用于冷凍干燥的疫苗的穩定劑的制作方法

專利名稱：：用于冷凍干燥的疫苗的穩定劑的制作方法
技術領域：
：總的來說，本發明涉及免疫學和疫苗工藝學領域。更具體而言，本發明涉及用于冷凍干燥的、活的、減毒的免疫原性和/或疫苗組合物的穩定劑，所述免疫原性和/或疫苗組合物尤其可以包含犬副粘病毒。本發明進一步涉及穩定化的、冷凍干燥的、活的、減毒的免疫原性和/或疫苗組合物，例如犬副粘病毒的免疫原性和/或疫苗組合物，其可以包含這些穩定劑。本發明的其他方面在下述公開內容中得到描述，或由于下述公開內容是顯而易見的，并且在本發明的范圍內。
背景技術：
：包含生物成分，例如病毒、細菌、寄生蟲、真菌、蛋白質、多肽、制備、配制和貯藏它們所采用的條件明顯敏感。此類生物成分可以通過化學反應(例如，水解作用、脫氨基作用、美拉反應)進行修飾和降解，所述化學反應中的許多由水介導。液態修飾。通過限制對水的接近或通過去除水，減少了修飾和降解的主要因素。賦予生物成分以穩定性的現有方法已主要涉及使水冷凍或通過冷凍干燥去除水。凍干法或冷凍干燥法是在脫水產品制備中去除水的常用技術。一般而言，使含水組合物"冷凍干燥"涉及3個步驟。首先，在低溫條件下使含水組合物冷凍。其次，通過在減壓和低溫條件下升華來去除冷凍的水。在這個階段時，組合物通常包含約15%的水。第三，通過在減壓和較高溫度的條件下解吸來進一步去除殘留水。在凍干法結束時，產生冷凍干燥的產品，也稱為"軟錠(pastille)"或"團塊(cake)"。冷凍干燥的產品包含非常少的殘留水(約0.5%-約5%重量/重量)和無定形形式的干燥材料。這種特殊狀態被描述為"玻璃質的"。然而，在制備階段過程中，例如在凍干之前和過程中，以及在免疫原性組合物和疫苗組合物貯藏過程中，觀察到生物成分的免疫原性活性的大量喪失。必須保護生物成分的完整性，以確保免疫原性組合物和疫苗組合物的免疫接種功效得到保留。通過在施用于宿主或受試者時誘導并刺激免疫應答的能力來測量生物成分的免疫原性活性。為了限制受試者的處理和施用的次數，本領域存在提供多價免疫原性組合物或疫苗組合物的強烈需要。根據定義，多價免疫原性組合物或疫苗組合物包含來源于或衍生自至少2種不同病原體的超過一種活性免疫原性組分。在冷凍千燥步驟和隨后的貯藏期過程中，來自不同屬的病毒在穩定性方面可以改變，導致生存力或感染性喪失。在病毒例如犬副粘病毒的情況下，通常施用的活性免疫原性組分是活的減毒病毒。為了有效刺激免疫系統，活的減毒病毒必須在被免疫的受試者中復制。在使多價免疫原性組合物或疫苗組合物冷凍干燥的過程中、在組合物l&藏期間、或在組合物重構后施用前，可以發生生存力或感染性的喪失。因此，已經向此類冷凍干燥的組合物中添加穩定劑。然而，為了獲得保留其感染性和/或生存力的多價免疫原性組合物或疫苗組合物，能夠保存不同活的減毒病原體的生存力和感染性的常見穩定劑將是特別有利的。干燥形式的生物成分的穩定化通常涉及抗毒素、抗原和細菌的保存(Flosodort等人(1935)J.Immunol.2夕，389)。然而，這個過程中的限制包括在環境溫度下從含水狀態進行干燥時蛋白質的部分變性。從冷凍狀態進行干燥幫助減少變性，并且導致雖然不完全但更佳的生物成分(包括細菌和病毒)的保存(Stamp等人(1947)J.Gen.Microbiol./，251;Rightsel等人(1967)CryobiologyJ，423;Rowe等人(1971)Cryobiology《，251)。近來，在使病毒凍干前以各種組合添加糖例如蔗糖、棉子糖和海藻糖作為穩定劑。已就它們使包含活的減毒生物成分特別是病毒的不同疫苗穩定化的能力測試了大量化合物。此類化合物包括SPGA(蔗糖、礴酸鹽、谷氨酸鹽和白蛋白；Bovarnick等人(1950)J.Bacteriol.509-522;美國專利號4,000，256)，牛或人血清白蛋白，谷氨酸的堿金屬鹽，鋁鹽，蔗糖，明膠，淀粉，乳糖，山梨糖醇，Tris-EDTA，酪蛋白水解物，乳糖酸鈉和鉀，以及單金屬或二金屬的堿金屬磷酸鹽。其他化合物包括例如，SPG-NZ胺(例如美國專利號3,783,098)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)混合物(例如美國專利號3,915,794)。疫苗和免疫原性組合物通過減少由于各種有毒力的病原體而引起的發病率和死亡率對公共衛生具有巨大的影響。然而，起因于免疫原性組合物和疫苗組合物中的添加物的不希望的副作用仍造成潛在危險，所述潛在危險可能超過免疫原性組合物和疫苗組合物的任何保護和治療屬性。在美國中常用的疫苗形式中，明膠在約2百萬劑之一中可以引起嚴重的過敏反應。過敏反應先前被認為起因于白蛋白(卵蛋白)，并且更可能由相同疫苗中的明膠引起。在人血清白蛋白的情況下，盡管沒有疾病曾與疫苗中的人血清白蛋白相關，但存在病毒通過源自人血液的這種蛋白質進行傳播的可能性。牛衍生制品例如牛白蛋白和明膠，具有通過在疫苗制備中使用的牛血液和結締組織制品傳播CJD(克雅病，也稱為"瘋牛病，，)的危險。然而，仍沒有其中CJD通過血液或結締組織制品傳播的報道病例，引起CJD的朊病毒仍未在血液或結締組織中發現，并且使用來自從存在已知的瘋牛病病例的國家輸入的牛的牛衍生制品被禁止。然而，考慮到這些危險，已努力取消在已觀察到引發不希望的免疫效應的免疫原性組合物中使用此類制品。