專利名稱：：用于改善皮膚狀態的組合物的制作方法
技術領域：
：本發明涉及用于改善皮膚狀態的組合物，其包含酵母細胞壁分離物作為活性成分。更具體而言，本發明涉及用于改善皮膚狀態的組合物，其包含酵母細胞壁分離物作為活性成分，所述酵母細胞壁分離物通過將可溶性胞內組分從經酶處理的和/或經非酶處理的酵母中去除而獲得。
背景技術：
：每個人都希望擁有漂亮的皮膚，或更具體而言，希望擁有健康的皮膚狀態。然而由于諸如衰老、紫外線和環境變化的因素，出現各種問題，諸如老年斑、皺紋和皮膚粗糙。為了克服這些問題，業已以例如化妝品、口服藥品和食品的形式開發出多種技術。這些技術旨在通過例如暫時補充皮膚細胞內減少的組分來重建健康皮膚。它們還可旨在通過例如暫時覆蓋皮膚表面來重建健康皮膚。使用皮膚改善劑可使皮膚暫時處于無問題的健康狀態。可以通過涂敷到皮膚來產生皮膚美白效果的試劑的實例包括包含原花色素作為活性成分的皮膚美白化妝品(日本特開平第H2-134309A號公報(1990))，和作為功能組分展現諸如皮膚美白和恢復皮膚彈性效果的山茶科木荷屬(7"'*科^f7屬77^aceaeSc/n'ma)的植物提取物(日本特開平第H9-95420A號公報(1997))。作為皮膚保濕效果或皮膚用基劑(皮膚用基剤dermatologicbase)的實例，日本特開第2005-15348A號公開了包含來源于微生物的^葡聚糖的護膚化妝品。此外，日本特開第2005-162663A號公開了包含具有特定分子量和粘度的、來源于微生物的(3-葡聚糖的皮膚用基劑。日本特開第2005-185187A號公開了通過使用包含酵母細胞壁水溶性分離物的皮膚洗劑實現皮膚保濕效果。日本特開第2001-163720A號公開了包含甘露糖的保濕劑、化妝品和皮膚外用劑。同時，業已開發出包含抗壞血酸、杜仲提取物、人參提取物、薏苡提取物、神經酰胺、膠原、透明質酸、硫酸軟骨素或DNA等作為功能性材料的食品，這些食品例如包括含有膠原蛋白或其水解產物作為主要成分的代謝促進劑(日本特開平第H7-278012A號公報(1995))、及含有神經酰胺作為活性成分的保健食品(日本特開平第HI1-113530A號公報(1999))。近年來，活性氧因引起皮膚粗糙或皮膚老化而受到關注。活性氧在生物細胞中的能量代謝過程中產生，并被稱為"超氧化物"(即，單電子還原氧分子所產生的超氧陰離子、過氧化氫、單線態氧或羥自由基等)。這樣的活性氧對于吞噬細胞殺微生物機制而言是必需的，并在清除病毒或癌細胞中起關鍵作用。然而，過量產生的活性氧攻擊體內構成膜或組織的生物分子，從而引起各種疾病。例如，認為活性氧使生物組織例如膠原降解、變性或交聯，或者產生可使油質氧化和損傷細胞的過氧化脂質。由活性氧造成的損傷被認為引起皮膚老化，例如形成皺紋或降低皮膚彈性。體內首先由氧產生的自由基是超氧化物，其他自由基如羥自由基則通過超氧化物產生。細胞中的超氧化物通過細胞所產生超氧化物歧化酶(SOD)轉變成過氧化氬。SOD的量隨著衰老而減少，SOD量的下降導致細胞中超氧化物的濃度升高，最終，超氧化物對身體造成損害。為了補充數量下降的SOD，將SOD本身、生育酚或黃芩根提取物等用作SOD樣作用試劑。另外，業已報道了用于阻抑過氧化脂質水平升高的組合物，其包含特定聚合度的甘露寡糖(日本特開第2002-262828A號)。業已知曉通過從酵母中去除可溶性胞內組分而獲得的酵母細胞壁分離物。業已知曉取決于制備方法的不同類型的酵母細胞壁分離物。業已知曉取決于制備方法而具有膳食纖維含量和蛋白含量等的不同組成的酵母細胞壁分離物(日本特開第2001-55338A號和日本特開第2002-153263A號)。此外，業已知曉這些酵母細胞壁分離物的各種生理活性功能。例如，業已知曉的各種功能例如有預防便秘和/或改善其癥狀、預防變應性疾病和/或改善其癥狀(日本特開第2001-55338A號)、預防脫水收縮的效果(日本專利第3502341號)、預防和改善腎功能下降(日本特開第2004-161618A號)、促進礦物質吸收以及預防和改善骨質疏松癥(日本特開第2004-292382A號)。然而，通過口服給予所述酵母細胞壁分離物改善皮膚狀態的效果仍未知曉。發明公開本發明所需解決的課題如上文所述，已開發出許多用于皮膚保濕或美白的技術，盡管這些技術的效果往往不足夠。已通過例如增加被混合活性成分的量的方法作出了克服這些問題的嘗試。然而，這些嘗試在成本和藥品穩定性方面造成問題，并強烈需要改進預期效果。例如，日本特開第2005-15348A號、日本特開第2005-162663A號、日本特開第2005-185187A號和日本特開第2001-163720A號公開了包含水溶性活性成分的外用劑。這些涂敷到皮膚上的化妝品不能維持其效果，因為這些有效成分將由于出汗而隨時間被清除。因此，防止皮膚老化的效果不足，或者僅在該試劑所涂敷的皮膚部位體現效果。