專利名稱：白花前胡總香豆素作為治療呼吸道疾病藥物的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及天然藥物領域，具體涉及一種白花前胡總香豆素提取物的新的醫藥用途，即其可作為治療呼吸道疾病的藥物的用途。
背景技術：
中藥前胡為傘形科植物白花前胡(Peucedanum Praerupterum Dunn.)的干燥根，其性微寒，味苦、辛，具有散風清熱、降氣化痰之功效，多與甘草、防風、枳殼、桔梗等聯用治療風熱咳嗽痰多，痰熱喘滿，咯痰黃稠。CN1433790A公開了白花前胡用于治療腫瘤的用途。現代中藥學研究發現其有效部位以香豆素類化合物為主，主要為白花前胡甲素和白花前胡丙素等角型二氫吡喃香豆素類化合物。有報道白花前胡的香豆素成分對心腦缺血、抗心衰有效(《中國中醫藥雜志》2006年第40卷第5期p64-65)；也有報道白花前胡總香豆素對小鼠肝藥酶活性有影響(Herald of Medicine Vol.23 No8 August 2004 p522-524)；還有報道白花前胡總香豆素具有解熱鎮痛抗炎作用(《中國中醫藥信息雜志》，2004年8月第11卷第8期p688-689)。
發明內容
本發明公開白花前胡總香豆素的醫藥新用途，即白花前胡總香豆素用于治療呼吸道疾病的用途，白花前胡香豆素可制備平喘、止咳、祛痰藥物，白花前胡總香豆素優選治療急慢性支氣管炎、肺炎、支氣管哮喘、過敏性哮喘或百日咳等疾病，進一步優選治療過敏性哮喘。
本發明的白花前胡總香豆素的制備方法如下以粉碎的白花前胡干燥根為原料，經有機溶劑提取、過濾、回收溶劑、干燥，即得，其中有機溶劑選自石油醚、乙醚、己烷或環己烷。其中有機溶劑優選石油醚。
還可以用以下方法制備以粉碎的白花前胡的干燥根為原料，用水、乙醇或甲醇提取，提取液用有機溶劑萃取，回收萃取溶劑，干燥，即得，其中萃取用有機溶劑選自石油醚、乙醚、己烷或環己烷。乙醇或甲醇的濃度優選30％～95％，為重量百分比。
上述方法制備所得白花前胡總香豆素主要成分為白花前胡甲素、白花前胡乙素、白花前胡E素、Peucedanocoumarin I及其它香豆素單體化合物，其總含量大于50％。
下面是白花前胡總香豆素(以下簡稱TCP)的部分藥理實驗及結果。
(一)TCP的藥理實驗1、對小鼠氨水引咳的影響18～22g ICR雄性小鼠50只按體重隨機分為5組，連續灌胃給藥7天，每天一次，末次給藥1h后將小鼠置于500mL廣口瓶中，將滴有0.3mL 25％濃氨水的濾紙片懸于瓶口，30s后取出。觀察并記錄小鼠咳嗽的潛伏期及3分鐘內的咳嗽次數，以小鼠腹腔收縮并張口為咳嗽指標。
2、對豚鼠枸櫞酸引咳的影響350～450g雄性豚鼠40只，按體重隨機分為5組，連續灌胃給藥7天，每天一次，末次給藥后1h，將豚鼠逐一放入玻璃鐘罩內，用噴霧器噴17.5％枸櫞酸溶液20s引咳，觀察并記錄豚鼠咳嗽潛伏期(從噴霧開始到出現第一次咳嗽的時間)和5min內咳嗽的次數。
3、對豚鼠Ach-His致喘的影響150～200g雄性豚鼠，逐一放入玻璃鐘罩內，用噴霧器噴2％Ach-0.1％His混合液(1∶1)10 s，記錄豚鼠的引喘潛伏期(從噴霧開始到呼吸急促、抽搐跌倒的時間)，超過150s者不予選用。將篩選出的豚鼠按體重隨機分為5組，連續灌胃給藥7天，每天一次，末次給藥后1h，將所有豚鼠噴霧引喘，記錄豚鼠的引喘潛伏期，潛伏期超過360s的當360s計。
4、對小鼠氣管酚紅排泌量的影響18～22g ICR雄性小鼠50只按體重隨機分為5組，連續灌胃給藥7天，每天一次，末次給藥0.5h后腹腔注射0.5％酚紅生理鹽水溶液10mL·kg-1，再0.5h后脫頸椎處死小鼠，剝離氣管，插入灌洗器，吸取5％NaHCO3溶液0.5mL來回灌洗呼吸道3次，將灌洗液注入離心管中，重復3次，共用洗液1.5mL灌洗9次，合并灌洗液，離心(2000rpm，5min)，每管取上清0.2mL置于96孔板中，用酶標儀于546nm處測光密度OD值。
