共表達gdnf和bdnf的轉基因神經干細胞的制作方法

專利名稱：共表達gdnf和bdnf的轉基因神經干細胞的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種治療帕金森氏病的共表達神經營養因子GDNF和BDNF的 轉基因神經干細胞系的構建，其所在的技術領域與生命科學和生物醫藥技術有 關。
背景技術：
膠質細胞源性神經營養因子(GDNF)是由腦組織中的神經膠質細胞產生、分 泌的一種有著重要生物功能的神經細胞營養因子。GDNF對中樞和外周的多種神 經細胞具有較為廣泛的神經營養作用，是目前發現的對多巴胺神經元和運動神 經元作用最為顯著的一類神經營養因子，有較廣泛的促進神經元生長和分化的 作用，尤其對多巴胺神經元作用最強(LinLTetal. Science 1993. 260(5111): 1130-2; Henderson et al. Science 1994， 266(5183): 1062-4)。近年在動物 與人活體實驗證明GDNF在治療缺血性腦損傷，肌萎縮側索硬化和帕金森氏病有 較好作用，是當今國際上治療帕金森氏病的熱門研究領域之一。
國內外對GDNF的功能進行了廣泛的研究。國外在動物或人體都是通過病 毒載體的基因治療或導管直接給藥對GDNF研究的(Do Thi NA， et al: Gene Ther. 2004 Jan 15)。通過病毒載體的基因治療或導管給藥顯示出一定程度的臨 床治療效應，但需要反復多次應用才行。近年在帕金森氏病患者的單側豆狀核 注入GDNF的臨床研究，顯示有顯著的、持續的雙側癥狀改善效果，而無明顯不 良反應(Slevin JT， et al: Neurosurg Focus. 2006 May 15;20(5); Slevin JT,et al: J Neurosurg. 2005 Feb;102(2):401; Gill SS， et al: Nat Med. 2003 May ;9 (5) :589-95)。
另一神經營養因子，腦細胞源性神經營養因子(BDNF，下同)是由腦細胞產 生、分泌的一種有著重要生物功能的神經細胞營養因子。BDNF對中樞和外周的 多種神經細胞具有較為廣泛的神經營養作用，如促進某些神經群的生存和分 化，調控神經突軸的軔力，并與海馬的學習、記憶以及脊髓疼痛機制有關等 (Pezet S et al: Expert 0pin Ther Targets. 2004 Oct;8(5):391-9)。
更重要的是，BDNF對多巴胺神經元的生存和生長有重要作用。它具有阻止 凋亡細胞的死亡，增加酪氨酸水解酶陽性神經元的生存和此神經元纖維的生長 (Ostergaard K， et al: Exp Neurol. 1996 Dec;142(2):340-50; Tang FI, et al: Exp Brain Res. 1998 Apr; 119(3) :287-96; Singh S， et al: Indian J Exp Biol. 2006 S印;44 (9) :699-704:胡旭東等.神經解剖學雜志，1998年02期)。 研究證明數種中樞神經系統疾病與此BDNF支持減少相關連。因此，BDNF作為一
種強效神經保護因子，被認為是治療某些中樞神經系統疾病的一個好的候選因 子(Pezet S， et al: Expert Opin Ther Targets, 2004 Oct;8(5):391-9)。
由于GDNF和BDNF具有上述重要生理功能，研究人員就BDNF和GDNF對冶療 中樞神經系統退行性疾病-帕金森氏病的作用進行了研究。研究證明帕金森 氏病黑質神經元BDNF表達比正常對照顯著減少(HowellsDW， etal: Exp Neurol. 2000 Nov;166(1) :127-35); Sun M,等應用表達GDNF、 BDNF的單純性皰疹病毒 載體，在鼠帕金森氏病動物模型上，定向注入腦紋狀體，分別觀察GDNF、 BDNF 及其二者對帕金森氏病鼠動物黑質紋狀體多巴胺神經元的保護作用以及行為缺 陷糾正的作用進行了觀察，發現GDNF作用在行為缺陷糾正的作用方面比BDNF作用更顯著，但并末能增加多巴胺神經元的數量(SunM， etal: Brain Res. 2005 Aug 9; 1052(2) :119-29)。同樣，Singh S，等的研究也映證Sun M的結果(Singh S et al: Indian J Exp Biol. 2006 S印;44(9):699-704)。此外，有研究證明 接受GDNF和BDNF綜合治療的老鼠，其多巴胺系統紋狀體的存活的活性纖維數 量較對照組和單用GDNF組增多，并能刺徼內源神經干細胞，使其遷移到紋狀體 (Torp R et al: Tidsskr Nor Laegeforen. 2006 Mar 23;126(7):899—901)。
