專利名稱：：杜仲總多糖在制備防治系統性紅斑狼瘡藥物中的用途的制作方法
技術領域：
：本發明屬中藥領域，涉及中藥杜仲總多糖新的藥用用途。具體涉及杜仲總多糖在制備系統性紅斑狼瘡藥物中的用途。
背景技術：
：系統性紅斑狼痛(systemiclupuserythematosus,SLE)是一種病因不甚明確的炎性結締組織病，主要發病在女性，也可累及兒童。一項多國多中心研究表明，目前系統性紅斑狼瘡的發病率為12.5/10萬39/10萬。SLE是一種累及多系統、臨床表現復雜、病程遷延反復的、致死率高的自身免疫性疾病，通常被視為代表性的自身免疫病。SLE自身免疫異常的表型具有高度多樣性，包括免疫耐受缺損、淋巴細胞凋亡障礙、T或B細胞功能調節障礙、NK細胞功能缺損、補體缺陷、自身抗原抗體形成的免疫復合物清除障礙、細胞因子分泌調節障礙等，幾乎涉及整個免疫系統。除皮膚、粘膜外，常累及腎臟、心臟、肝臟、肺及神經系統等內臟器官，常伴有發熱、乏力、關節痛等全身癥狀，并在血液中存在多種抗自身抗體。補體系統在自身免疫性疾病的預防發病及疾病損傷中，起著所謂"雙刃劍"的作用。一方面,補體系統功能的正常，可以有效地促進循環免疫復合物的運送及清除:另一方面,補體系統功能的缺陷，包括組分的缺失或功能的失常，又會參與對組織的損傷。SLE活動期患者體內B淋巴細胞活性增強，產生大量抗自身尤其是抗ds-DNA抗體，與自身抗原在體內形成大量免疫復合物，活化補體，消耗大量補體C3和C4成分，使C3、C4水平降低。而非活動期SLE患者B淋巴細胞活性基本正常，體內自身抗體水平也基本正常，補體消耗減少，使補體正常或輕度偏高。因此，血清中高Ig，低補體C3、C4是SLE活動性的重要指標。補體活化造成的III型變態反應的直接作用和對免疫細胞功能的影響可加重SLE的病理損害，影響SLE病程的發展和臨床表現。由于SLE患者體內產生大量的循環免疫復合物沉積于組織、器官等，尤其是腎臟，常可引起腎小球腎炎(即狼瘡性腎炎L叩usN印hritis，LN)。一旦免疫復合物沉積于腎組織內即可激活補體系統，引起一系列的免疫損傷反應(m型變態反應)血管內凝血因子的激活，毛細血管通透性增加，中性粒細胞、單核細胞等炎癥細胞的浸潤，局部組織細胞的壞死，蛋白溶解酶或裂解酶的大量釋放，以及一系列調節腎小球細胞增殖、基質增生的細胞因子的釋放等等，從而產生腎臟的各種病理變化。狼瘡性腎炎是SLE的重要臨床組成部分。SLE患者中約35X90X有腎臟累及的臨床表現，如蛋白尿、紅白細胞尿，管型尿及腎小管和小球濾過功能的變化。腎臟病理檢查發現90%患者在光鏡下可出現異常；采用免疫熒光或電鏡等復雜技術觀察，幾乎所有SLE患者均有不同程度的腎臟累及。腎臟損害的嚴重程度與SLE的預后密切相關。多數SLE患者最終出現腎功能不全,嚴重影響著患者的生命。(畢志剛，劉曉華.紅斑狼瘡現代診療.第l版[M].江蘇江蘇科學技術出版社，2000.98-100)。目前臨床治療主要以對癥的長期監控性治療為主，治療藥物主要為非甾體類抗炎藥、免疫抑制劑、靜脈注射免疫球蛋白、性激素等治療藥物等。盡管糖皮質激素及免疫抑制劑等能控制病情，但其不良反應也是患者致死原因之一。研究表明，高水平抗自身抗體和補體系統的過度激活所引發的免疫性組織損傷是SLE患者發病的重要機制，而且與SLE的發生與預后有顯著聯系。通過特異性抑制補體組成成分的激活，降低抗ds-DNA抗體水平，可能提高治療SLE的臨床療效，減少不良反應。因此臨床急需高效低毒的藥物。杜仲(^yco鵬iaiA7/z;a^es01ive.)