專利名稱：：異種骨移植材料的制備方法
技術領域：
：本發明屬于骨移植材料領域，特別涉及異種骨移植材料的制備方法。
背景技術：
：創傷、腫瘤和人工關節翻修術等疾患引起的骨缺損一直是困擾骨科醫師的難題之一，目前雖然有很多方法用于骨缺損的重建，但骨移植被認為是其中最有效的方法之一。自體骨移植由于具有良好的成骨活性、骨誘導性和骨傳導性，一直作為骨移植的標準方法。然而，由于自體骨來源有限，且取材部位可能帶來的并發癥如局部出血、神經損傷等，限制了自體骨的臨床應用。同種異體骨移植是臨床上常用的另一種植骨方式，但異體骨移植不僅存在一定的免疫原性，具有傳播人類疾病的危險，而且同其它異種器官移植一樣，面臨供體嚴重不足和醫學倫理學問題。異種骨移植被認為是能夠取代自體骨移植和同種異體骨移植的有效方法之一，但由于異種物種之間的免疫學障礙，阻礙了異種骨移植的進展。專利號為WO9947080-A的專利申請提供了一種用于人體的新型無免疫原性異種骨移植材料的制備方法，此種方法包括以下步驟a、自動物體內取部分骨用于制備異種骨材料；b、用水和酒精清洗；c、至少采用以下一種處理紫外線照射、酒精浸泡、臭氧化作用、凍融過程或消毒，以及細胞破壞；d、糖苷酶消化去除細胞表面碳水化物。此種方法存在的問題是1、沒有提及α-Gal以外的異種移植抗原的處理方法；2、用水和酒精清洗的目的僅是去除滑液和可溶性脂類污染物，而不是去除骨材料中的脂肪。因此，用此種方法制備的異種骨移植材料不能完全去除異種骨抗原和脂肪，若用于骨移植，不可避免地存在移植免疫排斥反應并對骨缺損愈合有較大影響。
發明內容本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種改進的異種骨移植材料制備方法，此種方法不僅能更好地去除異種骨移植材料的各種抗原和脂肪，而且能保留所需的骨誘導活性和生物力學特性。異種骨移植時應去除異種抗原，才能減少異種免疫排斥反應。異種抗原主要包括α-半乳糖基抗原(α-galactosylresidues，α-Gal)和主要組織相容性抗原(MHC)。根據結構和功能不同，與移植排斥反應有關的主要組織相容性抗原可分為MHC-I類與MHC-II類抗原。本專利申請的發明人通過實驗發現，α-Gal、MHC-I抗原廣泛表達在動物骨的骨髓細胞和骨細胞、成骨細胞胞膜及哈佛氏管周圍，MHC-II抗原主要表達于動物骨的骨髓細胞。脂肪在骨移植中對骨缺損愈合有很大影響，有研究表明[ChappardD.FressonnetC.GentyC.etal.Fatinbonexenograftsimportanceofthepurificationproceduresoncleanliness，wettabilityandbiocompatibility.Biomaterials.14(7)507-12，1993Jun.]未脫脂處理的骨材料經γ射線照射后，脂肪會發生過氧化反應，產生毒性。本發明所述方法以動物骨為原料，根據上述基礎研究，包括以下步驟(1)去除骨髓和血細胞將無菌條件下獲取的動物骨在常壓、室溫和無菌條件下用高壓脈沖蒸餾水或生理鹽水沖洗，沖洗時間以清除骨及其髓腔內的骨髓和血細胞為限；(2)乙醚脫脂與沖洗在常溫常壓下將步驟(1)去除骨髓和血細胞的動物骨置于質量濃度95％～100％的乙醚中脫脂，乙醚的用量以淹沒被處理的動物骨為限，脫脂處理的時間以去除動物骨中的脂肪為限，脫脂處理后，用無菌水沖洗去除乙醚；(3)超深低溫冷凍將經步驟(2)處理的動物骨在常壓下液氮冷凍(-196℃冷凍)，冷凍時間至少為1個月，以破壞骨細胞，降低抗原性；(4)γ射線照射將步驟(3)超深低溫冷凍后的動物骨在常壓、室溫下用γ射線照射消毒和進一步破壞骨細胞，即獲得去除了異種抗原的異種骨移植材料。