近年來，隨著干細胞的發現，研究人員對包括胚胎干細胞、骨髓干細胞和 神經干細胞等進行了廣泛深入的基礎研究，證明干細胞具有分化多向性和可導 向性，同時證明干細胞沒有或幾乎沒有免疫原性(Zeng SL et al:細胞與分子 免疫學雜志.2006 Jan;22(1) :110-2)。這些基礎研究為臨床應用奠定了堅定實 基礎。目前研究人員在臨床上應用上述干細胞對多種疾病的治療開展了應用研 究，取得可喜的成績，顯示了干細胞臨床上治療多種難治性疾病的巨大前景。
神經干細胞(NSCs)由于具有高度自生和神經分化能力，已被用于 實驗動物模型帕金森氐病的治療(YasuharaT, st al: J Neurosci. 2006 Nov29:26(48): 12497-511; Kim SU， st al: Neuropathology. 006Apr;26(2):129-40; Iacovitti L， et al: Brain Res. 2007 Jan 5; 1127 (1) : 19-25)。這些研究結果顯示神經干細胞移植到6-羥基多巴胺損 害的鼠紋狀體后，與在受損紋狀體部位單次或連續微泵注入神經營養因子相比 較，帕金森氐病癥狀有顯著改善，而且，在移植區有內源性神經發生激活，并認 為是由于神經營養因子BDNF的分泌和神經分化的作用而發揮神經保護作用。此 外，為了獲得產生多巴胺的神經干細胞，研究人員(Park S et al: Neurosci Lett. 2003 Dec 19; 353 (2) :91-4)，將酪氨酸羥化酶(TH)和GTP環水解酶基因共導入神經干細胞，移植后，動物帕金森氐病癥狀的改善明顯，認為酪氨酸羥化酶(TH) 和GTP環水解酶基因遺傳導入的神經干細胞在帕金森氐病患者的細胞替代療法 中有很大的潛力。亦有應用酪氨酸羥化酶(TH)和BDNF或GTP環水解酶遺傳修飾 的纖維母細胞、星狀細胞和人胚胎干細胞(Duan D et al: Exp Brain Res. 2005 Mar:161(3):316-24. ; Wang ZH et al: Neuroscience. 2002;113(3):629-40), 對帕金森病動物模型進行研究，均有較好的療效。
綜上所述，神經干細胞由于其神經分化能力、分泌神經營養因子和無免疫 原性，用于臨床上治療神經退行性疾病和/或中樞神經系統其他相關疾病是可行 的。而且轉基因神經干細胞將更具有針對性、是可行和有效的。
本發明基于以上的研究，為了更有效地治療神經退行性疾病，彌補神經干 細胞自身表達神經營養因子的不足，建立高表達GDNF和BDNF的轉基因神經干細 胞，通過定位移植技術，用于神經退行性疾病-帕金森氐病的治療將是可行的。

發明內容
本發明的目的是通過構建一種共表達人源神經營養因子GDNF和BDNF的轉 基因神經干細胞，形成一種能用于治療神經退行性疾病-帕金森氏病的新型神經 干細胞。本發明的新型神經干細胞，其主要特征為
1) .神經營養因子GDNF和BDNF為人源的，是成熟型基因序列；
2) .神經營養因子GDNF和BDNF的N-末端連接著人白細胞介素-2的分泌先導序 列；此先導序列由20個氨基酸構成；
3) .笫2)款所述的神經營養因子GDNF和BDNF是由CMV啟動子驅動、通過內部 核糖體結空合位點(IRES)連結形成的共表達質粒結構；4).神經干細胞為人源的、是通過電擊法將共表達GDNF和BDNF表達質粒導入 而形成的一種具有高表達神經營養因子GDNF和BDNF功能特點的新型神經干細 胞。


附圖l:人神經營養因子(GDNF)基因cDNA片段(RT-PCR)產物.第一泳道為 脫氧核苷酸(DNA,下同)分子量標準；第二和第三泳道為該基因反向轉錄酶-聚 合酶鏈反應(RT-PCR)產物。箭頭所指為該基因cDNA片段在瓊脂糖電泳上的位置。
