專利名稱：：連翹在制備抗腫瘤化療增敏減毒藥物中的應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及連翹的用途，尤其涉及在制藥領域中的用途。
背景技術：
：據世界衛生組織統計20世紀80年代，全世界癌癥發病人數每年約700萬人，癌癥死亡每年人數約500萬人。到90年代，全世界癌癥發病人數每年約IOOO萬人，每年死亡約700萬人。癌癥在全球的危害日趨嚴重。在下一個十年中，癌癥會取代心血管病成為是嚴重危害人類健康的疾病之首。在我國70年代中期，衛生部全國腫瘤防治研究辦公室組織全國癌癥死亡回顧調查，當時，癌癥發病每年約90萬人，癌癥死亡每年約70萬人。到90年代初期，據全國腫瘤防治研究辦公室抽樣調查結果，癌癥發病全國每年約160萬人，死亡每年約130萬人。目前，癌癥己經成為我國城鄉居民的第一位死亡原因。化療是目前治療癌癥的一個重要手段，化療藥物在殺死癌細胞的同時，對機體正常細胞也存在毒性。近年來，隨著抗癌新藥的不斷涌現，聯合化療方案的合理應用，化療的療效有了較大的提高，但這些藥物同時對正常組織器官有損害或毒性作用，從而降低機體免疫功能，出現骨髓抑制等一系列毒副反應，影響化療的療效，甚至迫使化療終止。臨床研究表明，在化療時根據患者的體質、癌癥分期以及出現的毒副反應癥狀，輔以中藥治療，可有效地增強化療的效果，又能在一定程度上避免或減輕放化療的毒副反應，延長患者的生存期和生存質量。而中藥作為我國得天獨厚的資源，在對腫瘤化療增效減毒方面具有獨特的優勢，它既能促進造血功能恢復；又提高機體免疫功能；還能防治胃腸道反應；有些藥物還具有明顯的抗腫瘤作用，因此從我國傳統的天然藥物中篩選具有對化療減毒增效的藥物具有十分重要的意義。連翹為木犀科連翹屬植物連翹的干燥果實，味苦，無毒，性微寒，具有清熱止吐、清肝利膽、除濕退黃、通調三焦、暢達血脈、保肝護心等作用，臨床應用廣泛。，但關于連翹與化療藥合用，增加化療藥療效，降低化療藥毒性的研究均未見有關報道，本發明提供連翹醇提取物作為一種新的化療藥增敏劑，用于抗腫瘤的輔助治療。
發明內容本發明就是針對上述問題提供連翹在制備抗腫瘤的輔助治療藥物中的用途，用連翹制備的藥物對化療藥的抗腫瘤作用具有明顯的協同增效作用，且可降低化療藥引起的血細胞下降、肝、腎損傷等副作用。本發明提供的技術方案是連翹在制備抗腫瘤化療增敏減毒藥物中的應用。上述抗腫瘤化療增敏減毒藥物為有效劑量的連翹醇提取物與藥用載體和/或賦形劑的組合物。上述抗腫瘤化療增敏減毒藥物為口服制劑。上述抗腫瘤化療增敏減毒藥物為注射劑。本發明可將連翹醇提取物與藥用載體和/或賦形劑制得藥用組合物。所制得的藥用組合物用于抗腫瘤化療的輔助治療，具有療效好，副作用少等優點。建議臨床用量一天兩次口服，每次50-200mg連翹醇提取物。圖1為連翹醇提取物對大鼠肝臟組織形態學影響的HE染色切片圖2為連翹醇提取物對大鼠腎臟組織形態學影響的HE染色切片圖。具體實施例方式本發明通過以下實施例作進一步說明實施例1:組合物由連翹醇提取物1100克、纖維素400499克制成1000粒。其制備方法為將連翹醇提取物與纖維素制粒，然后壓片或灌裝膠囊，每粒(片)含連翹醇提取物l-100mg。實施例2:連翹醇提取物組合物由1100克連翹醇提取物加注射用水至1升，分裝成1000支制得。其制法為將連翹醇提取物溶于注射用水中，加至1升，滅菌，分裝。每支含l-100mg連翹醇提取物。上述實施例的連翹醇提取物可由常規提取方法得到；如將連翹加3倍體積70%的乙醇回流2小時，重復3次，合并提取液，回流濃縮得到連翹醇提取物。連翹活性成分體外協同抗腫瘤作用研究實驗方法實驗分組CY+DDP(順鉑+環磷酰胺)處理組(1)正常對照組(control);(2)模型組(model,CY+DDP，60ug'ml"+10ug'ml");連翹醇提取物(LQ)各劑量組(CY+DDP+LQ)，分別為(3)LQ1(CY+DDP+LQ100Ug'mr1)，(4)LQ2(CY+DDP+LQ50ug'mr1)，(5)LQ3(CY+DDP+LQ10ug'mr1)，(6)LQ4(CY+DDP+LQ2ugmr1)，(7)LQ5(CY+DDP+LQ0.4ugml");所有藥物濃度均為終濃度。