由于溫度梯度的變化對骨材料的生物力學性能有一定影響，可在上述超深低溫冷凍步驟之后增加深低溫保存步驟，即將液氮冷凍后的動物骨在常壓、-60℃～-80℃保存至少1個月后再進行γ射線照射。上述方法中，步驟(1)所述高壓脈沖蒸餾水或生理鹽水的壓力為350KPa～600KPa；步驟(2)中的沖洗用無菌水為蒸餾水或生理鹽水或雙蒸水；γ射線照射的劑量為25KGy～30KGy，γ射線照射的時間為7小時～8小時。上述方法所述常壓為1個大氣壓，室溫指室內自然溫度。本發明具有以下有益效果1、本發明所述方法由于含有去除骨髓和血細胞、乙醚脫脂步驟，以及各步驟順序的合理安排，不僅可去除動物骨的α-Gal、MHC-I和MHC-II抗原及脂肪，而且使所制備的骨移植材料具有所需的骨誘導活性和生物力學特性。2、由于所制備的骨移植材料去除了α-Gal、MHC-I和MHC-II抗原，因而移植免疫排斥反應大大降低。3、由于所制備的骨移植材料去除了脂肪，在骨移植中有利于骨的愈合，在γ射線照射后，不會產生毒性反應。4、在超深低溫冷凍步驟之后增加深低溫保存步驟，可減小溫度變化對骨移植材料生物力學性的影響。圖1是豬皮質骨α-Gal抗原檢測圖(×400)骨細胞核呈藍染，細胞膜及哈佛氏管周圍棕黃色顆粒狀物質沉積，呈陽性染色，而細胞外骨基質中未見陽性染色。圖2是豬松質骨α-Gal抗原檢測圖(×400)骨小梁中骨細胞橢圓形、骨小梁周圍成骨細胞呈長梭形，細胞核呈藍染，骨細胞膜和成骨細胞膜上有棕黃色顆粒狀物質沉積，呈陽性染色，骨基質中未見陽性染色。圖3是豬松質骨骨髓細胞和骨細胞、成骨細胞胞膜及哈佛氏管周MHC-I抗原陽性表達圖(×200)。圖4是豬松質骨骨髓細胞MHC-II抗原陽性表達圖(×400)，呈棕黃色染色。圖5是本發明所述方法處理后的豬骨移植材料的抗原陽性表達圖，細胞核藍染，骨細胞表面僅可見極少量α-Gal、MHC-I和MHC-II抗原表達。圖6是本發明所述方法處理后的豬骨移植材料的掃描電鏡圖(×25)，從該圖看出，骨材料孔壁光滑。圖7是本發明所述方法處理后的豬骨移植材料的掃描電鏡圖(×100)，從該圖看出，骨材料孔壁光滑。圖8是術后1、2、4、6周的兔外周血清IL-2檢測結果圖。圖9是術后1、2、4、6周的兔外周血清IL-4檢測結果圖。具體實施例方式實施例1原始豬骨中α-Gal、MHC-I和MHC-II抗原的表達和分布情況檢測(1)主要試劑M86抗α-Gal單克隆抗體，Alexis公司生產；SLA-1鼠抗豬MHC-I單克隆抗體，Serotec公司生產；SLA-DR鼠抗豬MHC-II單克隆抗體，BD公司生產。(2)主要材料與設備標本取自6月～8月齡新鮮成年近交系內江豬股骨髁部松質骨及肋骨，內江豬由四川大學華西基礎醫學動物實驗中心購得。LEICA2500E型切片機，1600型修塊機，裱片儀，德國LEICA生產。(3)免疫組化檢測α-Gal、MHC-I和MHC-II抗原①標本經4％多聚甲醛固定24小時；②0.5M的EDTA在4℃條件下脫鈣2月～3月后，系列脫水石蠟包埋；③石蠟切片經脫石蠟后，3％H2O2抑制內源性酶，0.1％胰蛋白酶消化液37℃修復抗原15分鐘。0.01mol/LPBS洗滌2次，每次5分鐘。