附圖2:重組人神經營養因子(GDNF)的表達。此圖為轉化細菌后的表達產物 在SDS-PAGE膠經卡馬氏亮蘭染色后的結果。從左向右起，第一泳道為標準蛋白 質分子量標記物;第二泳道為未誘導的細菌產物；第三和第四泳道為誘導的產 物。箭頭所示為表達產物。
附圖3:該基因GDNF在表達產物的Western Blot分析結果。第一泳道 為標準蛋白質分子量標記物；第二泳道為末誘導細菌產物；第三、第四和 第五泳道分別為不同誘導時間的產物。顯示表達產物為符合預期的GDNF 基因產物。
附圖4:人神經營養因子BDNF基因cDNA片段(RT-PCR)產物.第一泳道為脫 氧核苷酸(DNA,下同)分子量標準；第二泳道為該基因的反向轉錄酶-聚合酶鏈 反應(RT-PCR)產物。箭頭所指為該基因cDNA片段。
附圖5:重組人神經營養因子BDNF的表達。此圖為轉化細菌后的表達產物在 SDS-PAGE膠經卡馬氏亮蘭染色后的結果。從左向右起，第一泳道為標準蛋白質 分子量標記物:第二泳道為未誘導的細菌產物；第三泳道為誘導產物。箭頭所示為表達產物。
附圖6: pIRES-GDNF/BDNF表達盒結構圖此表達盒圖譜顯示由位于N-未 端的CMV啟動子、GDNF、 IRES、 BDNF和SV40多聚腺嘌呤組成，并以不同內切酶 位點相連接。
具體實施例方式
構建高表達神經營養因子GDNF和BDNF功能特點的新型神經干細胞首先需 要分別克隆人GDNF和BDNF基因；其次構建共表達人GDNF和BDNF基因的表達 質粒；再其次轉染人神經干細胞，篩選、鑒定高表達GDNF和BDNF的神經干細 胞。
人膠質細胞源性神經細胞營養因子GDNF的克隆(包括人GDNF基因克隆及 其N未端的構建；原核表達質粒的構建和轉化后在原核細胞的表達)。 實施例一、人GDNF基因克隆及其N未端的構建 以備制的人腦組織信息核糖核苷酸(mRNA)為模板，用Poly(T)引物在反向 轉錄酶作用下，合成人腦組織的互補脫氧核糖核苷酸(cDNA).然后以人腦組織 cDNA作為模板，用人工合成的，含有編碼人白細胞介素-2分泌先導多肽核苷酸 和人GDNF基因N-末端序列核苷酸的正向引物和人GDNF基因C-末端序列核苷 酸的反向引物進行PCR擴增，進行人GDNF基因克隆及其N未端的改建，并在其 N-末端引入內切酶Nhel和Ndel位點，在其C-末端引入內切酶BamHl和HindUl 位點。引物l C-末端部份序列與引物2 N-末端部份序列相同(見下滑線)；引物 3 C-末端含GDNF的C-末端序列。
由于人白細胞介素-2分泌先導多肽核苷酸較長，故采用分步克隆法。即以人腦組織cDNA作為模板，先用引物2和引物3進行第一次PCR反應，再以此PCR 產物為模板，用引物1和引物3進行第二次PCR反應。 PCR引物設計如下 引物1(64 raer):
5， - gt|gctagccatatg[tacaggatgcaactcctgtcttgcattgcetctaagt;cttgcacttgt -3, 引物2(S3 mer):
5， - actaagtcttgcacttgtceicaaac￡Lgttctgagaagaagcgccggggatca-3, 引物3(34 mer):
5， —tcaagcttggatcctcagatacatccacaccttt -3，
PCR擴增產物經tai 1 ing加上腺嘌呤后，連接至T-easy載體，轉化細菌后， 擴增、抽提、純化，經DNA測序確定。
實施例二、含人GDNF基因原核細胞表達質粒的構建及其表達 用適當的內切酶，即Ndel和Hindlll分別消化上述含克隆的人GNDF的 T-easy載體和原核細胞表達載體Peal-n，用瓊脂糖電泳分離，并進行純化。 純化后的人GNDF和原核細胞表達載體PCAL-N在連接酶作用下進行拼接。轉化 細菌后，擴增、抽提、純化，經內切酶消化DNA確定成功構建的含人GDNF基因 原核表達質粒。
實施例三、人BDNF基因克隆及其N未端的構建
以備制的人腦組織信息核糖核苷酸(mRNA)為模板，用Poly(T)引物在反向 轉錄酶作用下，合成人腦組織的互補脫氧核糖核苷酸(cDNA).然后以人腦組織cDNA作為模板，用人工合成的，含有編碼人白細胞介素-2分泌先導多肽核苷酸 和人BDNF基因N-末端序列核苷酸的正向引物和人BDNF基因C-末端序列核苷 酸的反向引物進行PCR擴增，進行人BDNF基因克隆及其N未端的改建。并在其 N-末端引入內切酶Ncol和Smal位點，在其C-末端引入內切酶Xbal和Hindlll 位點。引物l C-末端部份序列與引物2 N-末端部份序列相同(見下滑線)；弓f物 3 C-末端含GDNF的N-末端序列。