未經CY+DDP處理組(1)正常對照組(control);連翹醇提取物各劑量組(LQ)，分別為(2)LQ1(100Ug.mr1)，(3)LQ2(50ug.mr1)，(4)LQ3(10ng'mr1)，(5)LQ4(2ug'mr1)，(6)LQ5(0.4yg'ml");所有藥物濃度均為終濃度。MTT法收集對數生長期的細胞，種于96孔培養板.每孔1X1(T個細胞，置5%0)2培養箱24h后，加入藥物.經48h后，除去培養液，每孔加入100ugMTT[3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazoliumbromide]，37。C溫育4h，去上清液，加入150ulDMS0溶解，振蕩10min混勻，測定波長490nm的吸光值(A)，計算抑制率。藥物聯合作用評價兩藥相互作用指數(coefficientofdruginteraction.CDI)的計算公式為CDI=AB/(AXB)。體外試驗是根據活細胞數(吸光值)進行計算。體內治療試驗是根據瘤重進行計算。AB為兩藥聯用組與對照組吸光值的比值；A或B是各藥物單獨使用組與對照組吸光值的比值。當CDI〈1時兩藥有協同作用；當CDI〈0.7時，協同作用非常顯著；如CDK，則兩藥作用性質為相加；如CDI〉1，則兩藥作用性質為拮抗。2.4數據以jc±S表示，均數比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析，數據分析采用SPSS10.0統計軟件。實驗結果1連翹活性成分與CY+DDP抑制腫瘤細胞生長的協同作用實驗結果表明，單獨使用CY+DDP對人胃癌細胞SGC2和鼠移植性肝癌細胞H22的抑制率分別為68.91%和77.33%，而與連翹醇提取物協同作用時，抑制率明顯提高，CDI均小于l，有協同作用；連翹苷與CY+DDP合用對腫瘤細胞的抑制作用明顯，且CDI均小于1，抑制率隨隨劑量的增大而增大。表l連翹活性成分與CY+DDP協同對SGC2細胞增殖的影響(J士S，n=6)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>3.連翹活性成分對SGC2、H22細胞生長的影響作用與空白對照組相比，連翹醇提取物對SGC2、H22細胞生長均無顯著影響，結果見表3表3連翹活性成分對SGC2、H22細胞增殖的影響(:f±S，n=6)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實驗結果實驗結果表明，單獨使用CY+DDP對人胃癌細胞SGC2和鼠移植性肝癌細胞H22的抑制率分別為68.91%和77.33%，而與連翹醇提取物協同作用時，抑制率明顯提高，CDI均小于l，有協同作用；連翹苷與CY+DDP合用對腫瘤細胞的抑制作用明顯，且CDI均小于1，抑制率隨劑量的增大而增大。，連翹對化療藥增效減毒的作用實驗方法動物分組及處理健康雄性SD大鼠y60只，基礎飼料喂養一周，作為適應期，隨機分為6組，每組IO只，普通飼料喂食，20g/只/天，共7天。造模方法第一天開始造模，同時給藥，每只大鼠腹腔注射環磷酰胺(60mg/kg)和順鉑(10mg/kg)，連續三天。正常組小鼠則注射生理鹽水為對照。分組正常組(ig.生理鹽水)；模型組(CY+DDP，ig.生理鹽水)；連翹高劑量組(CY+DDP+LQ1,ig.400mg/kg,qd);連翹中劑量組(CY+DDP+LQ2,ig.80mg/kg,qd);連翹低劑量組(CY+DDP+LQ3,ig.16mg/kg,qd);陽性對照組(CY+DDP+LTN，ig.5mg/kg，qd)7天后處死動物，眼眶采血，分兩管，其中一管肝素鈉抗凝，分別用于生化功能檢測與全血細胞分析。摘取免疫器官脾、胸腺，于4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，約4Hm厚,HE染色，光鏡檢察；摘取肝、腎組織，迅速至于5%戊二醛中固定，做透射電鏡觀察。