5、對小鼠二甲苯致炎的影響18～22g ICR雄性小鼠50只按體重隨機分為5組，連續灌胃給藥7天，每天一次，末次給藥1h后，每只小鼠右耳前后兩面涂30μL二甲苯致腫，左耳不涂以作對照，1h后處死小鼠，剪下左、右耳，用8mm直徑打孔器分別在同一部位打下圓耳片稱重，以左右耳差值作為腫脹度。
6、對小鼠棉球肉芽腫的影響18～22g ICR雄性小鼠50只，腹腔注射3.5％水合氯醛10mL/kg麻醉，在無菌操作下將15mg滅菌棉球1只植入小鼠右蹊部(每只棉球高壓滅菌后滴150μL 25％青霉素鈉和鏈霉素混合液預處理)。術后按體重隨機分為5組，于術后第二天開始灌胃給藥，連續6天，每天一次，于第8天脫頸椎處死小鼠，剝離棉球肉芽腫，于80℃烘箱中干燥3h后稱重，減去原棉球重量即為肉芽腫凈重。
7、對正常小鼠碳粒廓清的影響18～22g ICR雄性小鼠50只，隨機分為5組，連續給藥7天，末次給藥后1h，小鼠尾靜脈注射印度墨汁稀釋液(使用前以生理鹽水稀釋4倍)，注射后分別于2、12min用定量玻璃毛細管從眶內靜脈叢取血20μL，溶于1mL 0.1％的Na2CO3溶液，在波長675nm條件下測定光密度值(OD)。最后將小鼠脫頸椎處死，分別稱取肝、脾重量，依照下式計算廓清指數κ和校正廓清指數α。
κ＝(LogOD2-LogOD1)/(t2-t1)α＝κ1/3(體重/肝脾合重)8、對OVA致敏哮喘大鼠的影響(1)動物分組及模型制備取160±20g健康SD雄性大鼠60只，隨機分為6組，采用OVA注射霧化吸入致敏激發法復制哮喘大鼠。實驗第1天，將大鼠一次性腹腔注射10％OVA生理鹽水溶液1mL(OVA100mg，氫氧化鋁100mg，滅活百日咳桿菌菌苗6×109個)以致敏；第8天起，各實驗組灌胃給藥，正常組和模型組分別以0.02％CMC-Na灌胃；第15天起，于灌胃后1h，將大鼠分別置于玻璃容器中，以1％OVA生理鹽水溶液超聲霧化，自然吸入20min，誘發哮喘，隔天1次，共7次。
(2)對血中白細胞(WBC)及嗜酸性粒細胞(EOS)數量的影響末次激發后6h，收集標本。眼底靜脈叢取血，EDTA-Na2抗凝，混勻后各取20μL加入適量白細胞計數液和嗜酸性粒細胞計數液中，混勻，在顯微鏡下對白細胞和嗜酸性粒細胞進行計數。
(3)對肺泡灌洗液(BALF)中WBC及EOS數量的影響取血后。脫頸椎處死，沿頸正中線剪開皮膚，暴露氣管，開胸，分離氣管及肺，結扎右支氣管，經氣管插入灌洗器于左支氣管處，緩慢注入PBS液2mL，灌洗2～3次，保留30s后抽出，重復3次，將收集的BALF置離心管中，離心(2000rpm)10min。離心后，分離上清液與細胞沉淀，細胞沉淀用0.2mL PBS液重懸，每個樣本各取20μL加入適量白細胞計數液嗜酸性粒細胞計數液中，混勻，在顯微鏡下對白細胞和嗜酸性粒細胞進行計數。
(4)對哮喘大鼠肺組織形態學的影響末次激發后6h，收集標本。脫頸椎處死，沿頸正中線剪開皮膚，暴露氣管，開胸，分離氣管及肺臟。切取右肺，置于10％甲醛固定液中固定24h后采用HE染色。
(二)TCP的藥理實驗結果分析1、對小鼠氨水引咳的影響如表1所示，與對照組相比，TCP 50mg/kg極顯著延長小鼠咳嗽潛伏期(P＜0.01)，TCP100、200mg/kg和復方甘草片200mg/kg組均能極顯著延長小鼠咳嗽潛伏期(P＜0.01)和極明顯減少小鼠的咳嗽次數(P＜0.01)。
表1 TCP對小鼠氨水引咳的影響(
n＝10)
與對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.012、對豚鼠枸櫞酸引咳的影響如表2所示，與對照組比，TCP 50、100、200mg/kg極顯著地減少豚鼠咳嗽次數(P＜0.01)，并極明顯延長其咳嗽潛伏期(P＜0.01)，復方甘草片200mg/kg顯著延長小鼠咳嗽潛伏期(P＜0.05)和明顯減少小鼠的咳嗽次數(P＜0.05)。此外，與復方甘草片200mg/kg相比，TCP200mg/kg極顯著地延長其咳嗽潛伏期(P＜0.01)，可見，其止咳作用優于復方甘草片。