，又名"思仙"、"木棉"、"扯絲皮"、"絲連皮"等，是杜仲科杜仲屬的落葉喬木，系地質史上第四紀冰川運動殘留下來的古生孑遺樹種。中國傳統以杜仲干燥樹皮入藥，是常用的名貴滋補藥材，己有兩千多年應用歷史。從古至今，對杜仲的化學成分、藥理作用和臨床應用的研究一直十分活躍。《神農本草經》，將杜仲列為上品120種之一，記載"杜仲味辛平。主腰膝痛，補中益精氣，堅筋骨，強志。除陰下癢濕，小便馀瀝。久服輕身耐老。一名思仙。"杜仲的化學成分主要有木脂素類、環烯醚萜甙類、苯丙素類、黃酮類，其它成分還有酚類、三萜、甾體、揮發油、多糖、有機酸、氨基酸、磷脂、烷烴、醇類、維生素、微量元素及杜仲膠等。杜仲的藥理藥效作用主要有降壓作用、抗炎抗病毒的作用、有抗癌和防癌的作用、增強機體非特異性免疫功能、強壯抗衰老作用、利尿作用以及其他美白肌膚，消除老人斑，增加頭發黑色素細胞，提高頭發黑色素細胞活性，防止白發。文獻(徐詩論等，中草藥，1982，13:24;1983，14:27;周彥剛等，浙江省醫學科學院學報1993，37:32-35)報道杜仲能增加大鼠血皮質酮水平，減輕胸腺重量，并表現抗炎，增加肝糖元等皮質激素樣生理功效能;但未涉及對系統性紅斑狼瘡的作用。綜觀國內外的研究，均未見報道杜仲總多糖的防治系統性紅斑狼瘡的藥效及其藥物。
發明內容本發明的目的是提供中藥杜仲總多糖新的藥用用途，具體涉及杜仲總多糖在制備系統性紅斑狼瘡藥物中的用途。本發明從中藥杜仲中分離提取得到總多糖提取物。所述總多糖提取物經體外實驗證實有較強抗補體活性，整體動物模型試驗證實其具有很強的防治系統性紅斑狼瘡作用。本發明的杜仲總多糖通過下述方法制備杜仲藥材粉碎后以95%乙醇冷浸提取三次，每次7天，濾過，藥渣于室溫下通風處晾干，然后用熱水提取3次，濾過，合并提取液，濃縮，離心，上清液以三氯醋酸去游離蛋白，離心，上清液濃縮后流水透析3天，透析液濃縮至小體積后加乙醇至含醇量80%，沉淀用丙酮、乙醇洗漆后冷凍干燥即得總多糖提取物，收率達2%以上，多糖含量超過68%。上述杜仲總多糖用于抗補體和系統性紅斑狼瘡樣綜合征試驗1)抗補體激活經典途徑細胞溶血試驗采用豚鼠(購自復旦大學實驗動物部)血清1:80液作為補體，抗原激活補體經典途徑導致羊紅細胞溶血，結果顯示，測得杜仲總多糖可抑制細胞溶血。IC5。=462tig.mr(n=4)。2)抗補體激活旁路途徑細胞溶血試驗采用健康人血清l:IO稀釋液作為補體，激活補體旁路途徑導致兔紅細胞溶血，結果顯示，測得杜仲總多糖可抑制溶血。AP5。二1.675mg.m1—1(n=4)。3)總多糖用于防治系統性紅斑狼瘡樣綜合征試驗選用昆明種和BALB/c小鼠，以空腸彎曲菌滅活菌株免疫，建立系統性紅斑狼瘡綜合征模型。杜仲總多糖灌胃給藥，觀察試驗動物的血清中抗體水平及尿蛋白水平。取腎，石蠟固定，切片，顯微鏡下觀察病理改變，取脾和胸腺測定器官指數。結果證實，口服杜仲總多糖對小鼠狼瘡樣綜合征引起的腎損傷有明顯的保護作用。整體試驗結果證實，杜仲總多糖對小鼠系統性紅斑狼瘡有防治作用。圖1是SLE模型小鼠(昆明種)尿蛋白水平。圖2是空白對照組小鼠(昆明種)腎病理切片圖。圖3是模型對照組小鼠(昆明種)腎病理切片圖。圖4是SLE模型組小鼠(昆明種)腎病理切片圖。圖5是杜仲多糖給藥組小鼠(昆明種)腎病理切片圖。圖6是陽性對照(潑尼松)組小鼠(昆明種)腎病理切片圖。圖7是SLE模型小鼠(BALB/c)尿蛋白水平。圖8是SLE模型小鼠(BALB/c)抗ds-DNA抗體水平。