DeRizzo(deRizzo等人(1989)Bull.Pan.Am.HealthOrgan."，299-305)報道了包含山梨糖醇-明膠或谷氨酸-乳糖溶液的冷凍干燥的麻奢病毒制劑。將這些制劑貯藏于-20t:，并且在21個月的貯藏期期間測定它們的病毒滴度。所得到的數據表明，當經過21個月的時間段于-2(TC進行貯藏時，不含穩定劑的冷凍干燥的病毒是穩定的。此外，眾所周知，冷凍干燥的麻滲病毒在當貯藏于-20n時是穩定的，并且可以保持效力很多年而幾乎沒有損失(GrayA.，(1978)Dev.Biol.Stand.W，265-266)。然而，這些結果是在其中冷凍干燥的麻滲病毒為穩定的-2ox:時獲得，并且沒有證實另外的穩定化效應。這些結果只顯示，山梨糖醇-明膠和谷氨酸-乳糖溶液對麻療病毒的穩定性沒有負面影響，所述麻滲病毒以冷凍干燥的形式貯藏于-20°C。Precausta(Precausta等人(1980)J.Clin.Microbiol."fO，483-489)檢查了在冷凍干燥后，殘留水分和封閉大氣對犬痙熱病毒(CDV)和傳染性支氣管炎病毒(IBV)的感染性滴度的影響。向CDV制劑中添加乳糖溶液至75mg/ml的終濃度，而IBV疫苗包含40mg甘露醇/ml。當將冷凍干燥前的CDV滴度與冷凍干燥后和于6匸貯藏12個月后的滴度進行比較時，CDV滴度從IO"減少至102°CCID5。/ml，這反映了CDR滴度的非常顯著的減少。這些穩定劑通常包含由于安全性問題和不利的副作用而對于給受試者施用來說不希望的組分。因此，需要新型穩定劑和用于保持冷凍干燥形式的生物成分的生存力和感染性的方法，其對于給受試者注射來說是安全和適合的并且具有良好的外觀。本申請中任何文獻的引用或指明并非承認此類文獻可用作本發明的現有技術。發明概述本發明通過尤其是提供用于冷凍干燥的活的減毒免疫原性組合物或疫苗組合物的新型穩定劑解決了本領域的所述需要，所述免疫原性組合物或疫苗組合物可以包含活的減毒犬痙熱病毒(CDV)和犬副流感2型(cPi2)。除了其他病毒、病原體和活性免疫原性組分外，這些穩定劑可以保持這些犬副粘病毒的生存力和感染性，尤其是在冷凍干燥過程中，以及冷凍干燥制品在冷藏溫度下或在室溫下，特別是約41C-約251C的溫度下長時間貯藏過程中。重要的是，目前要求保護的、用于冷凍干燥的穩定化的活的減毒免疫原性組合物或疫苗組合物的穩定劑是安全的并且適合于在重構后給受試者注射。這些冷凍干燥的穩定化的免疫原性組合物可以包含具有良好的外觀，即具有規則的形狀和均勻的顏色的軟錠或團塊。本發明的穩定劑有利地不含動物來源的成分，特別是不含來自人或牛來源的血清白蛋白、乳白蛋白和明膠。用這種方式，將例如起因于明膠或白蛋白過敏性的過敏反應例如蕁麻滲和過敏癥，以及海綿狀腦炎疾病特別是克雅病(CJD)或牛海綿狀腦炎(BSE;也稱為瘋牛病)的傳播的任何潛在生物學危險降到最低或消除。因此，在一個方面，本發明提供了用于冷凍干燥的活的減毒犬瘟熱(CDV)和犬副流感2型(cPi2)免疫原性組合物或疫苗組合物的穩定劑，所述穩定劑可以包含至少一種還原性單糖和至少一種酸抗氧化劑化合物，其中所述至少一種酸抗氧化劑化合物可以包括天冬氨酸、谷氨酸、抗壞血酸或其組合。在某些實施方案中，所述至少一種還原性單糖可以包括葡萄糖、半乳糖、果糖、甘露糖、山梨糖或其組合。在另一個實施方案中，穩定劑可以進一步包含至少一種填充劑，所述填充劑可以包括葡聚糖、麥芽糖糊精、聚乙烯吡咯烷酮、羥乙基淀粉或其組合。在某些實施方案中，穩定劑可以進一步包含至少一種糖醇，所述糖醇可以包括山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、麥芽糖醇或其組合。在另一個實施方案中，穩定劑可以進一步包含至少一種非還原性寡糖，所述非還原性寡糖可以包括海藻糖、蔗糖、棉子糖或其組合。本發明還提供了進一步包含至少一種糖醇和至少一種非還原性寡糖的穩定劑，其中所述糖醇可以包括山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、麥芽糖醇或其組合，并且其中所述非還原性寡糖可以包括海藻糖、蔗糖、棉子糖或其組合。在本發明的另一個方面，提供了免疫原性懸浮液或溶液，其可以包含與本發明的穩定劑相混合的活的減毒副粘病毒，包括CDV和cPi2。一個實施方案提供了多價免疫原性懸浮液或溶液，其可以包含活的減毒副粘病毒(包括CDV和cPi2)，衍生自除副粘病毒外的其他病原體的至少一種活性免疫原性組分，與本發明的穩定劑相混合。所述至少一種免疫原性組分可以衍生自包括腺病毒科、細小病毒科、冠狀病毒科、皰瘆病毒科、痘病毒科、彈狀病毒科或其組合的病原體。所述至少一種活性免疫原性組分可以有利地包括活的減毒犬腺病毒2型(CAV2)和活的減毒犬細小病毒(CPV)。在某些實施方案中，所述至少一種活性免疫原性組分可以包括病毒載體，所述病毒載體包含一種或多種異源免疫原。在其他實施方案中，所述至少一種活性免疫原性組分可以包括質粒載體，所述質粒載體包含一種或多種異源免疫原。本發明的免疫原性懸浮液或溶液提供了這樣的穩定劑，所述穩定劑可以包含終濃度為約1%-約5%w/v;約l.5%-約5%w/v;約1.5%-約4%w/v;或約2.5%-約3%的至少一種還原性單糖。