專利名稱：一種含羥基磷灰石納米粒的殼聚糖/聚乙烯醇凝膠及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種含羥基磷灰石納米粒的殼聚糖/聚乙烯醇凝膠及其制備方法 和用途，屬于生物醫用復合材料領域。
技術背景水凝膠由于具有良好的生物相容性、溶脹性及載藥不失活等特性在藥物釋放 和組織工程中得了廣泛的應用。依據連接方式的不同，水凝膠可分為化學凝膠和 物理凝膠。化學凝膠是在化學交聯劑或引發劑的作用下，通過化學反應形成共價 鍵連接而成，當其成形后殘存的化學交聯劑或引發劑具有一定的毒性。物理凝膠 則是通過非共價鍵相互作用，避免了化學溶劑的使用，因而備受青睞。近年來原位形成凝膠體系由于可以應用于藥物緩釋，細胞培養和組織工程等 生物用途，已經受到了廣泛關注。原位形成凝膠體系在注射前保持溶液狀態，注 射后可在人體溫度下形成凝膠。溶劑、紫外輻射、離子交聯劑、pH和溫度等因 素都能夠導致原位凝膠的形成。因為以上形成方式不需要有機溶劑，共聚劑和引 發劑等化學試劑，所以可降低水凝膠的生物毒性。其中，通過溫度改變實行溶液 一凝膠轉變可原位凝固的溫敏型材料，也是可注射植入材料的研究熱點。殼聚糖具有很好的生物相容性和生物可降解性，大分子鏈上含有氨基和羥基, 是一種天然陽離子多糖,具有獨特的pH值和溫度雙重響應,是一種用途非常廣的 生物材料。殼聚糖與聚乙烯醇可形成可注射型溫度敏感凝膠，可用于藥物緩釋和 組織工程，但不足之處是凝膠強度較弱、有藥物突釋現象和藥物緩釋時間較長。 發明內容為克服現有技術的不足，本發明提供了一種含羥基磷灰石納米粒的殼聚糖/聚 乙烯醇凝膠及其制備方法和用途，本發明的制備條件簡便溫和，所制備的凝膠低 溫下能保持液態，人體溫度下則可形成凝膠，該生物復合凝膠的機械強度和生物 活性較殼聚糖/聚乙烯醇高。且制備方法簡單有效、工藝安全、符合環保要求， 可避免有機化學試劑及其它有害的物質，適合于藥物緩釋、組織工程和細胞培養 等領域。本發明提供的技術方案是一種含羥基磷灰石納米粒的殼聚糖/聚乙烯醇復合
凝膠，凝膠中包括羥基磷灰石納米粒、殼聚糖、聚乙烯醇，其中殼聚糖與聚乙烯 醇質量比在1:20 8:1之間，羥基磷灰石納米粒與殼聚糖的質量比在0. 5: 1 2:1 之間。本發明還提供了這種復合凝膠的兩種制備方法，其中一種制備方法是直接添 加法，具體步驟為(1) 首先制備濃度為0. 5 4wt。/。的殼聚糖酸溶液和濃度為0. 5 10wtM聚乙 烯醇溶液待用；(2) 將羥基磷灰石納米粒分散于蒸餾水，然后按羥基磷灰石納米粒與殼聚 糖的質量比為0.5:1 2:1的比例將分散于水中的羥基磷灰石納米粒 添加于殼聚糖酸溶液中，再將含有羥基磷灰石納米粒的殼聚糖酸溶液 在冰浴條件下攪拌均勻并放置待用；(3) 將堿性鹽溶解在聚乙烯醇溶液中，再將含有堿性鹽的聚乙烯醇溶液冰 浴放置至少15min;(4) 在冰浴和不斷攪拌下，按殼聚糖與聚乙烯醇質量比為1:20 8:1的比 例，將含有堿性鹽的聚乙烯醇溶液緩慢滴入含有羥基磷灰石納米粒的 殼聚糖酸溶液中形成混合液，將混合液放置于凝膠溫度下即可制得凝 膠。