具有保肝作用的組合物的制作方法

專利名稱：：具有保肝作用的組合物的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及用于注射和口服給藥的組合物。
背景技術：
：牛樟芝(JWrac/z'acamp/707wto)(又名牛樟燕)是薄孑L菌屬(genusAntrodia)(非褶菌目，多孔菌科)的一個新種，其寄生在特有樹種牛樟樹(cinnamomumKanehiraiHay)的樹洞中。它是臺灣的瀕危物禾中。牛樟芝的子實體為多年生，并具有強烈的氣味。其與普通的靈芝有許多不同，有板狀(plate-shaped)或鐘狀(bell-shaped)的外觀。板狀的為橙紅(黃)色，其表面遍布小孔，并且在底層具有淡黃的白色木栓組織。其通過將木栓組織黏附在空心牛樟芝內(nèi)部的內(nèi)壁來生長。鐘狀的子實體層(鐘面)也呈橙(黃)色，內(nèi)部布滿小孔，內(nèi)有孢子，味苦、新鮮時呈橙紅色，后呈橙棕色、棕色。鐘體為深綠棕色的外殼。在顯微鏡下觀察，孢子外表光滑、透明，呈稍微彎曲的柱狀。牛樟芝camp/wrato)傳統(tǒng)上用于治療因食物、酒精或藥物引起的中毒，以及腹瀉、腹痛、高血壓、皮膚瘙癢和癌癥(沈等，2004,FEMSMicrabioLLett.,231:137-143)。過去，植物化學的研究已經(jīng)實現(xiàn)了一系列新的類固醇酸、三萜酸和多糖的分離(劉等，2004,Toxicol.Appl.Pharmacol.201:186-193)。多糖是有生命的有機體中常見的結構性耐儲存聚合物，占植物干重的75%以上。這些化合物的結構研究中糖綴合物的組成分析是重要的。多糖由于具有多種生物活性，如促有絲分裂活性、激活補體旁路(alternative-pathwaycomplement，APCs)以及血槳凝固活性(李等，2002,FEMSMicrobiol.Lett.,209:63-67;陳等，2005,LifeSciences,76:3029-3042)，因此是醫(yī)藥用途方面很可能有用的生物活性成分。從牛樟芝中提取的多糖的作用有抗乙肝作用、抗炎活性、抗血管生成活性以及抗腫瘤作用(李等，2002,FEMSMicrobiol.Lett,209:63-67;沈等，2004,FEMSMicrobiol.Lett"231:137-143;陳等，2005,LifeSciences,76:3029-3042;劉等，2004,Toxicol.Appl.Pharmacol.201:186-193)。然而，從牛樟芝中提取的多糖的成分、結構或其它特征尚未被清楚地鑒定。肝炎是世界上尤其是發(fā)展中國家的常見病。然而，還沒有能治療該病的有效藥物。近些年，科學家對傳統(tǒng)藥物進行了大量的研究，試圖開發(fā)出治療肝炎的新藥。能通過增強對抗毒性刺激的防御機制來降低肝細胞的壞死損傷或者能改善損傷肝細胞的修復的化合物被認為對人類肝炎的治療是潛在有用的。圖1表示通過DE-52離子交換柱層析對牛樟芝(ACN)的洗脫圖(以苯酚-硫酸法檢測)。圖2表示通過HW-65凝膠過濾柱層析對^GV的洗脫圖(以苯酚-硫酸圖3表示通過HW-65凝膠過濾柱層析對JCW2的洗脫圖(以苯酚-硫酸法檢測)。圖4表示通過HW-65凝膠過濾柱層析對JCW2-7的洗脫圖(以苯酚-硫酸法檢測)。圖5表示^CW2fl的紅外光譜(以溴化鉀(KBr)法測定)。圖6表示^CvV2a的核磁共振氫。H-NMR)譜(在重水(D20)中測定)。圖7表示^C7V2a的核磁共振碳(13C-NMR)譜(在020中測定)。圖8表示^CW^7的糖組分的氣相色譜-質譜(GC-MS)分析。圖9表示^CA^2"的組分糖的絕對構型(D/L)的測定。圖IO表示不同時間點的血清谷草轉氨酶(AST)水平。Nor:正常對照；Con6:靜脈注射脂多糖(LPS)后6小時采集血樣；Conl2:靜脈注射LPS后12小時采集血樣；Conl8:靜脈注射LPS后18小時采集血樣；結果表示每組10只ICR小鼠所得值的平均值士標準差(mean士S.D.)。用student'st-檢驗時，與相應的痤搭丙酸桿菌和脂多糖(i3ac"^-LPS)對照組比較，*:PO.05以及"p<0.0]。圖11表示不同時間點的血清谷丙轉氨酶(ALT)水平。Nor:正常對照；Con6:靜脈注射LPS后6小時采集血樣；Conl2:靜脈注射LPS后12小時采集血樣；Conl8:靜脈注射LPS后18小時采集血樣；結果表示每組10只ICR小鼠所得值的平均值士標準差。用student'st-檢驗時，與相應的/^c潔&LPS對照組比較，*:PO.05以及^:p<0.01。圖12表示口服給予ACN2a對PflcM-LPS誘發(fā)的小鼠肝損傷的影響。A:正常對照，B:i3flc""-LPS,C:FK506ling/kg+i3ac""-LPS，D:ACN2a0.2g/kg+acwa-LPS，E:ACN2a0.4g/kg+Pac"ey-LPS禾口F:ACN2a0.8g/kg+Pa面'-LPS。圖13表示ACN2a對由PLPS誘發(fā)的肝損傷ICR小鼠的血清ALT水平的影響。