對大鼠全血細胞的影響給藥7天后，動物禁食不禁水12h后用乙醚麻醉，眼眶采血，置于1.5mlEP管(加肝素鈉抗凝)中，立即進行血細胞分析。對大鼠肝功能及肝臟病理變化的影響對大鼠肝功能的影響7眼眶采血，置于8mlEP管中，3000rpm離心10min，取上層血清于EP管中，進行血清生化指標的檢測。對大鼠肝臟病理變化的影響①肉眼觀察動物處死后摘取整個肝臟，肉眼觀察肝臟形態、大小、色澤及質地。②鏡下觀察取同一處肝葉片以10%多聚甲醛固定，按常規制作肝組織病理切片，分別進行HE染色在光鏡下檢査。對大鼠腎功能及腎臟病理變化的影響對大鼠腎功能的影響眼眶采血，置于5mlEP管中，3000rpm離心10min，取上層血清于EP管中，進行血清生化指標的檢測。對大鼠腎臟病理變化的影響①肉眼觀察動物處死后摘取兩側腎臟，肉眼觀察其形態、大小、色澤及質地。②鏡下觀察取同一側腎臟以10%多聚甲醛固定，按常規制作腎組織病理切片，分別進行HE染色在光鏡下檢查。腹水瘤模型的建立及動物處理取本室自行傳代57d，生長良好的乳白色腹水，以適量無菌生理鹽水稀釋成瘤細胞懸液，細胞數為5X106個，以0.2ml/只接種。小鼠接種24h以后隨機分成5組，每組8只。分為(1)空白對照組(control);聯合給藥組(2)連翹高組(CY+DDP+LQ1，ig.400mg/kg，qd);(3)連翹中組(CY+DDP+LQ2，ig.80mg/kg，qd);(4)連翹低組(CY+DDP+LQ3,ig.16mg/kg，qd);陽性組(DDP+CY,ip.lmg/kg+10mg/kg,qd)。8天后處死動物，摘眼球采血，分兩管，其中一管肝素鈉抗凝，分別用于生化功能檢測與全血細胞分析。抽取小鼠腹水稱重，同時腹水細胞計數。統計處理實驗數據用均數士標準差(:i士s)表示，兩樣本均數的比較用t檢驗，多組間比較采用方差分析，數據分析采用spssio.o統計軟件。對大鼠全血細胞的影響由表4可見，模型組全血WBC(白細胞)、PLT(血小板)、RTCy。(網織紅細胞比例)水平與對照組相比明顯降低，連翹高、中劑量組、陽性組全血中白細胞水平與模型組相比明顯升高，而各給藥組RBC(紅細胞)、HGB(血紅蛋白)與模型組相比無明顯差異。表4對大鼠全血細胞的影響(*±s，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>由表5可見，模型組血槳ALT(谷丙轉氨酶)、AST(谷草轉氨酶)、BUN(尿素氮)、CREA(肌苷清除率)水平與對照組相比顯著升高(P〈0.01);與模型組相比，連翹高、中劑量組及陽性組ALT、BUN水平明顯降低(P〈0.05)，其中連翹中劑量組血清AST水平較模型組相比明顯降低(P〈0.05);連翹高、中劑量組與模型組相比，血清CREA水平明顯降低(P<0.05)。表5對大鼠肝、腎功能的影響(《±S，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>與模型組相比申P〈0.05，**P<0.Ol;與正常組相比AP〈0.05，"P<0.01.對腹水瘤小鼠腹水生成量及瘤細胞數的影響由表6可見，與對照組相比，連翹各劑量組與陽性組腹水生成量與瘤細胞數量均呈顯著下降(P〈O.OD，其中連翹中、低劑量聯合用藥組對腹水瘤小鼠腹水生成量與瘤細胞數減少作用明顯。表6連翹醇提取物對腹水瘤小鼠腹水生成量及瘤細胞數的影響(*±S，n=8)組別腹水生成量(g)腫瘤細胞數(108/ml)Control10.78±2.312.75±3.0DDP+CY+LQ14.52±1.2"8.02±1.1AADDP+CY+LQ22.55±0.7"6.57±1.4"DDP+CY+LQ32.48±0.9"6.00±1.1AADDP+CY3.92±0.6"6.57±0,7"與對照組相比，AP<0.05，"P〈0.01.