eIF-5A在殺死多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞上的用途的制作方法

專利名稱：eIF-5A在殺死多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞上的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及凋亡特異性真核起始因子(eucaryotic initiation factor) ("elF-5A")和編碼的多核苷酸相同殺死多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞以及其 它癌細(xì)胞的相同用途。本發(fā)明涉及凋亡特異性elF-5 A或被稱為"凋亡特異 性elF-5A"或"elF-5Al"以及elF-5A2異構(gòu)體在抑制多發(fā)性骨髓瘤、殺死多 發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞和抑制和/或殺死其它癌細(xì)胞生長(zhǎng)上的用途。
背景技術(shù)：
凋亡是遺傳學(xué)編程的細(xì)胞事件，它的特征在于明確的形態(tài)學(xué)特 點(diǎn)，如細(xì)胞皺縮，染色質(zhì)濃縮，細(xì)胞核斷裂，以及細(xì)胞膜起泡。Kerr等 (1972) Br. J. Cancer, 26, 239-257; Wyllie等(1980)Int. Rev. Cytol.， 68, 251-306。它在正常的組織發(fā)育和體內(nèi)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用，并且，凋亡 程序的缺陷被認(rèn)為導(dǎo)致了從神經(jīng)變性和自身免疫性疾病到腫瘤的多種 人類疾病。Thompson (1995) Science, 267, 1456-1462; Mullauer等 (2001)Mutat Res, 488, 211-231。盡管已充分表征了凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué) 特征，調(diào)節(jié)這一過(guò)程的分子途徑才剛剛開(kāi)始闡明。 與凋亡相關(guān)的另一種關(guān)鍵的蛋白，是由腫瘤阻抑基因p53編碼 的蛋白。該蛋白是能調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)移到錄因子，并且誘導(dǎo)受到損傷 和遺傳學(xué)上不穩(wěn)定的細(xì)胞的凋亡， 一般認(rèn)為是通過(guò)上調(diào)Bax進(jìn)行的。Bold 等(1997) Surgical Oracology， 6, 133-142; Ronen等，1996; Schuler & Green (2001) Biochem. Soc. Tra71s., 29, 684-688; Ryan等(2001) Curr. Opin. Cell Biol., 13, 332-337; Z6mig等(2001) Biochem. Biophys. Acta, 1551, Fl-F37。 凋亡途徑的改變，被認(rèn)為在包括癌癥的多種疾病過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Wyllie等(1980)Int. Rev. Cytol.， 68, 251-306: Thompson (1995) Science, 267, 1456-1462; Sen & D'Incalci (1992) FEBS Letters, 307， 122-127; McDonnell等(1995)Seminars in Cancer and Biology, 6, 53-60。 對(duì)癌癥發(fā)生和進(jìn)展的研究，傳統(tǒng)上一直集中在細(xì)胞增殖方面。不過(guò)，凋 亡在腫瘤發(fā)生中的重要作用最近業(yè)已明確。實(shí)際上，對(duì)凋亡的了解，大 多是利用腫瘤^jt型獲得的，因?yàn)樵谀[瘤細(xì)胞中凋亡的控制總是以某種方 式改變的。Bold等(1997)Surgical Oncology, 6, 133-142。
細(xì)胞因子也參與了凋亡途徑。生物系統(tǒng)的調(diào)節(jié)需要細(xì)胞間相互
作用，而細(xì)胞間交互作用通常涉及到許多種細(xì)胞因子。許多種類的細(xì)胞
在響應(yīng)多種刺激時(shí)都產(chǎn)生細(xì)胞因子，它是介導(dǎo)因子(mediators)。細(xì)胞因 子是多效性分子，它可對(duì)多種不同細(xì)胞產(chǎn)生多種不同的作用，尤其在調(diào) 節(jié)免疫反應(yīng)及造血細(xì)胞增殖和分化中起重要作用。根據(jù)細(xì)胞因子具體種 類、相對(duì)濃度和其它介導(dǎo)因子的存在與否，細(xì)胞因子對(duì)靶細(xì)胞的作用可 以促進(jìn)細(xì)胞存活、增殖、活化、分化或凋亡。 已知脫氧肌苷合成酶(DHS)和含有8-羥-2， 7， 10-三氨基癸酸真 核翻譯起始因子-5A(elF-5A),在包括細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的很多細(xì)胞過(guò)程中 發(fā)揮重要作用。肌苷是一種獨(dú)特的氨基酸，存在于所有檢查過(guò)的真核細(xì) 胞和古細(xì)菌中，但不存在于真細(xì)菌中，而elF-5A是唯一已知的含有8-羥 -2, 7, 10-三氨基癸酸的蛋白。Park(1988) J. Biol. Chem., 263, 7447-7449; Schtimann & Klmk (1989) System. Appl. Microbiol., 11, 103-107; Bartig 等(1990) System. Appl. Microbiol., 13, 112-116; Gordon等(1987a)J. Biol. Chem., 262， 16585-16589?；钚詄lF-5A是通過(guò)兩個(gè)翻譯后步驟形成的 第一個(gè)步驟是，通過(guò)脫氧肌苷合成酶的催化，將亞精胺的4-氨基丁基部 分轉(zhuǎn)移到移到前體elF-5A的特殊賴氨酸的a-氨基上，形成脫氧肌苷殘基； 第二個(gè)步驟包括通過(guò)脫氧肌苷合成酶羥化酶使該4-氨基丁基部分羥基 化，以便形成8-羥-2, 7, 10-三氨基癸酸。 elF-5A的氨基酸序列在不同物種之間是相當(dāng)保守的，并且在 elF-5A中的8-羥-2， 7， 10-三氨基癸酸殘基周圍的氨基酸序列存在嚴(yán)格的 保守性，這表明，這種修飾對(duì)于存活來(lái)說(shuō)可能是重要的。Park等 (1993)Biofactors, 4， 95-104。這一々b殳得到了有關(guān)發(fā)現(xiàn)的進(jìn)一步支持， 即到目前為止，均存在于酵母中的elF-5A的兩種同工型的失活，或DHS 基因的失活，能催化它們的失活的第一個(gè)步驟，阻斷細(xì)胞分裂。Schmer
5等(1991)Mo1. Cell. Biol., 11， 3105-3114; Sasaki等(1996) FEBS Lett., 384， 151-154; Park等(1998) J. Biol. Chem., 273, 1677-1683。不過(guò)，消耗酵 母中的elF-5A蛋白，僅僅導(dǎo)致了總體蛋白合成的小的減弱，這表明elF-5A 可能是mRNA的特定亞型的翻譯所必須的，而不是蛋白總體合成所必須 的。Kang等(1993),"起始因子elF-5A消耗對(duì)細(xì)胞增殖和蛋白合成的影 響"，Tuite， M.(ed.), Protein Synthesis and Targeting in Yeast, NATO Series H。最近有關(guān)能結(jié)合elF-5A的配體擁有高度保守的基序的發(fā)現(xiàn)，也支持 了elF畫(huà)5A的重要作用的觀點(diǎn)。Xu & Chen(2001) J. Biol. Chem., 276， 2555-2561。另外，發(fā)現(xiàn)修飾過(guò)的elF-5A的8-羥-2, 7, 10-三氨基癸酸殘 基是與RNA的序列特異性結(jié)合所必須的，并且結(jié)合不會(huì)提供對(duì)核糖核酸 酶的保護(hù)作用。 另夕卜，elF-5A的細(xì)胞內(nèi)消耗，導(dǎo)致了特定mRNAs在細(xì)胞核中的 明顯積累，它表明elF-5A可能負(fù)責(zé)特殊類型的mRNAs從細(xì)胞核到細(xì)胞質(zhì) 的穿梭運(yùn)輸。Liu & Tartakoff (1997) Supplement to Molecular Biology of the Cell, 8, 426a.AbstractNo.2476, 37th American Society for Cell Biology Annual Meeting。 elF-5A在核孔相關(guān)的核內(nèi)絲上的積累，以及它與一4殳細(xì) 胞核輸出受體的相互作用，進(jìn)一步暗示了elF-5A是核質(zhì)穿梭蛋白，而不 是多核糖體的成分。Rosorms等(1999) J. Cell Science, 112, 2369-2380。
eIF-5A的第 一種cDNA是在1989年由Smit-McBride等克隆的，從 這時(shí)候起，業(yè)已從包括酵母，大鼠，雞胚胎，苜蓿和番茄在內(nèi)的各種真 核生物中克隆了elF-5A的cDNA或基因。Smit-McBride等(1989a) J. Biol. Chez., 264, 1578-1583; Schmer等(1991)(酵母)；Sano, A.(1995) in Imahon， M.等(eds)， Polyamine, Basic and Clinical Aspects, VNU Science Press， The Netherlands, 81畫(huà)88(大鼠)；Rinaudo & Park (1992) FASEB J., 6， A453(雞胚胎)；Pay等(1991) Plant Mol. Biol., 17, 927畫(huà)929(苜蓿)；Wang 等(2001)J. Biol. Chem., 276, 17541-17549(番茄)。 多發(fā)性骨髓瘤是一種漸進(jìn)性和致命性的疾病，其特征為在骨髓 中惡性血漿細(xì)胞(malignant plasma ells)的擴(kuò)張和溶骨損傷的出現(xiàn)。多發(fā) 性骨髓瘤是漿細(xì)胞無(wú)法醫(yī)治但可治療的 一種癌。漿細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的重 要部分，其產(chǎn)生免疫球蛋白(抗體)以幫助對(duì)抗感染和疾病。多發(fā)性骨髓 瘤特征在于在骨髓中異常漿細(xì)胞過(guò)多的數(shù)量和完整的單克隆免疫球蛋 白(IgG、 IgA、 IgD或IgE; "M-蛋白")或Bence-Jones蛋白(游離單克隆輕鏈)的生產(chǎn)過(guò)剩。低血鈣癥、貧血癥、腎損害增加對(duì)細(xì)菌感染的敏感性和減 少正常免疫球蛋白的產(chǎn)生是多發(fā)性骨髓瘤常見(jiàn)的臨床表現(xiàn)。此外，多發(fā) 性骨髓瘤的特征常常為通常存在于骨盆、脊柱、肋骨和頭骨中的彌散性 骨質(zhì)疏松癥。 多發(fā)性骨髓瘤的傳統(tǒng)治療包括化療、干細(xì)胞移植、伴隨干細(xì)胞 移植的高劑量化療和搶救治療?；煱ㄓ肨halomid⑧(反應(yīng)停)、硼替佐 米、Aredm⑧(伯米膦酸)、類固醇和Zometa㊣(唑來(lái)膦酸)。然而，許多化 療藥物對(duì)活性分離的非癌細(xì)胞如骨髓、胃和腸粘膜和毛嚢細(xì)胞有毒性。 因此，化療可能導(dǎo)致血細(xì)胞數(shù)量的降低、惡心、嘔吐、腹瀉和落發(fā)。
傳統(tǒng)的化療或標(biāo)準(zhǔn)劑量的化療一般是患有多發(fā)性骨髓瘤病人 的初級(jí)或初步治療。病人也可以接受化療以準(zhǔn)備高劑量化療和干細(xì)胞移 植。前導(dǎo)性治療(在干細(xì)胞移植之前的傳統(tǒng)化療)可用于減少移植前的腫 瘤負(fù)擔(dān)。 一些化療藥物由于對(duì)骨髓細(xì)胞較小毒性比其它藥物更適于前導(dǎo) 性治療，并導(dǎo)致骨髓干細(xì)胞的更多生長(zhǎng)。適于前導(dǎo)性治療的化療藥品的 實(shí)例包括地塞米、 沙利度胺/地塞米水> 、VAD(長(zhǎng)春新堿、 Adriamycin⑧(阿霉素)和地塞米+>的組合物)和DVd(聚乙二醇化的脂質(zhì) 體阿霉素(Doxi1⑧，Caelyx⑧)、長(zhǎng)春新堿和減少日程的地塞米松組合物)。
多發(fā)性骨髓瘤的標(biāo)準(zhǔn)療法是美法侖與強(qiáng)的松(一種皮質(zhì)甾類藥) 結(jié)合達(dá)到50%的響應(yīng)率。不幸地，美法侖是一種烷化劑，不太適于前導(dǎo) 性治療。在多發(fā)性骨髓瘤的治療，特別是在那些不能忍受化療的老年病 人中有時(shí)單獨(dú)使用皮質(zhì)甾類(特別是地塞米松)。此外，地塞米松單獨(dú)或
與其它藥物結(jié)合用于前導(dǎo)性治療。前導(dǎo)性治療中最普遍使用VAD,但近 來(lái)DVd業(yè)已在前導(dǎo)性治療中顯示出有效性。硼替佐米最近已被批準(zhǔn)用于 多發(fā)性骨髓瘤的治療，但其非常有毒。然而，現(xiàn)有療法都沒(méi)有提供治愈 的明顯潛力。 發(fā)明概述 本發(fā)明提供了 一種抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)和/或殺死癌細(xì)胞的方法。 本發(fā)明還提供了 一種抑制或減緩癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移到移能力的方法。抑制癌癥 生長(zhǎng)包括減小肺瘤的尺寸、減緩肺瘤的生長(zhǎng)，還可以包括完全緩解肺瘤 癥狀。癌癥可以為癌或腫瘤，包括但不限于結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸腺癌、膀 胱癌、宮頸腺癌和肺癌。本發(fā)明的方法包括elF-5A的給藥，優(yōu)選人elF-5Al對(duì)患有所述癌癥的患者(哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人)給藥。盡管優(yōu)選 elF-5Al，還可以使用elF-5A2異構(gòu)體。通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何適宜的方 法將elF-5A輸送至需要的患者體內(nèi)?？梢宰鳛榭肈NA輸送，如生物學(xué) 上適宜的介質(zhì)中DNA輸送，以及通過(guò)IV或皮下注射或任何其它生物學(xué) 上適宜的輸送裝置來(lái)輸送。另外的，可以在載體如腺病毒載體中輸送 elF-5A。另外地，可以在脂質(zhì)體或任何其它適宜的"載體"中輸送DNA, 其提供將DNA輸送至靶癌癥細(xì)胞。還可以將elF-5A直接遞送至腫瘤的 位置。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠確定輸送elF-5A治療方案的劑量和時(shí)間。