Nor:正常對照，Con:ac"^-LPS，A0.2:ACN2a0.2mg/kg(體重，靜脈注射)+JPac""-LPS，A0.4:ACN2a0.4mg/kg(體重，靜脈注射)+P"図-LPS,AO.8:ACN2a0.8mg/kg(體重，靜脈注射)+i5ac"e^LPS以及FK506:FK506lmg/kg(體重，口月艮)+Pac""扁LPS。結果表示每組10只ICR小鼠所得值的平均值士標準差。用student'st-檢驗時，與相應的/^c"^-LPS對照組比較，*:PO.05以及":p<0.01。圖14表示靜脈注射給予ACN2a對戶ac"^-LPS誘發(fā)的小鼠肝損傷的影響。A:正常對照，B:Pacwey-LPS，C:FK506lmg/kg+oc""-LPS以及(G:ACN2a0.2mg/kg，H:ACN2a0.4mg/kg，I:ACN2a0.8mg/kg)(體重，靜脈注射)+/^^""-0^。圖15表示ACN2a對肝增殖細胞的影響。Nor:正常對照，Con:戶flc"a-LPS,A0.4g:ACN2a0.4gZkg(口月艮)+Pac""'-LPS,A0.4mg:ACN2a0.4mg/kg(體重，靜脈注射)+2^"^-1^8，以及增殖的細胞(箭頭)。圖16表示ACN2a對由Pac"^-LPS誘發(fā)的肝損傷ICR小鼠中血清ALT水平的影響。Nor:正常對照，Con:Pac""-LPS，A0.2:ACN2a0.2g/kg(體重，口服)或ACN2a0.2mg/kg(體重，靜脈注射)+i5acw"-LPS，A0.4:ACN2a0.4g/kg(體重，口服)或ACN2a0.4mg/kg(體重，靜脈注射)+P"c"ay-LPS，A0.8:ACN2a0.8g/kg(體重，口服)或ACN2a0.8mg/kg(體重，靜脈注射)+i3ac""-LPS，以及FK506:FK506lmg/kg(體重，口服)+i3"cm^-LPS。結果表示每組IO只ICR小鼠所得值的平均值士標準差。用student'st-檢驗時，與相應的i3a諮-LPS對照組比較，*:PO.05以及**:pO.Ol。圖17表示對牛樟芝的熱水提取物進行分離。圖18表示動物實驗(通過口服)時間表。圖19表示動物實驗(通過靜脈注射)時間表。圖20表示動物實驗(治療作用)時間表。圖21表示Pac"^-LPS誘發(fā)肝毒性的機制。本發(fā)明提供了一種包含牛樟芝中性多糖的注射用組合物，該中性多糖具有如下特征(a)外觀無色、無定形粉末，(b)pH:中性，(c)分子量如圖4所示，HPLC測定為899.51670.5千道爾頓(kDa)，(d)旋光度(a〕D+115.0。(c=0.4433，H20)，(e)特性粘度〔r(〕=0.039710.06255dl■g"，(f)比熱容0.25360.3995Cal/g,。C，(g)紅外光譜如圖5所示，(h)tH-NMR譜如圖6所示，(i)"C-NMR譜如圖7所示，以及(j)GC-MS分析如圖8所示。本發(fā)明還提供了一種包含牛樟芝中性多糖的口服用組合物，該中性多糖具有如下特征(a)外觀無色、無定形粉末，(b)pH:中性，(c)分子量如圖4所示，HPLC測定為899.5~1670.5kDa，(d)旋光度〔a〕D+115.0。(c=0.4433,H20)，(e)特性粘度(tj〕=0.039710.06255dl'g"，(t〕
發(fā)明內(nèi)容比熱容0.2536~0.3995Cal/g'。C，(g)紅外光譜如圖5所示，(h,H-NMR譜如圖6所示，(i)UC-NMR譜如圖7所示，以及(j)GC-MS分析如圖8所示。發(fā)明的詳細說明本發(fā)明提供了一種包含牛樟芝中性多糖的注射用組合物，該中性多糖具有如下特征(a)外觀無色、無定形粉末，(b)pH:中性，(C)分子量如圖4所示，HPLC測定為899.5-1670.5kDa，(d)旋光度〔a〕D+115.0°(c=0.4433，H20)，(e)特性粘度(i]〕=0.039710.06255dlg"，(f)比熱容0.25360,3995Cal/g。C，(g)紅外光譜如圖5所示，(h)^-NMR譜如圖6所示，(i)"C-NMR譜如圖7所示，以及(j)GC-MS分析如圖8所示。在優(yōu)選實施例中，HPLC測定的多糖分子量為1092.251477.75kDa。在更優(yōu)選的實施例中，HPLC測定的多糖分子量為1285kDa，多糖的特性粘度為0.0417dlg—1，以及多糖的比熱容為0.2663Cal/g°C。多糖的紅外光譜顯示組分糖包含半乳糖、葡萄糖、巖藻糖、甘露糖和半乳糖胺。多糖的^-NMR譜顯示組分糖包含D-半乳糖、D-葡萄糖、L-巖藻糖和D-甘露糖。組分糖所含半乳糖、葡萄糖、巖藻糖、甘露糖和半乳糖胺的比例為1:0.46:0.035:0.016:0.092。組分糖具有由下列組成的主鏈(a)末端殘基巖藻糖或葡萄糖以及(b)中間殘基1,3-連接的葡萄糖，1,4-連接的葡萄糖,1,6-連接和1,2，6-連接的半乳糖，其中，1，2,6-連接的半乳糖殘基通過支鏈連接在2位氧。本發(fā)明的多糖在骨架上具有半乳糖，并且可以是直鏈或支鏈形式。