加入正常馬血清(1∶200)封閉非特異性抗體30分鐘；④實驗組分別滴加抗α-Gal單克隆抗體(M86)、抗MHC-I和MHC-II抗原的單克隆抗體(SLA-1和SLA-DR)50μl，抗體稀釋倍數1∶200，陰性對照組滴加PBS，4℃冰箱孵育過夜；⑤0.01mol/LPBS洗滌2次，每次5分鐘；⑥滴加生物素化的馬抗鼠抗體(1∶200)50μl作為二抗，37℃孵育40分鐘，0.01mol/LPBS洗滌2次，每次5分鐘；⑦加入SP(1∶200)作為三抗，37℃孵育40分鐘；⑧0.01mol/LPBS洗滌2次，每次5分鐘；⑨DAB避光顯色2分鐘～3分鐘后終止，蘇木素復染細胞核1分鐘。⑩95％、100％乙醇分別脫水15分鐘，二甲苯透明30分鐘后，加拿大樹膠封片。(4)免疫組化檢測結果實驗組骨細胞核呈藍染，細胞膜及哈佛氏管周圍棕黃色顆粒狀物質沉積，呈陽性染色，而細胞外骨基質中未見陽性染色(見圖1、圖2、圖3、圖4)，α-Gal、MHC-I抗原廣泛表達在豬骨的骨髓細胞和骨細胞、成骨細胞胞膜及哈佛氏管周圍，MHC-II抗原主要表達于豬骨的骨髓細胞。實施例2豬骨移植材料的制備本實施例以6月～8月齡新鮮成年近交系內江豬的肋骨為原料，內江豬由四川大學華西基礎醫學動物實驗中心購得。具體制備方法如下(1)去除骨髓和血細胞在無菌條件下去除豬肋骨周圍組織和骨膜，取肋骨中段并保留一側皮質，制成1.5cm×0.5cm×0.4cm骨條，將制備的豬肋骨在常壓、室溫(20℃)和無菌條件下用壓力為350Kpa的高壓脈沖蒸餾水沖洗，沖洗60分鐘左右即可清除豬肋骨及其髓腔內的骨髓和血細胞；(2)乙醚脫脂與沖洗在常溫常壓下將步驟(1)去除骨髓和血細胞的豬肋骨置于質量濃度95％的乙醚中脫脂，乙醚的用量以淹沒被處理的豬肋骨為限，脫脂處理的時間為24小時左右，即可去除豬肋骨中的脂肪，脫脂處理后，用雙蒸水沖洗去除乙醚；(3)超深低溫冷凍將經步驟(2)處理的豬肋骨在常壓下液氮冷凍(-196℃冷凍)1個月，以破壞骨細胞，降低抗原性；(4)γ射線照射將步驟(3)超深低溫冷凍后的豬肋骨在常壓、室溫(25℃)下用γ射線(Co60)照射消毒和進一步破壞細胞，γ射線照射的劑量為25KGy，γ射線照射的時間為8小時，經γ射線照射后即獲得本發明所述的豬骨移植材料。實施例3豬骨移植材料的制備本實施例以6月～8月齡新鮮成年近交系內江豬的股骨髁為原料，內江豬由四川大學華西基礎醫學動物實驗中心購得。具體制備方法如下(1)去除骨髓和血細胞在無菌條件下去除豬股骨髁周圍組織和骨膜，取股骨髁中間松質骨，制成0.5cm×0.5cm×0.5cm骨塊，將制備的豬松質骨塊在常壓、室溫(10℃)和無菌條件下用壓力為600KPa的高壓脈沖生理鹽水沖洗，沖洗30分鐘左右即可清除豬松質骨及其髓腔內的骨髓和血細胞；(2)乙醚脫脂與沖洗在常溫常壓下將步驟(1)去除骨髓和血細胞的豬松質骨置于無水乙醚(質量濃度100％的乙醚)中脫脂，乙醚的用量以淹沒被處理的豬松質骨為限，脫脂處理的時間為48小時左右，即可去除豬松質骨中的脂肪，脫脂處理后，用生理鹽水沖洗去除乙醚；(3)超深低溫冷凍將經步驟(2)處理的豬松質骨在常壓下液氮冷凍(-196℃冷凍)4個月，以破壞骨細胞，降低抗原性；(4)深低溫保存將步驟(3)液氮冷凍后的豬松質骨在常壓、-60℃保存1個月。(5)γ射線照射將步驟(3)超深低溫冷凍后的豬松質骨在常壓、室溫(5℃)下用γ射線照射消毒和進一步破壞細胞，γ射線照射的劑量為30KGy，γ射線照射的時間為7小時，經γ射線照射后即獲得本發明所述的豬骨移植材料。實施例4豬骨移植材料的α-Gal、MHC-I和MHC-II抗原檢測將實施例2和實施例3制備的豬骨移植材料，用免疫組化方法分別檢測其α-Gal、MHC-I和MHC-II抗原。