本發明的免疫原性懸浮液或溶液包含本發明的穩定劑，所述穩定劑可以包含終濃度為約0.1%-約0.3%;約0.1%-約0.25%;或約0.2%w/v的至少一種酸抗氧化劑化合物。本發明的免疫原性懸浮液或溶液包含這樣的穩定劑，所述穩定劑可以包含終濃度為約0.5%-約7.5%w/v;或約1.5%-約5%w/v的至少一種填充劑。本發明的免疫原性懸浮液或溶液包含這樣的穩定劑，所述穩定劑可以包含終濃度為約0.5%-約5%w/v的至少一種糖醇，和至少一種還原性單糖，條件是所述至少一種還原性單糖和所述至少一種糖醇的終濃度等于或小于約7.5%w/v。在另一個實施方案中，提供了包含穩定劑的本發明的免疫原性懸浮液或溶液，所述穩定劑可以包含終濃度為約0.5%-約5%w/v的至少一種非還原性寡糖，和至少一種還原性單糖，條件是所述至少一種還原性單糖和所述至少一種非還原性寡糖的終濃度等于或小于約7.5%w/v。本發明的另一個實施方案提供了免疫原性懸浮液或溶液，所述穩定劑可以包含終濃度為約0.5%-約5%w/v的至少一種糖醇，終濃度為約0.5%-約5%w/v的至少一種非還原性寡糖，和至少一種還原性單糖，條件是所述至少一種還原性單糖、所述至少一種糖醇和所述至少一種非還原性寡糖的終濃度等于或小于約12.5%w/v。本發明的免疫原性懸浮液或溶液包含這樣的穩定劑，所述穩定劑可以包含U)終濃度為約1%-約5%w/v的至少一種還原性單糖，和(ii)終濃度為約0.1%-約0.3%w/v的至少一種酸抗氧化劑。本發明的免疫原性懸浮液或溶液包含這樣的穩定劑，所述穩定劑可以包含(i)終濃度為約1%-約5%w/v的兩種還原性單糖的混合物，(ii)終濃度為約0.1%-約0.3%w/v的至少一種酸抗氧化劑，和(iii)終濃度為約0.5%-約7.5%w/v的至少一種填充劑。本發明的免疫原性懸浮液或溶液包含這樣的穩定劑，所述穩定劑可以包含(i)終濃度為約1%-約5%w/v的至少一種還原性單糖，(H)終濃度為約0.5%-約5%w/v的至少一種非還原性寡糖，(iii)終濃度為約0.1%-約0.3%w/v的至少一種酸抗氧化劑，和(iv)終濃度為約0.5%-約7.5%w/v的至少一種填充劑，條件是(i)和(ii)的終濃度等于或小于約7.5%w/v。本發明的免疫原性懸浮液或溶液包含這樣的穩定劑，所述穩定劑可以包含(i)終濃度為約1.5%-約4%w/v的至少一種還原性單糖，(ii)終濃度為約0.5%-約2.5%w/v的至少一種非還原性寡糖，(iii)終濃度為約0.1%-約0.25%w/v的至少一種酸抗氧化劑，和(iv)終濃度為約1.5%-約5%w/v的至少一種填充劑，條件是(i)和(ii)的終濃度等于或小于約5%w/v。在另一個實施方案中，免疫原性懸浮液或溶液包含這樣的穩定劑，所述穩定劑可以包含(i)終濃度為約1%-約5%w/v的至少一種還原性單糖，(ii)終濃度為約0.5%-約5%w/v的至少一種糖醇，(iii)終濃度為約0.1%-約0.3%w/v的至少一種酸抗氧化劑，條件是(i)和(ii)的終濃度等于或小于約7.5%w/v。本發明的另外一個實施方案提供了包含穩定劑的免疫原性懸浮液或溶液，所述穩定劑可以包含(i)終濃度為約1.5%-約4%w/v的至少一種還原性單糖，(ii)終濃度為約1.5%-約3%w/v的至少一種糖醇，和(iii)終濃度為約0.1%-約0.25%w/v的至少一種酸抗氧化劑，條件是(i)和(ii)的終濃度等于或小于約5%w/v。本發明的免疫原性懸浮液或溶液包含這樣的穩定劑，所述穩定劑可以包含(i)終濃度為約1%-約5%w/v的至少一種還原性單糖，(ii)終濃度為約0.5%-約5%w/v的至少一種糖醇，(iii)終濃度為約0.5%-約5%w/v的至少一種非還原性寡糖，和(iv)終濃度為約0.1%-約0.3%w/v的至少一種酸抗氧化劑，條件是(i)、(ii)和(iii)的終濃度等于或小于約12.5%w/v。本發明的免疫原性懸浮液或溶液包含這樣的穩定劑，所述穩定劑可以包含(i)終濃度為約1.5%-約4%w/v的至少一種還原性單糖，(ii)終濃度為約0.5%-約5%w/v的至少一種糖醇，(iii)終濃度為約0.5%-約2.5%w/v的至少一種非還原性寡糖，和(iv)終濃度為約0.1%-約0.25%w/v的至少一種酸抗氧化劑，條件是(i)、(ii)和(iii)的終濃度等于或小于約10%w/v。本發明的另一個方面提供了用于使本發明的活的減毒CDV和cPi2免疫原性懸浮液或溶液冷凍干燥的方法，其可以包括(a)使所述懸浮液或溶液與所述穩定劑接觸，從而形成穩定化的免疫原性懸浮液或溶液；(b)在大氣壓下使所述穩定化的免疫原性懸浮液或溶液冷卻至低于大約所述穩定化的免疫原性懸浮液的T，g值的溫度；(c)通過使冰在低壓下升華來干燥所述穩定化的免疫原性懸浮液或溶液；和(d)通過進一步降低壓力并增加所述穩定化的免疫原性懸浮液或溶液的溫度來去除過量的殘留水。在一個有利的實施方案中，步驟(b)中的所述溫度可以低于約-40"。步驟(c)中的所述壓力可以小于或等于約200^bar，而步驟(d)中的所述壓力可以小于或等于約100^bar。步驟(d)中的所述溫度可以為約2ox:-約30x:。另一個實施方案提供了本發明的方法，所述方法可以包括多價免疫原性組合物或疫苗組合物，其可以包含活的減毒CDV、活的減毒cPi2、和衍生自除副粘病毒外的其他病原體的至少一種活性免疫原性組分。