表2 TCP對豚鼠枸櫞酸引咳的影響(
n＝8)
與對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01；與復方甘草片組相比，△△P＜0.013、對豚鼠乙酰膽堿和組胺(Ach-His)致喘的影響如表3所示，與對照組比，TCP 50mg/kg可顯著延長哮喘豚鼠哮喘潛伏期(P＜0.05)，TCP 100、200mg/kg與氨茶堿100mg/kg極顯著地延長豚鼠哮喘潛伏期(P＜0.01)。
表3 TCP對豚鼠的平喘作用(
n＝8)
與對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.014、對小鼠氣管酚紅排泌量的影響如表4所示，與對照組比，TCP100、200mg/kg與氯化銨100mg/kg極顯著地促進了小鼠呼吸道酚紅排泌量(P＜0.01)。
表4 TCP對小鼠氣管酚紅排泌量的影響(
n＝10)
與對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.015、對小鼠二甲苯致炎的影響如表5所示，與模型組比，TCP50、100mg/kg與地塞米松5mg/kg顯著抑制二甲苯所致小鼠耳廓腫脹(P＜0.05)，TCP 200mg/kg極顯著抑制二甲苯所致小鼠耳廓腫脹(P＜0.01)。
表5 TCP對小鼠二甲苯致炎的影響(
n＝10)
與對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.016、對小鼠棉球肉芽腫的影響如表6所示，與模型組比，TCP50、100mg/kg與地塞米松5mg/kg顯著抑制小鼠棉球肉芽腫的增生(P＜0.05)，TCP 200mg/kg極顯著抑制棉球肉芽腫的增生(P＜0.01)。
表6 TCP對小鼠棉球肉芽腫的影響(
n＝10)
與對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.017、對正常小鼠碳粒廓清的影響如表7所示，與正常對照組比較，TCP50、100mg/kg顯著提高正常小鼠碳粒吞噬指數(P＜0.05)，玉屏風顆粒5000mg/kg則非常顯著地提高小鼠炭粒吞噬指數(P＜0.01)，說明TCP和玉屏風顆粒均可增強小鼠非特異性免疫功能。
表7 TCP對正常小鼠炭粒廓清的影響(
n＝10)
與對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.018、對OVA致敏哮喘大鼠的影響(1)對血中WBC及EOS數量的影響如表8所示，與正常組比較，模型組血中WBC數目、EOS數目、EOS百分比值均明顯升高；與模型組比較，TCP 50、100、200mg/kg與醋酸潑尼松10mg/kg均非常顯著地降低血中WBC及EOS數目(P＜0.01)，TCP50、200mg/kg與醋酸潑尼松10mg/kg顯著降低血中WBC及EOS數目(P＜0.05)，TCP100mg/kg則非常顯著降低血中WBC及EOS數目(P＜0.01)。
表8 TCP對OVA致敏哮喘大鼠血中WBC及EOS數量的影響(
n＝10)
與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01(2)對BALF中WBC及EOS數量的影響如表9所示，與正常組比較，模型組BALF中WBC數目、EOS數目、EOS百分比值均明顯升高；與模型組比較，TCP 50、100、200mg/kg與醋酸潑尼松10mg/kg均非常顯著地降低BALF中WBC及EOS數目(P＜0.01)，TCP 50、100、200mg/kg顯著降低血中WBC及EOS數目(P＜0.05)，與醋酸潑尼松10mg/kg則非常顯著降低BALF中WBC及EOS數目(P＜0.0表9 TCP對OVA致敏哮喘大鼠BALF中WBC及EOS數量的影響(
n＝10)
