專利名稱：：胡蘿卜烷型倍半萜及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
：本發明屬中藥制藥領域，涉及胡蘿卜垸型倍半萜新化合物及其制備方法和在制備抗乙肝病毒藥物中的用途。
背景技術：
：據有關統計顯示，全世界大約有3億多人為慢性乙肝病毒(HBV)攜帶者，我國約占半數。乙肝病毒感染已成為全球性的影響人類健康的主要疾病之一，由于HBV感染可以導致慢性肝炎、肝硬化和原發性肝—癌，因此成為影響人類壽命的九大疾病之一。由于慢性HBV感染者較非攜帶者發生肝癌的相對危險率為217，因此在全世界每年大約有200萬人死于乙肝引起的肝硬化和肝癌，而我國又是乙型肝炎的高發區，每年約有25萬人死于與乙肝相關的慢性肝病(肝硬化與肝癌)。上述疾病給人民健康和國民經濟帶來巨大損失。因此，尋求高效低毒的抗HBV藥物己成為刻不容緩的問題。藥物化學工作者在篩選抗HBV藥物的過程中進行了不懈的努力，但到目前為止能治愈HBV感染的特效藥還在尋找。臨床上已獲得FDA正式批準使用的oc-干擾素和核苷類藥物拉米呋啶只能在某種程度上獲得治療效果，對大多數病人還達不到治愈的目的，停止治療后的"反跳"現象是醫藥工作者最感棘手的問題，所以開發研制高效、低毒、不"反跳"的抗HBV新藥向藥物化學工作者提出了挑戰。在篩選抗HBV新藥的過程中，越來越多的藥物化學工作者把注意力轉向了植物來源豐富，價廉易得，毒副作用小，分子結構復雜多樣的天然化合物。鶴慶五味子Schisandrawilsoniana為我國特有藥用植物，屬于五味子科(Schisandrance)五味子屬(Schisandra)，分布于云南，其果實在民間一直作為五味子(FructusSchisandra)的代用品，具有收斂固澀，益氣養津，補腎寧心的功效，主治久咳虛喘，夢遺滑精、遺尿、尿頻、自汗、盜汗、神經衰弱、肝炎等。目前有關五味子科植物抗HBV的研-究主要集中在木脂素和三萜類成分上。
發明內容本發明的目的是提供胡蘿卜烷型倍半萜新化合物及其制備方法和在制備抗乙肝病毒藥物中的用途。本發明所述的胡蘿卜烷型倍半萜新化合物優選鶴慶五味子烯甲、鶴慶五味子烯乙和鶴慶五味子烯丙。本發明應用現代藥理篩選方法，從五味子科五味子屬(Sc/^flm/ra)植物鶴慶五味子w&om'a"a)中提取得到胡蘿卜烷型倍半萜新化合物鶴慶五味子烯甲、鶴慶五味子烯乙和鶴慶五味子烯丙，并證實其抗HBV病毒活性。本發明所述的活性胡蘿卜垸型倍半萜化合物具有如下式I的化學結構<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>其中各取代基及化合物1-3的情況如表1所示:表1<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>本發明的化合物通過下述方法制備:采用我國云南特有藥用植物鶴慶五味子S.wz7so"/a"a的干燥果實。取鶴慶五味子果實8kg,95%乙醇冷浸，提取物濃縮后用乙醚萃取，共得400克，取200克干法上樣進行硅膠柱層析，以石油醚-丙酮梯度洗脫，所得流份以不同洗脫劑進行反復硅膠柱層析，分離得到鶴慶五味子烯甲(l)、鶴慶五味子烯乙(2)和鶴慶五味子烯丙(3)。所述的化合物鶴慶五味烯甲schisanwilsoneneA，無色方晶，熔點165-168°c;分子式C15H2602，分子量238;[a]g=+52.3°(c0.02，MeOH);IR(KBr)i)m狀(cm"):3315，2941，2915,2360，2341,1456，1377，1152,1057，1002,945,868，1668;^-NMR(CDC13，400MHz)《ppm:1.32,，m，H-l),1.47(1H，m，H-l),1.47(1H，m，H國2)，1.73(IH，m，H-2)，2.31(1H，m，H-3)，1.83(1H，m，H-4)，1.22(1H，m，H-6),1.76(IH，m，H-6)，2.05(IH，m，H畫7)，2.25(1H，m，H-7),5.78(IH，d，J=8.6Hz,H-9),2.21(1H，m，H國IO),2.88(IH，m，H陽IO),3.93(2H，s，H-l1),0.88(3H，s，Me(13))，1.23(3H，s，Me(14)),L21(3H，s，Me(15));13C-NMR(CDC13,廳MHz)《ppm:42.0(1),27.4(2)，53.2(3)，50.3(4)，44.6(5),41.1(6),26.0(7),140.7(8)，127.5(9),26.5(10)，70.6(11),74.4(12)，17.7(13),27.1(14),32.5(15)/eSI-MSm/z:203(100),221(18),405(3),441(7);HR-ESI-MS附/z:261.1829([M+Na]+,C15H2602Na+;calc.261.1825)。