為了解決這種外部影響引起的問題，開發出旨在改善皮膚狀態的口服食品。然而，在這種情況下，存在以下顧慮存在因為口服活性成分而引起變應性癥狀的可能、以及因為影響消化酶功能所必需的金屬離子而造成未料及的副作用等。此外，口服的潛在問題已被指出，例如有因活性成分被胃酸或消化酶降解和修飾、在腸道中吸收消化率低等而導致對皮膚的影響不足。換言之，為改善皮膚狀態可以涂敷到皮膚或口服給予的現有產品在功能及安全性方面不充分。作為體內的酶及清除活性氧的物質的SOD非常昂貴，因為其難以純化、熱不穩定且容易失活。因此，表現與SOD相同的清除活性氧效果的、高穩定且節省成本的SOS代替物(即SOD樣活性物質)受到人們的期待。本發明旨在從具有高安全性的天然物質之中發現具有保濕和/或美白皮膚效果(即阻抑色素形成的效果)和/或清除活性氧效果的、具有SOD樣活性的物質。本發明還旨在利用這些物質來提供保濕組合物、美白組合物及消除活性氧的組合物。解決課題的手段為了克服上述問題，本發明深入研究關于具有改善皮膚狀態效果的天然物質，該物質安全并展現改善皮膚狀態的極好效果。結果，本發明如今已發現口服酵母細胞壁分離物(其通過將可溶性胞內組分從經酶處理的和/或經非酶處理的酵母中去除而獲得)會意想不到地表現改善皮膚狀態的極好效果，而且所述分離物可以作用安全無副作用的組合物來改善皮膚狀態。這致使本發明得以完成。作為用于改善皮膚狀態的本發明組合物的酵母細胞壁分離物，經以下步驟獲得的酵母細胞壁分離物可以用作本發明特別優選的酵母細胞壁分離物通過將可溶性胞內組分從經酶處理的和/或經非酶處理的酵母中去除而獲得酵母細胞壁分離物，使其進一步經受水洗處理、或者經受高壓處理及水洗處理。用作改善皮膚狀態的本發明組合物活性成分的酵母細胞壁分離物通過以下步驟制備從酵母中去除可溶性胞內組分，純化生成物，優選使酵母細胞壁分離物的干物質中膳食纖維含量為60%重量以上，更優選65%重量以上，最優選80。/。重量以上。包含酵母細胞壁分離物用于改善皮膚狀態的本發明組合物從天然制品中獲得，且安全、無副作用并對給予人體而言安全。給予所述組合物可以帶來改善皮膚狀態的效果。此外，用于改善皮膚狀態的本發明組合物可通過多種施用方式來表現改善皮膚狀態的效果，所述施用方式例如有藥品、食品或^t品、或者詞料。發明簡述總而言之，本本發明包含以下特征(1)用于皮膚狀態的改善的組合物，其包含通過將可溶性胞內組分從經酶處理的和/或經非酶處理的酵母中去除而獲得的酵母細胞壁分離物作為活性成分。(2)(l)的組合物，其中所述活性成分為如下獲得的酵母細胞壁分離物通過將可溶性胞內組分從經酶處理的和/或經非酶處理的酵母中去除而獲得酵母細胞壁分離物，使其進一步經受水洗處理、或者經受高壓處理及水洗處理。(3)(1)或(2)的組合物，其中所述酵母細胞壁分離物的膳食纖維含量為60%干重以上。(4)(1)-(3)中任一項的組合物，其被喂食或給予動物。(5)(1)-(4)中任一項的組合物，其中所述皮膚狀態的改善為皮膚保濕作用。(6)(1)-(4)中任一項的組合物，其中所述皮膚狀態的改善為皮膚美白作用。(7)(1)-(4)中任一項的組合物，其中所述皮膚狀態的改善為活性氧去除作用。(8)(1)-(7)中任一項的組合物，其為藥品、食品或飲品、寵物食品、或者飼料。(9)用于改善動物皮膚狀態的方法，其包括將(l)的組合物喂食或給予動物。(10)酵母細胞壁分離物用于制備改善皮膚狀態的組合物的用途，所述酵母細胞壁分離物通過將可溶性胞內組分從經酶處理的和/或經非酶處理的酵母中去除而獲得。術語定義本文所用術語定義如下。術語"酵母細胞壁分離物"是指主要由酵母細胞壁組成的經分離的物質(fractionatedsubstance),其通過將可溶于水或極性溶劑(例如，含水的乙醇或丙酮)的胞內組分(例如，蛋白質、氨基酸、核酸、糖類等)從經酶處理和/或經非酶處理的酵母細胞中去除來獲得。更具體而言，所述酵母細胞壁分離物能夠通過使以下物質經受水洗處理、或高壓處理和水洗處理而獲得通過將可溶性細胞組分從經酶處理的和/或經非酶處理的酵母中去除而獲得的酵母細胞壁分離物、或從酵母提取物傳統制備中排放的酵母提取殘余物(參見以下實施例1和2)。酵母細胞壁分離物的特征在于例如膳食纖維含量為60%干重以上、優選65%干重以上、最優選80。/。干重以上。術語"高壓處理"是指用于有效地將雜質(例如可溶性胞內組分)從酵母細胞壁分離物中進一步去除的處理，其包括使用勻漿器、弗氏壓碎器或高壓擠出機的處理，所述酵母細胞壁分離物通過將可溶性胞內組分從經酶處理的和/或經非酶處理的酵母中去除而獲得。術語"膳食纖維"是指難于被人消化酶消化的纖維組分。在本發明中，該術語特別指非水溶性膳食纖維。術語"皮膚狀態"是指動物(優選人)的非健康皮膚狀態，例如由皮膚干燥引起的皮膚粗糙、皮膚干裂、松弛、皺紋等，由日曬等引起的色素形成、老年斑、或雀斑等，由活性氧引起的皮膚病(特應性皮炎除外)等。