在一個進一步的方面，提供了冷凍干燥的穩定化的活的減毒CDV和cPi2免疫原性組合物，其通過本發明的方法產生。另一個方面提供了冷凍干燥的穩定化的活的減毒CDV和cPi2免疫原性組合物，其可以包含(i)終濃度為約20%-約50%w/w的至少一種還原性單糖，(ii)終濃度為約1.5%-約6%w/w的酸抗氧化劑，所述酸抗氧化劑包括天冬氨酸、谷氨酸、抗壞血酸或其組合。本發明還提供了冷凍干燥的穩定化的活的減毒CDV和cPi2免疫原性組合物，其可以包含(i)終濃度為約20%-約50%w/w的至少一種還原性單糖，(ii)終濃度為約2%-約6%w/w的至少一種酸抗氧化劑，所述至少一種酸抗氧化劑包括天冬氨酸、谷氨酸、抗壞血酸或其組合，和(iii)終濃度為約15%-約70%w/w的至少一種填充劑。本發明還提供了通過本發明方法產生的冷凍干燥的穩定化的多價免疫原性組合物或疫苗組合物，其包含活的減毒CDV、活的減毒cPi2、和衍生自除副粘病毒外的其他病原體的至少一種活性免疫原性組分，并且其可以包含(i)終濃度為約20%-約50%w/w的至少一種還原性單糖，(ii)終濃度為約1.5%-約6%w/w的至少一種酸抗氧化劑，所述至少一種酸抗氧化劑包括天冬氨酸、谷氨酸、抗壞血酸或其組合。本發明的另一個方面提供了冷凍干燥的穩定化的多價免疫原性組合物，其包含活的減毒CDV、活的減毒cPi2和衍生自除副粘病毒外的其他病原體的至少一種活性免疫原性組分，并且包含(i)終濃度為約20%-約50%w/w的至少一種還原性單糖，(ii)終濃度為約20/。-約6%w/w的至少一種酸抗氧化劑，所述至少一種酸抗氧化劑包括天冬氨酸、谷氨酸、抗壞血酸或其組合，和(iii)終濃度為約15%-約700/。w/w的至少一種填充劑。在另外一個方面，本發明提供了試劑盒，所述試劑盒可以包含含有本發明的冷凍干燥的穩定化的免疫原性組合物的第一管形瓶，和含有溶劑的第二管形瓶。所述溶劑可以選自去礦質水、蒸餾水、注射用水、緩沖液(即，磷酸鹽緩沖溶液)和佐劑(即，油包水乳狀液、氫氧化鋁、卡波姆)。這些和其他實施方案由下述詳細描述公開，或者由于下述詳細描述是顯而易見的并且由下述詳細描述所嚢括。附圖簡述作為例子給出但不希望將本發明限制于所描述的具體實施方案的下述詳細描述，可以結合通過提及而合并入本文的附圖進行理解，其中圖1A顯示了具有規則形狀、蛋糖霜(meringue)外觀或海綿狀外觀的冷凍干燥的軟錠的照片。圖1B顯示了粘著外觀、線軸外觀和兩分式(de-duplicated)外觀的照片。圖2描繪了顯示在冷凍干燥步驟結束時(在TO時)，(A)非還原性寡糖和(B)還原性單糖的百分比對于以logl。CCID5。/ml表示的CDV滴度的影響的圖。非還原性寡糖和還原性單糖的終濃度表示為％重量/體積。圖3描繪了表明(A)在冷凍干燥步驟結束時(在TO時)和(B)于+4'C在3個月的貯藏期后(T+3個月)，抗氧化劑化合物對于以logl。CCID5。/ml表示的cPi2滴度的影響的圖，其中終濃度表示為％重量/體積。發明詳述在本公開內容中，"包含"、"含有"和"具有"等可以具有美國專利法中歸于它們的含義，并且可以指"包括"等；"基本上由......組成"同樣具有美國專利法中歸于其的含義，并且該術語是開放式的，允許存在多于所描述事物的事物，只要所描述事物的基本或新型特征不由于存在多于所描述事物的事物而改變，但排除現有技術實施方案。本發明背景下的"受試者"可以是脊推動物，例如哺乳動物、烏類、爬行動物、兩棲動物或魚類；更有利地，人、伴倡動物或馴養動物；食品生產性或飼料生產性動物；家畜、游戲、竟賽或運動動物，例如但不限于牛類、犬類、貓類、山羊類、綿羊類、豬類、馬類和鳥類。優選地，所述脊推動物是犬類。如本文所使用的，"重組的"涉及在體外合成或者進行操作的核酸(例如，"重組核酸")，使用重組核酸在細胞、受試者或其他生物系統中產生基因產物的方法，或者由重組核酸編碼的多肽("重組蛋白質")。"重組方式"還包括切割核酸并將其連接到表達盒或載體中以用于例如核酸編碼序列的誘導型或組成型表達，所述核酸具有來自不同來源的各種編碼區、結構域或啟動子序列。如本文所使用的，術語"可操作地連接"意指所描述的組分處于允許其以其預期方式起作用的關聯中。術語"異源的"在當關于核酸進行使用時，表示核酸位于它在自然界中通常不存在于其中的細胞、病毒、受試者或細菌中；或者包含2個或更多個核酸子序列，所述子序列未發現處于與自然界中通常發現的相同的彼此關聯中，或進行重組改造，從而使得其在細胞、受試者或結構中的表達水平或與其他核酸或其他分子的物理關系在自然界中通常未發現。例如，可以重組生產具有2個或更多個來自無關基因的序列的異源核酸，所述序列以自然界中未發現的方式排列；例如，類基因。舉例來說:目的異源核酸可:編碼免疫原:基因產物，其中在載體中包含的目的異源核酸在治療上或預防上作為免疫原性組合物或疫苗組合物進行施用。異源序列可以包含啟動子和序列的各種組合，其眾多例子在本文中詳細描述。如本文所使用的，"載體"是允許或促進實體從一種環境轉移到另一種環境的工具。舉例來說，在重組核酸技術中使用的某些載體允許實體例如核酸區段(例如異源核酸區段，例如異源cDNA區段)被轉移到靶細胞內。本文還使用了術語"表達栽體"。