圖9是SLE模型小鼠(BALB/c)抗組蛋白抗體水平。圖10是空白對照組小鼠(BALB/c)腎病理切片圖。圖ll是模型對照組小鼠(BALB/c)腎病理切片圖。圖12是SLE模型組小鼠(BALB/c)腎病理切片圖。圖13是杜仲多糖(30mg/kg)給藥組小鼠(BALB/c)腎病理切片圖。圖14是杜仲多糖(15mg/kg)給藥組小鼠(BALB/c)腎病理切片圖。圖15是陽性對照(潑尼松)組小鼠(BALB/c)腎病理切片圖。具體實施方式實施例1取杜仲藥材100g粉碎后以95X乙醇冷浸提取三次，每次7天，濾過，藥渣于室溫下通風處晾干，然后用熱水提取3次，濾過，合并提取液，濃縮，離心，上清液以三氯醋酸去游離蛋白，離心，上清液濃縮后流水透析3天，透析液濃縮至小體積后加乙醇至含醇量80%，沉淀用丙酮、乙醇洗滌后冷凍干燥即得總多糖提取物，收率達2%以上，多糖含量超過68%。實施例2將杜仲C6""co肌'a〃^wWesOlive.)總多糖3.Omg.ml—1用巴比妥緩沖液(VBS2+)對倍稀釋得八個濃度的溶液，各取0.2ml各濃度樣品加入0.2ml補體(豚鼠血清1:32稀釋液)，O.lml2%羊紅細胞(sheepredbloodcell，SRBC)和0.Imll:1000溶血素(抗SRBC血清)，將每管37。C水浴30分鐘后放置入低溫高速離心機2500G、4'C離心，20min后分別取每管上清0.25ml于酶標儀405nm下測定吸光度。同時將0.2ml各濃度樣品溶液與0.4mlVBS2+混合，放置入低溫高速離心機以2500G、4。C離心10min，取每管上清0.25ml于酶標儀405nm下測定吸光度，作為樣品吸光本色值。再將每種不同濃度的樣品效價測定吸光度減去相應濃度下樣品吸光本色值為加入藥物后的溶血吸光度，并附加補體正常溶血管作為體系全溶血對照，計算藥物抑制溶血的半數抑制濃度(IC5。)為462Pg.ml—1(n=4)。實施例3將杜仲(^/c卿ia"7yz^VesOlive.)總多糖3.Omg.ml—'用含EGTA的巴比妥緩沖液(EGTA-VBS)對倍稀釋得八個濃度的溶液，取O.15ml各濃度樣品加入0.15ml補體(人血清hIO稀釋液)，0.2ml2%兔紅細胞，將每管37'C水浴30分鐘后放置入低溫高速離心機2500G、4'C離心，20min后分別取每管上清0.25ml于酶標儀405nm下測定吸光度。再將0.15ml各濃度樣品溶液與0.35mlEGTA-VBS混合，放置入低溫高速離心機以2500G、4。C離心10min，取每管上清0.25ml于酶標儀405nm下測定吸光度，作為樣品吸光本色值。再將每種不同濃度的樣品效價測定吸光度減去相應濃度下樣品吸光本色值為加入藥物后的溶血吸光度，并附加補體正常溶血管作為體系全溶血對照，計算藥物抑制溶血的半數抑制濃度(AP5。)為1.675mg.m1—1(n=4)。實施例4昆明種小鼠30只(16—20g),隨機分為5組(A、B、C、D、E組)。A組為正常對照組，B組為模型對照組，C組為SLE模型組，D組為杜仲多糖組，E組為醋酸潑尼松組。初次免疫，A組為正常對照組，尾根部皮下注射生理鹽水，B組為模型對照組，尾根部皮下注射弗氏完全佐劑，其余各組以空腸彎曲菌配合弗氏完全佐劑尾根部皮下注射，免疫誘導SLE樣綜合征，每只小鼠注射量為50pl。初次免疫后第14天加強免疫1次A組和B組皮下注射生理鹽水，其余各組皮下注射空腸彎曲菌菌懸液，每只小鼠注射量為0.2ml。小鼠在免疫當天開始灌胃給藥，每天一次至第32天。