術語"皮膚保濕作用"是指阻抑水分從皮膚表面蒸發而保持水分的作用。術語"皮膚美白作用"是指阻抑黑色素產生(即色素形成)的作用。術語"活性氧清除作用"是指在體內降低活性氧或阻抑活性氧(也稱為"超氧化物")產生的作用。術語"喂食"或"攝食"是指將食品或飲品或藥品通過口或食道送入胃腸道。該術語通常指是指經口喂食或經口攝食或經口給予。術語"給予"是指經口給予。術語"動物"是指哺乳動物，例如人、寵物(例如狗或貓)或家畜動物(例如牛、馬、綿羊或山羊)，優選人。發明效果本發明組合物具有改善皮膚狀態的作用，包括皮膚保濕作用、皮膚美白作用和清除活性氧的作用。因此，該組合物可以用于藥品、食品或飲品、或飼料以改善皮膚狀態。作為該組合物活性成分的酵母細胞壁分離物從天然制品中獲得，且安全、無副作用。因此，所述細胞壁分離物可以安全給予至體內。此外，所述活性成分所具備的改善皮膚狀態的效果事實上在以下實施例中被證實能在人或大鼠中提供顯著效果。附圖簡述圖1顯示在喂食釀酒酵母細胞壁分離物(BYC)之后，人受試者的經皮水分蒸發量。圖2顯示給予BYC后，人受試者下頜下區的黑色素水平。圖3顯示給予BYC后，人受試者臉頰區的黑色素水平。圖4顯示喂食BYC所致的人受試者臉頰水分含量隨時間的變化。圖5顯示喂食BYC所致的人受試者臉頰水分蒸發量隨時間的變化。圖6顯示喂食BYC對人受試者(一位男性)臉上老年斑的作用。圖7顯示與對照組相比，給予BYC的大鼠組別皮膚水分含量的變化。圖8顯示與對照組相比，給予BYC的大鼠組別經皮水分蒸發量的變化。圖9顯示與對照組相比，給予BYC的大鼠組別黑色素水平的變化。圖10顯示給予YCW的大鼠組別及給予BYC的大鼠組別中超氧化物的清除百分率。實施發明的最佳方式本發明涉及用于改善皮膚狀態的組合物，其包含酵母細胞壁分離物作為活性成分，所述細胞壁分離物通過將可溶性胞內組分從經酶處理的和/或經非酶處理的酵母中去除而獲得。特別優選的酵母細胞壁分離物實例為通過以下步驟獲得的酵母細胞壁分離物通過將可溶性胞內組分從經酶處理的和/或經非酶處理的酵母中去除而獲得酵母細胞壁分離物，使其進一步經受水洗處理、或者經受高壓處理及水洗處理。為使用作改善皮膚狀態的本發明組合物活性成分的酵母細胞壁分離物展現極好的改善皮膚狀態效果，優選從酵母中去除可溶性胞內組分，純化生成物，使酵母細胞壁分離物中的膳食纖維含量為60%干重以上，更優選65%干重以上，最優選80%干重以上。此后，對本發明作更詳盡的公開。(原料酵母)用作本發明所用酵母細胞壁分離物的原材料的酵母并無具體限制，只要其分類學上屬于酵母并且可食用即可。例如，作為釀酒過程中副產物的釀酒酵母、葡萄酒酵母、面包酵母、產朊假絲酵母、酒精酵母或日本清酒酵母均可以使用。具體實例包括但不限于釀酒酵母和面包酵母所屬的酵母屬(Sacc/wramyce力的酉良酒酵母OSacc/mra^ycescereWs/ae)、貝酵母(5"acc/zaramyce、巴斯德酵母(6Wcc/wom少ces"/7"stor/aw")和卡爾酵母(iSfifcc/flnm少ce5cflW56erge似^),以及其他酵母例如魯氏接合酵母(Z7g0saccAaraw;;ces、產朊假絲酵母(Om&^和解脂假絲酵母(amdWa在本發明中，上述酵母可以單獨使用或組合使用。優選使用活酵母。當使用除活酵母以外的其他形式的酵母(例如干酵母)時，例如可將該酵母懸浮在水等液體中，并以與活酵母相同的方式對其進行處理。此外，所用酵母的形式或大小無具體限制。大小優選為1//m-20//m之間。(酵母細胞壁分離物的制備)在本發明中，用作活性成分的酵母細胞壁分離物通過將可溶于水或極性溶劑的胞內組分(例如蛋白質、氨基酸、核酸、糖類等)從經酶處理和/或經非酶(即不使用酶)處理的酵母細胞中去除來獲得。一般而言，這樣的分離物可以通過酶處理溶解酵母細胞，并將可溶性胞內組分從細胞中分離及去除來獲得。這種酶處理技術的實例包括涉及使用來自酵母的酶的所謂自溶；從外部添加諸如蛋白酶、核酸酶、葡聚糖酶或酯酶的酶；及其組合。酵母細胞壁分離物可以通過離心或其他方法將可溶性胞內組分從所述經酶處理的酵母細胞中去除來獲得。優選可將得到的酵母細胞壁分離物進一步經過高壓處理和水洗處理，以得到高純度的酵母細胞壁分離物。非酶處理的實例包括機械法，例如機械研磨法、滲透壓差法、凍融法、超聲法或擠壓法。機械研磨法是涉及使用研磨器(例如攪拌器、球磨機或勻漿器)在水溶液(例如水或緩沖液)中研磨酵母的技術。滲透壓差法是利用滲透壓的差異來破環細胞壁的技術。例如，將酵母懸浮在低滲溶液中以破環細胞。凍融法是涉及重復凍結及融化酵母的循環以破環細胞壁的技術。超聲法是涉及將酵母細胞放置在例如10-600kc/sec的超聲中以破環細胞的技術。擠壓技術是涉及通過快速的壓力變化破環細胞的技術，快速壓力變化例如通過在含有酵母細胞的密閉容器中用壓機瞬時施加如900psi以上的壓力來實現，或者通過使被施加約20,000psi壓力的細胞從小噴嘴中噴出而實現。