本發(fā)明的多糖用水從牛樟芝中提取。多糖的有效治療量為每公斤患者體重0.01-5.0mg。在優(yōu)選實施例中，多糖的有效治療量為每公斤患者體重0.05-3.0mg。在更加優(yōu)選的實施例中，多糖的有效治療量為每公斤患者體重0.1-2.0mg。在最優(yōu)選的實施例中，多糖的有效治療量為每公斤患者體重0.1-l.Omg。該注射用組合物能抗肝毒性或肝損傷。上述組合物進一步包含藥學上的載體。在優(yōu)選實施例中，載體為注射用液態(tài)或半固態(tài)。適合的載體為極性溶劑，比如水、醇、酮、酯以及上述溶劑的混合物，優(yōu)選水、醇和水/醇的混合物。對于優(yōu)選實施例，適合的載體為水、生理鹽水、緩沖水溶液和緩沖鹽等。與本發(fā)明的組合物一起使用的載體還可以是乳糖、糊精和淀粉及硬脂酸鈉。本發(fā)明還提供了一種包含牛樟芝中性多糖的口服用組合物，該中性多糖具有如下特征(a)外觀無色、無定形粉末，(b)pH:中性，(c)分子量如圖4所示，HPLC測定為899.51670.5kDa，(d)旋光度(a〕D+115.0。(c=0.4433,H20)，(e)特性粘度〔"〕=0.039710.06255dl-g"，(f)比熱容0.25360.3995Cal/g'。C，(g)紅外光譜如圖5所示，(h)!H-NMR譜如圖6所示，(i)"C-NMR譜如圖7所示，以及([)GC-MS分析如圖8所示。在優(yōu)選實施例中，HPLC測定的多糖分子量為1092.251477.75kDa。在更加優(yōu)選的實施例中，HPLC測定的多糖分子量為1285kDa，多糖的特性粘度為0.0417d卜gA以及多糖的比熱容為0.2663Cal/g'。C。多糖的有效治療量為每公斤患者體重0.01-5.0g。在優(yōu)選實施例中，多糖的有效治療量為每公斤患者體重0.05-3.0g。在更加優(yōu)選的實施例中，多糖的有效治療量為每公斤患者體重0.1-2.0g。在最優(yōu)選的實施例中，多糖的有效治療量為每公斤患者體重O.l-l.Og。該口服用組合物能抗肝毒性或肝損傷。上述組合物進一步包含藥學上的載體。在優(yōu)選實施例中，載體是用于口服給藥的固態(tài)、液態(tài)或半固態(tài)。適合的載體為極性溶劑，比如水、醇、酮、酯以及上述溶劑的混合物，優(yōu)選水、醇和水/醇的混合物。對于優(yōu)選實施例，適合的載體為水、生理鹽水、緩沖水溶液和緩沖鹽等。與本發(fā)明的組合物一起使用的載體還可以是乳糖、糊精和淀粉及硬脂酸鈉。用于口服給藥的液體載體包括水、豆油、酒和汁液等。實施例下面的實施例是非限制性的，并且僅僅是本發(fā)明代表性的幾個方面和特點。實施例l(A)材料牛樟芝菌絲體由善笙生物科技股份有限公司(SimpsonBiotechCo.Ltd.)(臺灣)提供。支鏈淀粉(pullulans)的標準品(ShodexStandardP-82)購自昭和電工株式會社(ShowaDenkoCo.Ltd.)(日本)。(B)總的實驗過程用JASCODIP-360全自動旋光儀在水中測定旋光度。用SHIMADZUUV-2200UV-VIS記錄式分光計檢測紫外吸收。使用JASCOFT/IR-230紅外分光計以溴化鉀片或液膜法記錄紅外光譜。用VarianUnityPlus500(氫在500MHz，碳在125MHz)和VarianGEMINI300(氫在300MHz，碳在75MHz)核磁共振波譜儀記錄核磁共振波譜。多糖的重水溶液用1,4-二氧己環(huán)(1,4-diozane)作為外部參照來測定。在配有正OL質譜儀的SHIMADZUGC-17A氣相色譜儀上進行GC-MS分析。在預制的硅膠60F254板(默克公司，0.25毫米)、纖維素F板(默克公司，0.1毫米)上進行薄層層析(TLC)，通過10%硫酸噴霧或通過100。C下加熱的層次分析法(AHP)來檢測斑點。通過苯酚-硫酸法來檢測碳水化合物。實施例2牛樟芝中性多糖的制備(A)多糖的提取和分離室溫下，將牛樟芝的凍干粉末(1.5kg)用氯仿(CHC13)(4"3次)提取1天，然后過濾并干燥。室溫下將殘渣浸于水中1小時，并于100。C下提取(3次)2小時。將熱水提取物合并并濃縮至800ml，向提取物中加入3200m的乙醇。將混合物攪拌混勻并在冰箱中放置一夜。過濾沉淀物并用冷乙醇洗滌，然后干燥。將沉淀物用10%的三氯乙酸(trichloroaceticacid,TCA)處理后，將通過離心(3000轉/分鐘xIO分鐘)得到的TCA-可溶部分用蒸餾水透析3天。將未透析的部分凍干得褐色殘留物(AC)。產(chǎn)量為14.25g。(B)AC的離子交換柱層析將AC(100mg)溶于水中，上樣到DE-52(沃特曼國際公司(WhatmaninternationalLtd.),英國。2.0x20cm)柱中。依次用60ml的水、60ml的0.5MNaCl、60ml的1MNaCl、60ml的2MNaCl洗脫，每2ml收集流分。將水流分(ACN)濃縮并凍干，得產(chǎn)物68.3mg。