elF-5Al和elF-5A2是已知的，其在4支早的共同未決申請(qǐng)如 09/909,796 (U.S.6,867,237); 10/341,647(準(zhǔn)許)；10/200,148; 10/277,969; 10/383,614; 10/792,893; 11/287,460; 10/861,980; 11/134,445; 11/184,982; 11/293,391; 6(V749,604;和60/795,168中描述，所有的在此引入本文作 為參考。因?yàn)閑lF-5A在種類中是高度保守的，任意elF-5A可在本發(fā)明、 人、鼠、小鼠、狗等中使用。優(yōu)選地，人elF-5A被用來(lái)治療人等。elF-5A 同時(shí)包括突變種，只要該突變種能夠上調(diào)或增加elF-5A的表達(dá)，并且因 此抑制了生長(zhǎng)的癌癥或殺死癌細(xì)i包。 本發(fā)明還提供一種激活細(xì)l包內(nèi)MAPK/SAPK信號(hào)途徑的方法， 即通過(guò)向所述細(xì)胞提供核苷酸編碼的elF-5Al。 elF-5Al多核苷酸和 elF-5Al蛋白為如上所述。 本發(fā)明還提供可用于殺死骨髓瘤細(xì)胞的藥物組合物，其包含編 碼elF5A的多核苷酸。elF5A可以是elF5Al、 elF5A2或變異elF5Al。優(yōu) 選地elF5A是elF5Al。組合物進(jìn)一步可包括輸送媒介。該輸送媒介可以 是但不限于載體、質(zhì)粒、脂質(zhì)體或樹(shù)狀大分子(dendrimer)。
本發(fā)明還提供一種elF5A(優(yōu)選elF5Al)制備藥物以殺死患有多 發(fā)性骨髓瘤病人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的方法。 本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種殺死多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的方法，其包 括對(duì)骨髓瘤細(xì)胞給藥含有編碼elF5A的多核苷酸(polynucleotide encoding elF5Al )的組合物，其中所述組合物殺死多發(fā)性骨髓瘤細(xì)月包。 elF5Al可以是一種突變體，其中該突變體已具有保守的賴氨酸轉(zhuǎn)化為另 一種氨基酸，并且其中所述突變體不能肌苷化(hypusmated)。在治療方 法中有用的組合物如這里描述。 本發(fā)明進(jìn)一步提供一種殺死多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的方法，除了組
8合物包含編碼elF-5Al的多核苷酸，其中組合物還包含提供的針對(duì) elF-5Al的siRNA。 siRNA下調(diào)elF-5Al的內(nèi)源性表達(dá)，因此下調(diào)了 IL-6 的表達(dá)，其依次導(dǎo)致骨髓瘤細(xì)胞凋亡。包含elF-5Al siRNA的組合物可 以靜脈內(nèi)給藥或在一種輸送媒介如載體、質(zhì)粒、脂質(zhì)體或樹(shù)狀大分子范 圍內(nèi)給藥。 附圖簡(jiǎn)述 圖l顯示通過(guò)遺傳毒性壓力和一氧化氮來(lái)增力口elF-5Al表達(dá)。A) 在正常結(jié)腸成纖維細(xì)胞中用0.5昭/ml放射菌素D處理0、 1、 4、 8和24小時(shí) 的elF5A表達(dá)的DNA印跡(上面板)和蛋白印跡(下面板)分析。用elF5A、 p53和p-肌動(dòng)蛋白的抗體來(lái)探測(cè)蛋白印跡。B)在RICO細(xì)胞中用3mM的硝 普酸鈉處理O、 2、 4、 8和24小時(shí)的elFSA表達(dá)的DNA印跡(上面板)和蛋白 印跡(下面板)分析。用elF5A和|3-肌動(dòng)蛋白的抗體來(lái)探測(cè)蛋白印跡。
圖2顯示elF5Al表達(dá)的抑制在細(xì)胞增殖上沒(méi)有影響。A)在用 elF5Al siRNA或?qū)φ誷iRNA轉(zhuǎn)染72小時(shí)后從HT-29分離細(xì)胞裂解物的 蛋白印跡。顯示出兩個(gè)獨(dú)立試-瞼的蛋白印跡。用elF5A和(3-肌動(dòng)蛋白的 抗體探測(cè)印跡。B)使用XTT細(xì)胞增殖測(cè)試來(lái)檢測(cè)用elF5Al siRNA轉(zhuǎn)染 細(xì)胞的代謝活動(dòng)。用對(duì)照siRNA或elF5Al siRNA轉(zhuǎn)染前將HT-29細(xì)胞 接種在96孔平板上。轉(zhuǎn)染二十四小時(shí)之后，在檢測(cè)代謝活動(dòng)之前讓放 線菌素D(10]ig/ml)未處理或處理細(xì)力包48小時(shí)。數(shù)值為一式四份完成兩 個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值，并對(duì)設(shè)定為值1的0小時(shí)對(duì)照獲得的數(shù)值標(biāo)準(zhǔn)化。C) 用對(duì)照siRNA或elF5Al siRNA轉(zhuǎn)染的HT-29細(xì)月包的增殖性能與用50|nM GC7培養(yǎng)72小時(shí)的細(xì)胞比較。用BrdU來(lái)檢測(cè)細(xì)胞增殖。該值表示n=4 的平均±標(biāo)準(zhǔn)誤差(SE),并對(duì)i殳定為值1的GC7(+)血清樣品數(shù)值標(biāo)準(zhǔn)化。 星號(hào)(*)表示通過(guò)配對(duì)斯氏t檢驗(yàn)認(rèn)為與對(duì)應(yīng)的對(duì)照值顯著不同的值 (pO.Ol)。 D)XTT和E)BrdU結(jié)合用對(duì)照siRNA或elF5Al siRNA轉(zhuǎn)染的 HT-29細(xì)胞轉(zhuǎn)染從轉(zhuǎn)染日(0天)直到第5天改變轉(zhuǎn)染的細(xì)胞增殖檢測(cè)。設(shè) 定為值1的0天。 圖3顯示elF5Al響應(yīng)放線菌素D調(diào)節(jié)p53的表達(dá)。用對(duì)照 siRNA(C)或elF5Al siRNA(5A-l)轉(zhuǎn)染RKO細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后72小時(shí)后，細(xì)胞 用0.5昭/ml放線菌素D處理0、4、 8或24小時(shí)。A)細(xì)胞裂解物用針對(duì)elF5Al 、 p53或p-肌動(dòng)蛋白的抗體印跡蛋白印跡。結(jié)果代表了三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。B)蛋白印跡中相對(duì)強(qiáng)度的p53繪圖，其對(duì)相應(yīng)的肌動(dòng)蛋白條帶較小標(biāo)準(zhǔn)化。 該值表示n-3的平均土標(biāo)準(zhǔn)誤差(SE)。 圖4顯示人elF5Al的超表達(dá)不依賴于p53誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。用 pHM6-LacZ、 pHM6 elF5A或pHM6-elF5AA37(C-端點(diǎn)37個(gè)氨基酸的截?cái)? 轉(zhuǎn)染RKO細(xì)胞(A)或RKO-E6細(xì)胞(B)。轉(zhuǎn)染后四十八小時(shí)，使用TUNBL 方法固定并標(biāo)記細(xì)胞。核用Hoescht33258染色，并且標(biāo)記的細(xì)月包用萸光 顯微鏡術(shù)觀察。染為明亮綠色的細(xì)胞記^f故細(xì)胞凋亡。Hoescht-染色的核 用于檢測(cè)總細(xì)胞數(shù)目。值是『4(A)或r^3(B)的平均土標(biāo)準(zhǔn)誤差(SE)。星 號(hào)(*)表示通過(guò)配對(duì)斯氏t檢驗(yàn)認(rèn)為與對(duì)應(yīng)的對(duì)照(pHM6-LacZ)顯著不同 的值(p0.02)。 C)收集用0.5ng/ml放線菌素D處理0、 4、 8或24小時(shí)后RKO 和RKO-E6細(xì)胞的蛋白印跡。用RKO和(3-肌動(dòng)蛋白的抗體來(lái)探測(cè)蛋白印 跡。 圖5顯示結(jié)腸癌細(xì)l包中腺病毒構(gòu)建誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。A)用 Ad-LacZ(L)、 AdelF5Al(5A)或Ad-elF5A(K50A)(K50A)轉(zhuǎn)染HT-29細(xì)胞七 十二小時(shí)后，從中分離細(xì)胞裂解物蛋白印跡。B)細(xì)胞裂解物的2-D凝膠 電泳分離用GC7或DFO轉(zhuǎn)染七十二小時(shí)或用腺病毒構(gòu)建轉(zhuǎn)染后七十二 小時(shí)的HT-29細(xì)胞，然后用針對(duì)elF5A的抗體進(jìn)行蛋白印跡。除了裂解 物分離了 7昭的蛋白，還從腺病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞超表達(dá)elF5A中分離了 0.3貼 的蛋白。C)Toppanek用腺病毒構(gòu)建轉(zhuǎn)染HT-29細(xì)胞四十八小時(shí)后染色 TONEL。 Bottom panel:在相同區(qū)域進(jìn)行細(xì)胞核的Hoechst-染色。所有 相片采用400 x放大率。該結(jié)果代表3個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。D)用腺病毒構(gòu)建 轉(zhuǎn)染HT-29細(xì)胞四十八小時(shí)后的細(xì)胞凋亡百分率。值是n=3的平均±標(biāo) 準(zhǔn)誤差(SE)。 E)用腺病毒構(gòu)建轉(zhuǎn)染HT-29細(xì)胞四十八小時(shí)后的XXT細(xì) 胞增殖實(shí)驗(yàn)。值是n=4的平均±標(biāo)準(zhǔn)誤差(SE)。 圖6顯示用elF5A腺病毒構(gòu)建轉(zhuǎn)染HT-29細(xì)胞染色的膜聯(lián)蛋白 V和PI。 A)膜聯(lián)蛋白-FITC和碘化丙啶(PI)標(biāo)記用elF5A腺病毒構(gòu)建轉(zhuǎn)染 四十八小時(shí)后HT-29細(xì)胞的柱形圖。B)用腺病毒構(gòu)建轉(zhuǎn)染或用細(xì)胞凋亡 謙導(dǎo)劑、放射菌素D或Brefeldm A處理二十四、四十八和七十二小時(shí) 后，通過(guò)標(biāo)記膜聯(lián)蛋白V和流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析檢測(cè)HT-29細(xì)胞凋亡百分 率。值是n=4的平均±標(biāo)準(zhǔn)誤差(# of events〉5000)。
圖7顯示elF5A螢光免疫才企-瞼法定位。用IFN-和TNF-cx(A)刺 激HT-29細(xì)胞中elF5A蛋白的亞細(xì)胞定位或通過(guò)間接免疫熒光^^測(cè)放射
10菌素D(B)。 Hoechst 33258用于核染色。A)HT-29細(xì)胞未處理或用 TNF-a[(-)TNF-a]刺激0分鐘、10分鐘或30分鐘之前用lFN-y灌注。Top panel: elF5Al的螢光免疫檢驗(yàn)法檢測(cè)。middle panel:在相同的區(qū)域進(jìn) 行細(xì)胞核Fioechst-染色。bottom panel:合并圖像。B)HT-29細(xì)胞未處理 或用放射菌素D處理0.5小時(shí)、1.5小時(shí)或4小時(shí)。Top panel: elF5Al 的螢光免疫4全-瞼法4全測(cè)。middle panel:在相同的區(qū)域進(jìn)4亍細(xì)J包核 Fioechst-染色。bottom panel:合并圖像。所有相片采用400 x》文大率。 該結(jié)果代表3個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。 圖8顯示elF5Al響應(yīng)放線菌素D調(diào)節(jié)p53的表達(dá)。RKO-E6 細(xì)胞不表達(dá)p53。 A)RKO或RKO-E6細(xì)胞用0.5jig/ml放線菌素D處理1 、 4、 8或24小時(shí)。使用蛋白印跡收集和分析細(xì)胞裂解物用于p53超表達(dá)。 B)用對(duì)照siRNA(C)、 elF5A siRNA(5A-l)或靶向elF5A(5A-2)不同區(qū)域的 第二 elF5A siRNA轉(zhuǎn)染RKO細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后72小時(shí)后，細(xì)胞用0.5|ig/ml 放線菌素D處理0、 4、 8或24小時(shí)。A)細(xì)胞裂解物用針對(duì)elF5A、 p53 或P-肌動(dòng)蛋白的抗體印跡蛋白印跡。結(jié)果代表了三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。
圖9顯示細(xì)l包凋亡中肌苦化elF5Al的聚積。該圖提供了用i丈 線菌素D(A)或Fas抗體激動(dòng)劑(B)處理時(shí)間為1-24小時(shí)，繼之以用針對(duì) elF5A的抗體進(jìn)行蛋白印跡，從HT-29細(xì)胞中分離細(xì)胞裂解物的2-D凝 膠電泳。

圖10顯示用Ad-elF5Al或Ad-elF5Al(K50A)(Ad-elF5AlM)轉(zhuǎn) 染誘導(dǎo)HT-29結(jié)腸直腸腺癌細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞凋亡。該圖提供了用腺病毒構(gòu) 建轉(zhuǎn)染二十四、四十八和七十二小時(shí)或用細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑、；改射菌素D 或Brefeldm A處理后，通過(guò)標(biāo)記膜聯(lián)蛋白V和流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析;險(xiǎn)測(cè) HT-29細(xì)胞凋亡百分率。值是n=2的平均±標(biāo)準(zhǔn)誤差(# of events〉5000)。