D組杜仲多糖給藥劑量為30mg/kg，E組醋酸潑尼松組給藥劑量為5mg/kg，B組和C組均給予配藥用空白賦形劑(5%羧甲基纖維素鈉，CMC),A組不灌胃。小鼠于免疫后d32，常規檢測尿蛋白水平及顯微鏡下觀察腎石切片病理改變，病理損傷評級，按損傷的嚴重程度分為輕、中、重度，分別給1、2、3分，無病理損傷給0分。結果顯示，與正常對照組和模型對照組相比，SLE模型鼠的尿蛋白明顯升高，杜仲多糖對SLE樣綜合征小鼠尿蛋白有明顯的降低作用(附圖1)。腎病理檢測顯示，正常組小鼠腎臟正常，模型對照小鼠基本正常。模型組小鼠腎臟均有炎性細胞侵潤、腎小球增大和腎小球囊腔縮小。杜仲多糖給藥組所有小鼠都無腎小球增大、腎小球囊腔縮小現象，無炎性細胞侵潤。陽性對照藥強地松僅有一只小鼠的腎小球部分增大、囊腔縮小，伴炎性細胞侵潤(附圖2，3，4，5，6)。結果表明，杜仲總多糖在體內降低尿蛋白水平，明顯改善腎小球的增大，抑制炎性細胞侵潤，有緩解SLE樣小鼠腎損傷作用。表1是昆明種小鼠腎病理損傷評級(X土SD)(n=25)。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>其中，Hc與SLE模型組比較P〈0.05;林與SLE模型組比較P〈0.01。實施例5BALB/c小鼠48只(16—20g)，隨機分為5組(A、B、C、D、E組)。A組為正常對照組(n=8)，B組為模型對照組(n=8)，C組為SLE模型組(n=10)，D組為杜仲多糖組(n=9)，E組為醋酸潑尼松組(n=8)。初次免疫，A組為正常對照組，足跖部皮下注射生理鹽水，B組為模型對照組，足跖部皮下注射弗氏完全佐劑，其余各組以空腸彎曲菌配合弗氏完全佐劑足跖部皮下注射，免疫誘導SLE樣綜合征，每只小鼠注射量為50pl。初次免疫后第14天加強免疫1次A組和B組尾靜脈注射生理鹽水，其余各組注射空腸彎曲菌菌懸液，每只小鼠注射量為0.2ml。在免疫當天開始給小鼠灌胃給藥，每天一次至第34天。D組杜仲多糖給藥劑量為30mg/kg、15mg/kg，E組醋酸潑尼松組給藥劑量為5mg/kg，B組和C組均給予配藥用空白賦形劑(5%羧甲基纖維素鈉，CMC)，A組不灌胃。免疫后第35天，BALB/c小鼠常規取血測定血清抗自身抗體水平。取小鼠胸腺、脾稱重，求器官指數。器官指數=臟器重(mg)/10g體重。取雙側腎，石蠟固定，切片，顯微鏡下觀察病理改變，病理損傷評級，按損傷的嚴重程度分為輕、中、重度，分別給l、2、3分，無病理損傷給0分。結果顯示，與正常對照組和模型對照組相比，SLE模型鼠的尿蛋白明顯升高，杜仲多糖30mg/kg對SLE樣綜合征小鼠的尿蛋白有明顯的降低作用(附圖8)。與正常對照組和模型對照組相比，SLE模型鼠的抗ds-DNA抗體和抗組蛋白抗體水平明顯升高，杜仲總多糖30mg/kg和15mg/kg對SLE樣綜合征小鼠的抗ds-DNA抗體有明顯的降低作用。杜仲總多糖30mg/kg對抗組蛋白抗體水平明顯的降低作用(附圖9，10)。與正常小鼠和模型對照組相比，免疫使模型組小鼠的脾指數升高。與模型組相比，杜仲總多糖15mg/kg和陽性對照藥潑尼松均抑制小鼠免疫后脾指數升高，但潑尼松對脾指數有過度抑制作用，脾指數低于正常小鼠(p〈0.001)。與正常小鼠和模型對照組相比，免疫使模型組小鼠的胸腺指數升高。與模型組相比，杜仲總多糖15mg/kg對胸腺指數有明顯的降低作用。腎病理檢測顯示，正常組小鼠腎臟正常，模型對照小鼠基本正常。模型組小鼠腎臟腎小球的腫脹、腎小球囊腔縮小、腎小球細胞數的增多，杜仲總多糖對以上病變有明顯的改善作用。