(C)ACN的凝膠過濾將ACN(68.3mg)溶于0.2MNaCl溶液中，并上樣到ToyopearlHW-65(Tosoh，日本東京。2.0x90cm)柱中。用同樣的溶劑洗脫柱子，每5ml收集流分。根據(jù)在480nm下由苯酚-硫酸法制備的洗脫圖，將洗脫的流分分成兩部分(ACN1和ACN2)。產(chǎn)量ACN1:19mg，ACN2:49mg。在與上述相同的條件下進一步通過HW-65柱層析對ACN2進行純化。得無色多糖(命名為ACN2a，產(chǎn)量41mg)。如圖17所示，對牛樟芝的熱水提取物進行分離。10。/。TCA可溶部分的未透析部分(AC)具有保肝活性，并且由于苯酚-硫酸反應是陽性，因而含有多糖。如圖1所示，通過DE-52纖維素的離子交換柱層析對AC進行分離。然后對最有效的水部分(CAN)通過凝膠過濾進行分離(圖2)。第二部分ACN2a進一步通過HW-65凝膠過濾進行純化，得保肝組分無色多糖(ACN2a)(圖3)。實施例3牛樟芝中性多糖的結構分析(A)分子量的估算通過HPLC分析估算多糖(ACN2a)的平均分子量。將樣品上樣到TSK-GMPWXL凝膠過濾柱(7.8x300mmi.d.，Tosoh公司，日本東京)，用0.2MNaCl以lml/分鐘的速率洗脫。使用商業(yè)上可購得的支鏈淀粉(ShodexStandardP-82)作為標準品。HPLC(圖4)證明該多糖(ACN2a)是單一流分，并且，用HPLC估算其表觀分子量為1285320。多糖為無色、無定形粉末，其旋光度為〔a〕D+115.0°(c=0.4433,H20);特性粘度為〔"〕=0.0417dl.g—1(用奧式粘度計測定)，以及比熱容為0.2663Cal/g〃C(由差示掃描量熱計(differentialscanningcalorimeter,DSC)法測定)。在ACN2a中有0.20%的蛋白(由Bradford法測定)和0.12%的氮(通過元素分析法測定)；ACN2a中無硫酸鹽(由鋇-玫瑰紅酸(Bariumrhodizonate)法測定)。(B)組分糖的鑒定將多糖(2mg)溶于2ml的2N三氯乙酸(trifluoroaceticacid，TFA)中并密封。在蒸汽高壓釜中125'C水解1小時后，通過將反應混合物蒸發(fā)至干除去TFA。水解產(chǎn)物用硼氫化鈉(NaBH4)還原。用silblender-HTP試劑制成三甲基硅垸化產(chǎn)物用于GC-MS分析。(色譜柱DB-1，J&WScientific,0.25mm柱徑(i.d.)x30m;柱溫以5。C/分鐘的速率從50°C升溫190°C;然后19(TC下保持12分鐘；氦載氣流4.25kgf/cm)。根據(jù)對組分糖的鑒定結果(圖5)，上述多糖由半乳糖、葡萄糖、巖藻糖、甘露糖和半乳糖胺(1:0.46:0.035:0.016:0.092)組成。組分糖約62.38%的糖是半乳糖。ACN2a的旋光度是十115.0°(c=0.4433，H20)。該結果提示組分糖可能具有a-D-或卩-L-構型(根據(jù)Hudson的等旋定律(isorotationlaw))。根據(jù)對組分糖絕對構型的測定(圖6)，組分糖的絕對構型分別是L-巖藻糖、D-半乳糖、D-葡萄糖和D-甘露糖。(C)組分糖絕對構型的測定根據(jù)Ham等的報道對組分糖的絕對構型進行測定。將多糖(lmg)置2N三氯乙酸(TFA)中，125。C下水解l小時。蒸發(fā)除去TFA，得糖部分。將糖部分(2mg)的吡啶溶液(0.5ml)與L-半胱氨酸甲酯鹽酸鹽(3mg)混合，6(TC下溫熱1.5小時，然后用氮氣干燥。將干燥的樣品用silblender-HTP(0.4ml)在60。C下三甲基硅烷化1小時。用氯仿(3ml)和水(3ml)分層后，通過GC-MS(色譜柱:DB-wax，J&WScientific,30mx0.25mm;柱溫以10"C/分鐘的速率從5(TC升溫至230°C;然后于230°C下保持12分鐘；氦載氣流4.25kgf/cm)分析氯仿萃取物。(D)甲基化分析通過Anumula和Taylor's法用碘化甲烷對多糖(5mg)進行甲基化。在蒸汽高壓釜中用4N三氟乙酸(TFA)將甲基化的多糖125。C水解90分鐘。蒸發(fā)除去TFA后，用1M含3mg/mlNaBH4的NH4OH將水解產(chǎn)物轉變?yōu)樘谴?，然后乙?；?。通過GC和GC-MS(色譜柱:Sp-2330，Supelco，Bellefnte，Pa.，60mx0.25mm，0.20um的薄膜厚度。載氣為氦氣，柱溫以2TV分鐘的速率從16(TC升溫至21(TC，然后以5。C/分鐘的速率從210°C升溫至24(TC，以及24(TC下保持14分鐘)分析部分甲基化了的糖醇乙酯。使用已公布的摩爾響應因子(molarresponsefactors)校正峰面積。通過比較其相對于1，5-二-氧-乙酰基-2,3,4，6-四-氧-甲基葡糖醇(1，5-di-0-acetyl-2,3，4,6-tetra-0-methylglucitol)的相對保留時間及其GC-EI-MS裂解方式來鑒定衍生的化合物。