在上述制備方法中，所用羥基磷灰石納米粒的粒徑位于100 500nm之間； 得到的含羥基磷灰石納米粒的殼聚糖/聚乙烯醇復合凝膠中的羥基磷灰石納米粒 含量不超過0. 0002MolA，羥基磷灰石含量為0. OOOlMol/1時，凝膠強度最大， 采用動態流變儀測定其為160Pa;所用堿性鹽為NaHC03，堿性鹽用量需保證將含 有堿性鹽的聚乙烯醇溶液與含有羥基磷灰石納米粒的殼聚糖酸溶液混合后，混合 溶液的pH值在6.5 7.2之間。另一種制備方法為原位生成法，其具體步驟如下(1) 首先制備濃度為0. 5 4wa的殼聚糖酸溶液和濃度為0. 5 10wW聚乙 烯醇溶液待用；(2) 然后按氯化鈣與殼聚糖的質量比為0.14:1 0.56:1的比例，將氯化鈣 完全溶解在殼聚糖酸溶液中，再將溶解有氯化鈣的殼聚糖酸溶液在冰浴條件 下攪拌均勻并放置待用；(3) 接著按十二水磷酸鈉與聚乙烯醇的質量比為0. 285:1 1. 14:1的比例 或無水磷酸鈉與聚乙烯醇的質量比為0.123:1 0.492:1的比例，將堿性鹽 和磷酸鈉完全溶解在聚乙烯醇溶液中，再將溶解有堿性鹽和磷酸鈉的聚乙烯 醇溶液冰浴至少15min;(4) 在冰浴和不斷攪拌下，按氯化鈣與磷酸鈉中的Ca:P質量比為1.67的比 例，將溶解有堿性鹽和磷酸鈉的聚乙烯醇溶液緩慢滴入溶解有氯化鈣的殼聚 糖酸溶液中形成混合液，將混合液放置于凝膠溫度下即可制得凝膠。在該制備方法中，所用堿性鹽為NaHC03,堿性鹽用量要保證將溶解有堿性鹽 和磷酸鈉的聚乙烯醇溶液與溶解有氯化鈣的殼聚糖酸溶液的混合溶液PH值在 6. 5 7. 2之間；所得凝膠的強度隨羥基磷灰石納米粒的含量增大而增大，當羥基 磷灰石含量分別為0. 00005、 0.0001、 0. 0002Mol/l時，采用動態流變儀測定凝 膠強度分別為530、 590、 760Pa。由上述技術方案可知，本發明提供的生物復合凝膠中不僅含有殼聚糖和聚乙 烯醇，還含有羥基磷灰石納米粒，而羥基磷灰石[Ca,。(P04)6(0H)2]是動物和人體 骨骼的主要無機礦物成分，羥基磷灰石具有良好的生物相容性、生物活性、骨傳 導性及其與人體骨礦物相組分的相似性，是良好的骨替代物，已被廣泛用于生物醫用材料領域，如用作硬組織修復材料、藥物載體等，且羥基磷灰石對腫瘤細胞 的生長也有明顯的抑制作用，因此本發明提供的這種含羥基磷灰石納米粒的殼聚 糖/聚乙烯醇復合凝膠具有比現有的殼聚糖/聚乙烯醇凝膠更好的生物活性，且經 過試驗證明含羥基磷灰石納米粒的殼聚糖/聚乙烯醇復合凝膠的機械強度也優于 殼聚糖/聚乙烯醇凝膠。與現有技術相比，本發明具有以下優點(1) 在現有技術的基礎上增加對羥基磷灰石的利用，羥基磷灰石的生 物復合提高了殼聚糖/聚乙烯醇凝膠的機械強度和生物活性。(2) 在以牛血清蛋白(BSA)為模型藥的實驗中，BSA的包封率可達 卯％，兩天緩釋僅僅40%，并且沒有突釋效應，說明本發明凝膠 可作為藥物載體和藥物緩釋，特別用于敏感類藥物的緩釋。(3) 制備條件簡便溫和，所制備的凝膠低溫下保持液態，人體溫度下 可形成凝膠。 (4) 工藝安全、簡單有效、符合環保要求，可避免有機化學試劑及其它有害的物質，適合于藥物緩釋、組織工程和細胞培養等領域。 因此該含羥基磷灰石納米粒的殼聚糖/聚乙烯醇復合凝膠既可作為藥物載 體，用于敏感類藥物的緩釋，也可作為可注射型醫用材料，用于關節軟骨的修復 和作為組織工程支架材料，還可以應用于細胞的培養等方面。