本發明包括重組載體，所述重組載體可以包括但不限于，病毒載體、細菌載體、真菌載體、原生動物載體、質粒載體或其組合。關于用于在載體中表達的異源核酸(例如，編碼目的表位和/或抗原和/或免疫原和/或治療劑)和提供此類異源核酸的文獻，以及關于用于增強核酸分子表達的轉錄和/或翻譯因子的表達，以及關于術語例如"目的表位"、"治療劑"、"免疫應答"、"免疫學應答"、"保護性免疫應答"、"免疫學組合物"、"免疫原性組合物"和"疫苗組合物"等等，尤其可以參考1999年11月23日公布的美國專利號5，990，091以及W098/00166和W099/60164，以及其中引用的文獻和在那個專利和那些PCT申請的審查過程中的記錄文獻；所有所述參考文獻通過提及而合并入本文。因此，在本發明實踐中可以參考美國專利號5，990，091以及W098/00166和W099/60164，和其中引用的文獻和在那個專利和那些PCT申請的審查過程中的文獻或記錄，以及在本文中引用或者通過提及而合并入本文的其他文獻；并且其中所引用的所有異源核酸分子、啟動子和載體可以在本發明的實踐中使用。在這點上，還可以提及美國專利號6，706，693;6，716，823;6，348，450;美國專利申請序列號10/424,409;10/052,323;10/116,963;10/346，021;和于1999年2月25日公開的來自PCT/US98/16739的WO99/08713."抗原，，是由免疫系統識別并誘導免疫應答的物質。抗原可以包括被殺死的、減毒的或活的完整生物；生物的亞單元或部分；包含具有免疫原性性質的插入片段的重組栽體；在呈遞給宿主動物后能夠誘導免疫應答的核酸部分或片段；蛋白質、多肽、肽、糖蛋白、表位、半抗原、碳水化合物、糖或其任何組合。備選地，抗原可以包括毒素或抗毒素。在本文中可互換使用的類似術語是"免疫原"。"病原體，，指疾病的特定致病因子，例如細菌、真菌、原生動物、寄生蟲或病毒。如本文所使用的，術語"免疫原性組合物"和"免疫學組合物"和"免疫原性或免疫學組合物"包括引發針對從載體表達的目的抗原或免疫原的免疫應答的任何組合物；例如，在給受試者施用后，引發針對所靶向的目的免疫原或抗原的免疫應答。術語"疫苗性組合物"和"疫苗"和"疫苗組合物"包括誘導針對目的抗原的保護性免疫應答，或針對所述抗原提供有效保護的任何組合物；例如，在給受試者施用或注射后，引發針對所靶向的抗原或免疫原的保護性免疫應答或提供針對從載體表達的抗原或免疫原的有效保護。如本文所使用的，術語"多價"意指或者包含超過一種來自相同物種、來自不同物種的抗原的免疫原性組合物或疫苗組合物，或者包含來自不同屬的抗原的組合的免疫原性組合物或疫苗組合物。本發明背景下的"活性免疫原性組分"包括活的減毒病原體，例如，活的減毒病毒，活的減毒細菌、真菌或寄生蟲。當活性免疫原性組分是本發明的多價活的減毒CDV和cPi2免疫原性組合物、懸浮液或溶液的一部分時，活性免疫原性組分可以有利地衍生自除副粘病毒外的其他病原體。本發明還包括衍生自或來源于本文描述的一種或多種病原體的重組異源免疫原或抗原，其尤其可以在病毒載體、細菌載體、真菌載體和質粒栽體中包含并表達。本發明尤其還包括衍生自一種或多種病原體的異源免疫原或抗原的表位，免疫調節劑例如細胞因子，治療劑，毒素，抗體，抗體的抗原結合片段，佐劑，或其他種類，例如反義RNA、催化性RNA、小千擾RNA。術語"獸醫學組合物"意指包含表達治療蛋白質如例如促紅細胞生成素(EP0)或免疫調節蛋白例如干擾素(IFN)以用于獸醫學用途的載體的任何組合物。類似地，術語"藥物組合物"意指包含用于表達治療蛋白質的載體的任何組合物。本發明的組合物和方法可以適當地應用于下述物質的穩定化尤其是免疫調節劑例如細胞因子，治療劑，毒素，抗體，抗體的抗原結合片段，佐劑，或其他種類，例如反義RNA、催化性RNA、小干擾RNA。在重構后，這些化合物可以作為預防免疫接種而用于預防疾病，或者作為治療免疫接種而提供針對疾病癥狀的緩解。本發明包括用于冷凍干燥的活的減毒免疫原性組合物的穩定劑，其包含至少一種還原性單糖和至少一種酸抗氧化劑化合物。在某些實施方案中，穩定劑可以任選包含至少一種非還原性寡糖和/或至少一種填充劑和/或至少一種糖醇。這些穩定劑可以保持或保留生物成分的免疫原性、感染性和生存力，所述生物成分包括但不限于，尤其是病毒、細菌、真菌、寄生蟲、蛋白質、多肽。本文描述的本發明的穩定劑還具有良好的外觀，即均勻的形狀和顏色，并且對于給受試者的施用是安全的。"還原性單糖"是能夠貢獻出電子，并因此在氧化還原反應期間能夠使另一種化合物還原的糖。一般而言，還原性單糖在其結構中具有醛或酮基。比色測試可用于鑒定還原性糖，例如費林試劑測試，它產生從深藍色到紅色的顏色變化，因為銅離子試劑在還原性糖存在下被還原成銅金屬。在本發明中，還原性單糖優選包括葡萄糖、半乳糖、果糖、甘露糖、山梨糖或其組合。在本發明的一個實施方案中，提供了至少2種還原性單糖的組合。還原性單糖對于在冷凍干燥過程中保護組合物特別是蛋白質和活的減毒病原體是重要的，特別是在升華步驟(即，第一個和第二個干燥步驟)過程中，其中還原性單糖代替被升華的水并維持生物結構的內聚(cohesion)。任選地，可以向根據本發明的穩定劑中添加糖醇和/或非還原性寡糖。