同樣，由于人白細胞介素-2分泌先導多肽核苷酸較長，故采用分步克隆法。 方法與實施例一相同。PCR引物設計如下 引物1(63 mer):
5， - gtccatggcccgggatgtacaggatgcaactcctgtcttgcattgcactaagtcttgcacttgt -3，
引物2(55 mer):
5 ， — actaagtcttgcacttgtcacaaacagtcactctgaccctgcccgccgaggggag—3，
引物3(41 mer):
5， -gcctctagaaagcttctatcttccccttttaatggtcaatg -3， PCR擴增產物經tailing加上腺嘌呤后，連接至T-easy載體，轉化細菌 后，擴增、抽提、純化，經DNA測序確定。
實施例四、人BDNF基因原核細胞表達質粒的構建及其表達
用適當的內切酶，即Ncol和Hindlll分別消化上述含克隆的人BNDF的 T-easy載體和原核細胞表達載體pET-45b(+) DNA，用瓊脂糖電泳分離，并迸 行純化。純化后的人BNDF和原核細胞表達載體pET-45b(+) DNA在連接酶作用 下進行拼接。轉化細菌后，擴增、抽提、純化，經內切酶消化DNA確定成功構建的含人BDNF基因原核表達質粒。實施例五、構建共表達GDNF和BDNF的表達質粒本實施例所用的載體 pIRESneo3為CloneTech公司產品，以此載體為骨架構建共表達GDNF和BDNF的 表達質粒。通過多次不同的內切酶消化、連接反應、感受態細菌轉化和測序證 實，完成此表達盒構建。即以5-末端為Nhel和3-末端為BamHl內切酶位點的 GDNF片段，拼接于IRES的上游；以5-末端為Smal內切酶位點和3-末端為Xbal 內切酶位點的BDNF基因片段取代載體中的neo基因片段，拼接于SV40多聚腺 嘌呤的上游，而位于IRES的下游；至此，此共表達GDNF和BDNF的表達質粒 pIRES-GDNF/BDNF構建才告完成。將此pIRES-GDNF/BDNF表達質粒用脂質體導入真核細胞，觀察由 cytomegalovirus (CMV)啟動子驅動共表達GDNF和BDNF的狀況。實施例六、轉基因神經干細胞的構建在嚴格無菌條件下，采用常規細胞 培養法，按培養神經干細胞的特殊條件培養神經干細胞。取每毫升約一百萬個 神經干細胞，加入5-10毫克pIRES-GDNF/BDNF表達質粒DNA，輕輕混勻，用 Bio-Rad公司生產的電擊轉化儀，電擊轉染神經干細胞。置于冰上約10分鐘， 然后移至含適當抗生素的神經干細胞培養液的培養皿中，于二氧化碳培養箱、 37t靜置培養過夜。實施例七、共表達GDNF和BDNF神經干細胞的分離鑒定待轉染神經干 細胞長滿后，采用稀釋培養分離法，收集培養細胞上清液，進行westernblotting反應和PT-PCR反應，確定是否及高表達GDNF和BDNF的神經干細胞， 然后據此分離髙表達GDNF和BDNF的神經干細胞，進行擴增培養。實施例八、共表達GDNF和BDNF的轉基因神經干細胞的應用應用外科 神經核定位技術及輸送糸統，將共表達GDNF和BDNF的轉基因神經干細胞定點 移植至引發帕金森氏病的神經核團，如絞狀體、豆狀核和黑質等。序列表Individual ApplicantStreet :廣州市國際企業孵化器A區610房City :廣州市State :廣東省Country :中國PostalCode : 510633PhoneNuraber : 020-32290208FaxNumber : 020-32290208EmailAddress : shangwu一w錢yahoo- com 〈110> Us衡me :王 <110> FirstNeune :尚武 〈110> Middlelnitial : <110> Suffix :Application Project<120> Title :構建共表達GDNF和BDNF轉基因神經干細胞的方法〈130> AppFileReference :<140〉 