圖11顯示用Ad-elF5Al或Ad-elF5A2轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)HTB-9膀胱癌 細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞凋亡。該圖提供了用腺病毒構(gòu)建轉(zhuǎn)染二十四、四十八和七 十二小時(shí)或用細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑、放射菌素D或Brefeldm A處理后，通 過(guò)標(biāo)記膜聯(lián)蛋白V和流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析檢測(cè)HTB-9細(xì)胞凋亡百分率。值 是n=2的平均±標(biāo)準(zhǔn)誤差(# of events>5000)。 圖12顯示用Ad-eIF5Al或Ad-eIF5A2轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)HTB-4膀胱癌 細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞凋亡。該圖4是供了用腺病毒構(gòu)建轉(zhuǎn)染二十四、四十八和七 十二小時(shí)或用細(xì)胞凋亡i秀導(dǎo)劑、放射菌素D或Brefeldm A處理后，通過(guò)標(biāo)記膜聯(lián)蛋白V和流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析檢測(cè)HTB-4細(xì)胞凋亡百分率。值 是n=2的平均±標(biāo)準(zhǔn)誤差(# of events〉5000)。 圖13顯示用Ad-elF5Al或Ad-elF5Al(K50A)(Ad-elF5AlM)轉(zhuǎn) 染誘導(dǎo)HTB-4膀胱癌細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞凋亡。該圖提供了用腺病毒構(gòu)建轉(zhuǎn)染 二十四、四十八和七十二小時(shí)后HTB-4細(xì)胞XTT增殖分析的結(jié)果。值 是11=2的平均土標(biāo)準(zhǔn)誤差。 圖14顯示用Ad-elF5Al或Ad-elF5Al(K50A)(Ad-elF5AlM〉轉(zhuǎn) 染誘導(dǎo)HTB-9膀胱癌細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞凋亡。該圖提供了用腺病毒構(gòu)建轉(zhuǎn)染 二十四、四十八和七十二小時(shí)后HTB-9細(xì)胞XTT增殖分析的結(jié)果。值 是n二2的平均土標(biāo)準(zhǔn)誤差。 圖15顯示用Ad-elF5Al或Ad-elF5Al(K50A)(Ad-elF5AlM〉轉(zhuǎn) 染誘導(dǎo)HTB-1膀胱癌細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞凋亡。該圖提供了用腺病毒構(gòu)建轉(zhuǎn)染 二十四、四十八和七十二小時(shí)后HTB-1細(xì)i包XTT增殖分析的結(jié)果。 <直 是r^2的平均土標(biāo)準(zhǔn)誤差。 圖16顯示用Ad-elF5Al或Ad-elF5Al(K50A)(Ad-elF5AlM〉轉(zhuǎn) 染誘導(dǎo)UMUC-3膀胱癌細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞凋亡。該圖提供了用腺病毒構(gòu)建轉(zhuǎn) 染二十四、四十八和七十二小時(shí)后UMUC-3細(xì)胞XTT增殖分析的結(jié)果。 值是n=2的平均±標(biāo)準(zhǔn)誤差。 圖17顯示用Ad-elF5Al或Ad-elF5Al(K50A)(Ad-elF5AlM)轉(zhuǎn)
染誘導(dǎo)HeL子宮頸腺癌細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞凋亡。該圖提供了用腺病毒構(gòu)建轉(zhuǎn) 染二十四、四十八和七十二小時(shí)后HeL細(xì)胞XTT增殖分析的結(jié)果。值 是n-2的平均±標(biāo)準(zhǔn)誤差。 圖18顯示用Ad-elF5Al、 Ad-elF5Al(K50A)(Ad-elF5AlM)或 Ad-elF5A2轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)HTB-4細(xì)胞內(nèi)的PARP切割。該圖提供了使用 PARP、 elF5A和|3-肌動(dòng)蛋白抗體從腺病毒構(gòu)建轉(zhuǎn)染四十八或七十二小時(shí) 后HTB-4細(xì)胞中分離細(xì)胞裂解物蛋白印跡的結(jié)果。 圖19顯示用Ad-elF5Al、 Ad-elF5Al(K50A)(Ad畫(huà)elF5AlM)或 Ad-elF5A2轉(zhuǎn)染不誘導(dǎo)HTB-1細(xì)胞內(nèi)的PARP切割。該圖提供了4吏用 PARP、 elF5A和(3-肌動(dòng)蛋白抗體從腺病毒構(gòu)建轉(zhuǎn)染四十八或七十二小時(shí) 后HTB-4細(xì)胞中分離細(xì)胞裂解物蛋白印跡的結(jié)果。 圖20顯示在A549肺癌細(xì)胞中的elF5Al超表達(dá)激活 MAPK/SAPK信號(hào)途徑。在增加幾倍轉(zhuǎn)染(MOl)的情況下用Ad-elF5Al(5A)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。用Ad-Lac(L)轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為對(duì)比。轉(zhuǎn)染四十/\ 小時(shí)后，用EGF處理細(xì)胞30分鐘并收集細(xì)胞裂解物用于蛋白印跡。
圖21顯示在A549肺癌細(xì)胞中的elF5Al超表達(dá)激活 MAPK/SAPK信號(hào)途徑。用Ad-elF5Al(5A)或50MOI的Ad-Lac(L)轉(zhuǎn)染細(xì) 胞。轉(zhuǎn)染6、 24、 48或72小時(shí)后，用EGF處理細(xì)胞30分鐘并收集細(xì)胞 裂解物用于蛋白印跡。 圖22顯示不能肌苷化的elF5Al超表達(dá)激活MAPK/SAPK信號(hào) 途徑。在增加幾倍轉(zhuǎn)染(M01)的情況下用Ad-elF5Al(M)轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞。 用Ad-elF5Al(5A)和Ad-LacZ(Lac)轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為對(duì)比。在有或沒(méi)有MEK 抑制劑U1026的存在下孵化細(xì)胞。轉(zhuǎn)染四十八小時(shí)后，用EGF處理細(xì) 胞30分鐘并收集細(xì)胞裂解物用于蛋白印跡。 圖23顯示elF5Al超表達(dá)和A549肺癌細(xì)胞內(nèi)突變體elF5Al(5A) 增加p53的表達(dá)。在增加幾倍轉(zhuǎn)染(M01)的情況下用Ad-elF5Al(M)轉(zhuǎn)染 A549細(xì)胞。用Ad-elF5Al(5A)和Ad-LacZ(Lac)轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為對(duì)比。在有 或沒(méi)有MEK抑制劑U1026的存在下孵化細(xì)胞。轉(zhuǎn)染四十八小時(shí)后，用 EGF處理細(xì)胞30分鐘并收集細(xì)胞裂解物用于蛋白印跡。
圖24顯示elF5Al或突變體elF5Al(5A)超表達(dá)降低了通過(guò) Matrigel 細(xì)胞外基質(zhì)侵入A549肺癌細(xì)胞的能力。用腺病毒構(gòu)建轉(zhuǎn)染二 十四后，在無(wú)血清的培養(yǎng)基中將A549細(xì)胞接種于MatngelTM涂漬的 transwdl。含血清培養(yǎng)基放置在底部孔板中作為一種化學(xué)引誘劑。接種 二十四小時(shí)后，已經(jīng)通過(guò)transwell底部表面侵入的細(xì)胞一皮染為透明的紫 羅蘭色，在光學(xué)顯微鏡下通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)來(lái)檢測(cè)每個(gè)區(qū)域細(xì)胞的平均數(shù) 量。計(jì)算每個(gè)樣品的六個(gè)區(qū)域的最小值。 圖25顯示實(shí)驗(yàn)II的結(jié)果在B16F10-負(fù)載C57BL/6小鼠中的 elF5Al顯著降4氐了肺腫瘤負(fù)荷。將200,000 B16F10細(xì)胞注入六周齡 C57BL/6小鼠的尾部靜脈。在笫2、 4、 7、 11、 16、 21、 26和31天將負(fù) 載有LacZ基因(作為DNA對(duì)照)或elF5Al質(zhì)粒DNA注入尾部靜脈。使 用三種不同濃度的DNA: 1 x (3.3mg/kg), 0.1 x (0.3mg/kg)和2 x (6.6mg/kg)。小鼠接受PBS代替B16F10細(xì)胞作為陰性對(duì)照，同時(shí)B16F10-負(fù)載小鼠接受PBS而不是質(zhì)粒DNA注入作為陽(yáng)性對(duì)照。當(dāng)小鼠接近死 亡時(shí)，犧牲它們，將肺取出并照像。 圖26顯示實(shí)馬全I(xiàn)I的結(jié)果在B16F10-負(fù)載C57BL/6小鼠中的elF5Al顯著降低了肺重量。將200,000 B16F10細(xì)胞注入六周齡C57BL/6 小鼠的尾部靜脈。在第2、 4、 7、 11、 16、 21、 26和31天將負(fù)載有LacZ 基因(作為DNA對(duì)照)或elF5Al質(zhì)粒DNA注入尾部4爭(zhēng)脈。使用三種不同 濃度的DNA: 1 x (3.3mg/kg), 0.1 x (0.3mg/kg)和2 x (6.6mg/kg)。小鼠接 受PBS代替B16F10細(xì)胞作為陰性對(duì)照，同時(shí)B16F10-負(fù)載小鼠接受PBS 而不是質(zhì)粒DNA注入作為陽(yáng)性對(duì)照。當(dāng)小鼠接近死亡時(shí)，犧牲它們， 將肺取出并稱重。 圖27顯示實(shí)驗(yàn)I1的結(jié)果在B16F10-負(fù)載C57BL/6小鼠中的 elF5Al顯著降低了 VEGF表達(dá)。將200,000 B16F10細(xì)胞注入六周齡 C57BL/6小鼠的尾部靜脈。在第2、 4、 7、 11、 16、 21、 26和31天將負(fù) 載有LacZ基因(作為DNA對(duì)照)或elF5Al質(zhì)粒DNA注入尾部靜脈。使 用三種不同濃度的DNA: 1 x (3.3mg/kg)， 0.1 x (0.3mg/kg)和2 x (6.6mg/kg)。小鼠接受PBS代替B16F10細(xì)胞作為陰性對(duì)照，同時(shí)B16F10-負(fù)載小鼠接受PBS而不是質(zhì)粒DNA注入作為陽(yáng)性對(duì)照。當(dāng)小鼠接近死 亡時(shí)，犧牲它們，將肺取出并稱重。 一旦檢測(cè)了肺重量，冷凍肺并在以 后用于VEGFELISA。肺組織在裂解物緩沖液中沉底，用ELISA檢測(cè)裂 解物中存在的VEGF。 圖28顯示實(shí)驗(yàn)III的結(jié)果通過(guò)DNA和DOTAP的絡(luò)合改善 了 elF5Al基因治療的抗肺瘤效能。將50,000個(gè)B16F10細(xì)月包注射入6 周齡C57BL/6小鼠(O天)的尾部靜脈。在第7、 14和21天注射之前質(zhì)粒 DNA載有LacZ基因(作為DNA對(duì)照)或與DOTAP絡(luò)合的elF5Al。接受 無(wú)質(zhì)粒DNA的DOTAP注射的無(wú)腫瘤小鼠用作DOTAP影響的對(duì)照。在 第25天處死小鼠，移去肺并照相。 圖29顯示實(shí)驗(yàn)III的結(jié)果通過(guò)DNA和DOTAP的絡(luò)合改善 了 elF5Al基因治療的抗胂瘤效能。將50,000個(gè)B16F10細(xì)胞注射入6 周齡C57BL/6小鼠(天O)的尾部靜脈。在第7、 14和21天注射之前質(zhì)粒 DNA載有LacZ基因(作為DNA對(duì)照)或與DOTAP絡(luò)合的elF5Al 。接受 無(wú)質(zhì)粒DNA的DOTAP注射的無(wú)胂瘤小鼠用作DOTAP影響的對(duì)照。在 第25天處死小鼠，移去肺并稱重。 圖30顯示實(shí)驗(yàn)IV的結(jié)果AD-elF5Al注射誘導(dǎo)了 B16F0和 B16F10中的細(xì)月包凋亡。將50，000個(gè)B16F0或B16F10皮下注射入 C57BL/6小鼠的右肋。當(dāng)胂瘤達(dá)到約4mm直徑(B16細(xì)^^注射后10-12天)將50^1 PBS的1 x 109pfuAd-5Al注射入肺瘤。48小時(shí)后處死小鼠， 切除腫瘤、固定、干燥嵌入石蠟。根據(jù)制造商說(shuō)明用TUNEL(Promega) 將各自細(xì)胞胂瘤類型(Ad-5A1-1和Ad-5Al-2)的兩個(gè)區(qū)域染色。對(duì)于每個(gè) 細(xì)胞類型，包括陰性對(duì)照載玻片(Ad-5Al-neg)中不考慮TUNEL反應(yīng)的 TdT酶。 圖31顯示實(shí)驗(yàn)V的結(jié)果AD-elF5Al的注射顯著延遲了肺瘤 的生長(zhǎng)。對(duì)B16-F10皮下將1 x 109pfu的Ad-elF5Al或Ad-LacZ或緩沖 液的等同體積注射入C57BL/6。當(dāng)肺瘤達(dá)到約8mm直徑時(shí)發(fā)生第一天 的治療，并表示為天0。小鼠在第一個(gè)三天中每天注射，然后每間隔一 天注射直至小鼠死亡。當(dāng)肺瘤大小在一個(gè)方向上超過(guò)15至16mm時(shí)小 鼠死亡。在每一個(gè)組中有3只小鼠。用Ad-elF5Al處理第1組小鼠 (1-1,1-2,1-3)，用Ad-LacZ注射第2組小鼠(2-l,2-2,2-3)以及第3組小鼠 (3-l,3-2,3-3)僅僅接受緩沖液。使用測(cè)徑器每天測(cè)定腫瘤大小并用于估算 月中瘤體積。 圖32顯示實(shí)驗(yàn)V的結(jié)果AD-elF5Al的注射顯著增加了存活。 對(duì)B16-F10皮下將1 x I09pfu的Ad-elF5Al或Ad-LacZ或緩沖液的等同 體積注射入C57BL/6。當(dāng)肺瘤達(dá)到約8mm直徑時(shí)發(fā)生第一天的治療， 并表示為天0。小鼠在第一個(gè)三天中每天注射，然后每間隔一天注射直 至小鼠死亡。當(dāng)腫瘤大小在一個(gè)方向上超過(guò)15至16mm時(shí)小鼠死亡。 在每一個(gè)組中有3只小鼠。用Ad-elF5Al處理第1組小鼠(l-l,1-2,1-3), 用Ad-LacZ注射第2組小鼠(2-l,2-2,2-3)以及第3組小鼠(3-l,3-2,3-3)僅僅 接受緩沖液。 圖33顯示elF-5Al增加在A549肺癌細(xì)胞中p53抑癌基因蛋白 的積聚和磷酸化。 圖34顯示elF-5Al增加在A549肺癌細(xì)胞中的p53 mRNA濃度。