如圖6所示，在傅立葉變換-紅外(FT-IR)光譜中，由于在1153.22cm"、1079.94cm"和1033.66cm"處觀察到三個吸收帶(呋喃型在該區(qū)域僅有兩個吸收帶)，提示存在吡喃型結構。由于在917.95cm—i處有吸收帶，提示存在D-吡喃型葡萄糖。此外，在873.6cm—1處的帶是吡喃型甘露糖和吡喃型半乳糖的特定吸收帶。由于在1637.27cm—1處觀察到a-NH2的吸收帶，提示存在氨基糖。以上與元素分析的分析結論一致。在HNMR譜中(圖7)，在大于4.8ppm(4.885、4.909、4.963ppm)處觀察到H—M言號，提示組分糖具有a-構型。這與旋光度的分析結論一致。此外，在小于4.8ppm(4.738、4.663ppm)處，也觀察到H"信號。上述結果提示組分糖也具有少量的(3-構型。在1.134ppm處觀察到甲基質子信號，其應歸屬于巖藻糖殘基的甲基。在小于5.0ppm處檢測到呈單峰的端基異構體信號。這些結果提示巖藻糖殘基具有卩-L-構型。(cc-L-巖藻糖的端基異構體信號在大于5.0ppm處。)在CNMR譜中(圖8)，在小于80ppm處觀察到C-4和C-5信號。上述結果提示組分糖為吡喃型(呋喃型C-4和C-5的化學位移出現(xiàn)在8085ppm區(qū)域)。這與紅外分析結論一致。此外，在13.7ppm處觀察到甲基信號，其應歸屬于鹽藻糖殘基的甲基。上述結果提示巖藻糖殘基為L-巖藻糖(D-巖藻糖的C-6信號在6065ppm區(qū)域)。這與HNMR譜的分析結論一致。如表1所總結的，甲基化分析結果表明ACN2a由末端-巖藻糖、1,4-連接的葡萄糖、1，6-連接和1,2,6-連接的半乳糖殘基、以及少量末端和1，3-連接的葡萄糖殘基組成。通過甲基化分析，ACN2a包括由ot-D-l,6-半乳糖(a-D-1,6-和cc-D-l,2,6-)半乳糖組成的骨架，其約為72.82%。支鏈端點的數(shù)目約為總殘基數(shù)目的15.75%，支鏈連接在主鏈半乳糖殘基的2位O上。表l:ACN2a的甲基化分析結果甲基化的糖摩爾比TR質譜主要碎片(M/Z)連接類型2，3,4-三甲基-巖藻糖0.2090.78971、89、101、117、161、175131、巖藻糖-(l》2,3,4,6-四甲0.084171、87、101、117、145、161、205129、葡萄糖-(l今2,4,6—三甲基-0.0261.3〗71、87、101、117、161、233129、外葡萄糖-(1+2，3,6-三甲基-葡萄糖0.1571.48987、99、101、113、233117、葡萄糖-(l》2,3,4-三甲基-葡萄糖11.671、87、99、101、129、161、189117、》6)-葡萄糖-(1+3，4-三甲基-半乳糖0.2761.88187、99、129、189">2,6)-葡萄糖-(l今TR是各組分相對于1,5-氧-2,3,4，6-四甲基-葡萄糖的相對保留時間實施例4中性多糖(ACN2a)對P"c""-LPS誘發(fā)的肝毒性的保護作用(A)Pflc"^和試劑的準備將/5(ATCC6919)用添加有L-半胱氨酸(0.03%)和吐溫80(0.03%)的腦心浸液培養(yǎng)基(brainheartinfusionmedium)(日本和光純藥工業(yè)株式會社(WakoPureChemicalIndustries,Ltd.)，日本大阪)在37°C厭氧條件下培養(yǎng)48小時。將培養(yǎng)物在4。C以5500xg離心15分鐘，并用磷酸緩沖鹽(phosphate-bufferedsaline,PBS)洗滌。用300ml的PBS將菌團重新懸浮，80。C加熱處理30分鐘滅活細胞，然后凍干，制得加熱滅活的P粉。來自埃希氏菌屬大腸桿菌(Eycfen'c/n'aco//)055:B5的LPS購自西格瑪-奧德里奇公司(Sigma-Aldrich，Inc.)(德國Steinheim)。FK506(他克莫司水合物)購自日本第一制藥株式會社(FujisawaPharmaceuticalCo.，Ltd.)(日本大阪)。(B)動物四周齡雄性ICR小鼠(1820g)、雄性BALB/CU820g)以及雄性wistar大鼠U06180g)(SLC公司，日本濱松)用于抗Pac"-LPS.55'56)誘發(fā)的肝毒性的保護作用實驗。試驗前使動物適應一周。(C)保肝實驗(通過口服)利用下面的實驗研究JCA^fl的保肝活性A:ICR小鼠的(1)正常對照組(未處理);(2)Poc""-LPS(0.15mg-0.05iig/小鼠)處理對照組;[(3)0.2g/kg/天、(4)0.4g/kg/天、(5)0.8g/kgZ天，按體重(bodyweight(b.w.)計)，口月艮(P.O.)]加Pac""-LPS處理組；以及(6)FK506(lmg/kg，b.w.，P.O.)加i3ac"M-LPS處理組。B:BALB/C小鼠的(1)正常對照組(未處理);(2)Pfl聽-LPS(0.20mg-0,075昭/小鼠)處理對照組；(3)JCA/^(0.4g/l(g/天，b.w.，P.O.);(4)^GV2a(0.4g/kg/天，b.w.，P.O.)加Pac""-LPS處理組。