具體實施方式
實施例l:將200mg殼聚糖溶解在濃度為O.lmol/1的鹽酸溶液中，配制成 2wt免溶液；將100mg粒徑位于100 500nm之間的羥基磷灰石納米粒直接超聲分 散于lml蒸餾水后，添加于殼聚糖溶液中，冰浴中攪拌15min;將200mg聚乙烯 醇溶解后，配制成2wt。/。溶液；將碳酸氫鈉84mg加入聚乙烯醇溶液中，同樣在冰 浴中放置15 min;然后在不斷攪拌下、冰浴下將聚乙烯醇溶液緩慢滴入殼聚糖 鹽酸溶液中，攪拌10rain,混合后的溶液pH值為6.7。最后，將溶液在凝膠溫 度37'C放置30min制得凝膠，采用動態流變儀測定其強度為160Pa。凝膠中殼 聚糖與聚乙烯醇質量比例為l:l。以殼聚糖為參照，凝膠中羥基磷灰石納米粒與 殼聚糖的質量比例為1:2。通過實驗可知，采用直接添加法，所得含羥基磷灰石納米粒的殼聚糖/聚乙 烯醇復合凝膠中的羥基磷灰石納米粒含量不超過0. 0002Mol/l，羥基磷灰石含量 為0.0001Mol/l時，凝膠強度最大，采用動態流變儀測定其為160Pa實施例2:將200mg殼聚糖溶解在濃度為O.lmol/1的鹽酸溶液中，配制成 2wt呢溶液；將28mgCaCl2溶解于殼聚糖溶液中，冰浴中攪拌15min;將100mg聚 乙烯醇溶解后，配制成lwtM溶液；將84mg NaHC03和57mgNa3P04 12H20 (或相應 量的無水Na3P04)加入聚乙烯醇溶液中，同樣在冰浴中放置15 min;然后在不 斷攪拌下、冰浴下將聚乙烯醇溶液緩慢滴入殼聚糖鹽酸溶液中，攪拌10min，混 合后的溶液pH值為6.8。最后，將溶液在凝膠溫度37T:放置30min制得凝膠， 采用動態流變儀測定其強度為530Pa。凝膠中殼聚糖與聚乙烯醇質量比例為2:1。 以殼聚糖為參照，凝膠中羥基磷灰石納米粒與殼聚糖的質量比例為1:4。實施例3:將400mg殼聚糖溶解在鹽酸溶液中，配制成4wty。溶液;將56mgCaCl2 溶解于殼聚糖溶液中，冰浴中攪拌15min;將100mg聚乙烯醇溶解后，配制成 lwt免溶液；將168mgNaHC03和114mgNa3P04 12H20加入聚乙烯醇溶液中，同樣在 冰浴中放置15 min;然后在不斷攪拌下，冰浴下將聚乙烯醇溶液緩慢滴入殼聚 糖鹽酸溶液中，攪拌10min,混合后的溶液pH值為7.0。最后，將溶液在凝膠 溫度37'C放置30min制得凝膠，采用動態流變儀測定其強度為590Pa。凝膠中 殼聚糖與聚乙烯醇質量比例為4:1。以殼聚糖為參照，凝膠中羥基磷灰石納米粒與殼聚糖的質量比例為1:4。