因為以上所有處理技術均用于制備酵母提取物(可溶性胞內組分)，所以考慮到生產成本，將作為制備酵母提取物副產物的酵母提取殘余物用作酵母細胞壁分離物是有利的。酵母提取殘余物可以通過以下方法獲得例如，日本特開平第H8-56611A號公報(1996)的用于制備酵母提取物的方法，其包括用酶使熱滅活酵母的水懸液降解，通過添加殼聚糖、或添加殼聚糖和聚丙烯酸酯兩者去除水溶性物質，隨后獲得酵母提取物的水溶液；日本特開平第H9-56361A號公報(1997)的用于制備酵母提取物的方法，其包括將經過高壓勻漿器處理的酵母細胞懸液pH從弱堿水平調整至中性(例如約9以下的pH水平)，將含有內源型蛋白酶(endo-typeprotease)的酶試劑加入到該酵母細胞懸液中用于自溶；或日本特開平第H11-332511A號公報(1999)的用于制備酵母提取物的方法，其包括加熱酵母細胞(作為原材料)，在核酸酶存在及降解5'-核苷酸的酶活性受阻抑的條件下消化細胞組分，隨后進行提取以獲得酵母提取物。此外，還可以有效使用從其他制備酵母提取物的已知技術獲得的酵母提取殘余物。優選使用經水洗處理、或高壓處理及水洗處理得到的酵母細胞壁分離物，因為其有更佳的改善皮膚狀態效果。此外，優選使用這樣的分離物，因為所述分離物沒有任何因自溶而產生的不宜的特殊味道或氣味，因而適宜用于口服。高壓處理可以通過任何方法進行，前提是可溶性胞內組分可以被有效去除。這些方法的實例包括用高壓勻漿器處理、用弗氏壓碎器處理和用擠壓機處理。在高壓處理技術之中，最優選用高壓勻漿器處理因為可有效去除雜質。在使用高壓勻漿器的情況下，對酵母細胞壁分離物(通過將可溶性胞內組分從經酶處理的和/或經非酶處理的酵母中去除而獲得)進行的高壓處理包括在優選100-1,500kg/cm2、更優選500-1,500kg/cm2的壓力下的高壓處理。為了進一步增強去除雜質的效果，對酵母細胞壁分離物可進行多次高壓處理，或可實施適當組合的兩種或三種上述不同類型高壓處理技術，所述酵母細胞壁分離物通過將可溶性胞內組分從經酶處理的和/或經非酶處理的酵母中去除而獲得。高壓處理后對酵母細胞壁分離物(通過將可溶性胞內組分從經酶處理的和/或經非酶處理的酵母中去除而獲得)進行的水洗處理可通過任何技術進行，前提是可將可溶性胞內組分與不溶于水的酵母細胞壁分離物分離。這些技術的實例包括離心和過濾，考慮到工作效率更優選離心。可用于水洗的水除一般的潔凈自來水以外還包括酸性水、堿性水、或含醇(例如乙醇)的水，前提是除去雜質的效率不下降。洗滌的次數可視去除雜質的范圍或程度適當決定。若有需要，在高壓處理和水洗處理之后可進行有機溶劑處理、酶處理、或者酸或堿處理等，以制備更純的酵母細胞壁分離物。通過以上方法獲得的酵母細胞壁分離物可以進一步被干燥。干燥可以為例如冷凍干燥、噴霧干燥、風干或熱風干燥等。本發明的酵母細胞壁分離物經過制備而在干物質中包含通常為60%重量以上、優選65%重量以上、進一步優選80%重量以上的膳食纖維。(膳食纖維含量的測量)膳食纖維含量通過下述的酶促-重量分析法來測量。具體而言，分別將lg樣品分配到2個500mL高燒杯中，使樣品量的差異在20mg(S)內，然后分別加入50mL0.08mol/L磷酸鹽緩沖液(pH8.0)和0.1mLTermamyl(120L，NovoNordisk)，在沸7J^中將得到的混合物加熱30分鐘同時每隔約5分鐘進行振蕩。待混合物冷卻后，用10mL0.275mol/L氫氧化鈉將pH調整至7.5土O，l,分別加入0.1mL以50mg/mL溶于磷酸鹽緩沖液中的蛋白酶溶液(P-5380，Sigma),將生成物于60。C振蕩30分鐘。待混合物冷卻后，用10mL0.325mol/L鹽酸將pH調整至4.3士0.3，分別加入0.1mL淀粉葡糖苷酶溶液(A-9913，Sigma)，將生成物于60。C振蕩30分鐘。隨后，分別加入4倍體積加熱到60°C的95%乙醇，將生成物在室溫下靜置1小時，使用包含預先形成有約1.1gCelite硅藻土過濾層的2G2玻璃過濾器進行吸濾。將殘余物用20mL78。/。乙醇洗滌三次，用10mL95。/o乙醇洗滌兩次以上，然后用10mL丙酮洗滌二次以上，隨后于105。C干燥過夜。測量恒重(R1和R2)之后，將其中一個樣品于525°C灰化5小時，計算灰分含量(。/。)(A)。在另一個樣品中，測量并通過凱氏定氮法(系數6.25)計算蛋白質含量(。/。)(p)。對不加入樣品以相同方式獲得的數值進行測量，作為空白值。基于獲得的數值由下式確定膳食纖維含量。