本發明還包括還原性單糖和糖醇的組合，還原性單糖和非還原性寡糖的組合，以及還原性單糖、糖醇和非還原性寡糖的組合。糖醇在化學上是醇，更確切地說是多元醇，通過糖醛基的還原而衍生自糖分子。在本發明的背景下，糖醇有利地是單糖醇或二糖醇。糖醇可以有利地包括山梨糖醇、甘露醇、木糖醇或麥芽糖醇。本發明的穩定劑還可以包括至少2種糖醇的混合物。本發明背景下的"非還原性寡糖"是包含2-10個糖單元的糖，并且在氧化還原反應過程中不能使另一種化合物還原。在本發明中，非還原性寡糖可以是非還原性二糖或非還原性三糖，有利地包括海藻糖、蔗糖或棉子糖。本發明的穩定劑還可以包含至少2種非還原性寡糖的混合物。酸抗氧化劑化合物被定義為與氧化劑、自由基(即具有未成對電子的分子)或釋放自由基的化學制品反應并且使它們中和的化學化合物。在本發明的背景下，抗氧化劑化合物為酸的形式。為了清楚起見，它們在本文中被稱為"酸抗氧化劑"。酸抗氧化劑可以包括抗壞血酸和/或酸性氨基酸，例如天冬氨酸和谷氨酸。有利地，酸抗氧化劑是天冬氨酸。穩定劑優選地不包含酸抗氧化劑的鹽，例如堿金屬鹽，例如鈉或鉀鹽，特別是天冬氨酸鈉鹽、天冬氨酸鉀鹽、谷氨酸鈉鹽、谷氨酸鉀鹽、抗壞血酸鈉鹽和抗壞血酸鉀鹽。在本發明中還包括超過一種抗氧化劑化合物的組合。填充劑可以是藥學或獸醫學上可接受的聚合物，例如但不限于葡聚糖、麥芽糖糊精、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、交聚維酮和羥乙基淀粉。其他淀粉衍生物包括但不限于，微晶纖維素、甲基纖維素、羧曱基纖維素、羥丙基纖維素、羥乙基甲基纖維素和鞋丙基甲基纖維素。有利地，填充劑可以是葡聚糖或PVP，優選地葡聚糖。本發明還包括至少2種填充劑的組合。填充劑增加免疫原性組合物和疫苗組合物的T，g值，允許在冷凍過程中使用較高的溫度。"T，g值"被定義為玻璃化轉變溫度，這相應于在其下冷凍的組合物變成玻璃質的溫度。填充劑主要負責在本發明的冷凍干燥的軟錠和團塊中觀察到的良好的外觀，特別是通過保持軟錠的固體形狀而不產生氫鍵。如果使用葡聚糖作為填充劑，那么它的分子量可以為約5000Da-約70000Da，優選地約10，000Da-約40,000Da。如果使用PVP作為填充劑，那么它的分子量可以為約8,000Da-約360，000Da，優選地約10，000Da-約60，000Da。如果使用麥芽糖糊精作為填充劑，那么它的葡萄糖當量值(DE，這是淀粉聚合物水解程度的定量量度)可以為約3-約20,優選地約5-約18，更優選地約10-約15。如果使用羥乙基淀粉作為填充劑，那么它的分子量可以為約70,000Da-約450,000Da,優選地約130,000Da-約200，000Da。羥乙基淀粉的置換程度可以為約0.4-約0.7，優選地約0.4-約0.6。置換程度被定義為羥乙基的數目/葡萄糖單元。穩定劑中的某些組分可能是不溶性的。然而，為了獲得可溶性穩定劑的目的而替換適當地類似的組分(例如，通過選擇更可溶的組分)和/或調整穩定劑中存在的不溶性組分的量或數量，完全在技術人員的能力范圍內。組分的溶解度可以通過目視溶解度測試而容易地進行檢查。溶解度測試包括在約55C的溫度下添加穩定劑的所有組分并混合約30分鐘的步驟。在室溫和沒有任何攪動下大約24小時后，可以就沉淀物的出現來目視檢查穩定劑。如果穩定劑是透明的或清澈的，那么穩定劑的所有組分都是可溶的。命名為F2、F2B、F6B、F33、F37、A、H、K和U的本發明的穩定劑的具體實施方案在本文實施例中進行描述。本發明的穩定劑可以貯藏在約10"C-約4ox:，并且優選地約15。C-約25匸的溫度下。本發明還提供了穩定化的免疫原性懸浮液或溶液，其包含與根據本發明的穩定劑相混合的免疫原性懸浮液或溶液，所述免疫原性懸浮液或溶液包含活的減毒病毒，例如但不限于副粘病毒。犬副粘病毒尤其包括犬瘟熱病毒(CDV)和犬副流感2型(cPi2),兩者都為活的減毒病毒的形式。本發明的一個有利的實施方案包括活的減毒副粘病毒，特別是犬副粘病毒。犬副粘病毒是副粘病毒科的病毒，所述副粘病毒科包括犬痙熱病毒(CDV)和犬副流感2型病毒(cPi2)。犬副粘病毒是造成許多食肉動物物種中的廣泛多樣的疾病的原因，特別是馴養動物例如狗，或非馴養動物例如雪紹、獅子、老虎和豹。在本發明的穩定化的免疫原性懸浮液或溶液中，還原性單糖的終濃度為約1%-約5%w/v，有利地約1.5%-約5%w/v，更有利地約1.5%-約4%w/v，和優選地約2.5%-約3%w/v。在本發明的背景下，"終濃度"意指在穩定化的免疫原性懸浮液或溶液中的化合物濃度。本發明的穩定化的免疫原性懸浮液或溶液可以包含終濃度為約0.1%-約0.3%w/v，特別地約0.1%-約0.25%w/v,和更特別地約0.2%w/v的酸抗氧化劑化合物。當穩定化的免疫原性懸浮液或溶液包含至少一種填充劑時，填充劑的終濃度為約0.5%-約7.5%w/v，和有利地約1.5%-約5%w/v。當穩定化的免疫原性懸浮液或溶液包含至少一種還原性單糖和至少一種糖醇時，還原性單糖的終濃度為約1%-約5%w/v，有利地約1.5%-約5%w/v，更有利地約1.5%-約4%w/v，和優選地約2.5%-約3%w/v，糖醇的終濃度為約0.5%-約5%w/v,和有利地約1.5%-約3°/。w/v，條件是還原性單糖和糖醇的混合物的終濃度等于或小于約7.5%w/v，和有利地等于約5%w/v。