檢測步驟同實施例1。檢測結果骨陷窩和哈佛氏管(Harversian管)周圍僅有少量骨細胞存留，細胞核藍染，骨細胞表面僅可見極少量α-Gal、MHC-I和MHC-II抗原陽性表達(見圖5)。實施例5豬骨移植材料的孔隙結構檢測將實施例2和實施例3制備的豬骨移植材料用掃描電鏡觀察顏色呈淡黃色，微孔壁光滑，孔徑為(239.83±150.19)μm，空隙率(36.36±9.36)％，如圖6、圖7所示。已有研究表明(HulbertSF，YoungFA，MathewsRS.Potentialofceramicmaterialsaspermanentlyimplantableskeletalprostheses.JBiomedMaterRes.1970，4(3)433-456.)，骨移植材料的最佳孔徑為100μm～500μm，相互之間連接的孔徑應該＞100μm，相對大的孔徑材料有利于直接成骨，有利于血管化和氧和作用。本發明所述方法制備的豬骨移植材料，其孔徑大小和空隙率滿足上述條件，適合成骨細胞長入。實施例6豬骨移植材料的生物力學性能檢測常溫常壓下，采用INSTRON8874生物力學測試系統(InstronCo.，USA)對實施例2制備的豬骨移植材料進行軸向壓縮，以相同部位的新鮮豬肋骨作為對照。壓縮實驗加載速度0.5mm/min，應力下降25％-70％停止加載。各組材料的壓縮實驗結果見表1。表1各組材料的壓縮實驗結果(N＝4，x±S)表1中的壓縮實驗數據表明，實施例2制備的豬骨移植材料與新鮮豬肋骨對照組相比，抗壓縮性能無明顯改變。實施例7動物實驗1.異種骨材料體內移植免疫的實驗研究(1)材料與方法主要試劑包括FITC標記的抗兔CD4抗體、純化的抗兔CD8抗體(購自美國Pharmingen公司)，FITC標記的抗鼠CD8抗體作為二抗(北京中杉試劑公司生產)；抗兔IL-2、IL-4的ELISA試劑盒(購自BD公司)。主要設備包括流式細胞儀、酶標儀等。異種骨材料為實施例3制備的豬松質骨。(2)動物分組及實驗新西蘭大白兔30只，3月齡，雌雄各半，體重2.0Kg左右(四川大學華西醫院動物中心提供)，隨機分成2組，一組為實施例3制備的豬骨移植材料實驗組，一種為新鮮豬松質骨實驗組，每組15只。新西蘭大白兔10％水和氯醛(按3ml/kg劑量給藥)腹腔內麻醉，俯臥位固定于手術臺上，背部備皮，消毒，鋪無菌巾。取背部正中切口，切開皮膚、皮下組織，以第4腰椎體水平，將處理過的異種骨材料分別包埋植入兩側骶棘肌內，左右各一塊骨材料，縫合肌筋膜，逐層縫合傷口。術后肌注青霉素40萬單位，連續3天。(3)術后檢測指標①淋巴細胞亞群分析分別于術后1、2、4周取兔耳緣靜脈血，流式細胞儀檢測移植骨后CD4+、CD8+T細胞亞群和CD4/CD8比值的變化。具體操作方法如下a.抗凝取兔耳緣靜脈血0.5ml，立即加入含有EDTA的抗凝管，輕輕搖勻；b.加入熒光抗體取上述抗凝血20μl，加入FITC標記的抗兔CD4單克隆抗體10μl；另取上述抗凝血20μl，加入純化的抗兔CD8單克隆抗體10μl；抗體與樣品充分混勻，室溫下避光靜置20分鐘；c.分離淋巴細胞加入溶血劑10μl，混勻，室溫下避光孵育20分鐘，1500r/min離心3分鐘，棄上清液。檢測CD8組加入FITC標記的山羊抗小鼠IgG作為二抗；d.洗滌加入0.01MPBS混勻，1500r/min離心5分鐘，棄上清液；e.加入0.01MPBS混勻，流式細胞儀分別檢測CD4+、CD8+T淋巴細胞百分比。