對腹水瘤小鼠全血細胞的影響由表7可見，與對照組相比，連翹各劑量組與DDP+CY組全血WBC(白細胞)、LYM(淋巴細胞)、PLT(血小板)水平均有所下降，連翹各劑量組全血細胞中WBC與DDP+CY組相比有上升趨勢，而各給藥組RBC(紅細胞)、HGB(血紅蛋白)與模型組相比無明顯差異表7連翹醇提取物對腹水瘤小鼠全血細胞的影響(*±S，n=8)GroupWBCX107LLYMX107LRBCX10'7LHGBg/LControl3.69±1.11.28±0.210.06±0.4170.13±7.0DDP+CY+LQ1U3±0.38.82±2.3141.75±27.3ADDP+CY+LQ23.81±1.5*1.28±0.48.91±1.1A148.38±18.2AADDP+CY+LQ33.6±1.2*1.69±0.7*9.52±0.6144.63±11.7DDP+CY2.49±0,7^1.14±0.78.16±0.9"136.38±9.3"與對照組相比AP<0.05，"PO.01;與DDP+CY(順鉑+環磷酰胺)組相比*P<0.05，**P<0.01.對腹水瘤小鼠肝、腎功能的影響由表8可見，與DDP+CY組相比連翹各劑量組的血漿ALT、AST、BUN、ALP、CREA水平有一定程度降低，而與空白對照組相比連翹各劑量組動物血漿ALT、AST、BUN、CREA水平無明顯差異。表8連翹醇提取物對腹水瘤小鼠肝、腎功能的影響(《士S，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>與對照組相比，AP〈0.05，AAP〈0.01;與DDP+CY(順鉑+環磷酰胺)組+P〈0.05，**P<0.01.對腹水瘤小鼠肝、腎組織病理學變化的影響大鼠肝臟肝臟組織學檢查與正常肝組織相比，模型組可見肝細胞濁腫、空泡變性，排列較疏松，胞質內散在大量脂滴，連翹醇提取物能明顯降低肝組織的損害程度，可見肝小葉結構基本正常(見圖1)。圖1中，A:對照組；B:CY+DDP(順鉬+環磷酰胺)組；C:CY+DDP+LQ1(順鉬+環磷酰胺+連翹低劑量)組；D:CY+DDP+LQ2(順鉬+環磷酰胺+連翹中劑量)組；E:CY+DDP+LQ3(順鉑+環磷酰胺+連翹高劑量)組；F:CY+DDP+LTN(順鉑+環磷酰胺+硫普羅寧)組；大鼠腎臟組織學檢查光鏡觀察模型組與正常組相比，腎小管上皮細胞有濁腫病變，刷狀緣有缺失，細胞腫脹.(見圖2)。連翹聯用組病變不明顯，腎小球及腎小管結構基本完整(見圖C、D、E)。圖2中，A:對照組；B:CY+DDP(順鉑+環磷酰胺)組；C:CY+DDP+LQ1(順鉑+環磷酰胺+連翹低劑量)組；D:CY+DDP+LQ2(順鉑+環磷酰胺+連翹中劑量)組；E:CY+DDP+LQ3(順鉬+環磷酰胺+連翹高劑量)組；F:CY+DDP+LTN(順鉑+環磷酰胺+硫普羅寧)組；討論連翹活性成分協同抗腫瘤作用分析連翹具有清熱熱解毒，抗菌、抗病毒、消炎、鎮痛等多種藥理作用，其活性成份苯乙醇苷類，萜類等有抗腫瘤、抗病毒等作用。體外實驗結果表明，連翹醇提取物在與化療藥物環磷酰胺和順鉑聯合使用時，具有協同作用，藥物相互作用指數(CDI)在0.7-l之間。體內實驗結果表明，連翹醇提取物與化療藥物合用，對鼠移植性肝癌H22腹水瘤小鼠腹水生成量及瘤細胞數的抑制具有協同作用。提示連翹與化療藥物合用具有協同抗腫瘤作用。連翹醇提取物對化療所致肝、腎損傷的保護作用分析本實驗從生化、血液、組織形態學和超微結構的變化等方面，進一步較全面研究連翹醇提取物在化療輔助治療方面的作用。實驗結果表明，連翹醇提取物能提升化療所致的白細胞數量減少，并保護化療藥物導致的肝腎功能損傷。提示其具有潛在的化療藥物輔助治療藥用功效。綜上所述，通過對連翹醇提取物及其活性成分在體內、體外的研究，我們發現連翹醇提取物在保護化療所致的免疫低下及肝腎功能損傷方面，有一定的改善作用，同時還發現連翹與化療藥物合用具有協同抗腫瘤作用，提示連翹具有化療治療過程中的減毒增效之功效。權利要求1.連翹在制備抗腫瘤化療增敏減毒藥物中的應用。全文摘要本發明涉及連翹在制備抗腫瘤化療增敏減毒藥物中的應用。本發明可將連翹醇提取物與藥用載體和/或賦形劑制得藥用組合物。所制得的藥用組合物用于抗腫瘤化療增敏減毒，具有療效好，副作用少，提高患者生存質量等優點。文檔編號A61K131/00GK101099769SQ20071005254公開日2008年1月9日申請日期2007年6月25日優先權日2007年6月25日發明者虹丁,陸偉根,高天蕓申請人:武漢大學