CurrentAppNufflber : 1〈141> CurrentFilingDate : 2007.05.05Sequence〈210〉 1 <211〉 490 〈212> ■〈213〉 GDNF人工序列 <400〉 1gtgctagccatstgtacacctgtcttgc3ttgC3Ct33gtcttgc3cttg60ttc3cc3gggc3gtgcttcct3g33g3g3gcggwtcggc120aggctgcagcggtcggagaggccsgaggggcs180a333ccggggttgtgtcttsactgcsstgtcsctgscttgggtctgggct240ettgs33cc33tgatttttsggtsctgcsgcggctcttgcg300caacgtacgatg33aaacttstccsgsasttgagtgscaasg360tsgggcaggcatgttgcag3ccc3tcgcctttgstg3tgacctgtcgtttttagatgata4203cctggttt3ccatattcttccgct333sggtgtggstgtstctgaggat480cc33gcttgs490<210> 2 <211> 154 <212> PRT〈213> GDNF人工序列 <400〉 2Met Tyr Arg Met Gin Leu Leu Ser Cys lie 1 5 10Leu Val Thr Asn Ser Ser Pro Asp Lys Gin20 25Arg Arg Glu Arg Asn Arg Gin Ala Ala Ala35 40Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gin Arg50 55Cys Val teu Thr Ala lie His Leu Asn Val65 70Gly Tyr Glu Thr Lys Glu Glu Leu lie Phe80 85Ser Cys Asp Ala Ala Glu Thr Thr Tyr Asp95 100Leu Ser Arg Asn Arg Arg Leu Val Ser Asp110 115Cys Cys Arg Pro lie Ala Phe Asp Asp Asp125 130Asp Asn Leu Val Tyr His lie Leu Arg Lys140 145Cys Gly Cys lie 154Ala Leu Ser Leu Ala 15Met Ala Val Leu Pro 30Ala Asn Pro Glu Asn 45Gly Lys Asn Arg Gly 60Thr Asp Leu Gly Leu 75Arg Tyr Cys Ser Gly 90Lys lie Leu Lys Asn 105Lys Val Gly Gin Ala 120Leu Ser Phe I>eu Asp 135His Ser Ala Lys Arg 150<210〉 3 <211〉 436 <212〉廳〈213〉 BDNF人工序列 <400> 3gtcccggg3tgtacaggatgcaactcctgtcttgc3ttgcactaagtcttgcacttgtca60C333C3gtC3ctctgsccctgcccgccgaggggagctgsgcgtgtgtgsc3gt3ttsgtg120agtgggtaacggcggcsgsccsgtggscstgtcgggcgggscggtc3C3g180ggtccctgt3tc3335tggcc3t3CttC"t3Cgagaccaagt240gcasitcccstgggttsc3C3gcaggggcatC3ttgg33ct300cccagtgccgtcgtacgtgcgggcccttaccatggatagc360ttggctggcgsttc3t33ggatsgscscttcttgtgtstgt3csttgscc420gaagstagtctagagt436〈210> 4 <211〉 144 <212> PRT<213〉 BDNF人工序列 〈400〉 4Met Tyr Arg Met Gin Leu Leu Ser Cys 1 5L>eu Val Thr Asn Ser His Ser Asp Pro 20Ser Val Cys Asp Ser lie