②細胞因子IL-2、IL-4檢測分別于術后1、2、4、6周取兔耳緣靜脈血2ml，放入玻璃采血管中，室溫下靜置2小時，1500r/min離心15分鐘，獲取血清。ELISA定量檢測血清中IL-2和IL-4水平。IL-2檢測方法a.建立標準曲線設標準孔6孔，每孔加入標準品25μl，標準品濃度依次為0、62.5pg/ml、125pg/ml、250pg/ml、500pg/ml、1000pg/ml，各待測孔中每孔分別加入待測血清25μl，每份血清標本滴加3個復孔；b.加樣每孔加入生物素標記的抗兔IL-2抗體25μl，輕輕混勻30秒，室溫下孵育30分鐘；c.洗板甩盡板內液體，每孔加入350μl洗滌液洗滌，并在厚疊吸水紙上吸干去除水滴，反復洗滌3次；d.每孔加入50μl辣根過氧化物酶，輕輕混勻30秒，室溫下孵育30分鐘；e.洗板方法同(c.)；f.每孔加入50μl顯色液，輕輕混勻10秒，室溫下孵育15分鐘；g.每孔加入50μl終止液，輕輕混勻30秒，即刻用酶標儀在450nm處讀取OD值；h.結果的判定以OD值作為縱坐標，標準品濃度0、62.5pg/ml、125pg/ml、250pg/ml、500pg/ml、1000pg/ml為橫坐標繪制標準曲線，根據樣品的OD值在標準曲線上計算出相應樣品的IL-2含量。IL-4檢測方法同IL-2檢測方法。(4)結果①淋巴細胞亞群分析結果見表3、表4、表5表3流式細胞術檢測CD4+細胞(x±S)表4流式細胞術檢測CD8+細胞(x±S)表5流式細胞術檢測CD4+/CD8+細胞(x±S)從表3、表4、表5可以看出，各實驗組術后1周～2周CD4+、CD8+T淋巴細胞均逐漸升高，新鮮豬松質骨實驗組升高明顯。CD4/CD8比值在各組術后1周最高，以后逐漸下降，新鮮豬松質骨實驗組較高(P＜0.05)。②血清IL-2、IL-4檢測結果各組骨材料移植分別于術后1、2、4、6周取兔耳緣靜脈血2ml，離心獲得血清，ELISA定量檢測血清中IL-2和IL-4水平，檢測結果見圖8、圖9。從圖8可以看出，植骨術后外周血清中IL-2水平，實施例3制備的豬骨移植材料實驗組＜新鮮豬松質骨實驗組，兩組間差別明顯(P＜0.05)。從圖9可以看出，植骨術后外周血清中IL-4水平，術后1、2周實施例3制備的豬骨移植材料實驗組＜新鮮豬松質骨實驗組，兩組間差別明顯(P＜0.05)，術后4、6周兩組間無明顯差別(P＞0.05)。(5)結論免疫學檢測結果表明異種骨移植免疫排斥反應主要發生在術后1周～2周，新鮮豬松質骨實驗組免疫排斥明顯高于實施例3制備的豬骨移植材料實驗組，實施例3制備的豬骨移植材料實驗組免疫排斥反應明顯降低。2.異種骨材料體修復兔橈骨缺損的實驗研究(1)材料與方法異種骨材料為實施例2制備的豬肋骨移植材料(2)動物分組及實驗新西蘭大白兔30只，3月齡，雌雄各半，體重2.0Kg左右(四川大學華西醫院動物中心提供)，隨機分成2組，即實施例2制備的豬骨移植材料實驗組和新鮮豬肋骨實驗組，每組15只。10％的水和氯醛(按3ml/kg劑量給藥)腹腔內麻醉，俯臥位固定于手術臺上，背部備皮，消毒，鋪無菌巾。取雙側橈骨中段切口，切開皮膚、皮下組織，從肌間隙進入暴露橈骨，在橈骨頭下20mm處將一段長15mm的橈骨連同周圍骨膜一起截除，止血并沖洗傷口，按分組要求分別將不同的異種骨材料植入骨缺損處。術中不予固定，縫合肌筋膜，逐層縫合傷口。術后常規籠中飼養，患肢不行外固定，肌注青霉素40萬單位，連續3天。(3)術后觀察指標術后6周、12周、24周不同時間每組分別處死5只兔，進行X線觀察。