圖35顯示p53濃度的增加依賴于在A549肺癌細(xì)胞中p53轉(zhuǎn)錄活性。 圖36顯示TNFR1 mRNA濃度在A549肺癌細(xì)胞中不被elF-5Al
轉(zhuǎn)染所調(diào)節(jié)。 圖37顯示在A549肺癌細(xì)胞中elF-5Al誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和^吏用 MEK抑制劑增加elF-5Al誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的數(shù)量。 圖38顯示elF-5Al的假設(shè)模型在MAPK/SAPK途徑和在A549肺癌細(xì)l包中細(xì)^9包凋亡的影響。 圖39顯示elF-5Al在腫瘤生長(zhǎng)(在小鼠異種移植模型)抑制上優(yōu) 于elF-5A2。 圖40顯示elF-5Al在延長(zhǎng)小鼠存活(在小鼠異種移植才莫型 (B16-FO黑素瘤細(xì)胞))上優(yōu)于elF-5A2。 圖41顯示elF-5Al增加與用對(duì)照的有或沒(méi)有IL-6處理的細(xì)月包
相比較，增加了死亡或即將死亡細(xì)胞的數(shù)量。 圖42提供了 eIF-5A2的序列。 圖43提供了 elF-5Al siRNA的定位和序列。 圖44提供了具有人elF-5A2的elF-5Al siRNA核酸序列比對(duì)。 圖45提供了具有人elF-5A2的elF-5Al siRNA氨基酸序列比對(duì)。 圖46A和46B提供了 elF-5Al siRNA的定位和序列。
發(fā)明詳述 真核翻譯起始因子5Al(elF5Al)業(yè)已假定作為核質(zhì)穿梭蛋白的 功能，其涉及促進(jìn)與細(xì)胞增殖相關(guān)mRNA亞型的翻譯。然而，elF5Al 也被定義作為細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)劑(Taylor等，Invest Ophthalmol Vis Sci;3568-76(2004))和能夠調(diào)節(jié)p53表達(dá)的前細(xì)胞凋亡蛋白(Li等,(2004)J Biol Chem.;279:49251-49258;及該文獻(xiàn)的圖23)。腫瘤抑制蛋白p53在調(diào) 節(jié)細(xì)胞周期延滯和響應(yīng)應(yīng)激和DNA損傷的細(xì)胞凋亡中起重要作用。盡 管elF5Al的超表達(dá)能夠上調(diào)癌細(xì)胞系中p53表達(dá)(Li等,(2004)J Biol Chem.;279:49251-49258;及該文獻(xiàn)的圖23), elF5Al的超表達(dá)還能夠誘導(dǎo) 癌細(xì)胞系中的細(xì)胞凋亡(Taylor等，(2006)Journal of Molecular and Cellular Biology,Feb 9 2006(decision pending)),意指elF5Al通過(guò)多重才幾 制誘導(dǎo)細(xì)月包凋亡。 elF5Al的表達(dá)與細(xì)胞凋亡相關(guān)聯(lián)。用拓樸異構(gòu)酶抑制劑放射菌 素D(圖IA)處理正常結(jié)腸成纖維細(xì)胞的蛋白印跡顯示elF5Al蛋白表達(dá)與 p53同時(shí)在放射菌素D引發(fā)二十四小時(shí)后被上調(diào)。RKO細(xì)胞由于暴露在 一氧化氮(NO)-給體、SNP中遭受凋亡，此外上調(diào)elF5Al蛋白表達(dá)(圖IB)。 在這些條件下elF5Al不增加RNA轉(zhuǎn)錄濃度，表明作為mRNA轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié) 的結(jié)果是積聚elF5Al蛋白(圖IA和IB)。這些結(jié)果表明elF5Al可涉及由于遺傳毒性應(yīng)激或 一 氧化氮產(chǎn)生的細(xì)胞凋亡。 已經(jīng)長(zhǎng)期建議在細(xì)胞增殖中對(duì)elF5Al的需要，部分由于DHS 和DHH抑制劑誘導(dǎo)細(xì)胞周期延滯和凋亡的報(bào)道和肌苷化elF5Al必須 要求維持細(xì)胞生長(zhǎng)的結(jié)論。然而，可以確定通過(guò)4吏用siRNA的elF5Al 表達(dá)特異性抑制對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)沒(méi)有影響。在HT-29細(xì)胞中elF5Al表達(dá)抑 制>卯％對(duì)5天周期的細(xì)胞增殖沒(méi)有影響(圖2A-E)。然而，DHS抑制劑 GC7對(duì)這些細(xì)胞的生長(zhǎng)具有深刻的影響(圖2C)。這些結(jié)果表明了 elF5Al 不為細(xì)胞生長(zhǎng)所需要。此外，感興趣的事實(shí)是elF5Al的抑制能夠部分 保護(hù)HT-29細(xì)胞不受放射菌素D誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性影響(圖2B),進(jìn)一 步維 持與遺傳毒性應(yīng)激的細(xì)胞凋亡相關(guān)的elF5Al。 elF5Al siRNA保護(hù)細(xì)胞避免細(xì)胞凋亡的能力促使在p53表達(dá) 上影響elF5Al蛋白抑制的檢查。除了在應(yīng)激條件下，具有功能性p53 蛋白的RKO細(xì)胞不會(huì)聚集。放射菌素D處理二十四小時(shí)后，用siRNA 對(duì)elF5Al的抑制能夠阻止69%的p53蛋白聚集(圖3A和3B),表明在基 因應(yīng)激中elF5Al需要p53的正確表達(dá)。針對(duì)elF5Al具有不同序列的第 二siRNA也能夠阻止響應(yīng)放射菌素D(圖8B)的p53上調(diào)，這表明該效果 不是siRNA的非特異效果。然而，elF5Al能夠在RKO細(xì)胞(具有功能性 p53)和RKO-E6細(xì)l包(不具有功能性p53;圖8A)(圖4A和4B)中誘導(dǎo)細(xì) 胞凋亡，表明elF5Al同樣可以通過(guò)p35-獨(dú)立的機(jī)制誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
腺病毒構(gòu)建表達(dá)elF5Al或在保守賴氨酸(K)(位置50)中包含一 個(gè)點(diǎn)突變的elF5Al，其需要肌苷突變體(elF5Al(K50A》構(gòu)建。點(diǎn)突變4吏 得賴氨酸變?yōu)楸彼?A)。 HT-29細(xì)胞的感染在這些細(xì)胞(圖5C和5D和 圖6)中的構(gòu)建誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或大大降低細(xì)胞生活能力(圖5E)。使用二維 凝膠電泳來(lái)檢測(cè)elF5Al由于用Ad-elF5Al或Ad-elF5Al(K50A)(圖5B) 感染聚集的elF5Al類型。正如所料，在AD-elF5Al(K50A)感染后聚集 未改性的elF5Al。用AD-elF5Al感染導(dǎo)致未改性和脫氧月幾苷-改性 elF5Al的聚集上戲劇性的增加，表明DHS和DHH活性不夠"幾苷化由病 毒(圖5B)產(chǎn)生的多數(shù)elF5Al蛋白。這些結(jié)果強(qiáng)烈表明未改性的elF5Al 和脫氧肌苦-改性elF5Al可能是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的形式。還不清楚肌苷化 elF5Al是否具有這種能力。 核質(zhì)穿梭功能已經(jīng)建議用于elF5Al，然而，已報(bào)道elF5Al 主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)(Shi等，Exp Cell Res.,225:348-356(1996b))。核質(zhì)穿梭蛋白也期望具有核定位。因?yàn)樵诩?xì)胞凋亡中已發(fā)現(xiàn)elF5Al的功能， 所以研究細(xì)胞凋亡中elF5Al定位的變化。通過(guò)兩種不同的才幾制經(jīng)由 IFN-y和TNF-a處理的死亡受體活性和經(jīng)由放射菌素D處理的遺傳毒性， 在HT-29中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。間接免疫熒光顯示elF5Al定位在未處理、 生長(zhǎng)的細(xì)胞(圖7)細(xì)胞質(zhì)中。然而，細(xì)胞凋亡刺激素非常迅速刺激elF5Al 從主要細(xì)胞質(zhì)定位移動(dòng)至主要核定位(圖7A和7B)。在10分鐘內(nèi)對(duì)于 IFNy/TNF處理的細(xì)胞(圖7A)和90分鐘內(nèi)對(duì)于放射菌素D處理的細(xì)胞(圖 7B), elF5Al定位中發(fā)生的移動(dòng)非常迅速。這些結(jié)果表明在通過(guò)死亡受 體活性和遺傳毒性應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中具有核功能的elF5Al。
為了闡明未改性、脫氧肌苷-改性或涉及細(xì)胞凋亡的elF5Al的 肌苷-改性型，用2-D凝膠電泳檢測(cè)細(xì)胞凋亡中elF5Al聚集的形式。用 放射菌素D(遺傳毒性應(yīng)激)刺激或用4十對(duì)Fas的促進(jìn)抗體(agomstic antibody)培養(yǎng)(死亡受體途徑)刺激誘導(dǎo)TH-29細(xì)胞經(jīng)受凋亡。在1-24小 時(shí)范圍的不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞裂解物，然后通過(guò)elF5Al抗體(圖9)用2D-凝月交電泳和蛋白印跡分析。在未處理的細(xì)胞中，與文獻(xiàn)中4艮道的一致， elF5Al蛋白主要是肌普形式。在改變治療的開(kāi)始1小時(shí)，但在改變治療 的消失24小時(shí)，細(xì)胞誘導(dǎo)劑刺激以肌苷的脫氧肌苷化形式存在的增加。 處理2個(gè)小時(shí)后還觀察到未改性elF5Al的聚集。與脫氧肌苷和/或未改 性elF5Al —致的結(jié)果涉及調(diào)節(jié)細(xì)l包凋亡。 在不同癌細(xì)胞系中檢定elF5Al、elF5Al(K50A)(突變體elF5Al) 和elF5A2 i秀導(dǎo)細(xì)J包凋亡和抑制增殖的能力。elF5Al和elF5Al(K50A)能 夠誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞系HT-29(圖5、 6和IO)和膀胱癌細(xì)月包系HTB-9(圖11) 及HTB-4(圖12)中的細(xì)胞凋亡。此外，用腺病毒表達(dá)elF5A2可以誘導(dǎo) 膀胱癌細(xì)月包系HTB-9(圖11)和HTB-4(圖12)中的細(xì)月包凋亡。Ad-elF5Al 或Ad-elF5Al(K50A)和Ad-elF5A2能夠抑制膀胱癌細(xì)胞系HTB-4(圖13)、 HTB-9(圖14)、 J82HTB-1(圖15)和UMUC-3(圖16)的生長(zhǎng)。這些病毒構(gòu) 建也能夠抑制HeLa宮頸腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)(圖17)。通過(guò)響應(yīng)Ad-elF5Al 或Ad-elF5Al(K50A)和Ad-elF5A2感染的PARP切割也可^見(jiàn)察到HTB-4 中的細(xì)胞凋亡(圖18)。 PARP正常涉及DNA修補(bǔ)、DNA穩(wěn)定性和其它 細(xì)胞功能，在早期細(xì)胞凋亡中通過(guò)caspase家族構(gòu)件切割。PARP的 caspase切除的斥僉測(cè)已證明是細(xì)胞凋亡的 一個(gè)標(biāo)志。Lazebmk Y.等，Nature 371,346-347(1994)。這些結(jié)果表明在細(xì)胞凋亡期間事實(shí)上elF5Al和elF5A2可能具有眾多的功能。此外，elF5Al的變異體形式能夠延滯生 長(zhǎng)和誘導(dǎo)不同細(xì)胞系的凋亡。當(dāng)由于DHS和DHH的限制活性將 Ad-elF5Al引入細(xì)胞時(shí)，野生型elF5Al(和elF5A2)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力 可以與存在的肌苷化和未改性的elF5Al相關(guān)(圖5B)。最近的一份凈艮告 已顯示為了外源的elF5Al在細(xì)胞中以肌苷化形式超表達(dá)，DHS和DHH 必須在相同的細(xì)胞中超表達(dá)(Park等,2006,PNAS;103(l):51-56)。這些結(jié)果 認(rèn)為DHS和DHH抑制劑以抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的能力可以不預(yù)期減少所需細(xì) 胞增殖的肌苷化elF5Al，但是作為替代可以預(yù)期為未改性的(DHS抑制 劑)或肌苷化未改性的(DHH抑制劑)elF5Al,其在細(xì)胞中依次？I發(fā)細(xì)胞周 期停滯和/或細(xì)胞凋亡。此外感興趣的是注意到已發(fā)現(xiàn)DHS在細(xì)胞系中 超表達(dá)(Clement等,2006,FEBS J;273(6):l 102-14)，并且確定DHS作為癌 癥轉(zhuǎn)移中擴(kuò)增基因的signature set之一 (Ramaswams等，2003,Nat Genet;33,49-54)。該信息的一種可能解釋是某些癌細(xì)胞超表達(dá)DHS為了 阻止由于未改性或肌苷化elF5Al聚集引發(fā)的細(xì)胞凋亡(當(dāng)引發(fā)細(xì)胞至 經(jīng)受細(xì)胞凋亡時(shí)顯示聚集，參見(jiàn)圖9)。由于超表達(dá)的DHS,癌細(xì)胞可減 少由于遺傳毒性應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡和通過(guò)肌苷化和由此"安全"形式 的其它應(yīng)^t物。 