專(zhuān)利名稱：：海洋溴酚在制備治療抗血栓形成作用藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及治療心腦血管疾病的藥物，具體地說(shuō)是一種海洋溴酚化合物的制備方法、藥理活性及藥學(xué)用途。該化合物作為凝血酶(J/7ramZn'":)抑制劑，可用于治療各種血栓性缺血造成的心腦血管疾病。
背景技術(shù)：
：心腦血管疾病與糖尿病、腫瘤等是目前對(duì)人類(lèi)健康威脅最大的三類(lèi)疾病，其中心腦血管疾病位于這三大疾病之首，原因是其不僅具有很高的致死率，而且其發(fā)病后導(dǎo)致患者的致殘率也極高。中國(guó)是世界上心腦血管疾病發(fā)病率最高的國(guó)家，有心腦血管患者3000多萬(wàn)，其中癱瘓?jiān)诖舱哌_(dá)1200萬(wàn)人，每年死亡400多萬(wàn)人，所以預(yù)防和治療心腦血管疾病已成為擺在我們面前的一項(xiàng)嚴(yán)重而艱巨的任務(wù)，并被世界衛(wèi)生組織列為當(dāng)前全組織范圍總體工作重點(diǎn)之一。血栓形成是心腦血管缺血性疾病的重要病理基礎(chǔ)之一，抗血栓形成是預(yù)防和治療多種血栓缺血性心腦血管疾病的重要手段。血栓的形成是復(fù)雜的生理、病理過(guò)程，其中凝血因子、抗凝因子、纖溶系統(tǒng)以及血液流變學(xué)改變等都起重要的作用。正常狀態(tài)下，血液不會(huì)自行凝固，當(dāng)血管壁受損，血流緩慢，血小板聚集性、血液凝血活性和黏度增高時(shí)就易形成血栓，進(jìn)而引起各種缺血性心腦血管疾病，因此尋找理想抗血栓形成的藥物，對(duì)于心腦血管疾病的防治具有重要意義。凝血酶Thrombin(EC3.4.21.5)是一種多功能絲氨酸蛋白水解酶，具有與胰凝乳蛋白酶相似的序列和結(jié)構(gòu)，對(duì)賴氨酸或精氨酸具有親和特異性，在心腦血管疾病的病變過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。凝血酶是血栓形成的關(guān)鍵因素，影響血凝過(guò)程中的級(jí)聯(lián)反應(yīng)、纖維蛋白沉積和血小板活化等；凝血酶抑制劑能阻斷凝血酶及其受體在動(dòng)脈粥樣硬化和腦水腫為基本病變的病變過(guò)程，因此，作為抗栓以及溶栓藥物中重要靶點(diǎn)的凝血酶，尋找其高效特異性的抑制劑，可為預(yù)防和治療心血管疾病提供新的途徑，以期發(fā)現(xiàn)強(qiáng)活性新結(jié)構(gòu)的抗心腦血管疾病海洋新藥。21世紀(jì)人類(lèi)生存和發(fā)展的巨大壓力，迫使人們加快合理開(kāi)發(fā)海洋資源的步伐，如何進(jìn)行海洋天然活性物質(zhì)的深度開(kāi)發(fā)與利用，開(kāi)發(fā)針對(duì)人類(lèi)重大疾病的新藥，是合理利用我國(guó)生物資源的戰(zhàn)略需求。海洋是生命的起源地，海藻是海洋中最大的植物類(lèi)群，是海洋生物鏈中能夠通過(guò)光合作用合成自身必要物質(zhì)的主要自養(yǎng)生物類(lèi)群。在海洋獨(dú)特的生態(tài)環(huán)境中，海藻屬于被吞食的弱者，為了對(duì)付海洋食草動(dòng)物的大量吞食來(lái)維護(hù)自身的生存繁衍，大多海藻能產(chǎn)生一些很有特色的活性物質(zhì)。