當穩定化的免疫原性懸浮液或溶液包含至少一種還原性單糖和至少一種非還原性寡糖時，還原性單糖的終濃度為約1%-約5%w/v，有利地約1.5%-約5%w/v，更有利地約1.5%-約4%w/v和優選地約2.5%-約3%w/v，非還原性寡糖的終濃度為約0.5%-約5%w/v和有利地約0.5%-約2.5%w/v，條件是還原性單糖和非還原性寡糖的混合物的終濃度等于或小于約7.5%w/v，和有利地等于約5%w/v。當穩定化的免疫原性懸浮液或溶液包含至少一種還原性單糖、至少一種非還原性寡糖和至少一種糖醇時，還原性單糖的終濃度為約1%-約5%w/v，有利地約1.5%-約5%w/v，更有利地約1.5%-約4%w/v,和優選地約2.5%-約3%w/v;非還原性寡糖的終濃度為約O.5%-約5%w/v，和有利地約0.5%-約2.5%w/v;糖醇的終濃度為約0.5%-約5%w/v，和有利地約1.5%-約3%w/v，條件是還原性單糖、非還原性寡糖和糖醇的混合物的終濃度等于或小于約12.5%w/v，有利地約10%w/v，和更有利地等于約7.5%w/v。在某些實施方案中，將穩定劑F2、F2B、F6B、F33、F37、A、H、K或U與包含活的減毒病毒的免疫原性懸浮液或溶液，或者與包含活的減毒病毒的多價免疫原性懸浮液或溶液相混合。優選地，將l體積的F2、F2B、F6B、F33、F37、A、H、K或U穩定劑與1體積的包含活的減毒病毒的免疫原性懸浮液或溶液，或者與l體積的包含活的減毒病毒的多價免疫原性懸浮液或溶液相混合。它們在穩定化的懸浮液或溶液中的終濃度優選為初濃度的大約一半。活的減毒疫苗或免疫原性組合物具有下述優點它可以以低劑量施用，特別是當它是自主復制的時候；它接近地模仿受試者中的天然/野生型感染，并且它同時，即在單次施用中，給受試者提供所有可能的在免疫學上重要的抗原。一般承認，基于活的減毒微生物的免疫原性組合物或疫苗組合物具有誘導高度有效類型的免疫應答的能力。此類免疫原性組合物或疫苗組合物具有下述優點一旦已對動物宿主進行免疫后，病原體進入宿主內誘導較早的細胞介導的或體液的免疫的加速回憶，這能夠在傳染可以呈現臨床上顯著的比例前控制該生物的進一步生長。基于被殺死的病原體的免疫原性組合物或疫苗組合物(殺死的疫苗)在本領域中一般被認為不能或較不可能達到這種類型的應答。然而，取決于減毒水平，包含活病原體的免疫原性組合物或疫苗組合物，存在經免疫的宿主在免疫接種后可能染上正尋求針對其的保護的疾病的危險。因此這樣的免疫原性組合物或疫苗組合物將是高度希望的，即所述免疫原性組合物或疫苗組合物具有活病原體的免疫接種屬性，但在給受試者施用后不能引起不希望的副作用。通過摻入廣泛范圍的突變可以產生活的減毒病原體，所述突變包括單核苷酸變化、位點特異性突變、插入、置換、刪除或重排。取決于突變的性質，這些突變可以影響病原體基因組的小區段，例如，15-30個核苷酸，或病原體基因組的大區段，例如50-1000個核苷酸。例如，可以在消除或消弱其活性的病原體非編碼調節區或元件的上游或下游引入突變，從而導致減毒表型。可以導致病原體基因的復制下調，和/或病原體基因的轉錄下調的病原體基因組的非編碼調節區的突變，可以導致在每輪復制中產生缺陷型病原體；即包含少于完全感染性病原體所需的基因組區域或區段的完整互補物的病原體。因此，改變的病原體將顯示減毒特征，因為在每輪復制中病原體將產生比野生型病原體更有缺陷的病原體。然而，因為在每輪中合成的蛋白質、抗原或免疫原的量對于野生型病原體和缺陷型病原體來說是類似的，所以此類減毒的病原體可能能夠在受試者中誘導良好的免疫應答。當病原體基因編碼結構蛋白(例如在病原體例如病毒的情況下，衣殼、基質、表面或包膜蛋白)時，在復制期間產生的顆粒數目將減少，從而突變的病原體顯示出減毒特征；例如，導致亞臨床水平的感染的滴度。例如，病毒衣殼表達的下降將減少在復制期間包裝的核衣殼的數目，而包膜蛋白表達的下降可以減少子代病毒粒子的數目和/或感染性。備選地，復制所需的病毒酶例如聚合酶、復制酶、解旋酶等表達的下降將減少在復制期間產生的子代基因組的數目。因為在復制期間產生的感染性顆粒的數目減少，所以改變的病毒顯示出減毒特征。然而，產生的抗原病毒顆粒的數目一般將足以在受試者中誘導強烈的免疫應答。用于改造減毒病原體的備選方法涉及引入突變，包括但不限于，一種或多種氨基酸殘基和/或表位插入、刪除或置換到一種或多種病原體蛋白質內。這可以通過將合適的突變改造到病原體的相應基因序列中而容易地完成。本發明包括了改變病原體蛋白質的活性從而修飾或減少復制的任何變化。例如，在減毒病毒的背景下，可以將這樣的突變改造到病毒表面抗原或參與加工的病毒蛋白酶內以產生減毒林，所述突變干擾但不完全取消病毒與宿主細胞受體的附著和隨之發生的感染。病毒表面抗原或毒力因子可以進行修飾以包含一個或多個氨基酸或表位的插入、置換或刪除，其干擾或減少病毒抗原對于宿主細胞受體的結合親和力。這種方法提供了附加的優點，因為可以產生表達外源或異源表位的嵌合病毒，所述嵌合病毒還顯示了減毒特征。此類病毒是用作活的重組疫苗的理想候選物。被改造到任何病毒酶內的突變包括但不限于，酶的活性位點的氨基酸序列中的插入、刪除和置換。舉例來說，可以改變酶的結合位點，從而減少其對其底物的結合親和力，并且因此，該酶更不特異和/或有效。