實施例4:將200mg殼聚糖溶解在濃度為0. lmo1/1的鹽酸溶液中，配制成2wtM溶液；將112mgCaCl2溶解于殼聚糖溶液中，冰浴中攪拌15rain;將200mg聚乙烯醇溶解后，配制成2wtW溶液；將牛血清白蛋白、NaHC0384mg和228mgNa3P04* 12H20加入聚乙烯醇溶液中，同樣在冰浴中放置15 min;然后在不斷攪拌、冰浴下將聚乙烯醇溶液緩慢滴入殼聚糖鹽酸溶液中，攪拌10 min,混合后的溶液pH值為7. 2。最后，將溶液在凝膠溫度37。C放置30 rain制得凝膠。凝膠在pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中兩天累積緩釋僅僅為40%。采用動態流變儀測定其強度為760Pa。凝膠中殼聚糖與聚乙烯醇質量比例為1:1。以殼聚糖為參照，凝膠中羥基磷灰石納米粒與殼聚糖的質量比例為1:1。本實施例中BSA的包封率可達90 %，兩天緩釋僅僅40%，并且沒有突釋效應，說明這種凝膠可作為藥物載體和藥物緩釋，特別用于敏感類藥物的緩釋。通過實施例2 —實施例4可知，采用原位生成法所得凝膠的強度隨羥基磷灰石納米粒的含量增大而增大，實施例5:所得凝膠冷凍干燥并高壓滅菌后，在無菌條件下，將培養三代的 兔膝關節軟骨細胞接種于凝膠支架上，置于37'C， 5%0)2，95%濕度的培養箱中 培養。培養兩周后可見細胞比較均勻分布于支架上,沿凝膠支架生長，細胞多呈 球形，少數為梭形，可見細胞伸出偽足，黏附于支架。
權利要求
1.一種含羥基磷灰石納米粒的殼聚糖/聚乙烯醇復合凝膠，其特征在于凝中包括羥基磷灰石納米粒、殼聚糖、聚乙烯醇，其中殼聚糖與聚乙烯醇質量比在1∶20～8∶1之間，羥基磷灰石納米粒與殼聚糖的質量比在0.5∶1～2∶1之間。
2. —種權利要求1所述含羥基磷灰石納米粒的殼聚糖/聚乙烯醇復合凝膠的制備 方法，其特征是采用如下步驟(1) 首先制備濃度為0. 5 4wt。/。的殼聚糖酸溶液和濃度為0. 5 10wt免聚乙 烯醇溶液待用；(2) 將羥基磷灰石納米粒分散于蒸餾水，然后按經基磷灰石納米粒與殼聚 糖的質量比為0.5:1 2:1的比例將分散于水中的羥基磷灰石納米粒 添加于殼聚糖酸溶液中，再將含有羥基磷灰石納米粒的殼聚糖酸溶液 在冰浴條件下攪拌均勻并放置待用；(3) 將堿性鹽溶解在聚乙烯醇溶液中，再將含有堿性鹽的聚乙烯醇溶液冰 浴放置至少15min;(4) 在冰浴和不斷攪拌下，按殼聚糖與聚乙烯醇質量比為1:20 8:1的比 例，將含有堿性鹽的聚乙烯醇溶液緩慢滴入含有羥基磷灰石納米粒的 殼聚糖酸溶液中形成混合液，將混合液放置于凝膠溫度下即可制得凝 膠。
3. 根據權利要求2所述的含羥基磷灰石納米粒的殼聚糖/聚乙烯醇復合凝膠的制 備方法，其特征在于所用羥基磷灰石納米粒的粒徑位于100 500mn之間。
4. 根據權利要求2所述的含羥基磷灰石納米粒的殼聚糖/聚乙烯醇復合凝膠的制 備方法，其特ffi在于得到的含羥基磷灰石納米粒的殼聚糖/聚乙烯醇復合凝膠 中的羥基磷灰石納米粒含量不超過0.0002MOl/l，羥基磷灰石含量為 0. 0001Mo1/1時，凝膠強度最大，采用動態流變儀測定其為160Pa。