發(fā)明內(nèi)容申請(qǐng)人從一種海洋紅藻中得到一個(gè)結(jié)構(gòu)新穎的溴酚類(lèi)化合物，體外活性篩選中發(fā)現(xiàn)其具有極強(qiáng)的Thrombin酶抑制活性，抑制率高達(dá)93.7%(陽(yáng)性對(duì)照Argatruban抑制率為95.3。/。)；采用動(dòng)物模型進(jìn)行體內(nèi)活性測(cè)試，分別測(cè)定藥物的凝血時(shí)間、凝血酶原時(shí)間和白陶土部分凝血活酶時(shí)間；檢測(cè)了藥物對(duì)三氯化鐵(FeCl3)誘導(dǎo)血栓形成的影響，結(jié)果表明該化合物在體內(nèi)具有顯著的抗凝血功能和抗血栓形成療效，可用于治療各種血栓性心腦血管疾病，如急性冠脈綜合癥(acutecoronarysyndrome,ACS)、急性心肌梗塞(Acutemyocardialinfarction，AMI)、月市血檢檢塞癥(pulmonarythromboembolism,PTE)、深靜脈血栓(deepvenousthrombosis,DVT)及動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,As)等。本發(fā)明目的是提供一種溴酚類(lèi)化合物在制備治療抗血栓形成作用藥物中的應(yīng)用，所述溴酚類(lèi)化合物具有凝血酶(J72ram6/")抑制活性，可用于治療各種由于血栓性缺血造成的心腦血管疾病。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為溴酚類(lèi)化合物在制備治療抗血栓形成作用藥物中的應(yīng)用。所述溴酚類(lèi)化合物為3-溴-4-[2,3-二溴-4,5-二羥基苯基]-甲基-5-(甲氧基甲基)-l,2-二苯酚及其藥物學(xué)上可接受的鹽、酯或醚；抗血栓形成作用藥物可為各種血栓性缺血造成的心腦血管疾病藥物。溴酚化合物結(jié)構(gòu)如下HO.、BrBrBrOH3-溴-4-[2，3-二溴-4，5二羥基苯基]-甲基-S-(甲氧基甲基)-l，2-二苯酚3-bromo-4畫(huà)[2，3陽(yáng)dibromo-4，5-dihydroxyphenyl]methyl畫(huà)5陽(yáng)(methoxymethyl)-l，2-benzenedio1本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)(1)、生物資源豐富我國(guó)是海洋大國(guó)，擁有的海洋生物資源，其中松節(jié)藻分布尤其廣泛，其中富含溴酚類(lèi)化合物。療效顯著作為極具海洋特色的多鹵代化合物，溴酚類(lèi)藥物是一種高效的凝血酶抑制劑，在試驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)表現(xiàn)出顯著的抗血栓形成作用，具有很好的抗心腦血管疾病療效。(3)、副作用小溴酚類(lèi)藥物來(lái)源于海洋紅藻，屬純天然生物制品，相比化學(xué)合成類(lèi)藥物，具有高效低毒的優(yōu)點(diǎn)。(2)具體實(shí)施方式(一)、溴酚化合物的提取、分離及結(jié)構(gòu)鑒定風(fēng)干的松節(jié)藻i/o^me/acw^rvo^^樣品14.4kg(干重)粉碎后用10L95%乙醇提取三次，每次72小時(shí)；提取液4(TC下減壓濃縮的乙醇提取物723g，濃縮物用IO倍重量蒸餾水懸浮后，用乙酸乙酯(體積比1:1)萃取，減壓濃縮，得乙酸乙酯相浸膏594.6g，乙酸乙酯萃取部位進(jìn)行硅膠柱色譜，以石油醚-丙酮梯度洗脫(體積比從500:1至1:1)，直至二者體積比為h1，改用氯仿-甲醇梯度洗脫(體積比從20:1至1:1)，最后用95%乙醇洗脫，薄層色譜檢查，合并成分相似的洗脫液，減壓濃縮得14個(gè)部分LiL14。L部分[氯仿甲醇體積比=3:l]洗脫部分經(jīng)過(guò)硅膠色譜，采用氯仿-甲醇(體積比依次為50:1-20:1-10:1-5:1)進(jìn)行梯度洗脫，重結(jié)晶可得純化合物，經(jīng)波譜分析，此化合物為3-溴-4-[2,3-二溴-4,5-二羥基苯基]-甲基-5-(甲氧基甲基)-1,2-二苯酚(中文)，3-bromo-4-[2,3-dibromo-4,5-dihydroxypheny1]methyl-5-(methoxymethyl)-1,2-benzenediol(英文)。