膳食纖維(％重量)=(Rx(1—(p+A)/100-B)/Sx100R:殘余物重量(平均值，(Rl+R2)/2，mg)P:殘余物中的蛋白含量(％)A:殘余物中的灰分含量(％)S:所收集的樣品量(平均值，mg)B:空白(mg)B(mg)=rx(1-(p+a)/100)白殘余物的重量(平均^直，mg)p:空白殘余物中的蛋白質含量(％)a:空白殘余物中的灰分含量(％)蛋白質含量通過凱氏定氮法來測量，且蛋白質含量可以根據例如以下文獻中描述的方法進行"食品分析法，由日本工業學會食品分析方法編輯委員會編輯(日本)，第101頁。"(改善皮膚狀態的組合物的施用)本發明組合物具有阻抑皮膚(或肌膚)表面水分蒸發量的效果。因此，該組合物具有使動物(優選人)的肌膚濕潤的效果，該組合物還具有保持水分的效果。因此，喂食、攝食或給予該組合物可以改善皮膚的干燥狀態(即改善皮膚干燥)、防止皮膚干燥(即預防皮膚干燥)或增強及改善皮膚角質層的屏障功能。這些突出的效果還預期可以使皮膚堅實或有光澤、改善皮膚皺紋或松垂，以及預防或改善由千燥引起的皮膚粗糙。本發明組合物具有皮膚保濕效果。因此，該組合物預期表現例如使皮膚濕潤、使皮膚保持水分、軟化皮膚、使皮膚平滑以及使皮膚光滑。因此，本發明組合物可以優選用于例如皮膚千燥者、皮膚傾向變干燥者、皮膚容易干燥者、皮膚敏感者、對皮膚干裂不適者或者頭皮干燥者，以賦予皮膚保濕效果或改善皮膚角質層屏障功能的效果。此外，將本發明組合物喂食、攝食或給予人可以防止或減輕各種由皮膚引起(或與之相關)的癥狀或疾病，例如老年干燥病或兒童皮膚干燥。本發明組合物還具有阻抑人黑色素產生的效果。因此，攝食該組合物可以防止或改善日曬后色素形成、老年斑、雀斑或黃褐斑，并可以展現良好的皮膚美白效果。此外，因為本發明組合物在動物(優選人)中具有消除活性氧效果，所以它可以用于例如防止或治療由活性氧(oo引起的皮膚病，諸如老年斑、雀斑、皮膚粗糙、不耐冷或皺紋。所述組合物還可以用于以下方面藥品、諸如健康食品的食品或飲品、或食品添加劑，以治療、改善、防止活性氧(〇2-)所引起的各種疾病，或用于對這些疾病的其他目的，所述疾病例如有血液循環紊亂所引起的疾病(例如心肌梗塞、中風、高血壓、經期痙攣、肩膀僵硬、神經痛、腰背痛或宿醉)、和與生活方式相關的疾病和內科疾病(例如癌癥、肝炎或糖尿病)。本發明組合物還可以用于家畜動物詞料或狗、貓等的寵物食品。這樣的飼料或寵物食品可作為上述組合物情況的任何形式，前提是所述飼料或寵物食品常規形式的飼料或寵物食品，并且可以與通常在銅料或寵物食品所含的添加劑或食物原料結合，以按照傳統技術制備各種形式的詞料或寵物食品。當然，本發明組合物可以用作例如飼料或寵物食品。此外，本發明組合物在所述飼料或寵物食品中的含量、所飼喂的飼料或寵物食品量、或其他條件不作具體限制，前提是本發明的效果可以得以展現。根據飼料或寵物食品的形式、家畜動物或寵物的類型、或其他因素對這些條件作適當確定。例如，可以使用類似于上述食品所用的條件。當本發明組合物用于家畜動物飼料或寵物食品時，可以寄望喂食這樣的飼料或寵物食品飼能實現上述改善皮膚狀態的效果，所述效果例如阻抑皮膚(或肌膚)水分蒸發量的效果、或改善與之相伴隨的皮膚干燥狀態的效果。本發明組合物可以單獨包含酵母細胞壁分離物作為活性成分，或者該組合物可以酵母細胞壁分離物與用于改善皮膚狀態的其他成分或材料混合的形式使用。用于改善皮膚狀態的其他成分或材料的實例包括膠原、透明質酸、硫酸軟骨素、原花色素、生育酚和抗壞血酸。本發明組合物可視預期應用而配制為藥品、包括健康食品在內的食品或飲品、或者飼料的形式。或者，所述制品可以摻入到食品或伺料等中，或與它們混合。本發明組合物可以用作例如防止或改善皮膚干燥狀態的試劑、改善皮膚角質層屏障功能的試劑、抗氧化劑、抗衰老劑、用于美容目的的食品或飲品、護膚化妝品、或用于美白動物皮膚的食品。劑型可作為固體狀(例如固體、粉末、顆粒或其他形式)、糊狀、凝膠狀、液體狀或渾濁狀(或混懸狀)的任何形式。當制備這些制劑時，可以充分使用常常用于制備固體制劑的輔藥，例如載體、賦形劑、稀釋劑、潤滑劑、防腐劑、崩解劑、懸浮劑、著色劑、矯味劑或甜味劑。制劑的實例包括各種內服用制劑(包括動物例如家畜動物或寵物用制劑)。具體實例包括1)藥品和2)準藥物，它們為如下形式針劑、膠嚢、丸劑、片劑、散劑、顆粒劑、固體、液體、凝膠或氣泡。載體和賦形劑的實例包括無菌水、乳糖、硬脂酸鎂、淀粉、滑石、明膠、瓊脂、果膠、阿拉伯樹膠、植物油(例如橄欖油和麻油)、可可脂、乙二醇、和醇(例如乙醇)。稀釋劑的實例包括乳糖、甘露醇、葡萄糖、羥基丙基纖維素、微晶纖維素、淀粉、聚乙烯吡咯酮、硅酸鋁^:、滅菌水、醇(例如乙醇)和甘油。潤滑劑的實例包括硬脂酸鎂。崩解劑的實例包括纖維素乙二醇酸鈣。懸浮劑的實例包括乙二醇，諸如丙二醇和聚乙二醇；植物油，諸如橄欖油；醇，諸如乙醇；和聚山梨酯80(商標)。防腐劑的實例包括苯扎氯銨、節索氯銨、羥苯曱酯、羥苯乙酯和山梨酸鈉。矯味劑的實例包括薄荷油和檸檬酸。甜味劑的實例包括蔗糖和人造甜味劑，諸如阿斯帕坦(商標)。