大孔吸附樹(shù)脂乙醇梯度洗脫而得到重樓皂苷提取物，將黃芪經(jīng)水提醇沉除蛋白后得到黃芪多糖，最后將兩種提取物混合而制成。經(jīng)體外MTT法活性試驗(yàn)證明，此藥物混合物可顯著抑制LA795肺腺癌細(xì)胞等多種肺癌細(xì)胞株的生長(zhǎng)，IC<sub>50</sub>可達(dá)26.73μg/ml；對(duì)荷瘤小鼠試驗(yàn)顯示，抑瘤率可達(dá)55.63％，可明顯抑制荷瘤小鼠皮下移植腫瘤的肺轉(zhuǎn)移和引起腫瘤細(xì)胞的凋亡，并可提高荷瘤小鼠脾指數(shù)與胸腺指數(shù)，且無(wú)明顯毒副作用。另外，與原藥材相比，該藥物組合物活性高且作用明確，并可制備成各種不同劑型。文檔編號(hào)A61K36/88GK101152408SQ200710059758公開(kāi)日2008年4月2日申請(qǐng)日期2007年9月24日優(yōu)先權(quán)日2007年9月24日發(fā)明者滿淑麗,顏璐璐,高文遠(yuǎn)申請(qǐng)人:天津大學(xué)