上述化合物具有以下理化特性C15H13Br305，EIMSm/z514(M-1),482(M-OCH3)463,433,402,384(463-Br),355,322(402國(guó)Br)，305,275,242,213,197,160,121,92,80,63,45;IRv=cm":3529,3415,2925,1589,1566,1489,1471,1373,1304,1271,1171,1099,1074,1007,933,883，858，808;'H-NMR(Me2CO-4,300MHz)&3.24(3H,s，9-CH3),4.12(2H,s,7-CH2),4.21(2H,s,8-CH2),6.07(1H,s,6'-CH),7.00(1H,s,6-CH);13C-固R(Me2CO-4,75MHz)A39.3(q,7-C),58.0(t,9-C),73.2(t,8-C),113.6(s,3'-C),114.8(d,6'畫(huà)C),114.8(s,3-C),116.2(d,6-C),116.2(s,2'-C),129.5(s,4-C),130.7(s,l'-C),132.3(s,5-C),143.5(s,2-C),143.5(s,4'隱C)，144.8(s,5'-C),145.4(s,1-C)(二)、人源凝血酶Thrombin活性抑制活性測(cè)試Thrombin是一種多功能絲氨酸蛋白水解酶，作為抗栓及溶栓藥物的重要靶點(diǎn)，尋找其高效選擇性的抑制劑，可為預(yù)治心腦血管疾病提供新的途徑。將待測(cè)藥物樣品加入到內(nèi)含凍干人凝血酶國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品的酶反應(yīng)體系中進(jìn)行孵育；加入特異性的底物Ac-FVR-AMC,室溫下Envision多標(biāo)記微孔板檢測(cè)儀動(dòng)態(tài)檢測(cè)RFU(relativefluorescenceunit,相對(duì)熒光強(qiáng)度)的變化，計(jì)算藥物對(duì)Thrombin的抑制率和IC5。，Argatroban作為陽(yáng)性為對(duì)照。(三)、溴酚化合物抗凝血活性測(cè)試1、小鼠凝血時(shí)間的測(cè)定玻片法昆明小鼠，隨機(jī)分組，給藥；于末次給藥后lh進(jìn)行凝血時(shí)間測(cè)定。末次給藥lh后毛細(xì)管眼眶取血，滴于載玻片，血滴直徑約5mm，立即用秒表記時(shí)；用清潔的4號(hào)注射針頭自血滴邊緣向里輕輕撥動(dòng)，觀察有無(wú)血絲挑起；從采血開(kāi)始至挑起血絲止即為凝血時(shí)間。2、大鼠凝血酶原時(shí)間測(cè)定試管法Wistar大鼠，抽取心血，枸櫞酸鈉抗凝；離心分離血漿，用于凝血酶原時(shí)間測(cè)定和白陶土部分凝血活酶時(shí)間測(cè)定。兔腦粉0.3g，加入生理鹽水和草酸鈉溶液中，45。C保溫一定時(shí)間，即凝血活酶；配制不同濃度的化合物溶液，分別加入凝血活酶、CaCl2溶液以及大鼠血漿，混勻，開(kāi)始計(jì)時(shí)。每隔2秒傾斜試管1次，直至液面不動(dòng)，此記錄時(shí)間即為凝血酶原時(shí)間。3、白陶土部分凝血活酶時(shí)間的測(cè)定試管法部分凝血活酶用巴比妥緩沖液按比例稀釋?zhuān)尤氲攘堪滋胀翍乙夯旌?，即白陶土部分凝血活酶。配制不同濃度的化合物溶液，分別加入大鼠血漿和白陶土部分凝血活酶試液，37。C水浴3min，然后加入預(yù)熱的CaCl2溶液，立即計(jì)時(shí)，直至白陶土顆粒聚集變粗，凝固成塊為止，此記錄時(shí)間即為大鼠白陶土部分凝血活酶時(shí)間。