片劑和丸劑可用諸如蔗糖、明膠、或羥基丙基曱基纖維素鄰苯二曱酸酯的糖衣包衣；或者用胃溶性或腸溶性的膜包衣；或若有需要可用兩層以上的層包衣。在膠嚢制劑中，可以使用軟明膠或硬明膠作為包衣材料。優選給藥途徑為口服途徑。當將酵母細胞壁分離物(其作為本發明改善皮膚狀態的組合物的活性成分)加入或摻入食品或飲品中時，這樣的食品或飲品可以作為各種形式。實例包括各種飲品，例如酸奶飲料、果汁、蔬菜汁、果蔬混合汁、牛奶、豆奶、酒精飲料、咖啡、紅茶、綠茶、煎茶(煎茶)、精制綠茶(玉露)、烏龍茶、黃姜茶(々3^茶)、普洱、茉莉花茶、運動飲料、礦泉水、味噌湯、和湯；乳制品，例如千酪、奶油、酸奶和酸奶果凍(yoghurtjelly);西式糖食，例如布丁、餅干、曲奇餅、蛋糕、糖納子、和果凍；烘培點心，例如脆米々并，日式糖食，例如羊羹(羊羹)、大福餅(大福)、萩餅("a多')和茶碗糕(力^于，日本松蛋糕)；糖食(confectionery),例如冷凍甜^;口腔護理組合物，例如口香糖和糖果；面包，例如方形面包、法式面包和面包巻；面條，例如烏冬面和蕎麥面；加工過的魚醬，例如魚糕、圓筒狀魚糕、火腿(ham)和魚肉香腸；肉制品，例如火腿、香腸和漢堡包；調味料，例如豆醬、醬油、調味汁、佐料、蛋黃醬、蜂蜜和甜味劑；香辛料，例如咖喱粉、芥末粉和胡椒粉；鐵板燒的食品，例如章魚餃子、御好燒(日式薄餅)和炒面；豆腐、魔芋食品、果凍、馬茉蘭、巧克力醬、腌制食品、佃煮、香松(A0力>j"香松粉)、鍋貼餃、比薩餅、三明治、漢堡包、油炸丸子、色拉和其他各種熟食品。此外，所述酵母細胞壁分離物可以用于一般的食品或飲品，例如作化妝品用途的食品和保健食品(例如用于改善皮膚粗糙或膚質)。優選本發明組合物包含一般食品中所包含的添加劑和食品材料，視該組合物形式而定。可對添加劑作任意選擇，視食品形式而定，例如選自甜味劑、著色劑、抗氧化劑、維生素和合成香料等。本發明組合物可以用作食品材料以制備任意食品。當本發明組合物作為食品材料用于食品時，可將該組合物加入到預制的食品中，例如市售的^1品。本發明組合物中酵母細胞壁分離物的含量為0.1-100%重量，優選1-30%重量，盡管所述含量不受此范圍限制。根據食品的形式以及進食本發明組合物者的年齡、性別和其他情況選擇恰當的劑量或進食量。一般而言，基于干重計算，作為本發明組合物活性成分的酵母細胞壁分離物的進食量或給予量為每天每kg體重約l-l，OOOmg，優選約10-200mg。酵母細胞壁分離物可以每天給予或進食一次或若干次。除以上組合物以外，本發明還提供用于改善動物皮膚狀態的方法，包含用所述化合物喂食或給予動物。本發明還提供了作為本發明組合物活性成分的酵母細胞壁分離物(通過將可溶性胞內組分從經酶處理的和/或經非酶處理的酵母中去除來獲得)用于制備改善皮膚狀態的組合物的用途。在這之后，根據實施例對本發明作更詳細的描述，但是本發明的
技術領域：
不受其限制。此外，除非另外指明，否則實施例中所出示的酵母細胞重量在實際情況中為干重。實施例準確稱量作為釀酒過程副產物而獲得的經發酵的釀酒酵母漿的重量，加水以調整其中的固體含量至10%重量。加入氪氧化鈉直至pH水平達到9,進行離心，將水加入沉淀分離物進行洗滌，再次進行離心。使上述混懸液(通過加入水已使其中的固體含量調整至10%重量)在冷卻的同時經過高壓勻漿器處理，于50。C使生成物自溶3小時以上。然后，通過加入蛋白酶于50°C過夜作進一步酶反應，進行離心去除可溶性胞內組分。加入水使得到的酵母細胞壁分離物的固體含量調整至10%重量，洗滌生成物，隨后進行離心；重復2次以上步驟，將得到的沉淀分離物凍干，生成物稱為"酵母細胞壁分離物1:凍干YCW,"對其組分進行分析。通過在常壓下加熱的干燥方法測量水分含量，所述方法涉及在常壓下于105。C加熱樣品5小時(參見"食品分析法，由曰本食品工業學會食品分析方法編輯委員會編輯(曰本)，第4頁")。蛋白質含量通過上述凱氏定氮法測量，灰分含量通過上述直接灰化法測量，而膳食纖維通過上述酶促-重量分析法測量。進行3次測量，平均測量值由％重量表示。經分析的組分于表1中顯示(實施例2應參考表中的有關BYC1和BYC2)。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>[實施例2]準確稱量作為釀酒過程副產物而獲得的經發酵的釀酒酵母漿的重量，加水以調整其中的固體含量至10%重量。加入氫氧化鈉直至pH水平達到9，進行離心，將水加入沉淀分離物進行洗滌，再次進行離心。使上述混懸液(通過加入水已使其中的固體含量調整至10%重量)在冷卻的同時經過高壓勻漿器處理，于50。C使生成物自溶3小時以上。然后，通過加入蛋白酶于50°C過夜作進一步酶反應，進行離心去除可溶性胞內組分。使用高壓勻漿器(Blue-t叩40.80H，APV,England)在60。C和900bar下對獲得的酵母細胞壁分離物進行高壓處理。