5. 根據權利要求2所述的含羥基磷灰石納米粒的殼聚糖/聚乙烯醇復合凝膠的制 備方法，其特征在于所用堿性鹽為NaHC03，堿性鹽用量需保證將含有堿性鹽的 聚乙烯醇溶液與含有羥基磷灰石納米粒的殼聚糖酸溶液混合后，混合溶液的pH 值在6. 5 7.2之間。
6. —種權利要求1所述含羥基磷灰石納米粒的殼聚糖/聚乙烯醇復合凝膠的制備 方法，其特征是采用如下步驟(1) 首先制備濃度為0. 5 4wt。/。的殼聚糖酸溶液和濃度為0.5 10wtM聚乙 烯醇溶液待用；(2) 然后按氯化鈣與殼聚糖的質量比為0.14:1 0.56:1的比例，將氯化鈣 完全溶解在殼聚糖酸溶液中，再將溶解有氯化鈣的殼聚糖酸溶液在冰浴條件 下攪拌均勻并放置待用；(3) 接著按十二水磷酸鈉與聚乙烯醇的質量比為0.285:1 1.14:1的比例 或無水磷酸鈉與聚乙烯醇的質量比為0. 123:1 0. 492:1的比例，將堿性鹽 和磷酸鈉完全溶解在聚乙烯醇溶液中，再將溶解有堿性鹽和磷酸鈉的聚乙烯 醇溶液冰浴至少15min;(4) 在冰浴和不斷攪拌下，按氯化鈣與磷酸鈉中的Ca:P質量比為1.67的 比例，將溶解有堿性鹽和磷酸鈉的聚乙烯醇溶液緩慢滴入溶解有氯化藥的殼 聚糖酸溶液中形成混合液，將混合液放置于凝膠溫度下即可制得凝膠。
7. 根據權利要求6所述的含羥基磷灰石納米粒的殼聚糖/聚乙烯醇復合凝膠的制 備方法，其特征在于凝膠強度隨羥基磷灰石納米粒的含量增大而增大，當羥基 磷灰石含量分別為0. 00005、 0.0001、 0. 0002Mol/l時，采用動態流變儀測定凝 膠強度分別為530、 590、 760Pa。
8. 根據權利要求6所述的含羥基磷灰石納米粒的殼聚糖/聚乙烯醇復合凝膠的制 備方法，其特征在于所用堿性鹽為NaHCO"堿性鹽用量要保證將溶解有堿性鹽 和磷酸鈉的聚乙烯醇溶液與溶解有氯化鈣的殼聚糖酸溶液混合后，混合溶液的 pH值在6. 5 7. 2之間。
9. 一種權利要求1所述含羥基磷灰石納米粒的殼聚糖/聚乙烯醇復合凝膠的用 途，其特征在于所述生物復合凝膠作為藥物載體或作為可注射型醫用材料或用 于細胞的培養。
全文摘要
本發明公開了一種含羥基磷灰石納米粒的殼聚糖/聚乙烯醇復合凝膠及其制備方法和用途。該復合凝膠中包括羥基磷灰石納米粒、殼聚糖、聚乙烯醇，其中殼聚糖與聚乙烯醇質量比在1∶20～8∶1之間，羥基磷灰石納米粒與殼聚糖的質量比在0.5∶1～2∶1之間。本發明提供了兩種制備該復合凝膠的方法，即直接添加法和原位生成法。用這兩種方法制得的該復合凝膠既可作為藥物載體，用于敏感類藥物的緩釋，也可作為可注射型醫用材料，用于關節軟骨的修復和作為組織工程支架材料，還可以應用于細胞的培養等方面。
文檔編號A61K47/36GK101130107SQ20071005301
公開日2008年2月27日 申請日期2007年8月22日 優先權日2007年8月22日
發明者艷 李, 杜予民, 湯玉峰 申請人:武漢大學