(五)、溴酚化合物對(duì)三氯化鐵(FeCb)誘導(dǎo)血栓形成的影響wistar大鼠，隨機(jī)分組，給藥后10min造模；大鼠麻醉后，暴露右側(cè)位于嗅束及大腦下靜脈之間的一段MCA，置一小片塑料薄膜保護(hù)血管周?chē)X組織，將吸有FeCl3液的小片定量濾紙片貼在該段MCA上，持續(xù)30min后去掉濾紙片，生理鹽水沖洗局部組織，逐層縫合，回籠飼養(yǎng)；參照Z(yǔ)eaLonga評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行神經(jīng)功能缺損程度的行為學(xué)評(píng)價(jià)。實(shí)施例l溴酚化合物的提取、分離及結(jié)構(gòu)鑒定風(fēng)干的松節(jié)藻A/o^w7e/aco"/ervoW^樣品14.4kg(干重)粉碎后用10L95%乙醇提取三次，每次72小時(shí)；合并浸提液，提取液40。C下減壓濃縮的乙醇提取物723g，濃縮物用IO倍重量蒸餾水懸浮后，用等體積乙酸乙酯萃取，減壓濃縮，得乙酸乙酯相浸膏594.6g，乙酸乙酯萃取部位進(jìn)行硅膠柱色譜，以石油醚-丙酮梯度洗脫(體積比500:ll:l)，直至二者體積比為1:1，改用氯仿-甲醇梯度洗脫(體積比20:11:1)，最后用95%乙醇洗脫，薄層色譜檢查，合并成分相似的洗脫液，減壓濃縮得14個(gè)部分"Lm。Lu部分[氯仿甲醇體積比=3:l]洗脫部分經(jīng)過(guò)硅膠色譜，采用氯仿-甲醇(體積比50:15:1)進(jìn)行梯度洗脫，重結(jié)晶可得純化合物，經(jīng)波譜分析，此化合物為3-溴-4-[2,3-二溴-4,5-二羥基苯基]-甲基-5-(甲氧基甲基)-1,2-二苯酚(中文)，3-bromo-4-[2，3-dibromo-4,5-dihydroxyphenyl]methyl-5-(methoxymethyl)-1,2-benzenediol(英文)。實(shí)施例2人源凝血酶Thrombin活性抑制活性測(cè)試在酶標(biāo)板小孔中加入5pg/mL3-溴-4-[2,3-二溴-4，5-二羥基苯基]-甲基-5-(甲氧基甲基)-1,2-二苯酚緩沖液50pL和2.7pg/mL標(biāo)準(zhǔn)人凝血酶液IOjiL，混勻后孵育15min;加入4mmol/L特異性的底物Ac-FVR-AMC10jiL,充分混勻，室溫下Envision多標(biāo)記微孔板檢測(cè)儀動(dòng)態(tài)檢測(cè)RFU(relativefluorescenceunit,相對(duì)熒光強(qiáng)度)的變化；此即抑制凝血酶RFU。將緩沖液取代待測(cè)藥物緩沖液，其余步驟同上，即抑制凝血酶RFU。為抑制凝血酶和抑制凝血酶RFU的測(cè)定可以在同一塊酶標(biāo)板上進(jìn)行，計(jì)算藥物對(duì)Thrombin的抑制率和IC5()(Argatroban作為陽(yáng)性為對(duì)照)。表1人源凝血酶抑制率及IC5()_Figure1InhibitionandIC50ofthrombin_<table>complextableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>:化合物對(duì)人源凝血酶Thrombin有顯著的抑制作用，其抑制率高于陽(yáng)性對(duì)照藥物Argatruban,可用于血栓性心腦血管疾病的防治。實(shí)施例3溴鼢化合物抗凝血活性測(cè)試(1)、動(dòng)物分組及處理昆明雄性小鼠20只，體重1822g，隨機(jī)分為4組空白對(duì)照組、低、中、高劑量組。藥物采用少量乙醇溶解，用生理鹽水稀釋至不同濃度。劑量組小鼠分別灌胃不同劑量的藥物溶液0.5mL/只(劑量分別為5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg)，對(duì)照組小鼠則灌胃同體積生理鹽水，每曰l次，連續(xù)10d，于末次給藥后lh進(jìn)行凝血時(shí)間測(cè)定。