專利名稱：純化和去除內毒素的方法
技術領域：
本發明涉及純化方法，具體而言涉及從植物提取物中去除內毒素的方法。
背景技術：
近千年來，已經知道植物4^取物的治療用途和其他用途。不斷JL艮的高 新技術已經被應用于從草本和其他植物中提:^價值的物質，特別是油。其 產品一M用于口服。
當然希望從植物4^取物中去除污染物。US6024998描述了一種用于去除在 飲^植物制品中存在的不需要的親脂性污染物的方法。這些污染物包括殺蟲劑 和^4^生物質，這些泰性物質一^:^L物生長過程中被施用，而且可以在土壤 中積累并^Mt物部分中殘留。
US6024998中描述的方法包含扭所述植物制品與親脂相混合，污染物溶解 于所述親脂相中并由JW^l縮，然后例M過過濾去除該親脂相。以這，種方式， 可以保留整個的植物提取物而去除外源的物質。
WO03/101479描述了一種可含有甘菊提取物的治療產品。已表明，當通過注 射(優選的方iO給予該產品的時候，該^1取物可能具有可用于減少炎癥的抗炎性 質。
在細胞壁中發現的內毒素類型是致熱原，所iiit熱原是注射制劑的不良的組 分。最大調節極限-^為75 EU/ml，小于IOO EU/ml的初始目標是合適的。
發明內容
現在已經知道，內毒素一般是不能被選擇性除去的水溶性物質，如果能 被除去的話，也不能通過US6024998中描述的方法將它們選擇地除去。然而，現在已經知道，內毒素具有能與親脂物質形成復合物的脂質基團，并且可以通過 類似的方法^皮去除。
根據本發明，在一種用于純化水性組^ (包含具有脂質基團的水溶l"生污染 物)的方法中，所述組合物與一種親脂組分接觸，所述親脂組分與所述污染物形
成復合物；然后是去除比所述復合物的大小更大的物質的第一去除步驟，以及去 除所述復^的第二去除步驟。
在所述新方法中，所述第二去除步驟-^l^濾，除去與所述親脂組分復合 的內毒素。所述第一忠慮步M，的去除步驟是除去將ia^所i^濾過程的較
;J^且分所必須的。
圖1A和1B都是;J^呈圖，表示本發明的實施方案所涉及的步驟。
具體實施例方式
在本發明中使用的親脂組分可以與US6024998中描述的相同。鑒于這樣的 組分可以形成親脂相的相對較大的液滴(其中溶解了親脂污染物)，本發明的一個 特棘于這樣的物質還可以與通常水溶的襯(例如內毒素)中的脂質基團復合； 所述復合物的大小可以通it^濾除去，而不能通itA以除去所述液滴的微孔過濾 除去。因此，雖然本發明中使用的物質可能與l^技術中的那些相同，但是方法 顯然是不同的。
內毒素以及抗原主要是具有側鏈的蛋白質和脂質基團的碳水化合物；所 述脂質基團的存在使其足以與合適的親脂物質形成復合物，而不損害所述碳 水化合物分子的通常的水溶性質。這些致熱的分子在注射時可能具有炎癥效 應，因此最好盡可能地把它們從注射藥劑中除去。
本發明特別適合于^^甘菊中去除不需要的組分，用于制備WO03/101479 中描述的藥劑。甘菊植物(西洋甘菊(他"/car/a recw"&))的花頭(頭狀花序 (ca/^7w/W)由兩部分構成，即黃色盤狀或管狀花或小花(/7ores ^/6//br邁2's 或'^/62T7on^和白色的放射花或小花(/7ore;y7/^/^&a)。前者特別值得注意。 通過本發明，可以通過以下方式獲得有用的產品把管狀花與甘菊頭/植抹的其 他部分分離，在水中提取所述分離的黃色部分，并且分離所述提取物/去除內毒
素。然而，本發明適用于任何草本或其他的植物制品；這些植物的實例在 US6024998中給出，其內錢過引用的方式納A^文。