為了闡明哪條信號(hào)途徑受elF5Al超表達(dá)所影響，檢驗(yàn)促細(xì)胞 分裂素活化蛋白激酶(MAPK)/應(yīng)激活化蛋白激酶(SAPK)[MAPK/SAPK] 途徑的活化以響應(yīng)在A549肺癌細(xì)胞中感染的Ad-elF5Al或 Ad-elF5Al(K50A)。三條主要的MAPK途徑是ERK MAPK途徑、p38 MAPK途徑和JNK SAPK途徑。ERK MAPK途徑是主要由響應(yīng)致有絲分 裂刺激物例如生長(zhǎng)激素如表皮生長(zhǎng)因子(EGF)引發(fā)，并支持寬范圍腫瘤 的生長(zhǎng)和存活。p38 MAPK途徑由響應(yīng)細(xì)胞應(yīng)激、紫外線、生長(zhǎng)因子消 退和促炎細(xì)胞因子而激活。經(jīng)由磷酸化的p38的活化導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子例如 p53的^I酸^m其可以依次導(dǎo)致p53增加的活性或穩(wěn)定性。如同炎癥， p38的活化涉及預(yù)凋亡和抗凋亡途徑。JNK/SAPK途徑介導(dǎo)響應(yīng)細(xì)胞的 應(yīng)激包括紫外線、DNA損害和促炎細(xì)胞因子，并導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子如c-jun 的石舞酸化和增加的活性。JNK途徑的J敫活可以導(dǎo)致許多細(xì)l包的反應(yīng)包4舌 生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)化和凋亡。JNK途徑看上去是在A549細(xì)胞中EGF-誘導(dǎo)生長(zhǎng)的 最初效應(yīng)因子途徑(Bosl等，1997, JBC: 272:33422-33429)。具有 Ad-elF5Al的A549細(xì)胞感染誘導(dǎo)所有三種這些途徑的活化。用ERK刺激30分鐘，在A549細(xì)月包中用增加數(shù)量的Ad-elF5Al感染，導(dǎo)致增加ERK和它的下游耙p90RSK的磷酸化作用/活化作用，同時(shí)未;壽酸4t的ERK的數(shù)量保持不變(圖20)。在以一劑量應(yīng)答方式響應(yīng)中還觀察到Ad-elF5Al磷酸化/活化的p38和磷酸化/活化的JNK的強(qiáng)力上調(diào)(圖20)。Ad-elF5Al感染的一次過(guò)程顯示了感染后維持ERK、 p38和JNK途徑的活化24至72小時(shí)(圖21)。發(fā)現(xiàn)了在響應(yīng)用未肌苷化變異體Ad-elF5Al、Ad-elF5Al(K50A)(圖22)感染這些途徑的活化中劑量響應(yīng)的增加。感興趣的是注意到使用MEK1抑制劑、U1026抑制ERK的活化，還抑制了JNK的活化(圖22)，確定在這些細(xì)l包中，JNK一皮活4匕響應(yīng)于ERK活化<(Bost等,1997, JBC:272:33422-33429)。與此相反，MEKI抑制劑一貫導(dǎo)致增加的p38活化響應(yīng)于Ad-elF5Al或Ad-elF5Al(K50A)感染，其表明了ERK途徑的活化負(fù)調(diào)節(jié)響應(yīng)于elF5Al的p38途徑活化作用(圖22)。
圖38提供了在MAPK/SAPK途徑和在A549肺癌細(xì)J包中elF-5Al影響的一種假想才莫型。elF5Al(野生型或不能肌苷化的突變體)(K50A)的超表達(dá)誘導(dǎo)A549細(xì)胞的凋亡。elF5Al的超表達(dá)也伴有MAPK/SAPK途徑包括p38、 JNK和ERK的增加。elF5Al的超表達(dá)i秀導(dǎo)p53蛋白水平的增加，包括增加p53的磷酸化形式，其與p53增加的穩(wěn)定性和活性相聯(lián)系。在p53的該增加取決于MEK/ERK途徑的活性和p53轉(zhuǎn)錄活性。然而，MEK/ERK途徑的抑制和JNK途徑的較低程度抑制導(dǎo)致用elF5Al誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的增強(qiáng)。這些結(jié)果表明了 elF5Al可用于為了在癌細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的治療以及增加MEK抑制劑類抗癌藥物的癌細(xì)胞殺死能力。 Ad-elF5Al和Ad-elF5Al(K50A)在p53表達(dá)和石舞酸化上的作用可參見(jiàn)圖23。野生型和變異體elF5Al的超表達(dá)導(dǎo)致p53蛋白超表達(dá)以劑量響應(yīng)度方式的增加(圖23)。對(duì)于elF5Al的兩種形式，還^見(jiàn)察到在絲氨酸15上p53磷酸化的增加(圖23)。對(duì)于Ad-elF5Al(K50A),還觀察到在絲氨酸46上p53磷酸化的增加。通過(guò)幾種激酶包括ATM、 ATR和p38在絲氨酸15上可以磷酸化p53,該改性降低了 MDM2結(jié)合p53和靶向p53用于泛素化的能力，并且從而促進(jìn)p53的聚集和功能性活動(dòng)。通過(guò)不同激酶包括PKCAIeUa和p38在p53絲氨酸46上磷酸化p53,該改性增加p53對(duì)預(yù)凋亡啟動(dòng)子的親合力并被認(rèn)為對(duì)p53誘導(dǎo)凋亡是重要的。
胂瘤的侵入和轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜過(guò)程，其需要腫瘤細(xì)胞去適應(yīng)依附降解周圍細(xì)胞外基質(zhì)的能力，在第二位點(diǎn)轉(zhuǎn)移和增殖的能力和最終促
進(jìn)血管生成以維持增加生長(zhǎng)的能力?；な青徑影饣|(zhì)(ECM)的薄片，其圍繞每一個(gè)器官并作為大分子和細(xì)胞的屏障?？捎迷僭霦CM(MatrigelTM>々8pm膜涂漬transwell和染色細(xì)胞來(lái)測(cè)定肺瘤細(xì)胞的侵入，其能夠穿透該層并達(dá)到響應(yīng)于趨化性刺激的膜另一側(cè)。A549肺癌細(xì)胞是高度侵略性的，并能夠分泌蛋白如基質(zhì)metaloprotease,其是能夠消化ECM組分的明膠酶。檢驗(yàn)在A549細(xì)胞的侵入上elF5Al超表達(dá)的效果，Ad-elF5Al和Ad-elF5Al(K50A)的感染顯著減少侵入Matrigel 涂漬transwell的細(xì)胞數(shù)量(圖24)。 到目前為止提出的結(jié)果存在用elF5Al來(lái)治療腫瘤的可能性可以有治療益處。因此，在小鼠中使用試驗(yàn)性轉(zhuǎn)移的模式。在實(shí)驗(yàn)II中，試驗(yàn)性轉(zhuǎn)移開(kāi)始于用高度侵略性的小鼠黑素瘤細(xì)胞系B16F10(天O)注射小鼠。將質(zhì)粒DNA編碼LacZ基因(作為DNA對(duì)照)或elF5Al在第2、4、7、 11、 16、 21、 26和31天注射入尾部靜脈。使用DNA的三個(gè)不同濃度1 x(3.3mg/kg)、 0.1 x(o.33mg/kg)和2x(6.6mg/kg)。當(dāng)小鼠瀕死時(shí)，對(duì)它們實(shí)施安樂(lè)死，移去肺并照相(圖25)。當(dāng)小鼠用質(zhì)粒DNA編碼elF5Al治療小鼠時(shí)，觀察到在胂瘤負(fù)載中劑量-響應(yīng)度減小(圖25和26)。盡管2 x劑量看起來(lái)比1 x劑量的效率低一些，但是在0.1 x劑量和1 x
劑量之間在腫瘤負(fù)載上觀察到有顯著的減小。腫瘤宏觀上生長(zhǎng)的能力取決于新血管(血管生成)的形成。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)是一種細(xì)胞因子，其通過(guò)許多胂瘤細(xì)胞分泌，是促進(jìn)腫瘤血管生成的關(guān)鍵因素。從負(fù)載肺的B16F10的細(xì)胞裂解物在實(shí)驗(yàn)II中分離，并通過(guò)ELISA分析用于VEGF表達(dá)(圖27)。在接受elF5Al質(zhì)粒DNA的小鼠中，VEGF水平上有顯著的、劑量響應(yīng)的減小，表示elF5Al可以調(diào)節(jié)VEGF。
在實(shí)驗(yàn)III中，用尾部靜脈注射B16F10細(xì)胞的試驗(yàn)性轉(zhuǎn)移的模式再次使用，但這次用DOTAP絡(luò)合質(zhì)粒DNA以增加DNA在血清中的半衰期，并增加肺腫瘤對(duì)質(zhì)粒的攝取。在第7、 14和21天注射DNA/DOTAP絡(luò)合物。當(dāng)小鼠瀕死時(shí)，對(duì)它們實(shí)施安樂(lè)死，移去肺并照相(圖28)。當(dāng)與接受LacZ質(zhì)粒DNADOTAP絡(luò)合物的小鼠相比較時(shí)，用elF5Al質(zhì)粒DNADOTAP絡(luò)合物(圖29)治療的小鼠在肺重量上有平均60%的減少。
為了確定是否elF5Al處理誘導(dǎo)在黑素瘤肺瘤中的細(xì)l包凋亡，負(fù)載B16F0或B16F10皮下胂瘤的小鼠用Ad-eiF5Al(實(shí)驗(yàn)IV)進(jìn)行尾部靜脈注射。四十八小時(shí)后切除肺瘤，石蠟灌封并切片，切片組織用TUNEL染色，顯示Ad-elF5Al誘導(dǎo)肺瘤細(xì)胞的凋亡(圖30)。實(shí)-驗(yàn)V設(shè)計(jì)用來(lái)確定瘤內(nèi)注射的Ad-elF5Al誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是否將導(dǎo)致減少皮下B16F10腫瘤的腫瘤生長(zhǎng)并延長(zhǎng)存活。將B16F10細(xì)胞注射入C57BL/6小鼠的肋部。當(dāng)肺瘤大小達(dá)到直徑約8mm時(shí)，它們用Ad-LacZ、 Ad-elF5Al或緩沖液瘤內(nèi)注射。小鼠在第一個(gè)三天中每天注射，直至當(dāng)腫瘤大小在一個(gè)方向上超過(guò)15至16mm時(shí)，在這個(gè)點(diǎn)時(shí)處死小鼠。使用測(cè)徑器每天測(cè)定胂瘤大小并用于估算胂瘤體積。當(dāng)用AD-elF5Al處理小鼠時(shí)顯著延遲了腫瘤的生長(zhǎng)(圖31)。僅僅接受了緩沖液注射的小鼠在開(kāi)始治療后存活時(shí)間的最大值為4-6天，而接受了 Ad-LacZ注射的小鼠在開(kāi)始治療后僅僅存活了 4天。接受了 Ad-elF5Al注射的小鼠在治療后至少存活8天，并且在治療后差不多存活了 25天，表明了用Ad-elF5Al治療可以導(dǎo)致在患有腫瘤小鼠的存活上驚人的改善(圖3"。 所以,本發(fā)明提供了一種抑制癌生長(zhǎng)的方法。本發(fā)明還提供了一種抑制或減緩癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的方法。抑制癌生長(zhǎng)包括減少肺瘤的大小、減少肺瘤的生長(zhǎng)，還可以包括肺瘤的完全免除，抑制癌生長(zhǎng)也意指
殺死癌細(xì)l包。該癌可以{壬<可癌或肺瘤，包括:j旦不限于結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸
腺癌、膀胱癌、宮頸&t癌和肺癌。 本發(fā)明的方法包括對(duì)患者(哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人)給藥多核苷酸編碼的elF-5A,優(yōu)選人elF-5Al，優(yōu)選具有所述癌的elF-5Al登錄號(hào)為NM001970(參見(jiàn)圖44)。也可以使用elF刁A2的異構(gòu)體(即登錄號(hào)NM020390)，盡管優(yōu)選elF-5Al。可以通過(guò)任何本領(lǐng)域公知的合適方法輸送elF-5Al。它可以作為棵DNA輸送，如生物學(xué)上適宜的介質(zhì)中DNA輸送，以及通過(guò)IV或皮下注射或任何其它生物學(xué)上適宜的輸送裝置來(lái)輸送。另外的，可以在載體如腺病毒載體中輸送elF-5A。
另外地，可以在脂質(zhì)體或任何其它適宜的"載體"中輸送DNA，其提供將DNA(或質(zhì)?；虮磉_(dá)載體)輸送至靶癌癥細(xì)胞。參見(jiàn)實(shí)例，Luo,Dan等,Nature Biotechnology,Vo1.18, Jan.2000, pp.33-37對(duì)合成DNA輸送系統(tǒng)的綜述。雖然本發(fā)明人已較早說(shuō)明了 elF-5Al對(duì)正常組織是無(wú)毒的(參見(jiàn)未決申請(qǐng)11/293,391, 2005年11月28日提交，其在此全部引入作為參考)，優(yōu)選一種輸送系統(tǒng)(與elF5A多核苷酸/質(zhì)粒/表達(dá)載體的直接給 藥相比較)。優(yōu)選的輸送系統(tǒng)提供了有效量的elF-5A至腫瘤或癌細(xì)胞群， 而且優(yōu)選提供了靶輸送-至肺瘤或癌細(xì)胞群。因此，優(yōu)選通過(guò)毫微米大小 的載體如脂質(zhì)體、樹(shù)狀大分子或類似無(wú)毒的納米顆粒來(lái)輸送elF-5A的核 普/質(zhì)粒-表達(dá)載體。此外，賦形劑優(yōu)選保護(hù)elF5A核苷酸/質(zhì)粒/表達(dá)載體 以免過(guò)早清除或以免引起免疫反應(yīng)，同時(shí)輸送有效量的elF5A核苷酸/ 質(zhì)粒/表達(dá)載體至腫瘤或細(xì)胞群?？膳e例的載體可從與elF5A核苷酸/質(zhì) 粒/表達(dá)載體相關(guān)的簡(jiǎn)單納米顆粒延伸到更復(fù)雜的聚乙醇化載體如具有 配體附著于表面以靶向特異細(xì)胞受體的聚乙醇化脂質(zhì)體。
脂質(zhì)體和聚乙醇化脂質(zhì)體為本領(lǐng)域所公知。在常規(guī)的脂質(zhì)體 中，輸送的分子(例如藥物小分子、蛋白、核苷酸或質(zhì)粒)包含在脂質(zhì)體 的空穴中。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解這里還有可用于分子輸送的"秘密"靶 向和陽(yáng)離子脂質(zhì)體。參見(jiàn)例如，Hortobagyi,Gabnei，N.等，J. Clinical Oncology,Vol.l9,Issue 14(July)2001:3422-3433和Yu,Wei等，Nucleic Adds Research.2004,32(5);e48.脂質(zhì)體可以靜脈內(nèi)注射，并可以改性以使 它們的表面更親水(通過(guò)向雙分子層加入己二酸乙二醇"聚乙醇化")，其 增加了它們?cè)谘褐械难h(huán)時(shí)間。這些被稱為"秘密"脂質(zhì)體，作為載體，