Wistar大鼠10只，體重300350g，抽取心血，加入重量濃度3.8%枸櫞酸鈉l:9(其與心血的體積比)抗凝；離心10min，分離血槳，用于凝血酶原時(shí)間測(cè)定和白陶土部分凝血活酶時(shí)間的測(cè)定。(2)、小鼠凝血時(shí)間的測(cè)定玻片法末次給藥lh后毛細(xì)管眼眶取血，滴于載玻片，血滴直徑約5mm，立即用秒表記時(shí)；用清潔的4號(hào)注射針頭自血滴邊緣向里輕輕撥動(dòng)，觀察有無(wú)血絲挑起；從采血開(kāi)始至挑起血絲止即為凝血時(shí)間。表2藥物對(duì)小鼠凝血時(shí)間的影響Table2Theeffectsofthebromophenolonbloodcoagulationinmice<table>complextableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>性，且與空白劑量組比較，高劑量組呈現(xiàn)顯著性差異。(3)、大鼠凝血酶原時(shí)間測(cè)定試管法稱取兔腦粉0.3g，加入生理鹽水4.9mL和0.1mol/L的草酸鈉溶液0.1mL，45。C水浴，每5min搖動(dòng)l次，15min后即得凝血活酶。實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照組(生理鹽水)、低、中、高劑量組(劑量分別為5mg/kg,10mg/kg,20mg/kg的溴酚化合物)；將上述各組溶液0.2mL加入到不同試管中，37。C水浴，然后分別依次加入O.lmL凝血活酶、0.1mL的CaCl2溶液(0.025mol/mL)和0.1mL大鼠血漿，混勻，立刻開(kāi)始計(jì)時(shí);每隔2s傾斜試管l次，直至液面不動(dòng)，此記錄時(shí)間即為凝血酶原時(shí)間，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。(4)、白陶土部分凝血活酶時(shí)間的測(cè)定試管法部分凝血活酶用巴比妥緩沖液按l:50的體積比例稀釋?zhuān)尤氲攘康闹亓繚舛?%白陶土懸液混合，即白陶土部分凝血活酶。實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照組(生理鹽水)、低、中、高劑量組(劑量分別為5mg/kg,10mg/kg,20mg/kg的溴酚化合物)；將上述各組溶液0.2mL加入到不同試管中，依次加入O.lmL大鼠血漿和O.lmL白陶土部分凝血活酶試液，于37。C水浴3min，然后加入37。C預(yù)熱的0.1mL的CaCl2溶液(0.025mol/mL)，立即開(kāi)始計(jì)時(shí)，直至白陶土顆粒聚集變粗，凝固成塊為止，此記錄時(shí)間即為大鼠白陶土部分凝血活酶時(shí)間。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。表3藥物對(duì)大鼠凝血酶原時(shí)間和白陶土部分凝血活酶時(shí)間的影響Table3TheeffectsofthebromophenolontheprothrombintimeandKPTTinrats(x±s，n=5)<table>complextableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表中*表示與空白對(duì)照組比較有顯著性差異(P<0.05):藥物能夠顯著抑制內(nèi)源性途徑和外源性途徑的凝血酶(Thrombin)的產(chǎn)生，且對(duì)其外源性途徑的抑制作用大于內(nèi)源性途徑,其抑制機(jī)理主要是抑制凝血酶的活性，而不是抑制凝血酶的產(chǎn)生過(guò)程。實(shí)施例5溴酚化合物對(duì)三氯化鐵(FeCl3)誘導(dǎo)血栓形成的影響(1)、動(dòng)物分組及處理Wistar大鼠60只，隨機(jī)分為6組，模型組(ig生理鹽水，以FeCl3造模)、假手術(shù)組(ig生理鹽水，不用FeCh，其余操作同其它組)、高、中、低劑量給藥組(分別ig溴酚藥物5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg，F(xiàn)eCls造模)和陽(yáng)性藥對(duì)照組(iv肝素500U/kg，F(xiàn)eCl3造模)。