適合于在本發明中使用的親脂組分也在US6024998中有所記載。該組分 可以源自于動物、植物、礦物或是合成的。它優選是無毒的。合適的物質的 實例包括可可脂(cocoa butter)和椰子脂等脂肪；天然油、葵花油和分餾椰 子油等油；硬月旨(stearin)、希蒙得木油(jojoba oil)、蜂蠟、鯨蠟(spermaceti) 和棕櫚蠟(camauba wax)等蠟；石蠟，包括凡士林；脂質；以及固醇類 (sterols)。所有這些化合物(不管是單獨使用還是作為混合物使用)優選符 合以下的要求德國藥典(Deutsches Arzneibuch)、英國藥典(British Pharmacopoeia)、歐洲藥典(European Pharmacopeia)或美國食用4匕學品集(US Food Chemical Codex)。特別優選的物質是miglyol、甘油二酯、甘油三酯和蓖 麻油。所ii^一種物質包括狄油酸，它是一種含極性基團的長MJI旨肪酸的實 例。
可以被本發明的純化方法處理的所述水性提取物一般包含多種水溶組 分的多組分混合物。它可以通過以下方式獲得在所述合適的植物部分中加 入水以獲得懸浮液，所述懸浮液然后通常被加熱至低于水的沸點的溫度(例 如90-94。C)，然后冷卻至室溫。
然后，所述水性提取物經過所述兩個過濾步驟。積/f5l作為示例的目的， 下文將分別對微孔過濾和超濾進行描述。其他的技術例如親脂屏障的使用也 可能^:合適的。如果需要，每個過濾步驟可以分一個、兩個或多于兩個階段 進行。
如上文所述，使用微孔過濾的目的是為了去除那些會損害所^濾步驟 的效果的物質。微孔過濾確實可以去除污染物，如US6024998中描述的那樣。 這通常涉及使用具有至少O.l)iin的孔徑的濾器。在隨后的超濾步驟所使用 的孔徑一fel0. 001-O.Olnim,例如最多至O. l|am。
每個過濾步驟優選通itM分離進行，使用玻璃、金屬、陶瓷或合成塑料 等材料制造的合成膜。適用于微孔過濾的材料包括聚丙烯和聚四氟乙烯 (polytetrafluorethyene)。適用于超濾的材料包括聚醚砜(polyether sulfone)
和再生纖維素。
當分離兩種液相的時候，優選通itM技術的方法i^f亍。為了該目的，優 選使用管狀膜或被稱為"錯流(cross-flow)"膜的膜。
所述產品擬用于治療中。然后應該把它滅菌，并且其合適的生產步驟需 要在無菌的務降下進行。這些步艱在附圖的圖IB中顯示為19、 21、 23和 26。這種方法示于下文的實施例1至實施例5中。實施例6使用經改進的方 案^J"本發明進行了闡述。實施例7至實施例11作為對比。
下文報道的實驗工作表明，過濾 和加入植物油的聯^(吏得完全或者 幾乎完全去除了細菌細胞壁碎片，它被本領域技術人員當作細菌性內毒素或 致熱原。這些脂多糖或大分子由附著于多糖鏈的脂質A部分構成，并且是革 蘭氏陰性細菌的細胞壁的主要組成部分。這些復合大分子是水溶性的，但是 意外地可與植物油形成高分子復合物而產生懸浮液，并且可以通過分子量排 除技術(優選地通過使用超濾裝置)被阻留。分子量過濾的微孔過濾適宜于除 去大片的細胞壁碎片以及植物材料的粘液細胞壁片段，否則它們會堵塞超濾 裝置的孔。
在所述實施例中獲得的樣品中的細菌內毒素用Cambrex PyroGene測定進 行分析，4吏用1: 10. 000的稀^^數。
實施例1和2
將45 g的黃色管狀甘菊花(C力獨o肌7/a recw〃7a)與900 g的水(Aqua purificata, Ph. Helv.)混合。將該混合液加熱到90*C-94n的溫度保持20-30 分鐘。之后將所述混合液置于室溫下(151C-25。C)直至達到30匸-35X:的溫 度。
通過深層過濾去除藥物殘留。把獲得的粗濾液通過0.22 jam的膜過濾使
在所述澄清的濾液中，# 據^:取物的量加入0. 3°/。(實施例l)或0.1% (實 施例2)的蓖麻油(Ph. Eur. Grade)。所述全混合液經過勻漿化處理5分鐘。 該制備的提取物經過0.22 pm的膜進行^物回收過濾(以切線流過濾模式 (tangential flow mode))。
所述獲得的滲透物經過0.1pm的膜進行絲物回收過濾(以切線流過濾模 式)。^，所ii^得的滲透物經過1000 kDa的膜進行^^回收i^慮(以切線 流過濾模iO 。
在每種終濾液中的殘余細菌內毒素< 100 EU/ml。
實施例3-5