C:wistar大鼠的(l)正常對照組(未處理);(2)PLPS(5mg-5嗎Zrat)處理對照組;(3)爿CA^(0.2g/kg沃，b.w.，P.O.)加P"c醇-LPS處理組。將懸浮于鹽液中的加熱滅活的Pflc"a細胞經(jīng)尾靜脈注射(圖18)。七天后，通過靜脈注射LPS誘發(fā)急性肝損傷。通過胃管連續(xù)7天每天給予動物一次JCA^fl。在第8天，給予^CA^z后1小時，注射LPS。用FK506作為陽性對照藥，并在靜脈注射LPS前48、36、24、12和]小時通過胃管給藥。采集血樣至試管中，用于分析LPS注射后6小時的肝損傷，并處死這些動物。在3500xg下，將試管離心15分鐘，使用血清作為樣本。將所有樣本儲存于-20。C下，直至實驗。使用測定酶活性的試劑盒(轉氨酶CII-testWako)(日本和光純藥工業(yè)株式會社，日本大阪)，來檢測肝細胞損傷的標志物血清谷草轉氨酶(aspartateaminotransferase,AST)和谷丙轉氨酶(alanineaminotransferase,ALT)的活性。(D)肝組織學采集血液后將小鼠處死，快速獲得肝臟。將肝切片，并立即固定于10%的緩沖福爾馬林磷酸鹽溶液中，用50-100%的乙醇溶液脫水，并固定于石蠟中。切下45微米片段，并用蘇木精伊紅(hematoxylin-eosin)染色。(E)保肝實驗(通過靜脈注射)使用下列實驗研究」CA^fl的保肝活性AICR小鼠的(1)正常對照組(未處理);(2)5面-0^(0.151緊0.05jig/小鼠)處理對照組；[(3)0.2g/kgZ天，(4)0.4g/kg/天，(5)0.8gZkg/天)，b.w.，靜脈注射(i.v.)]加Pac/^-LPS處理組;以及(6)FK506(lmg/kg，b.w.，P.O.)加P"c"as-LPS處理組。B(1)正常對照組(未處理);(2)Pa面-LPS(0.15mg-0.05(ig/小鼠)處理對照組；[(3)0.4g/kg/天，(4)0.8g/kg/天，b.w,，i.v.)，P,O.]加Pflc/za-LPS處理組。如上誘發(fā)急性肝損傷的實驗模型。A靜脈注射方法與口服給藥相同。B靜脈注射方法是在第8天，將JCW2a與LPS的鹽溶液經(jīng)尾靜脈僅注射一次(圖19)。采集血樣至試管中，用于分析LPS注射后6小時的肝損傷，然后將這些動物處死。將試管以3500xg離心15分鐘，并將血清用作樣本。將所有的樣本儲存于-20。C下直至實驗。使用測定酶活性的試劑盒來檢測血清谷草轉氨酶(AST)和谷丙轉氨酶(ALT)的活性。(F)^C7V2"對P.acnes-LPS誘發(fā)的小鼠肝損傷的治療作用利用下列實驗研究^CA^fl的治療作用(1)正常對照組(未處理)；(2)i3ac"^-LPS(0.15mg-0,05嗎/小鼠)處理對照組；[(3)0.4g/kg/天，(4)0.8g/kg/天，(5)1.6g/kg/天，(6)3.2mg/kg/天，(7)6.4mg/kg/天，)，按體重(b.w.)計，靜脈注射]加i3flc"^-LPS處理組；以及(6)FK506(lmg/kg，b.w.，P.O.)加i5ac"e^LPS處理組。如上誘發(fā)急性肝損傷的實驗模型。在第8天，給予LPS3小時后，將爿CW2a鹽溶液經(jīng)尾靜脈僅注射一次(圖20)。一個Racnes—LPS處理組注射LPS3小時后，采集血樣至試管中，采集注射LPS后6小時的其它血樣至試管中用作肝損傷的分析，然后處死這些動物。將試管在3500xg下離心15分鐘，并將血清用作樣本。將所有的樣本儲存于-20。C下直至實驗。使用測定酶活性的試劑盒來檢測肝細胞損傷的標志物血清谷草轉氨酶(AST)和谷丙轉氨酶(ALT)的活性。(G)結果a.模型動物的評價先注射P.acnes、接著注射LPS對于建立急性肝損傷的實驗模型是有用的。大多數(shù)動物在注射LPS的24小時內(nèi)死于嚴重的肝損傷。在本實驗中，我們找到了戶ac""-LPS的最佳劑量(0.15mg-0.05ug/小鼠)。所有的動物幸免于嚴重的肝損傷，并且在靜脈注射LPS后12小時肝損傷最為嚴重(圖10和11)。因此在本發(fā)明中，采集注射LPS后6小時的血樣用于肝損傷的分析。b.口服給予ACN2a的保肝作用表2表示ACN2a對用i5ac"m-LPS處理過的小鼠血清中ALT和AST水平的影響。在所有用0.4和0.8g/kg體重的ACN2a預處理過的動物中，急性肝毒性反應被顯著地(P〈0.05)抑帝i」。因此ACN2a具有抗Pac""-LPS誘發(fā)的小鼠肝毒性的保護作用；而且，還發(fā)現(xiàn)這些保護作用具有劑量依賴性。此外，在所有用0.4g/kg體重的ACN2a預處理過的BALB/c小鼠中，和所有用0.25g/kg體重的ACN2a預處理過的Wistar大鼠中，急性肝毒性反應也被顯著地(戶<0.05)抑制，表明爿C7V2"對Pflcw"-LPS誘發(fā)的鼠科動物的肝毒性具有保護作用。