進行4次高壓處理，對各次高壓處理獲得的液體產物均用水作4倍稀釋并攪拌，然后用離心機(FEUX512，AlfaLaval,Sweden)對其進行固液分離，洗滌去除可溶性胞內組分。再重復3次洗滌去除步驟，以制備酵母細胞壁分離物漿液(以下簡稱為"BYC漿")。對經過4次高壓處理的BYC漿再進行凍干而獲得的產物稱為"酵母細胞壁分離物BYC1。"對BYC漿進行噴霧干燥而獲得的產物稱為"酵母細胞壁分離物BYC2。"通過與實施例1中的相同方法對這些產物中的組分進行分析。測量值在表1中顯示。采用6名年齡在25-35之間的健康女性作為受試者，每天進食6g由實施例2獲得的BYC2。每日的進食持續3周時間，進食前后用皮膚分析儀對皮膚狀態(角質層水分含量、屏障功能和黑色素水平)變化進行評價。清洗測量部位以后，讓受試者在椅子靜坐等候30分鐘，在環境測試實驗室中進行測量，其中的溫度調整至20°C-23。C而濕度調整至40%-50%。1)角質層水分含量通過Low-FrequencyCapacitance法用CorneometerCM825(Courage+KhazakaElectronicGmbh,Germany)測量角質層水分含量。測量部位為表現可見干燥跡象的前臂、臉頰和嘴角周圍區域。結果在表2中出示。進食BYC所產生的效果沒在臉頰區中觀察到，該區在進食BYC之前觀察到水分含量充足。然而，在前臂和嘴角周圍區域，進食BYC后水分含量明顯增加。特別地，與進食BYC之前的水分含量相比，表現干燥跡象的嘴角周圍區域中的水分含量顯著增加rp<0.05)。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>2)屏障功能用TewameterTM300(Courage+KhazakaElectronicGmbh)測量上臂經皮水分蒸發量并對屏障功能進行評價。經皮水分蒸發量通過測量皮膚的水分蒸發量來檢測。即，值約小代表屏障功能越好。結果在圖1中顯示。作為進食BYC的結果，在幾乎所有受試者中觀察到經皮水分蒸量減少。在進食BYC前平均經皮水分蒸發量為14.4g/m2/hr,而在進食BYC后該值顯著降至12.1g/m2/hr(p<0.001)，觀察到屏障功能的顯著改善。認為測量到的經皮水分蒸發量體現了以下事實水分容易從體內傳至外部，物質也容易從外部滲入皮膚。這表明進食BYC可以抑制刺激物從外部入侵。3)黑色素水平4吏用MaxameterMX18(Courage+KhazakaElectronicGmbh)測量黑色素水平。測量部位為受紫外線影響較少的下頜下區和易受紫外線影響的臉頰。結果分別在圖2和圖3中出示。作為進食BYC的結果，黑色素水平均在下頜下區和臉頰區中顯著降低(p<0.05)。采用遭受皮膚干燥的年齡在28-40歲的9名男女(4位男性，5位女性)作為受試者，每日攝食2g由實施例2獲得的BYC2。每日的攝食持續3周時間，使用皮膚分析儀評價皮膚水分保持功能(角質層的水分含量和屏障功能)隨時間的變化。在受試者當中，對臉上有暗色老年斑的男性受試者的黑色素水平進行測量，以評價進食BYC對老年斑的作用。測量的條件和方法與實施例3中的一致。圖4顯示受試者臉頰區中的水分含量隨時間消逝的變化。虛線代表男性受試者而實線代表女性受試者。作為攝食BYC的結果，除攝食前就保持水分含量充足的l名受試者外，所有受試者的臉頰區均觀察到水分含量增加。進食前評價為"具一定程度干燥"的4名女性受試者在進食3周BYC之后被評為"維持水分含量充足"。經受相當干燥的2名男性受試者的狀態被改善為輕微干燥。圖5顯示起屏障作用的臉頰水分蒸發量隨時間的變化。結果，觀察到9名受試者中有7名的屏障功能得以改善，幾乎所有受試者的狀態改善至正常水平。圖6顯示對男性受試者臉上老年斑的作用。作為攝食BYC的結果，老年斑的黑色素水平隨時間而下降，觀察到對已存在的暗斑的皮膚增白效果。[實施例5]讓兩組IO名受試者(年齡為20-50的男女)分別攝食本發明實施例1制備的YCW和實施例2制備的BYC2，攝食量為2g每天，持續2個月。評價進食前后的皮膚狀態變化。評價項有皮膚濕度、皮膚堅實度(彈性)和細紋情況，通過調查表將評價結果分成4個等級改善、稍微改善、無變化和惡化。將結果經由各個水平的受試者數目在表3中顯示。在YCW組和BYC組中均觀察到各個參數改善的趨向。在BYC組中觀察到更顯著的效果。在皮膚濕度方面，BYC組中的幾乎全部受試者都觀察到改善的趨向。YCW組和BYC組中均無副作用的跡象，且未觀察到皮膚狀態惡化的情況。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>[實施例6]預先對HYW/Slc雄性大鼠(5周齡)在自由取食標準粉狀食品(CE-2，CLEAJapan，Inc.)的條件下進行哏養以使其適應實驗環境。隨后，基于它們的體重將大鼠分成2組，每組10只。