晶體數據供試樣品為無色透明塊狀結晶，實驗用晶體—大小為0.15X0.10X0.06mm，空間群為P2(l)2(l)2(l)。晶胞參數a=11.605(7)A,b=12.335(7)A,c=20.051(11)A,a=900,f3=90o,y=卯°,晶胞體積2870(3)A3，晶胞內分子數z=8，計算密度/>^=1.103Mg/m3,Mo尺a射線(X=0.71073A),F(OOO)=1056,T=293K。所述的化合物鶴慶五味烯乙schisanwilsoneneB，白色粉末，分子式C17H2803，分子量280;[a]2D5=+30.4。(c0.01,MeOH);IR(KBr)umax(cm-1):3446,2925,2853,2359,2340，1734，1717,1375,1233，1045;iH國NMR(CDCl3，400MHz)5ppm:1.32(1H，m，H腸l)，1.45(IH，m，H國l),1.42(1H，m，H-2),1.71(1H，m，H-2),2.31(1H，m，H-3)，1.86(1H，m,H-4),L26(1H，m，H-6)，1.74(1H，m，H-6)，1.98(1H，m,H-7)「2.22(IH，m，H畫7)，5.83(1H，d，J=8.6Hz,H-9)，2.20(1H，m，H誦10)，2.89(1H，m，H-IO)，4.40(2H，s，H-ll),0.89(3H，s，Me(13)),1.23(3H，s，Me(14)),1.21(3H，s，Me(15))，2.06(3H，s，OAc);13C-NMR(CDC13，100MHz)3ppm:42.0(1),27.4(2),53,2(3),50.1(4),44,5(5),41.0(6)，26.3(7),135.8(8)，131.0(9),26.7(10)，72.0(11),74.3(12)，17.7(13)，27.1(14)，32.5(15),171.1,21.1(OAc);EI-MSw/z:43(100),159(84)，91(69),59(67),105(57),41(43),79(42)，119(41);HR國EI-MSw/z:280.2043([M]+，C17H2803+;calc.280.2038)。所述的化合物鶴慶五味烯丙schisanwilsoneneC,白色粉末，分子式C15H2402，分子量236;[a]2D5=+56.2o(c=0.02，MeOH);IR(KBr)umax(cm-1):3441，2942，2853，2696，2369，1684，1635,1379，1134，950;iH-NMR(CDCl3，400MHz)^ppm:1.35(1H，m，H-l)，1.50(1H，m，H-l),1.41(1H，m，H-2)，L72(1H，m，H畫2)，2.36(1H，m，H-3),1.88(1H，m，H-4)，1.16(1H，m，H畫6)，1.81(1H，m，H-6)，2.01(1H，m，H隱7),2.75(1H,m，H-7)，6.80(1H，d，J=8.6Hz，H-9),2.50(1H，m，H-10),3.36(1H，m，H-10),9.30(1H，s，H-ll)，0.89(3H，s，Me(13))，1.26(3H，s，Me(14))，1.24(3H，s，Me(15));13C-NMR(CDC13，100MHz)5ppm:42.1(1)，27.2(2),52.9(3)，49.3(4),44.5(5)，41,9(6)，20.2(7),144.7(8)，157.0(9),28.3(10),196.1(11),74.3(12),17.7(13),26.9(14),33.0(15);ESI-MS附/z:219(100),237(5)，495(13)，259(14);HR-ESI國MSm/z:259.1667([M+Na]+，C17H2802Na+;calc.259.1669)。本發明所述的胡蘿卜烷型倍半萜經藥理試驗，結果證明具有顯著的抗HBsAg作用，且有效濃度低，細胞毒性較小(表3)。鶴慶五味子烯甲在100//g/mL時對HBsAg的抑制率為54.7%，顯著高于陽性對照拉米呋啶(200pg/mL時抑制率為28.6%);鶴慶五味子烯乙在100//g/mL時對HBsAg表現出較強的抑制作用，抑制率為58.6%;鶴慶五味子烯丙在200Ag/mL時對HBsAg的抑制率和陽性對照相當，抑制率為28.3%。