(4)結果術后不同時間點X線片Lane-Sandhux評分[LaneJM，SandhuHS.Currentapproachestoexperimentalbonegrafting.OrthopClinNorthAm.1987Apr；18(2)213-25.]結果均顯示，實施例2制備的豬骨移植材料修復能力優于新鮮豬骨，有統計學差異(P＜0.05)。表6修復骨缺損的放射學Lane-Sandhux評分(n＝5，x±S)(5)結論實施例2制備的豬骨移植材料實驗組修復能力優于新鮮豬肋骨實驗組。權利要求1.一種異種骨移植材料的制備方法，以動物骨為原料，其特征在于包括以下步驟(1)去除骨髓和血細胞將無菌條件下獲取的動物骨在常壓、室溫和無菌條件下用高壓脈沖蒸餾水或生理鹽水沖洗，沖洗時間以清除骨及其髓腔內的骨髓和血細胞為限；(2)乙醚脫脂與沖洗在常溫常壓下將步驟(1)去除骨髓和血細胞的動物骨置于質量濃度95％～100％的乙醚中脫脂，乙醚的用量以淹沒被處理的動物骨為限，脫脂處理的時間以去除動物骨中的脂肪為限，脫脂處理后，用無菌水沖洗去除乙醚；(3)超深低溫冷凍將經步驟(2)處理的動物骨在常壓下液氮冷凍，冷凍時間至少為1個月，以破壞骨細胞，降低抗原性；(4)γ射線照射將步驟(3)超深低溫冷凍后的動物骨在常壓、室溫下用γ射線照射消毒和進一步破壞骨細胞，即獲得去除了異種抗原的異種骨移植材料。2.根據權利要求1所述的異種骨移植材料的制備方法，其特征在于還包括深低溫保存步驟，該步驟在超深低溫冷凍步驟之后，即將液氮冷凍后的動物骨在常壓、-60℃～-80℃保存至少1個月后再進行γ射線照射。3.根據權利要求1或2所述的異種骨移植材料的制備方法，其特征在于步驟(1)所述高壓脈沖蒸餾水或生理鹽水的壓力為350KPa～600KPa。4.根據權利要求1或2所述的異種骨移植材料的制備方法，其特征在于步驟(2)中的沖洗用無菌水為蒸餾水或生理鹽水或雙蒸水。5.根據權利要求3所述的異種骨移植材料的制備方法，其特征在于步驟(2)中的沖洗用無菌水為蒸餾水或生理鹽水或雙蒸水。6.根據權利要求1或2所述的異種骨移植材料的制備方法，其特征在于γ射線照射的劑量為25KGy～30KGy，γ射線照射的時間為7小時～8小時。7.根據權利要求3所述的異種骨移植材料的制備方法，其特征在于γ射線照射的劑量為25KGy～30KGy，γ射線照射的時間為7小時～8小時。8.根據權利要求4所述的異種骨移植材料的制備方法，其特征在于γ射線照射的劑量為25KGy～30KGy，γ射線照射的時間為7小時～8小時。9.根據權利要求5所述的異種骨移植材料的制備方法，其特征在于γ射線照射的劑量為25KGy～30KGy，γ射線照射的時間為7小時～8小時。全文摘要一種異種骨移植材料的制備方法，以動物骨為原料，包括以下步驟(1)去除骨髓和血細胞，將無菌條件下獲取的動物骨在常壓、室溫和無菌條件下用高壓脈沖蒸餾水或生理鹽水沖洗，沖洗時間以清除骨及其髓腔內的骨髓和血細胞為限(2)乙醚脫脂與沖洗，在常溫常壓下將步驟(1)去除骨髓和血細胞的動物骨置于質量濃度95％～100％的乙醚中脫脂，乙醚的用量以淹沒被處理的動物骨為限，脫脂處理的時間以去除動物骨中的脂肪為限，脫脂處理后，用無菌水沖洗去除乙醚；(3)超深低溫冷凍，將經步驟(2)處理的動物骨在常壓下液氮冷凍；(4)γ射線照射，將步驟(3)超深低溫冷凍后的動物骨用γ射線照射。文檔編號A61L27/00GK101032631SQ20071004882公開日2007年9月12日申請日期2007年4月6日優先權日2007年4月6日發明者裴福興,程驚秋,馮衛,廉永云,周宗科申請人:四川大學華西醫院