表2ACN2a對P.acnes-LPS誘發(fā)的鼠科動物肝損傷中血清ALT和AST水平的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>上述值表示為每組10只或8只動物的平均值±標準差(means±S.D.)。用Student'st-檢驗檢査，與相應的OC"M-LPS組比較，*:/7<0.05以及**:p<0.001。通過組織學觀察證實了ACN2a的保肝作用(圖12)。注射P.acnes-LPS引起了ICR小'鼠肝臟的肉芽月中、出血壞死和細胞浸潤。然而，ACN2a的預處理降低了細胞浸潤的損傷分值，并且抑制了肝細胞的壞死(表3)。氣球狀的肝細胞有不同尺寸，并且遠遠大于正常的肝細胞,表3.肝臟在不同劑量ACN2a下的組織學損傷分值<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>經(jīng)光學顯微鏡檢査對肝損傷肝臟進行評分0=無可見細胞損傷；1=局灶性肝細胞損傷占組織的比例<25%;2=局灶性肝細胞損傷占組織的比例<25-50%;3=廣泛、但為局灶性的肝細胞損壞；4=全部肝細胞壞死。c.通過靜脈注射給予ACN2a的保肝作用圖13表示ACN2對P.acnes-LPS處理過的ICR小鼠血清中ALT水平的影響。在所有被通過尾靜脈注射0.2和0.4mg/kg體重的ACN2a處理過的ICR小鼠中，急性肝毒性反應被劑量依賴性地顯著(p<0.05)抑制，表明通過尾靜脈注射ACN2a對Racnes-LPS誘發(fā)的ICR小鼠肝毒性也具有保護作用。通過組織學觀察證實了靜脈注射ACN2a的保肝作用(圖14)。注射P.acnes-LPS引起了ICR小鼠肝臟的氣球樣變性、出血壞死和細胞浸潤。然而，ACN2a預處理降低了細胞浸潤的損傷分值并抑制了肝細胞的壞死(表4)。表4.肝臟在不同劑量ACN2a下的組織學損傷分值動物組別損傷分值肉芽腫出血壞死細胞浸潤ICR小鼠(每組IO只小鼠)對照組尸ac'w—LPS尸,a—LPS+」CW2o(0.2g/kg)Po置？—LPS+z(C腸(0.4g/kg)尸flc臘—LPS+』CA。a(0.8g/kg)經(jīng)光學顯微鏡檢査對肝損傷肝臟進行評分0=無可見細胞損傷；1=局灶性肝細胞損傷占組織的比例<25%;2=局灶性肝細胞損傷占組織的比例<25-50%;3=廣泛、但為局灶性的肝細胞損壞；4=全部肝細胞壞死。此外，通過組織學觀察(圖15)發(fā)現(xiàn)用ACN2a預處理過的小鼠肝細胞增殖期可以促進肝細胞的增殖并改善損傷肝細胞的修復。d.口服給藥和靜脈注射保肝作用的比較(圖16)比較了用P,acnes-LPS處理過的ICR小鼠ACN2a的不同給藥途徑對ICR小鼠血清中ALT水平的影響。在所有用0.2、0.4和0.8ACN2ag/kg(b.w"p.o.)，以及0.2和0.4ACN2amg/kg(b.w"p.o.)處理過的ICR小鼠中，急性肝毒性反應被劑量依賴性地顯著(p<0.05)抑制，表明通過口服給藥和靜脈注射給藥的ACN2a對P.acnes-LPS誘發(fā)的ICR小鼠肝毒性都具有保護作用。此外，雖然通過靜脈注射給予的劑量僅為通過口服給予劑量的1/1000，但是通過靜脈注射是通過口服給藥方式保肝作用的100倍，表明靜脈注射是最優(yōu)選的方法。總之，ACN2a無論通過口服還是靜脈注射，都表現(xiàn)出了對P.acnes-LPS誘發(fā)的鼠科動物(ICR小鼠、BALB/c小鼠和Wistar大鼠)肝損傷的保肝作用。實施例5保肝模型的機制圖21所示為P.acnes-LPS誘發(fā)的實驗模型的機制。將Racnes經(jīng)尾靜脈注射到小鼠導致肝臟的單核細胞浸潤，因此肝巨噬細胞增多，并且隨后靜脈注射的少量LPS激活了肝巨噬細胞。腫瘤壞死因子(tumornecrosisfactor,TNF)、白細胞介素-1(IL-1)、可溶性白細胞介素-2(IL-2)受體等的細胞因子離開肝巨噬細胞并且增多。然后，這些細胞因子經(jīng)三種途徑對肝臟造成損傷1).TNF和IL-1經(jīng)血小板激活因子(plateletactivatingfactor,PAF)和白三烯(leukotriene)等使肝細胞廣泛地壞死。2).TNF和IL-1經(jīng)中性粒細胞和微循環(huán)障礙使肝細胞廣泛地壞死。在這種方式中，氧自由基起到了關鍵作用。3).IL-2由于與可溶性IL-2受體結合而減少，導致抑制性T細胞(suppressorTcell)減少和細胞毒性T細胞(cytotoxicTcell,CTL)增多。CTL使大量的肝細胞壞死。牛樟芝的粗多糖對清除氧自由基形態(tài)和增加IL-2是有效的。本發(fā)明中，發(fā)現(xiàn)粗多糖和中性多糖(ACN2a)對P.acnes-LPS誘發(fā)的小鼠肝毒性都具有保護作用。牛樟芝的多糖可能通過至少部分清除氧自由基形態(tài)、從而阻斷了P.acnes-LPS以方式2)誘發(fā)的肝毒性，或者通過使IL-2增多而達到減少CTL和保護肝臟(圖21)，從而發(fā)揮其保肝活性。