除以下改變W卜重復實施例1:條提取物的質量用0. 3% (實施例3) 、 1. 0% (實
施例4)和3. 0% (實施例5)的mygl iol (Ph. Eur.) ^^絲油加入到澄清后的濾液 中。
在^^終濾液中的殘余細菌內毒素< 100 EU/ml。 實施例6
該實施例使用經改進的方案，其中加熱和^HP步驟不是在高壓滅菌器中而是 在攪拌下的10L雙層容器中進行咖熱器的最高溫;ILA 140*C)。
加入miglyol^^代絲油。miglyol^^自股nseler的"非腸胃用的Miglyol 812"。所述^給WE室溫下攪拌10^lf代替勻漿化。
前人的微孔過濾方法都是用Mi 11 ipore Pel 1 icon 2系統進行的。為了更 好地實施并且為了避免費時的清洗程序，本實施例中的微孔過濾用以下設備 進行
過濾濾器系統Cartouche
0.2 |jm過濾M川ipore Pellicon 2Durapore 0.2 C-screen
0.1 (jm過濾單向濾器Millipack 200， 0.1 nm
1000 kDa過濾Millipore Pellicon 2Biomax 1000 kDa' V-Screen
0.2 |jm過濾單向濾器Millipack 200， 0.2
另外，加入苯酚以穩定所述《^取物。加入苯酚的量是6.0-8.0 mg/ml。 在1000 kDa過濾之后加入它。在加入之后，攪拌所述懸浮液約IO分鐘，直 至所有的苯酚都溶解。
在每個實例中所述內毒素的水平都是很低的。
實施例7(對比實施例)
除以下改變之外重復實施例1:省略最后兩步過濾步驟。 在所*濾液中的殘余細菌內毒素1917 EU/ml。
實施例8(對比實施例)
除以下改變之外重復實施例1:省略最后一步it^慮步驟。 在所iiif濾液中的殘余細菌內毒素1556 EU/ml。實施例9(對比實施例)
除以下改變之外重復實施例1:不加入M^油并JJl略最后兩步itj慮步驟。 在所iiif濾液中的殘余細菌內毒素3095 EU/ml。
實施例IO(對比實施例)
除以下改變之外重復實施例1:不加入M油并JL^略最后一步i^慮步驟。 在所iiif濾液中的殘余細菌內毒素4839 EU/ml。
實施例ll(對比實施例)
除以下改變O卜重復實施例1:不加入M油。 在所i^if濾液中的殘余細菌內毒素2068 EU/ml。
權利要求
1.一種用于純化水性組合物的方法，所述水性組合物包含含有脂質基團的水溶性污染物，所述方法包含把所述組合物與一種親脂組分相接觸，所述親脂組分與所述污染物形成復合物；去除比所述復合物的大小更大的物質的第一去除步驟；以及去除所述復合物的第二去除步驟。
2. 根據權利要求l的方法，其中所述組合物為植物提取物。
3. 根據權利要求2的方法，其中所述植物提取物為水性提取物。
4. 根據權利要求2或3的方法，其中所述植物為甘菊。
5. 根據權利要求4的方法，其中所述提取物為flores tubiformis的提取 物。
6. 根據前述權利要求任一項的方法，其中所述水溶性污染物為還含有蛋白 基團的碳水化合物。
7. 根據權利要求6的方法，其中所述污染物為內毒素。
8. 根據前述權利要求任一項的方法，其中所述親脂組分為油。
9. 根據前述權利要求任一項的方法，其中所述第一去除步驟包括微孔過濾。
10. 根據權利要求9的方法，其中所述微孔過濾使用孔徑為至少O.lum的 過濾器。
11. 根據前述權利要求任一項的方法，其中所述第二去除步驟包括超濾。
全文摘要
一種用于純化水性組合物的方法，所述水性組合物包含有脂質基團的水溶性污染物，例如內毒素，所述方法包含將所述組合物與一種親脂組分相接觸，所述親脂組分與所述污染物形成復合物；去除比所述復合物的大小更大的物質的第一去除步驟；以及去除所述復合物的第二去除步驟。
文檔編號A61K36/28GK101346151SQ200680049183
公開日2009年1月14日 申請日期2006年11月14日 優先權日2005年11月15日
發明者M·H·克瑞特 申請人:韋羅特龍有限公司