將給予標準粉末食品的大鼠組定為對照組。使用通過以下方法制備的測試飼料(試樣)將實施例2制備的BYC1樣品與標準粉狀食品以5%:95%的比例混合。允許受試大鼠自由取食這些測試飼料3周，在給予測試飼料之前、開始給予后10天、開始給予后22天，用皮膚分析儀對皮膚狀態(角質層水分含量、屏障功能和黑色素水平)進行評價。將背部定為測量部位，使用實施例3中的分析儀。結果由變化百分比來表示，該變化百分比相對于給予測試飼料前的數值"100"而言(圖7-9)。直到開始給予后10天，對照組與BYC組之間的水分含量、經皮水分蒸發量和黑色素水平基本不存在差異。然而，在開始給予后的22天，BYC組的皮膚水分含量與對照組相比增力口(圖7)。BYC組中出現經皮水分蒸發量下降的趨勢，且因喂食BYC而觀察到屏障功能增強(圖8)。此外，BYC組中黑色素水平顯著下降(圖9)。因此，作為喂食混合物的結果，在無毛鼠中觀察到改善皮膚功能的效果。預先對HYW/Slc雄性大鼠(5周齡)在自由取食標準粉狀食品(CE-2,CLEAJapan,Inc.)的條件下進行喂養以使其適應實驗環境。隨后，基于它們的體重將大鼠分成2組，每組5只。將給予標準粉末食品的大鼠組定為對照組。通過分別將實施例1或2制備的YCW樣品或BYC1樣品與標準粉狀食品以5%:95%的比例混合，制備測試飼料(試樣)。允許受試大鼠自由取食這些測試飼料2周，從腹部動脈抽取全血，用二水合乙二胺四乙酸二鉀使血液抗凝，對離心所得的血清進行分析。在96孔微滴定板上根據SOD測試Wako(和光純藥)(基于氮藍四唑(NBT)還原測試)對血清的SOD樣活性進行測定。具體而言，將10//1分析物加至100//1含0.24mMNBT和0.4mM黃嘌呤的著色劑中，然后另外加入100//l酶溶液(黃嘌呤氧化酶)，使24生成物在37。C下孵育20分鐘。隨后，用200/il反應終止物(69mM十二烷基石危酸鈉)終止酶反應，使用酶標儀(microplatereader)在560nm下測量OD。將加入了O.lM磷酸鹽緩沖液(pH8.0)代替酶的樣品定為空白樣品，將加入了蒸餾水代替分析物的樣品定為對照樣品，通過下式確定超氧陰離子((V)清除百分比。02-清除百分比(％)=(A-B)/Ax100A:對照的吸光度B:加入樣品時的吸光度結果在圖10中顯示。與對照樣品比較，YCW組和BYC組的超氧化物清除率得以增力口。特別在BYC組中觀察到強SOD樣活性(p<0.05)。(1)使用實施例2制備的[BYC1]來制備表4所示的含酵母細胞壁的酸奶果凍。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>(2)使用實施例2制備的[BYC1]來制備表5所示的含酵母細胞壁的餅干。表5含酵母細胞壁的餅干筋力弱的面粉90.0g玉米淀粉28.0g全蛋45.0g蔗糖42.0g奶油66.0g焙烤粉0.6g水17.4g酵母細胞壁(BYC1)5.0g工業實用性本發明組合物具有改善皮膚狀態的效果，包括皮膚保濕效果、皮膚美白效果和消除活性氧效果。因此，本發明組合物可以用于藥品、食品或飲品、或飼料以改善皮膚狀態。本文所列舉的所有公開、專利、和專利申請以其全文通過引用結合到本文中。2權利要求1.用于皮膚狀態的改善的組合物，其包含通過將可溶性胞內組分從經酶處理的和/或經非酶處理的酵母中去除而獲得的酵母細胞壁分離物作為活性成分。2.權利要求1的組合物，其中所述活性成分為如下獲得的酵母細胞壁分離物通過將可溶性胞內組分從經酶處理的和/或經非酶處理的酵母中去除而獲得酵母細胞壁分離物，使其進一步經受水洗處理、或者經受高壓處理及水洗處理。3.權利要求1的組合物，其中所述酵母細胞壁分離物的膳食纖維含量為60%干重以上。4.權利要求l的組合物，其被喂食或給予動物。5.權利要求1的組合物，其中所述皮膚狀態的改善為皮膚保濕作用。6.權利要求1的組合物，其中所述皮膚狀態的改善為皮膚美白作用。7.權利要求1的組合物，其中所述皮膚狀態的改善為活性氧去除作用。8.權利要求1的組合物，其為藥品、食品或飲品、寵物食品、或者飼料。9.用于改善動物皮膚狀態的方法，其包括將權利要求1的組合物喂食或給予動物。10.酵母細胞壁分離物用于制備改善皮膚狀態的組合物的用途，所述酵母細胞壁分離物通過將可溶性胞內組分從經酶處理的和/或經非酶處理的酵母中去除而獲得。全文摘要本發明公開用于改善皮膚狀態的組合物。所述組合物包含酵母細胞壁分離物作為活性成分，其可以通過將可溶性酵母胞內組分從經酶處理的酵母細胞和/或未經處理的酵母細胞中除去來制備。該組合物有效改善皮膚狀態，所述改善包括保濕皮膚、美白皮膚及清除活性氧。文檔編號A61P17/00GK101528245SQ20068005617公開日2009年9月9日申請日期2006年8月24日優先權日2006年8月24日發明者小西豐,芳田美智子申請人:麒麟控股株式會社