特別對(duì)親水(水溶性)抗癌藥如阿霉素和米托蒽醌有用。更進(jìn)一步，對(duì)于 靶細(xì)胞的特異結(jié)合性能，如腫瘤細(xì)胞、特異性分子如抗體、蛋白、肽等 輸送脂質(zhì)體可以與附著在脂質(zhì)體表面。例如，存在于癌細(xì)月包受體的抗體 用于粑向癌細(xì)胞的脂質(zhì)體。在靶向多發(fā)性骨髓瘤、葉酸、II-6或轉(zhuǎn)鐵蛋 白的情況下，例如，可用于靶向多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的脂質(zhì)體。
樹(shù)狀大分子也為本領(lǐng)域所公知，它提供了一種優(yōu)選的輸送媒 介。參見(jiàn)例如 Marjoros,Istvan,J,等，"PAMAM Dendrimer隱Based Multifunctional Conjugate for Cancer Therapy Synthesis. Characterization, 和 Functionality, " Biomaceonolecules, Vol.7,No.2006;572-579, 和 Marjoros,Istvan,J,等,J.Med.Chem, 2005.48,5892-5899用于樹(shù)狀大分子的 論述。 eIF-5A也可以直接輸送至肺瘤的位置。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠 確定eIF-5A輸送治療方案的劑量和時(shí)間長(zhǎng)短。 本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供了 一種在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方法。多發(fā)性骨髓瘤是一種產(chǎn)生高水平炎癥細(xì)胞因子類
23型的骨髓癌，其可以導(dǎo)致骨骼損壞和胂瘤發(fā)展。細(xì)胞因子IL-1B和IL-6
作為一種生長(zhǎng)因子用于骨髓瘤細(xì)胞。 腺病毒載體構(gòu)建包含編碼elF-5A的多核苷酸(全長(zhǎng)編碼區(qū))的 腺病毒載體結(jié)構(gòu)被給藥至多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系、KAS6/1細(xì)胞。KAS6/1 細(xì)胞系產(chǎn)生于 Mayo Clinic , 并在 Westendorf,JJ.等， Leukemia(1996)10,866-876中報(bào)道。該細(xì)胞系從患有侵略性多發(fā)性骨髓 瘤病人的分離物中直接產(chǎn)生。本發(fā)明人已證明當(dāng)含elF-5A的腺病毒構(gòu)建 對(duì)KAS 6/1細(xì)胞給藥，快死或死細(xì)胞(留下少量活的癌細(xì)i包)(在圖41中 "WT"所示)的數(shù)量增加與已用單獨(dú)的對(duì)照載體(指的是圖1的"CTL")處 理的細(xì)胞比較。參見(jiàn)圖41。用因子5A1處理癌細(xì)胞死去大約90%,與 之相比未處理的細(xì)胞為約25%。所以，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供了一 種用提供的編碼elF5A的多核苷酸上調(diào)elF-5A的表達(dá)以殺死骨髓瘤細(xì)胞 的方法，其導(dǎo)致多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞死亡。 此外，IL-6與對(duì)照(意指"CTL+ILW)和eIF_5A構(gòu)建(意指圖41 中的"WT+II-6")—起給藥。IL-6是作為骨髓瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)因子的細(xì)胞因 子。這些結(jié)果說(shuō)明了即使當(dāng)IL-6與elF-5A構(gòu)建共同給藥，還能達(dá)到增 加細(xì)胞凋亡。參見(jiàn)圖41。這表明Factor 5A1不僅能夠殺死骨髓瘤細(xì)胞， 還能夠在IL-6存在的情況下消除骨髓瘤細(xì)胞。該發(fā)現(xiàn)在使用標(biāo)準(zhǔn)治療如 地塞米松在IL-6存在下骨髓瘤細(xì)胞中4艮難誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
此外，具有突變體elF-5A(K50A)(由于在位點(diǎn)59將保守賴氨酸 置換為另一個(gè)氨基酸而不能肌苷化)的腺病毒構(gòu)建也是單獨(dú)給藥("MUT，，) 或與IL-6("MUT + IL-6")聯(lián)合給藥。這些結(jié)果顯示與對(duì)照細(xì)胞相比，甚至 在IL-6的存在下，突變體elF-5A也能夠增加細(xì)胞凋亡。參見(jiàn)圖41。因 此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供了一種通過(guò)給予突變體elF-5Al殺死骨 髓瘤細(xì)胞的方法，所述突變體不能肌苷化。突變體elF-5Al引起在未肌 苷化elF-5Al表達(dá)的增加，其增加了在骨髓瘤細(xì)胞中的細(xì)胞死亡。
因?yàn)镮L-6作為骨髓瘤細(xì)^^的一種生長(zhǎng)因子，下調(diào)IL-6的表達(dá) 也提供了 一種殺死骨髓瘤細(xì)胞的方法。本發(fā)明人已顯示針對(duì)eIF-5A1 (參 見(jiàn)siRNA構(gòu)建的圖43和46A和46B)的siRNA不僅下調(diào)elF-5Al的內(nèi)源 性表達(dá)，而且下調(diào)各種促炎細(xì)胞因子表達(dá)。因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方 案提供了一種殺死骨髓瘤細(xì)胞的方法，其通過(guò)給予針對(duì)細(xì)胞凋亡特異性 elF-5A的siRNA以下調(diào)內(nèi)源性IL-1B的表達(dá)，依次下調(diào)IL-6的表達(dá),其
24依次提供較少的IL-6作為骨髓瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)因子。通過(guò)下調(diào)IL-6的表 達(dá),可用的IL-6減少，這對(duì)骨髓瘤細(xì)胞的繼續(xù)生長(zhǎng)和存活^:必須的。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，編碼elF-5A的多核苷酸和針對(duì)elF-5Al 的siRNA —起給藥以提供骨髓瘤細(xì)胞中增加的細(xì)月包凋亡。優(yōu)選地編碼 elF-5Al的多核苷酸在諸如如腺病毒載體的載體中給藥，因此siRNA不 抑制外原性elF-5Al的表達(dá)。例如，siRNA靶向3'UTR,但多核苷酸編 碼的外原性elF-5Al優(yōu)選包含完全開(kāi)放讀框(ORF)，因此沒(méi)有3'UTR被 siRNA革巴向。合適的siRNA構(gòu)建在共同未決申請(qǐng)11/287,460; 11/134,445; 11/184,982和11/293,391中早已描述，其在此全部引入作為參考。也參 見(jiàn)涂43和46A和46B。 elF-5Al在骨髓瘤細(xì)l包中表達(dá)并導(dǎo)致細(xì)月包死亡。 此外，elF-5Al siRNA降低elF-5A的內(nèi)源性表達(dá)，其依次下調(diào)IL-6的表 達(dá),依次增加在骨髓瘤細(xì)^9包的細(xì)l包死亡。在該方法中，如上述描述的突變 體elF-5A也可用于載體構(gòu)建。 本發(fā)明還提供殺死多骨髓瘤細(xì)胞的聯(lián)合治療。組合物包含編碼 elF5A的多核苷酸，優(yōu)選地elF5Al與標(biāo)準(zhǔn)治療一起給藥。elF5A組合物 可在傳統(tǒng)治療之前、之中或之后給藥。elF5A可作為藥物組合物來(lái)給藥， 或用以上討i侖的delivery vehicle《合藥。 實(shí)施例
實(shí)施例1:體外實(shí)-驗(yàn)
化學(xué)制品 DHS抑制劑Nl-脒基-l,7-二氨基庚烷(GC7; Bioscarch Technologies)在濃度為50pM下使用。放射菌素D(Calbiochem)在 1.0nM/ml下使用。從Sigma購(gòu)買硝普鈉和去鐵草酰胺并分別在3mM和 500pM濃度下使用。 細(xì)胞培養(yǎng)和處理 用于細(xì)胞增殖和elF5A定位研究的人結(jié)腸腺癌細(xì)胞系，HT-29 是乂人Anita Antes(University of Medicine and Dentistry of New Jersey)4尋到 的一份禮物。在補(bǔ)充有ImM丙酮酸鈉、10mM HEPE和10%胎牛血清 (FBS)的RPMI 1640中培養(yǎng)HT-29細(xì)胞。從American Type Culture Collection獲得所有其它的細(xì)月包系。CCD112Co是常^見(jiàn)的結(jié)腸成纖維細(xì)
25胞系。RKO是包含野生型p53的人結(jié)腸癌細(xì)胞系(CRL-2577)。 RKO-E6 細(xì)胞系(CRL-2578)衍生于RKO細(xì)胞系。它包含一種穩(wěn)定完整的人乳頭 狀瘤病毒E6致癌基因，因此缺乏可評(píng)估功能的p53肺瘤抑制蛋白。RKO、 RK〇-E6、 A549和細(xì)胞系CD112Co在2mM L-谷氨酸酯和Earle平衡鹽 溶液(調(diào)節(jié)至包含1.5g/L石友酸氫鈉、O.lmM非必需氨基酸、lmM丙酮酸 鈉并補(bǔ)充10。/。FBS)調(diào)節(jié)的Modified Eagle Minimum Essential Medium中 生長(zhǎng)。在37。C、含有5%(:02的潮濕環(huán)境培養(yǎng)細(xì)胞。 克隆和質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)粘附細(xì)胞制造商的規(guī)程使用GenEli)te Mammalian RNA質(zhì) 粒小量提取(Sigma),從RKO細(xì)胞分離的總RNA中用RT-PCR克隆人 elF5A。 4吏用的引物為正向，5'-CGAGTYGGAATCOAAGCCTC-3';和 反向5'-GGTTCAGAGGATCACTGCTG-3'。得到的532堿基對(duì)產(chǎn)物被亞 克隆入pGEM-T Easy(Promega)和序列化。得到的質(zhì)粒用作使用該引物的 模板正向，5'-GCCAAGCTTAATGGCAGATGATGATTTGG-3';和反向 5'-CCTGAATTCCAGTTATTTTGCCATGG畫(huà)3',并且PCR產(chǎn)物亞克隆入 HimdIIl和pHM6(標(biāo)記有[HA]血球凝集素；Roche Molecular Biochemical) 的EcoRl位點(diǎn)以產(chǎn)生pHM6-elF5A載體。使用以下引物通過(guò)PCR產(chǎn)生 elF5A(pHM6-elF5AA37)的C-末端擊夾失構(gòu)建正向， 5'-GCCAAGCTTAATGGCAGATGGATTGG-3';和反向5'-GCCGAATTCT CCCTC AGGCAGAGAAG-3'。得到的PCR產(chǎn)物亞克隆入pHM6載體。 pHM6-LacZ載體(Roche Molecular Biochemical)用于最優(yōu)化轉(zhuǎn)染并作為 在細(xì)胞凋亡轉(zhuǎn)染影響的對(duì)照。 DNA印跡 在6-孔平板上接種RKO細(xì)胞用于匯集，用1.0pM/ml的放射菌 素D處理0、 1、 4或8小時(shí)。使用GenEh)te Mammalian RNA質(zhì)粒小 量提取(Sigma)從細(xì)胞分離總RNA,在1.2 %瓊脂糖/曱醛凝膠上分餾15昭 RNA。才艮據(jù)確定的方法用elF5A的與3'-非轉(zhuǎn)譯區(qū)(3'-UTR)同源的32p-標(biāo) 記cDNA探測(cè)該膜。使用以下引物通過(guò)從PCR細(xì)胞得到的RT-PCR克隆 用于DNA印跡的elF5A 3'-UTR cDNA:正向，5'-GAGGAATTCGCT GTTGCAATCAAGGC-3'; 和反向5'-TTTAAGCTTTGTGTCGGGGAGAGAGC-3'。使用以下引物通過(guò)RF-PCR克隆用于DNA印跡用作對(duì)照的 卩-肌動(dòng)蛋白cDNA:正向，5'-GATGATATCGCCGCGCTCGT-3';和反向 5 '-GT AGATGGGCAC AGTGTGGGTG畫(huà)3'。 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染和細(xì)胞凋亡的招r觀'J 使用根據(jù)制造商推薦的規(guī)程Lipofectamine 2000(Invitrogen)將 質(zhì)粒DNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染RKO和RKO-B6。轉(zhuǎn)染四十八小時(shí)后，根據(jù)制造商 的規(guī)程使用DNA Fragmentation Detection Kit(致癌基因研究產(chǎn)物)通過(guò)末 端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移到移酶介導(dǎo)的dUTP-毛地黃毒普末端標(biāo)記(TUNEL)才企 測(cè)含片段DNA的凋亡細(xì)胞。為了熒光顯微分析，根據(jù)Taylor等(2004) 描述的方法將細(xì)胞在8孔培養(yǎng)載玻片上轉(zhuǎn)染，用4%曱醛固定然后用 TUNEL標(biāo)記并用Hoescht 33258染色。 siRNA的轉(zhuǎn)染 所有的siRNA購(gòu)自Dharmacon。 elF5A siRNA,其耙向elF5A mRNA(登記號(hào)BCO85015)的3'UTR,具有以下的序列有義鏈， 5'畫(huà)GCUGGACUCCUCCUACACAdTdT-3';及反義鏈，3'-dTdTCGACC UGAGGAGGAUGUGU-5'。針對(duì)elF5A的第二 siRNA具有以下序列有 義鏈，5'陽(yáng)AGGAAUGACUUCCAGCUGAdTdT-3';及反義鏈，3'誦dTdTUC CUUACUGAAGGUCGACU-5'。使用的對(duì)照siRNA具有elF5A-特異 siRNA的反向序列，與任何已知的人基因產(chǎn)物不具有同 一性。對(duì)照siRNA 具有以下序列，有義鏈，5'-ACACAUCCUCCUCAGGUCGdTdT-3';及反 義鏈，3'- dTdTUGUGUAGGAGGAGUCCAGC-5'。使用Lipofectamine 2000 將siRNA12轉(zhuǎn)染細(xì)胞并用于增殖研究或用于蛋白印跡。 蛋白印跡 使用沸騰的裂解物緩沖液[2。