雖然己經(jīng)足夠詳細地描述并舉例說明了本發(fā)明，使本領域的技術人員能夠制造和利用它，但是在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，對本發(fā)明所進行的各種替換、更改以及改進是顯而易見的。本領域的技術人員很容易領會本發(fā)明能夠很好地實現(xiàn)其目的并獲得上述的結果和優(yōu)點及其中內(nèi)在的特點。胚胎、動物以及制造它們的過程和21方法代表優(yōu)選的實施例，為示例性的，并不用來限定本發(fā)明的范圍。本領域的技術人員可以想到其中的更改以及其它用途。這些更改也落在本發(fā)明的思想范圍內(nèi)，并受到權利要求保護范圍的限定。權利要求1.含有牛樟芝中性多糖的注射用組合物該中性多糖具有如下特征(a)外觀無色、無定形粉末，(b)pH中性，(c)分子量如圖4所示，HPLC測定為899.5～1670.5kDa，(d)旋光度〔α〕D+115.0°(c＝0.4433，H2O)，(e)特性粘度〔η〕＝0.03971～0.06255dl·g-1，(f)比熱容0.2536～0.3995Cal/g·℃，(g)紅外光譜如圖5所示，(h)核磁共振氫譜如圖6所示，(i)核磁共振碳譜如圖7所示，以及(j)氣相色譜-質譜分析如圖8所示。2.如權利要求1所述的組合物，其特征在于，多糖的有效治療量為每公斤患者體重0.01-5.0毫克。3.如權利要求2所述的組合物，其特征在于，多糖的有效治療量為每公斤患者體重0.05-3.0毫克。4.如權利要求3所述的組合物，其特征在于，多糖的有效治療量為每公斤患者體重0.1-2.0毫克。5.如權利要求4所述的組合物，其特征在于，多糖的有效治療量為每公斤患者體重0.1-1.0毫克。6.如權利要求1所述的組合物，其特征在于，HPLC測定的多糖分子量為1092.251477.75kDa。7.如權利要求6所述的組合物，其特征在于，HPLC測定的多糖分子量為1285kDa。8.如權利要求1所述的組合物，其特征在于，多糖的特性粘度為0.0417dl-g-1。9.如權利要求1所述的組合物，其特征在于，多糖的比熱容為0.2663Cal/g'。C。10.如權利要求l所述的組合物，其特征在于，該組合物能夠抗肝毒性或肝損傷。11.如權利要求1所述的組合物，其特征在于，該組合物進一歩包含藥學上可接受的載體。12.如權利要求ll所述的組合物，其特征在于，載體為液態(tài)或半固態(tài)。13.含有牛樟芝中性多糖的口服用組合物，該中性多糖具有如下特征:(a)外觀無色、無定形粉末，(b)pH:中性，(c)分子量如圖4所示，HPLC測定為899.51670.5kDa，(d)旋光度(a〕d+115.0。(c=0.4433,H20)，(e)特性粘度〔ri)=0.039710.06255dl'g"，(f)比熱容0.25360.3995Cal/g'。C，(g)紅外光譜如圖5所示，(h)核磁共振氫譜如圖6所示，(i)核磁共振碳譜如圖7所示，以及(j)氣相色譜-質譜分析如圖8所示。14.如權利要求13所述的組合物，其特征在于，多糖的有效治療量為每公斤患者體重0.01-5.0克。15.如權利要求14所述的組合物，其特征在于，多糖的有效治療量為每公斤患者體重0.05-3.0克。16.如權利耍求15所述的組合物，其特征在于，多糖的有效治療量為每公斤患者體重0.1-2.0克。17.如權利要求16所述的組合物，其特征在于，多糖的有效治療量為每公斤患者體重0.1-1.0克。18.如權利要求13所述的組合物，其特征在于，HPLC測定的多糖分子量為1092.25~1477.75kDa。19.如權利要求18所述的組合物，其特征在于，HPLC測定的多糖分子量為1285kDa。20.如權利要求13所述的組合物，其特征在于，多糖的特性粘度為0.0417dl.g-1。21.如權利要求13所述的組合物，其特征在于，多糖的比熱容為0.2663Cal/g-。C。22.如權利要求13所述的組合物，其特征在于，該組合物能夠抗肝毒性或肝損傷。23.如權利要求13所述的組合物，其特征在于，該組合物進一步包含藥學上可接受的載體。24.如權利要求23所述的組合物，其特征在于，載體為固態(tài)、液態(tài)或半固態(tài)。全文摘要本發(fā)明涉及含有牛樟芝中性多糖的注射用組合物，該中性多糖具有如下特征(a)外觀無色、無定形粉末，(b)pH中性，(c)分子量如圖4所示，HPLC測定為899.5～1670.5kDa，(d)旋光度〔α〕_D+115.0°(c＝0.4433，H₂O)，(e)特性粘度〔η〕＝0.03971～0.06255dl·g^-1，(f)比熱容0.2536～0.3995Cal/g·℃，(g)紅外光譜如圖5所示，(h)核磁共振氫譜如圖6所示，(i)核磁共振碳譜如圖7所示，以及(j)氣相色譜-質譜分析如圖8所示。本發(fā)明還涉及含有牛樟芝中性多糖的口服用組合物，該中性多糖具有如上的特征(a)-(j)。文檔編號A61K36/06GK101553238SQ200680056180公開日2009年10月7日申請日期2006年10月23日優(yōu)先權日2006年10月23日發(fā)明者服部征雄,許嘉欽申請人:善笙生物科技股份有限公司