與模型組小鼠相比，正常組小鼠腎小管正常，模型對照小鼠基本正常，模型組小鼠腎小管有明顯的腫脹。由于模型對照組也給予弗氏完全佐劑，造成模型對照組小鼠與正常組相比腎臟有輕度損傷。杜仲總多糖對SLE樣模型小鼠的腎小管腫脹也有改善作用(附圖ll，12，13，14，15)。結果表明，杜仲總多糖在體內抑制SLE樣綜合征小鼠的抗自身抗體水平的升高(抗ds-DNA抗體和抗組蛋白抗體)，改善小鼠的體液免疫應答亢進，抑制脾和胸腺的腫大；杜仲總多糖降低SLE樣綜合征小鼠的尿蛋白水平，明顯改善腎小球和腎小管的病變，有緩解SLE樣小鼠的腎損傷的作用。表2是BALB/c小鼠的脾指數和胸腺指數(X士SD)(n=39)。表3,是BALB/c小鼠腎病理損傷評級(X士SD)(n=39)表2組別數量脾指數(mg/10g)胸腺指數(mg/10g)正常845.7±12.0**19.6±3.2*模型對照849.1±10.1*19.2±6.4林SLE模型959.2±17.325.3±4.7杜仲(30mg/kg)852.3±9.023.6±3.3杜仲(15mg/kg)848.0±6.0*20.8±2.7*潑尼松(5mg/kg)824.6±8.4***16.2±6.l氺氺氺其中，承與SLE模型組比較P〈0.05;林與SLE模型組比較P〈0.01，***與SLE模型組比較P〈0.001。表3組別數量腎小球腫脹腎小球囊腔縮小腎小球細胞數增多腎小管病變正常80.6±0.5"0.8±0.5**0.8±0.5**0.4±0.5**模型對照80.4±0.5**1.1±0.4**1.5±0.5**1.6±0.5*SLE模型92.9±0.32.2±0.43±02.4±0.5杜仲81.5±0.5**1.4±0.5*1.8±0.5**1.6±0.5*(30mg/kg)杜仲82.3±0.5*2±02.1±0.4**2.4±0.5(15mg/kg)潑尼松62±0**2±02±0**1.7±0.5*(5mg/kg)其中，Hc與SLE模型組比較P〈0.05;林與SLE模型組比較P〈0.01。權利要求1、杜仲總多糖在制備防治系統性紅斑狼瘡藥物中的用途。2、杜仲總多糖在制備防治自身免疫病藥物中的用途。3、杜仲總多糖在制備抗變態反應藥物中的用途。4、杜仲總多糖在制備抗補體藥物中的用途。5、權利要求1或2或3或4的用途，其中所述的杜仲總多糖通過下述方法和步驟制備杜仲藥材粉碎后以95%乙醇冷浸提取三次，每次7天，濾過，藥渣于室溫下通風處晾干，然后用熱水提取3次，濾過，合并提取液，濃縮，離心，上清液以三氯醋酸去游離蛋白，離心，上清液濃縮后流水透析3天，透析液濃縮至小體積后加乙醇至含醇量80%,沉淀用丙酮、乙醇洗滌后冷凍干燥即得總多糖提取物，收率達2%以上，多糖含量超過68%。全文摘要本發明屬中藥領域，涉及杜仲總多糖在制備防治系統性紅斑狼瘡藥物中的用途。本發明從中藥杜仲中分離提取得到總多糖提取物，平均產物收率2.2％，多糖含量＞68％。所述總多糖提取物經體外實驗證實有較強抗補體活性，整體動物模型試驗顯示，對系統性紅斑狼瘡樣綜合征小鼠的自身免疫反應亢進和腎損傷有明顯的保護作用，證實對系統性紅斑狼瘡樣綜合征有防治作用。可制備防治系統性紅斑狼瘡藥物和防治自身免疫性疾病等藥物。文檔編號A61P37/00GK101095716SQ20071004345公開日2008年1月2日申請日期2007年7月5日優先權日2007年7月5日發明者弘力,朱紅薇,錚王,章蘊毅,陳道峰申請人:復旦大學