/。SDS, 50mM Tris-HCl(pH7.4)]分 離蛋白印跡的蛋白。使用Bicinchonmic Acid試劑盒(Sigma)檢測(cè)蛋白濃 度。在12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠上分餾5貼總蛋白并轉(zhuǎn)入聚偏氟乙烯 膜。使用的第 一抗體是抗elF5A( BD Transduction Laboratories;小鼠IgG) 和抗卩肌動(dòng)蛋白(致癌基因，小鼠IgM),它們都為5%牛奶中1:20,000的 稀釋度。第二抗體是抗小鼠IgM-HRP(致癌基因)。使用增強(qiáng)的增敏化學(xué)發(fā)光法(ECL, Amersham Biosdences)顯現(xiàn)抗體蛋白蛋白絡(luò)合物。elF5A 檢測(cè)后，根據(jù)ECL Plus蛋白印跡檢測(cè)系統(tǒng)提供的說(shuō)明剝離印跡并用抗卩 肌動(dòng)蛋白抗體再探查以確定相等的負(fù)載。 使用在MAPK裂解物緩沖液[10mMTris-pH7.4， 2%SDS， 10% 甘油]中收集的裂解物，進(jìn)行A549細(xì)胞的裂解物蛋白印跡用于 MAPK/SAPK的途徑分析。在10%SDS- PAGE凝膠上分離10樣i克裂解 物并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在PBS的5%非脫脂牛奶中封閉膜1小時(shí)，PBS 洗滌并在4。C、振蕩下用第一抗體在5%BSA/PBS-T中為1: 1000培養(yǎng)。 MAPK/SAPK(P-p38、 p38、 P-JNK、 JNK、 P-ERK、 ERK、 p90RSK)購(gòu)自 Cell Signaling,并以類似的方式使用。 2-D凝膠電泳 對(duì)于2-D凝膠電泳，在冷裂解物緩沖液(7M脲，2M石克脲，30mM Tns, 4%CHAPS,蛋白酶抑制劑混合物)中收集HT-29細(xì)胞裂解物，超 聲處理和用離心法清除碎片。使用Bradford法檢測(cè)蛋白濃度。根據(jù)制造 商i兌明用 Ettan IPGphor Isoelectric Focusing System (Amersham Biosciences)進(jìn)行一維等電聚焦。在室溫下與細(xì)胞裂解物一起在再水合i爰 沖液(8M脲，2%CHAPS, 0.2DTT, 0.5% pH4-7 IPG緩沖液，0.002% Broraophenol blue)再水合immobiline DryStrips(7cm pH4隱7; Amersham Biosciences) 12小時(shí)。在500V下進(jìn)行等電聚焦30分鐘、1000V下進(jìn)行 30分鐘和在5000V下進(jìn)行1小時(shí)和40分鐘。然后用SDS-PAGE分離在 IPG帶凝膠上的蛋白，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Amersham Biosciences)。使 用elF5A抗體(BD Biosciences)進(jìn)行蛋白印跡。 腺病毒的產(chǎn)生 腺病毒(腺病毒5血清型，El,E3-deleted)表達(dá)人elF5A或承受 單個(gè)點(diǎn)突變(K50A50)[elF5A(K50A)]的elF5A,其使用AdMaxTMHi-IQ系 統(tǒng)(Microbix Biosystems公司，多倫多，加拿大)阻止肌苷化構(gòu)建。在elF5A cDNA中使用PCR產(chǎn)生位點(diǎn)特異性突變。使用質(zhì)粒DNA作為才莫板通過(guò) PCR擴(kuò)增elF5A cDNA,并連接在腺病毒穿梭載體pDC516(io)的Smal 位點(diǎn)上。PCR引物的序列為正向，5'-GCCAAGCTTAATGGCAG ATGATTTGG-3';和反向5'-CCTGAATTCCAGTTATTTTGCCATGG-3'。
28在E.coli DH5a中繁殖腺病毒基因組質(zhì)粒載體pBHGfrt(del)El,3FLP和穿 梭載體，并使用QmgenEndoFreePlasmidMega試劑盒純化。5jag各自腺 病毒基因組質(zhì)粒pBHGfrt(del)El,3FLP和穿梭載體，在60mm培養(yǎng)板上 用Microbix Biosystems Inc.推薦的CaCl2方法轉(zhuǎn)染pDC516(io)-elF5A或 pDC516(io)-elF5A(K50A)到60-80 %融合的293-IQ細(xì)胞(Microbix Biosystems)。在37。C下培養(yǎng)7-10天后出現(xiàn)斑點(diǎn)，并且得到的腺病毒顆 粒[Al-elF5A和Al-elF5A(K50A)]在293-IQ細(xì)胞中擴(kuò)增。根據(jù)Microbix Biosystems公司提供的規(guī)程用CsCl梯度超速離心制備純的、高的滴定度 原料。腺病毒載體表達(dá)LaxZ(Ad-LacZ,腺病毒5血清型，El,E3-deleted) 購(gòu)自Qbiogene(California, CSA)，在這些實(shí)驗(yàn)中作為對(duì)照和報(bào)告子。用 與Ad-elF5A和Ad-elF5A(K50A)病毒同樣的方法擴(kuò)增和純化Ad-LacZ腺 病毒。 腺病毒感染和annexin V標(biāo)記 在100mm組織培養(yǎng)平板中以1 x 106細(xì)胞每平板接種HT-29、 HTB-9或HTB-4,第二天在5mlRPMI 1640+2% FBS中以3000個(gè)感染單 位/每細(xì)胞用腺病毒感染。在4小時(shí)后向細(xì)胞加入額外的培養(yǎng)基，F(xiàn)BS的 濃度達(dá)到10%。轉(zhuǎn)染二十四、四十八或七十二小時(shí)后，根據(jù)制造商說(shuō)明 (BD Biosciences)用Annexinx V-FITC洗滌和染色，通過(guò)胰蛋白酶作用分 離細(xì)胞。使用焚光檢測(cè)的488nm氬激光源和濾波器通過(guò)流動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù) 器(Coulter Epics XL-MCL)將細(xì)胞分類，并用WmMDI 2.8分析該數(shù)據(jù)。
以3000個(gè)感染單位/每細(xì)胞用腺病毒感染HT-29細(xì)胞，并使用1500 個(gè)感染單位/每細(xì)胞進(jìn)行A549細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。 增殖實(shí)-驗(yàn) 使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)在96孔平板上用siRNA感 染HT-29細(xì)胞。使用BrdU細(xì)胞增殖試劑盒(Roche Applied Science)來(lái)檢 測(cè)增殖細(xì)胞的新陳代i射活動(dòng)。根據(jù)制造商"i兌明使用BrdU細(xì)胞增殖試劑 盒(Roche Applied Science)來(lái)檢測(cè)DNA合成。為了在腺病毒感染后進(jìn)行 XTT測(cè)定，在96孔平一反在每孔接種5000細(xì)胞。4吏用未處理的細(xì)月包作為 陰性對(duì)照和放射菌素D處理的細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照，第二天各自用 Ad-laZ、 Ad-elF5A和Ad-elF5A(K50A)(Ad-elF5A)感染細(xì)胞。加入XTT
29培養(yǎng)基并用A690nm檢測(cè)A475nm作為參考。
間接免疫熒光 在聚-L-賴氨酸涂敷的玻璃蓋玻片上培養(yǎng)HT-29細(xì)胞。用200 單位干擾素y(IFN-y, Roche Applied Science)培養(yǎng)亞融合細(xì)胞16小時(shí)， 然后用TNF-(100ng/ml; Leinco Technologies)培養(yǎng)30分鐘至16小時(shí)。用 3%的甲醛(不含曱醇；Polysciences Inc.)固定處理過(guò)的細(xì)胞20分鐘，用 PBS洗滌5分鐘兩次和用包含100mM甘氨酸的PBS洗滌5分鐘一次， 用0.2。/。在PBS中TritonX-100permeabilize4分鐘。然后使用標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程標(biāo) 記細(xì)胞用于免疫熒光。第一抗體是在l: 250稀釋液中培養(yǎng)抗elF5A(BD Transduction Laboratories;小鼠IgG)10分鐘。第二抗體在1: 200稀釋 液中使用1小時(shí)的抗小時(shí)LgG-AlexaFluor 488(分子探針)。標(biāo)記完抗體 后，核用Hoescht 33258染色，并且標(biāo)記的細(xì)胞用熒光顯微鏡術(shù)觀察。 MatrigelTM細(xì)胞侵入分析 每細(xì)胞1500感染單元將腺病毒感染至A549細(xì)胞并培養(yǎng)24小 時(shí)。然后用胰島素分離細(xì)胞，無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌，并在無(wú)血清培養(yǎng)基中 以30,000細(xì)月包每孔4妻種于transwell(Falcon 8.0pm細(xì)胞培養(yǎng)插入物)，其 已纟至用15|ig MatrigelTM Basement Membrane Matrix( BD Biosciences)予貞 涂漬。將含10% FBS的培養(yǎng)基放置于底孔(24孔平板的孔，其中transwell 處于休眠中)，細(xì)胞再培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)后，從transwell的上室除去培 養(yǎng)基，移去transwell并放置在包含500微升龍膽紫的24孔平板的孔中。 在染色劑中培養(yǎng)transwell 20分鐘，然后用浸在一燒杯水的transwell反 復(fù)洗滌。預(yù)濕的棉拭用于從transwell的頂面上刮落細(xì)胞。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到 transwell的底面，通過(guò)光學(xué)顯微術(shù)、照相觀察，計(jì)算每區(qū)域轉(zhuǎn)移的細(xì)胞 數(shù)量。參見(jiàn)圖24。 統(tǒng)計(jì)學(xué) Student's t-test用于統(tǒng)計(jì)分析。通過(guò)置信水平大于95%(p<0.05)
檢測(cè)顯著性。 實(shí)施例2:體內(nèi)試-驗(yàn)
小鼠和腫瘤的確立 從Charles River,Quebec,Canada購(gòu)買的Cb7BL/6小鼠為5-7周 齡。在開(kāi)始試驗(yàn)前讓小鼠適應(yīng)環(huán)境一周。從ATCC購(gòu)買的B16F10鼠黑 素瘤細(xì)月包并在DMCM-10%FBS。用PBS洗滌細(xì)^^兩次，用臺(tái)盼蘭染色 檢測(cè)細(xì)胞存活力。對(duì)于試驗(yàn)性代謝試-驗(yàn)(試驗(yàn)II和III),通過(guò)將B16F10 細(xì)胞尾部靜脈注射入6周齡小鼠以確立黑素瘤腫瘤。在PBS中稀釋 B16F10細(xì)胞至1 x 10S活力細(xì)胞/ml。經(jīng)尾部靜脈將200^1細(xì)胞注射入每 只小鼠。對(duì)于皮下胂瘤試-驗(yàn)(試馬全I(xiàn)V和V),通過(guò)皮下將500,000個(gè)B16F10 細(xì)胞注射入10-14周齡小鼠的右肋部。在試驗(yàn)的結(jié)束(當(dāng)小鼠瀕死或腫瘤 超過(guò)預(yù)確定的大小)，通過(guò)吸入C02對(duì)小鼠實(shí)施安樂(lè)死。 實(shí)施例3:試馬全I(xiàn)I
質(zhì)粒DNA的構(gòu)建和純化 從InvivoGen,San Diego,USA購(gòu)買缺失CpG 二核普酸的 pCpG-lacZ表達(dá)載體。通過(guò)首先消化帶有Ncol和Nhel的質(zhì)粒，分離3.1 kb 的pCpG載體主鏈(/人而除去LacZ編碼序歹'J)將HA-標(biāo)記的elF5Al cDNA 亞克隆入pCpG-lacZ載體,并與含有HA標(biāo)記(pCpG-HA5Al)的elF5Al的 PCR擴(kuò)增cDNA連接。PCR引物為elF5Al正向HA-5A1正向 5'匿GCTCCATGGATGTACCCATACGACGTCCC隱3';和elF5Al反向 5'-CGCGCTAGCCAGTTATTTTGCCATCGCC-3'。在含有25pg/ml zeocin 的LB或2XYT培養(yǎng)基中培養(yǎng)的E.coliGT115中擴(kuò)增pCpG-lacZ和 pCpG-HA5Al 。通過(guò)QIAGEN Endofree Plasmid Giga kit萃取質(zhì)粒。用在 260nm的UV吸收和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA濃度。 質(zhì)粒DNA的尾部靜脈注射(實(shí)馬全I(xiàn)I): 將溶于1 x PBS(基于體重為約200jil)的質(zhì)粒DNA注射入天數(shù) 為2、 4、 7、 11、 16、 21、 26、 31的小鼠尾部l爭(zhēng)脈。質(zhì)粒DNA的濃度 為660ng/pl對(duì)2 x (6.6mg/kg)、330ng/W對(duì)1 x (3.3mg/kg)和3.3ng/pl對(duì)0.1 x (0.33mg/kg)。 體重和肺稱重 在尾部l爭(zhēng)脈注射或每周一和周五測(cè)定體重。當(dāng)它們?yōu)l死時(shí)(嗜
31睡的、呼吸困難)，使用C02對(duì)小鼠實(shí)施安樂(lè)死，并移去肺、稱重、照
相、冷凍并在-70。C下儲(chǔ)存。參見(jiàn)圖25-27。