與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01(3)對OVA致敏哮喘大鼠肺組織形態學的影響正常對照組大鼠肺組織切片結構清晰，肺泡壁無增厚，未見明顯炎細胞浸潤，支氣管上皮細胞排列整齊，無變性壞死。模型對照組大鼠肺組織切片中可見肺泡壁中度到重度增厚、充血，有明顯的巨噬細胞、嗜酸性粒細胞及中性粒細胞浸潤，病變周圍肺泡呈中度代償性肺氣腫，支氣管上皮細胞呈輕度到中度變性，肺內血管及支氣管周圍可見明顯的巨噬細胞、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞等炎細胞的浸潤。TCP 50mg/kg劑量組大鼠肺組織切片中可見肺泡有輕度到中度炎細胞浸潤，支氣管上皮細胞呈輕度變性。TCP100、200mg/kg量組及陽性對照組大鼠肺組織切片中可見肺泡炎性細胞數量均較模型對照組明顯減少，支氣管上皮細胞呈極輕度變性。此外，TCP 50、100、200mg/kg各劑量組及陽性對照組大鼠肺組織切片均可見肺泡壁輕度增厚、充血，病變周圍肺泡只呈輕度代償性肺氣腫，肺內血管周圍及支氣管壁只有少量炎細胞浸潤，可見個別嗜酸性粒細胞。
上述實驗結果表明TCP能明顯抑制氨水和枸櫞酸所致的咳嗽，明顯抑制乙酰膽堿-組胺所致的哮喘，顯著促進了小鼠呼吸道酚紅排泌量，可對抗組胺和乙酰膽堿引起的離體氣管平滑肌的收縮作用，對二甲苯致炎和棉球肉芽腫具有明顯的抑制作用。由此可見，TCP具有顯著的止咳平喘祛痰作用和抗炎活性。
綜上所述，TCP可用于制備止咳、祛痰、平喘的藥物，治療各種急慢性支氣管炎、肺炎、支氣管哮喘、過敏性哮喘、百日咳及其它呼吸道疾病。
具體實施例方式
實施例1取粉碎白花前胡干燥根15kg，加入六倍量石油醚浸泡12小時后加熱回流反復提取3次，每次1小時，所得提取液趁熱過濾，合并濾液，常壓加熱回收溶劑，放置24小時形成沉淀，過濾干燥后得到白花前胡總香豆素147克。
實施例2取粉碎白花前胡干燥根15kg，加入一倍量水浸泡12小時后反復煎煮4次，每次2小時，所得煎煮液趁熱過濾，合并濾液，濃縮成浸膏后加入一倍體積的60％乙醇沉淀，過濾，濾液回收乙醇后用一倍量體積石油醚反復萃取3次，萃取液常壓加熱回收溶劑，放置24小時形成沉淀，過濾干燥后得到白花前胡總香豆素48克。
實施例3將實施例1所得的白花前胡總香豆素10g，加適量淀粉稀釋，以乙醇潤濕，混勻后制軟材，制顆粒，干燥，加適量潤滑劑，壓制成100片，每片含0.1g白花前胡總香豆素，常規包衣，打光。
實施例4將實施例2所得的白花前胡總香豆素20g，干燥后磨粉，過篩，裝入膠囊，制得膠囊100粒，每粒含0.2g白花前胡總香豆素。
權利要求
1.白花前胡總香豆素提取物用于制備治療呼吸道疾病的藥物的用途。
2.權利要求1的用途，其中呼吸道疾病是急慢性支氣管炎、肺炎、支氣管哮喘、過敏性哮喘或百日咳。
3.權利要求2的用途，其中呼吸道疾病是過敏性哮喘。
4.權利要求1的用途，其中白花前胡總香豆素提取物由以下方法制備以粉碎的白花前胡干燥根為原料，經有機溶劑提取、過濾、回收溶劑、干燥，即得，其中有機溶劑選自石油醚、乙醚、己烷或環己烷。
5.權利要求4的用途，其中有機溶劑是石油醚。
6.權利要求1的用途，其中白花前胡總香豆素提取物由以下方法制備以粉碎的白花前胡的干燥根為原料，用水、乙醇或甲醇提取，提取液用有機溶劑萃取，回收萃取溶劑，干燥，即得，其中萃取用有機溶劑選自石油醚、乙醚、己烷或環己烷。
7.權利要求6的用途，其中乙醇或甲醇的濃度是30％～95％，為重量百分比。
全文摘要
本發明涉及天然藥物領域，具體涉及一種白花前胡總香豆素提取物的醫藥用途，即其可作為治療呼吸道疾病的藥物的用途，可用于治療急慢性支氣管炎、肺炎、支氣管哮喘、過敏性哮喘和百日咳等疾病。
文檔編號A61K125/00GK101091733SQ20071002481
公開日2007年12月26日 申請日期2007年7月2日 優先權日2007年7月2日
發明者孔令義, 吳斐華, 何冬梅 申請人:中國藥科大學