本發明首次從鶴慶五味子植物中分離到胡蘿卜垸型倍半萜，并首次發現該類型的化合物具有較好的抗HBV活性。本發明所述的胡蘿卜烷型倍半萜化合物可作為活性成分制備用于治療乙型肝炎的藥物。.-圖1是鶴慶五味子烯甲、鶴慶五味子烯乙和鶴慶五味子烯丙的提取分離工藝流程圖，其中A:甲醇-水B:石油醚-乙酸乙酯C:石油醚-丙酮。具體實施例方式實施例l制備鶴慶五味子烯甲-丙鶴慶五味子果實8kg，95%乙醇浸泡，提取物濃縮后用乙醚萃取，共得400克(提取率5%)，取200克干法上樣進行硅膠柱層析，以石油醚-丙酮梯度洗脫。石油醚-丙酮(20:l)的流份，經MCI柱(甲醇-水(4:1))除去色素，經石油醚-丙酮(20:l)反復硅膠柱洗脫，后經制備TLC方法(石油醚-乙酸乙酯(10:1))，得到鶴慶味子烯乙(2);石油醚-丙酮(IO:I)的流份，經MCI柱(甲醇-水(4:l))除去色素，經石油醚-丙酮(10:l)反復硅膠柱洗脫，后經制備TLC方法(石油醚-乙酸乙酯(6:l》，得到鶴慶味—子烯丙(3);石油醚-丙酮(3:l)的流份，經C18反相柱(甲醇-水(6:4))洗脫，得到粗晶，經石油醚-丙酮(6:l))溶劑中重結晶，得到鶴慶味子烯甲(l)。實施例2體外抗HBV實驗應用HepG2的2.2.15細胞株(教育部/衛生部醫學分子病毒學重點實驗室，上海)，以每孔10><105個細胞接種于24孔板，培養基為DMEM，生長液含10%胎牛血清，380|ig/mlG418，0.03%谷胺酰胺，青霉素、鏈霉素各100pg/ml，在5%(302孵箱中37'C培養，48小時后，換成二甲基亞砜助溶的含藥物的培養液，每種藥物設35個濃度，每個濃度設4個平行孔，繼續培養9天(每3天換液一次)，收集上清液用ELISA檢測HBsAg及HBeAg含量。同樣條件下以不含藥物的培養液—上清液作為對照組。同時用上述細胞株，用MTT法測定藥物的細胞毒性。陽性對照為拉米呋啶(3TC)。結果證實本發明化合物具有顯著的抗HBV作用，且有效濃度低，細胞毒性較小。表3是鶴慶五味子烯甲、鶴慶五味子烯乙和鶴慶五味子烯丙對HepG22.2.15細胞的毒性情況及對HBsAg和HBeAg的抑制效果。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>25--5.60鶴慶五味子烯丙200-28.38.8100-11.76.150-5.51.425陽01.13TC200-28.634.8"未見明顯毒性"系指用MTT法檢測細胞存活率^75%;+:"顯示毒性"指細胞存活率<75%;/:沒有進行抑制率測試。權利要求1、胡蘿卜烷型倍半萜在制備抗乙肝病毒藥物中的用途。2、按權利要求1所述的用途，其中所述的胡蘿卜烷型倍半萜具有式I的化學結構<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>其中各取代基及化合物1-3如下表:<table>tableseeoriginaldocumentpage2</column></row><table>3.按權利要求1所述的用途，其中所述的胡蘿卜垸型倍半萜是化合物鶴慶五味子烯甲。4.按權利要求1所述的用途，其中所述的胡蘿卜垸型倍半萜是化合物鶴慶五味子烯乙。5.按權利要求1所述的用途，其中所述的胡蘿卜烷型倍半萜是化合物鶴慶五味子烯丙。6.按權利要求1或2或3或4或5所述的用途，其中所述的胡蘿卜烷型倍半萜通過下述方法制備，采用植物藥鶴慶五味子S.m7^"/"""的干燥果實，95%乙醇冷浸，提取物濃縮后用乙醚萃取，取200克干法上樣進行硅膠柱層析，以石油醚-丙酮梯度洗脫，所得流份以不同洗脫劑進行反復硅膠柱層析，分離得到鶴慶五味子烯甲(l)、鶴慶五味子烯乙(2)和鶴慶五味子烯丙(3)。全文摘要本發明屬中藥制藥領域，涉及胡蘿卜烷型倍半萜及其制備方法和在制備抗乙肝病毒藥物中的新用途。本發明從五味子屬Schisandra植物鶴慶五味子S.wilsoniana中提取胡蘿卜烷型倍半萜并證實其抗HBV病毒活性。所述的化合物經與陽性對照拉米呋啶藥理試驗比較，結果證實具有顯著的抗HBV作用，且有效濃度低，細胞毒性較小，本發明所述的胡蘿卜烷型倍半萜化合物可作為活性成分制備治療乙型肝炎的藥物。文檔編號A61P31/00GK101375841SQ20071004530公開日2009年3月4日申請日期2007年8月27日優先權日2007年8月27日發明者佩周,陳道峰,馬文輝,海黃申請人:復旦大學