VEGPELISA: 用PBS洗滌收集的肺組織，在干水中冷凍并在-7(rC下4諸存。 從研磨的肺組織中分離蛋白裂解物。50pg的肺組織用于檢測(cè)在小鼠肺中 使用MouseVEGF免疫測(cè)定試劑盒(R&D Systems, Inc. Minneapolis, USA) 的VEGF濃度。 實(shí)施例4:實(shí)-瞼III 質(zhì)粒DNA/DOTAP絡(luò)合物的注射 將BI6F10黑素瘤細(xì)胞(200]！1 PBS/小鼠的50,000個(gè)細(xì)胞)、質(zhì)粒 DNA和包含質(zhì)粒DNA純化的50嗎無(wú)內(nèi)毒素試劑盒的DNA載體絡(luò)合物 尾部靜脈注射入6周齡小鼠，并將80jig DOTAP尾部靜脈注射入7、 14 和21天齡的小鼠。小鼠在第25天被處死。移去肺、稱重、照相。參見(jiàn) 圖28-29。 實(shí)施例5:實(shí)-驗(yàn)IV 腺病毒構(gòu)建和TUNEL的注射 將500,000個(gè)B16F0或B16F10細(xì)月包皮下注射入10周齡 C578L/6小鼠的右肋。當(dāng)胂瘤達(dá)到約4mm直徑(B16細(xì)胞注射后10-12 天)將50WPBS的1 x 109pfuAd-5Al注射入肺瘤。48小時(shí)后處死小鼠， 切除胂瘤、固定、干燥灌入石蠟。根據(jù)制造商說(shuō)明用TUNEL(Promega) 將各自細(xì)胞肺瘤類型(Ad-5Al-l和Ad-5Al-2)的兩個(gè)區(qū)域染色。對(duì)于每個(gè) 細(xì)胞類型，包括陰性對(duì)照載玻片(Ad-5Al-neg)中不考慮TUNEL反應(yīng)的 TdT酶。參見(jiàn)圖30。 實(shí)施例6:實(shí)-驗(yàn)V
肺瘤的確立 將500,000個(gè)B16F10細(xì)胞(在100^1 PBS中)皮下注射入14周 齡C578L/6小鼠的右肋。每天檢查肺瘤形成的進(jìn)程直至腫瘤大小達(dá)到直 徑約8mm。
32
腺病毒注射 當(dāng)腫瘤大小達(dá)到直徑約8mm時(shí)開(kāi)始處理。將1 x 109斑點(diǎn)形成 單位(pfu)或Ad-elF5Al注射入小鼠。注射分布在腫瘤的三個(gè)位點(diǎn)。小鼠 在第一個(gè)三天中每天注射，然后每間隔一天注射直至小鼠死亡。當(dāng)腫瘤 大小在一個(gè)方向上超過(guò)15至16mm時(shí)小鼠死亡。<51僅小鼠接受的緩沖 液僅僅所述緩沖液中腺病毒是懸浮的(10mM Tns-HCl pH7.4, 10mM MgCl2, 10%甘油)。使用測(cè)徑器(卡鉗)每天測(cè)定胂瘤大小并使用下面等 式計(jì)算腫瘤體積
腫瘤體積(mm3^I^W"0.52 這里I^長(zhǎng)度，W-寬度(總是較短的方向) 參見(jiàn)圖31和32。 實(shí)施例7: 用腺病毒表達(dá)LacZ(Lac)或elFSAl(5A)感染A549肺癌細(xì)月包。 感染四小時(shí)后，用含DMSO、 10pM p38抑制劑SB2U35HU (Calbiochem)、 10pM JNK抑制劑II(Calbiochem)、 IOjiM MEK抑制劑U1026(Calbiochem) 或30pM p53抑制劑Pifithrm-a(Calbiochem)的培養(yǎng)基置換該培養(yǎng)基。四 十八小時(shí)后，用EGF處理細(xì)胞30分鐘并收集細(xì)胞裂解物。使用針對(duì)總 p53(p53)或在絲氨酸15[P-p53(serl5)]上磷酸化的p53或在37[P-p53(ser37)] 上磷酸化的p53的抗體在裂解物上進(jìn)行蛋白印跡。參見(jiàn)圖33。
圖33所示的結(jié)果顯示感染48小時(shí)后Ad-eIFSAl i秀導(dǎo)p53的聚 集。該圖也顯示感染48小時(shí)后Ad-eIFSAl誘導(dǎo)p53的磷酸化；由MEK 的抑制劑抑制p53的聚集和磷酸化；由p53活性的抑制劑抑制p53的聚 集和磷酸化；eIFSAl刺激p53的MEK依賴性磷酸化；以及eIFSAl刺 激p53的p53依賴性;舞酸化。 實(shí)施例8: 用月泉病毒表達(dá)LacZ(Ad-LacZ)或eIFSAl(Ad陽(yáng)eIFSAl)感染A549 肺癌細(xì)胞。四十八小時(shí)后，從該細(xì)胞中分離總RNA。 Real Time PCR使 用GAPDH作為對(duì)照基因檢測(cè)p53的水平和bax mRMA轉(zhuǎn)錄水平。p53 引物是5'-CGCTGCTCAGATAGCGATGGTC畫(huà)3'(5'-引物)和5'-CTTCT
33TTGGCTGGGGAGAGGAG-3'(3'-引物)[這些p53引物序列取自于Li等， (2004).A Novel elF5A/complex Functions as a Regulator of p53 and p53隱dependent Apoptosis, J Biol Chem, 27949251-49258]。參見(jiàn)圖34,其 顯示在mRNA水平上eIFSAl的超表達(dá)誘導(dǎo)p53的聚集，此外沒(méi)有^見(jiàn)察 在bax的作用。 實(shí)施例9: 用A良病毒表達(dá)LacZ(Ad-LacZ)或eIFSAl(Ad-eIFSAl)感染A549 肺癌細(xì)胞。四小時(shí)后，用含DMSO 、 IOjiM的MEK抑制劑 U1026(Calbiochem)或30pM p53抑制劑Pifithrm-a(Calbiochem)的培養(yǎng)基 置換培養(yǎng)基。四十八小時(shí)后，從細(xì)胞中分離總RNA。 Real Time PCR使 用GAPDH作為對(duì)照基因檢測(cè)p53的水平和bax mRMA轉(zhuǎn)錄水平。p53 引物是5'-CGCTGCTCAGATAGCGATGGTC-3'(5'-引物)和5'-CTTCTTT GGCTGGGGAGAGGAG-3'(3'-引物)[這些p53引物序列取自于Li等， (2004).A Novel elF5A/complex Functions as a Regulator of p53 and p53-dependentApoptosis, J Biol Chem, 27949251-49258]。參見(jiàn)圖34,其 顯示p53的eIFSAl依賴性聚集依賴于p53轉(zhuǎn)錄活性，在響應(yīng)eIFSAl中 發(fā)生的p53上調(diào)導(dǎo)致增加了 p53 mRNA的轉(zhuǎn)錄。 實(shí)施例10: 用&良病毒表達(dá)LacZ(Ad-LacZ)或eIFSAl(Ad-eIFSAl)感染A549 肺癌細(xì)胞。四小時(shí)后，用含DMSO 、 lO)aM的MEK抑制劑 U1026(Calbiochem)或30pM p53抑制劑Pifithrin-a(Calbiochem)的培養(yǎng)基 置^灸培養(yǎng)基。四十/\小時(shí)后，/人細(xì)月包中分離總RNA。 Real Time PCR使 用GAPDH作為對(duì)照基因檢測(cè)p53的水平和bax mRMA轉(zhuǎn)錄水平。TNFR1 引物是TNFR1-F 5'ATCTCTTCTTGCACAGTGG3'和 TNFR1國(guó)F 5'CAATGGAGTAGAGCTTGGAC3'。參見(jiàn)圖36,其顯示用Ad-eIFSAl感 染上調(diào)TNFR1 mRNA的水平，TNFR1 mRNA的聚集部分依賴于MEK。 該TNFR1 mRNA聚集依賴于p53的轉(zhuǎn)錄活性。 實(shí)施例11 用腺病毒表達(dá)LacZ(Lac)或elFSAl(5A)感染A549肺癌細(xì)月包。
34四小時(shí)后，用含DMSO、 IO^iM的p53抑制劑SB203580(Calbiochem)、 lO^M的JNK抑制劑II(Calbiochem) 、 10jiM的MEK抑制劑 U1026(Calbiochem)或30|iM p53抑制劑Pifithrm-a(Calbiochem)的培養(yǎng)基 置換培養(yǎng)基。四十八小時(shí)后，收集細(xì)胞，用Annexin/PI染色(BD Bioscience),然后用流式細(xì)胞計(jì)分析檢測(cè)經(jīng)受凋亡細(xì)胞的百分比。參見(jiàn) 圖37。 圖37顯示感染48小時(shí)后Ad-eIFSAl誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；JNK的抑 制增加了 eIFSAl誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；MEK的抑制增加了 eIFSAl誘導(dǎo)的 細(xì)月包凋亡，以及p53的抑制減少了 eIFSAl誘導(dǎo)的細(xì)J包凋亡。 實(shí)施例12 用50,000個(gè)B16-F0黑素瘤細(xì)胞皮下注射入小鼠。當(dāng)腫瘤達(dá)到 約5 x 5mm(65mm3)的大小時(shí)停止腫瘤內(nèi)注射。將稀釋在50-100pl的 PBS/10。/。甘油緩沖液或單獨(dú)緩沖液(組l)的1 x 109 pfu的Ad-lacZ(組2)、 Ad-elF5 Al(組3)或Ad-elF5 A2(組4)每隔 一 天注射到該肺瘤的三個(gè)位點(diǎn)(每 個(gè)肺瘤)。每隔一天檢測(cè)胂瘤的大小直到每隔另一天，直到當(dāng)腫瘤細(xì)胞達(dá) 到10%的體重時(shí)小鼠死亡。參見(jiàn)圖39。 實(shí)施例13 用50,000個(gè)B16-F0黑素瘤細(xì)胞皮下注射入小鼠。當(dāng)腫瘤達(dá)到 約5 x 5mm(65mm3)的大小時(shí)停止胂瘤內(nèi)注射。將稀釋在50-100)il的 PBS/10。/。甘油緩沖液或單獨(dú)緩沖液(組l)的1 x 109 pfu的Ad-lacZ(組2)、 Ad-elF5Al(組3)或Ad-elF5A2(組4)每隔一天注射到該胂瘤的三個(gè)位點(diǎn)(每 個(gè)腫瘤)。當(dāng)腫瘤細(xì)胞達(dá)到10%的體重時(shí)小鼠死亡。參見(jiàn)圖40。 實(shí)施例14:多發(fā)性黑素瘤 在第0天，用3000個(gè)IFU/細(xì)胞野生型或突變elF5a(不能被肌 苷化-保守賴氨酸突變)腺病毒載體構(gòu)建感染KAS 6/1多發(fā)性黑素瘤細(xì)胞 4小時(shí)。在感染后培養(yǎng)基中建立需要或不需要IL-6存在的三個(gè)復(fù)制品。 除了 KAS細(xì)胞被接種用于對(duì)照(未被感染)。 在第2和第4天，進(jìn)行MTT和annexm/PI測(cè)定。收集上清液。 該結(jié)果在圖41中顯示。
3權(quán)利要求
1.一種用于殺死包含編碼eIF5A的多核苷酸的骨髓瘤細(xì)胞的組合物。
2. 如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述elF5A選自由elF5Al、 elF5A2或突變體elF5Al所組成的組。
3. 如權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述elF5A是elF5Al。
4. 如權(quán)利要求3所述的組合物,其中組合物進(jìn)一步包含輸送媒介。
5. 如權(quán)利要求4所述的組合物，其中所述輸送媒介選自由載體、質(zhì) 粒、脂質(zhì)體或樹(shù)狀大分子所組成的組。
6. 如權(quán)利要求5所述的組合物，其中所述輸送媒介是載體。
7. 如權(quán)利要求6所述的組合物，其中所述輸送媒介是腺病毒載體。
8. 如權(quán)利要求5所述的組合物，其中所述輸送媒介是脂質(zhì)體。
9. 如權(quán)利要求5所述的組合物，其中所述輸送媒介是樹(shù)狀大分子。
10. eIFA用于制造藥物以殺死患有多發(fā)性骨髓瘤患者中多發(fā)性骨髓 瘤細(xì)胞的用途。
11. 如權(quán)利要求10的elF5A的用途，其中所述elF5A是elF5Al、 elF5A2或突變體elF5Al，其中所述突變體elF5Al具有已轉(zhuǎn)化為丙氨酸 或任何其它氨基酸的保守賴氨酸，并且其中所述突變體不能肌苷化。
12. —種殺死多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的方法，該方法包括對(duì)骨髓瘤細(xì)胞 給藥含有編碼elF5A的多核苦酸的組合物，其中所述組合物殺死多發(fā)性 骨髓瘤細(xì)月包。
13. 如權(quán)利要求12所述的方法,其中所述elF5Al是一種突變體，其 中所述突變體具有已轉(zhuǎn)化為丙氨酸或任何其它氨基酸的保守的賴氨酸， 并且其中所述突變體不能肌苷化。
14. 如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述組合物包含載體。
15. 如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述載體是腺病毒載體。
16. 如權(quán)利要求12所述的方法，進(jìn)一步包含給藥針對(duì)elF-5Al的 siRNA,其中所述siRNA下調(diào)elF-5Al的內(nèi)源性表達(dá)，并且其中所述下 調(diào)elF-5Al的表達(dá)下調(diào)IL-6的表達(dá)，以及其中IL-6的所述下調(diào)殺死多發(fā) 性骨髓瘤細(xì)胞。
17. —種在患有多發(fā)性骨髓瘤患者中誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞凋亡的 方法，所述方法包含給藥如權(quán)利要求3所述的組合物，其中所述組合物中的elF5Al誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的凋亡。
18. 如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述組合物為靜脈內(nèi)給藥。
19. 如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述組合物進(jìn)一步包含脂質(zhì)體。
20. 如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述組合物進(jìn)一步包含樹(shù)狀大 分子。
21. —種殺死多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的方法，其包含給藥如權(quán)利要求3 所述的組合物，以及進(jìn)一步給予傳統(tǒng)的多發(fā)性骨髓瘤治療。
全文摘要
本發(fā)明涉及真核起始因子5A和編碼真核起始因子5A的多核苷酸在抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)和抑制轉(zhuǎn)移到移中的用途。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，eIF-5A1用于殺死多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞。
文檔編號(hào)A61K38/43GK101568347SQ200680052718
公開(kāi)日2009年10月28日 申請(qǐng)日期2006年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月13日
發(fā)明者C·泰勒, J·E·湯普遜 申請(qǐng)人:森尼斯科技術(shù)公司