Ser Glu Trp 35Lys Thr Ala Val Asp Met Ser Gly Gly 50Lys Val Pro Val Ser Lys Gly Gin ILeu 65Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly Tyr Thr 85lie Asp Lys Arg His Trp Asn Ser Gin 100Tyr Val Arg Ala Leu Thr Met Asp Ser 115Arg Phe lie Arg lie Asp Thr Ser Cys 130Lys Arg Gly Arg 144lie Ala Leu 10Ala Arg Arg 25Val Thr Ala 40Thr Val Thr55Lys Gin Tyr 70Lys Glu Gly 90Cys Arg Thr 105Lys Lys Arg 120Val Cys ThrSer Leu Ala 15Gly Glu Leu 30Ala Asp Lys 45Val Leu Glu 60Phe Tyr Glu 80Cys Arg Gly 95Thr Gin Ser 110lie Gly Trp 125Leu Thr lie135 140
權利要求
1、一種共表達神經營養因子GDNF和BDNF的表達質粒本發明構建的表達質粒以pIRESneo3載體為骨架，經改造形成本發明的共表達神經營養因子GDNF和BDNF的表達質粒，其表達盒具有以下主要特征a).神經營養因子GDNF和BDNF基因均為編碼GDNF和BDNF成熟蛋白氨基酸序列的核苷酸序列；b).神經營養因子GDNF和BDNF基因的N-末端均連結著人白細胞介素-2的分泌先導序列，此分泌先導序列由編碼20個氨基酸(MYRMQLLSCIALSLALVTNS)的60個核苷酸組成；c).神經營養因子GDNF和BDNF基因是通過內部核糖體結合位點(IRES)連接的；GDNF基因位于內部核糖體結合位點上游、而BDNF位于內部核糖體結合位點的下游、SV40多聚腺嘌呤的上游；d).CMV啟動子驅動神經營養因子GDNF和BDNF基因的共表達。
2、 根椐權利要求1， 一種CMV啟動子驅動共表達驅動神經營養因子GDNF和BDNF 基因的表達盒，其含有下列氨基酸序列和具有轉錄功能的脫氧核苷酸序列a) .親本源于人的神經營養因子GDNF和BDNF基因成熟蛋白氨基酸序列和具 有轉錄功能的脫氧核苷酸序列；b) .內部核糖體結合位點(IRES)源于腦心肌炎病毒。
3、 根椐權利要求l，表達盒中共表達的GDNF基因既可位于IRES的上游，也可 位于其下游；BDNF亦如此
4、 根椐權利要求1和要求3，本發明由CMV啟動子驅動共表達的、位于IRES 上游的基因GDNF、位于IRES下游的基因BDNF基因；但不限于神經營養因子， 也包括酪氨酸羥化酶(TH)和GTP環水解酶或其他神經細胞因子基因。
5、 本發明應用的神經干細胞親本為人源的，但不限于神經干細胞，也包括人胚 胎干細胞、星狀細胞和纖維母細胞。
6、 根椐權利要求l，由本發明構建的共表達GDNF和BDNF的pIRES-GDNF/BDNF 表達質粒經電擊轉染神經干細胞所形成的轉基因神經干細胞及其在治療神經退 行性疾病和/或其他中樞性神經系統疾病的應用。
全文摘要
本發明描敘了一種構建共表達GDNF和BDNF的轉基因神經干細胞的方法及其用途和意義，其主要特征為1)表達的GDNF和BDNF親本為人源的、為編碼成熟GDNF和BDNF蛋白的核苷酸序列；2)GDNF和BDNF的N-未端連結人IL-2分泌先導序列，表達的重組GDNF和BDNF為分泌型蛋白；3)構建的表達質粒含有由CMV啟動子驅動，通過內部核糖體結合位點(IRES)連結GDNF和BDNF的表達盒；4)神經干細胞為人源的，應用電擊轉導法，使其為共表達GDNF和BDNF的轉基因神經干細胞；本發明的轉基因神經干細胞，彌補了神經干細胞自身GDNF和/或BDNF的不足，為臨床冶療神經退行性疾病-帕金森氏病和/或其他中樞神經系統疾病提供了一種轉基因神經干細胞治療新途經。
文檔編號A61K35/30GK101302529SQ20071002783
公開日2008年11月12日 申請日期2007年5月8日 優先權日2007年5月8日
發明者徐評議, 王尚武 申請人:王尚武;徐評議