(2)、MCA血栓形成模型制備血管內(nèi)膜被FeCl3損傷后，暴露出內(nèi)皮下膠原纖維，誘發(fā)血小板的黏附、聚集，形成血栓，其主要成分是血小板、紅細(xì)胞及纖維蛋白等。各組均于給藥或生理鹽水后10min造模。用烏拉坦(1.2g/kg,ip)麻醉大鼠，按Tamura法暴露右側(cè)位于嗅束及大腦下靜脈之間的一段MCA，置一小片塑料薄膜保護(hù)血管周?chē)X組織，將吸有重量濃度50。/。FeCl3溶液5)aL的小濾紙片貼于該段MCA，30min后去掉濾紙片，生理鹽水沖洗局部組織，逐層縫合，回籠飼養(yǎng)。(3)、造模后24h行為學(xué)評(píng)分參照Z(yǔ)eaLonga評(píng)定進(jìn)行神經(jīng)功能缺損程度的評(píng)價(jià)0級(jí)，無(wú)缺陷；l級(jí)，不能伸展對(duì)側(cè)前肢；2級(jí)，對(duì)側(cè)前肢屈曲；3級(jí)，輕度向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；4級(jí)，嚴(yán)重的轉(zhuǎn)圈；5級(jí)，對(duì)側(cè)癱瘓。表4MCA血栓形成后24h行為學(xué)評(píng)分Table4Scoreofbehavioralscienceat24hafterMCA(X±s，n=10)<table>complextableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表中*表示與模型組比較有顯著性差異(P<0.05):模型組術(shù)后出現(xiàn)不同程度的對(duì)側(cè)前肢內(nèi)收、肩內(nèi)旋、肌張力降低，推右肩向?qū)?cè)移動(dòng)，抵抗阻力降低，甚至出現(xiàn)不停向一側(cè)轉(zhuǎn)圈現(xiàn)象；藥物各劑量組癥狀均有減輕，高劑量組與模型組相比有顯著性差異，且溴酚藥物對(duì)行為學(xué)的改善具有明顯的量效關(guān)系；陽(yáng)性對(duì)照組行為學(xué)評(píng)分與模型組相比具有顯著性差異；假手術(shù)組未見(jiàn)行為學(xué)改變。權(quán)利要求1.海洋溴酚在制備治療抗血栓形成作用藥物中的應(yīng)用。2.按照權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其特征在于所述海洋溴酚化合物在制備治療血栓性心腦血管疾病藥物中的應(yīng)用。3.按照權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述海洋溴酚化合物為3-溴-4[2,3二溴-4,5-二羥基苯基]-甲基-5-(甲氧基甲基)-1,2-二苯酚及其藥物學(xué)上可接受的鹽、酯或醚。全文摘要本發(fā)明涉及治療心腦血管疾病的藥物，具體地說(shuō)是溴酚類(lèi)化合物在制備治療抗血栓形成作用藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明溴酚類(lèi)化合物具有凝血酶(Thrombin)抑制活性，可用于治療各種由于血栓性缺血造成的心腦血管疾病。文檔編號(hào)A61K31/075GK101342160SQ200710015298公開(kāi)日2009年1月14日申請(qǐng)日期2007年7月13日優(yōu)先權(quán)日2007年7月13日發(fā)明者史大永,曉范,袁兆慧,鳳許,韓麗君申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院海洋研究所