例如，選擇的靶是病毒聚合酶復合物，因為溫度敏感型突變存在于所有聚合酶蛋白質中。因此，可以將被引入與此類溫度敏感性相關的氨基酸位置內的變化改造到病毒聚合酶基因內，從而產生減毒的病毒林oCDV是直徑約100-300nm的有包膜單鏈RNA病毒，并且屬于麻滲病毒屬。CDV病毒粒子核心包含與病毒RNA緊密相關的核蛋白(NP)肽。第二種核心肽是磷蛋白(P)。CDV包膜包含3種肽，即M蛋白(基質蛋白)和2種糖蛋白。所述糖蛋白是血凝素糖蛋白(H)和融合(F)糖蛋白。融合糖蛋白被降解成命名為R和F2的更小亞單位。H蛋白主要負責病毒與靶細胞的吸附，和融合糖蛋白負責細胞與細胞的融合。迄今為止，所有已知的瘋熱病毒分離物都包含這些共同的病毒多肽。對于犬的感染途徑是通過感染性氣溶膠小滴，并且該病毒的傳播通過咳嗽，噴嚏和緊密拘限于溫暖、潮濕、密閉的環境中而得到促進。研究暗示，病毒感染首先在上口鼻道的呼吸上皮中發生，而隨后傳播至深肺部薄壁組織(Gorham"CanineDistemper",(1960)AdvanceVeterinaryScience,Brandley和Jungher編輯，6:288-315)。位于扁桃體中或沿著扁桃體中的呼吸上皮定位的組織巨噬細胞和單核細胞看起來是獲得并復制CDV的第一種細胞類型。該病毒隨后在血流中傳播至遠處的淋巴網狀組織。這通過病毒血癥來完成并且在最初感染后2-4天在任何地方發生。感染后8-9天之間，該病毒傳播到淋巴網狀組織外從而涉及上皮和間質組織(Appel，(1969)Am.J.Vet.Res.M，1167-1182)。正是在這個病毒感染階段時，針對病毒抗原的特異性宿主免疫應答影響疾病的后果。疾病的急性致命形式的特征在于病毒不受限制地傳播至身體中幾乎每種組織。病毒可以在受感染的受試者中的每種排泄物和分泌物中找到，并且通過使用免疫熒光法或抗原追蹤技術，在狗體內幾乎每種細胞類型中可以觀察到抗原的存在。對于這些動物中的大多數，最可能的死亡原因是爆發性的致命性神經病學牽涉和/或腦炎。某些受CDV感染的狗顯示出在臨床上延遲的疾病進展和適度的恢復期免疫應答。臨床征兆(如果存在)在疾病早期是微妙的，并且是中樞神經系統(CNS)內病毒滯留的反映。超過CNS疾病的后續發展是可變的。大多數受CDV感染的犬基本上不顯示出明顯的臨床病病征兆并且被識別為恢復期的、在臨床上正常的犬。最終從CDV感染中恢復的被活躍感染的犬已顯示，在感染后第6或7天時或大約在感染后第6或7天顯現出游離的循環抗病毒抗體(Krakowka，等人(1975)J.Infect.Dis."二384-392)。在早期恢復期中滴度快速上升至高水平。受CDV急性侵襲的狗顯示可變程度的抑郁、食欲減退和發熱。皮膚可以不定地是脫水的、干燥-粗糙的和無彈性的。這些動物中的一部分顯示出畏光和粘液膿性眼-鼻流出物的跡象。間歇性腹瀉是常見的臨床征兆。在疾病的這個急性病毒血癥時期期間，病毒散發到每種分泌物和排泄物中。隨著疾病進展，可以發展出通常由于繼發性細菌侵入物而引起的肺炎。取決于繼發感染的程度或量，在這個疾病階段中的狗具有適度的至嚴重的淋巴細胞減少。盡管受急性侵襲的狗可以顯示出神經學征兆的基本上每種組合，但是在其最常見的表現中，狗呈現癲癇的小發作或大發作。這些驚厥性發作隨著時間過去而發生并且頻率逐漸增加。犬瘟熱的第二種神經學形式是伴隨老狗腦炎(olddogencephalitis,0DE)發生的那種，或在亞臨床感染和看似恢復后發生的那種。CNS征兆在表現方面可以是非常不同的，并且可以被誤認為腦腫瘤、頭創傷、細菌性腦膜炎、腦積水和脊髄盤疾病(spinalcorddiscdisease)。CDV感染在狗中的主要非神經性表現是CDV相關的免疫抑制(Krakowka，等人(1980)Am.J.Vet.Res."，284-292)。狗瘟熱病毒感染的許多征兆可歸因于在這種虛弱動物中出現的同時發生的繼發性感染過程。狗中的疾病還可以與細菌病原體相關，例如肺部細菌物種，包括但不限于，支氣管炎博德特氏菌(Aorc^fe//a6ro/7C力"e;〃cfl)、巴斯德氏菌屬(戶a"ei/re"a)物種、葡萄球菌屬(5^ap/^,c)物種和鏈球菌屬(^re/^ococc^)物種。這些細菌在受CDV感染的狗中是造成臨床上顯著的化膿性結膜炎、鼻炎和支氣管肺炎的原因。主要是呼吸型的混合型病毒感染也是常見的。除了犬腺病毒11感染之外，呼腸孤病毒、犬副流感病毒和可能其他病毒例如犬皰滲病毒，都可以參與雙重或多重混合型感染。cPi2是誘導呼吸系統疾病的RNA病毒，所述呼吸系統疾病是最常遇到的狗病毒疾病之一。當副流感病毒、犬腺病毒-2和支氣管炎博德特氏菌的組合一起出現時，導致"犬舍咳(kennelcough)"。cPi2還引起在某些動物中導致滲出性肺炎的氣管支氣管炎。咳嗽的征兆在暴露于病毒后7-9天發生。臨床征兆是輕微的并且具有短持續時間除非發生繼發感染。cPi2是球狀的有包膜病毒，平均直徑為150-200nm，具有由脂雙層包圍的螺旋核衣殼，所述脂雙層由糖蛋白刺突(spikes)覆蓋。每個病毒顆粒包含單鏈的非節段的負義RNA基因組，具有核蛋白(NP)和磷蛋白(P)和大(L)蛋白。cPi2感染通過吸入受感染的呼吸飛沫核而獲得。鼻和鼻咽是主要的感染部位。該病毒主要通過經由血凝素-神經氨酸酶蛋白質附著至這些區域的纖毛上皮細胞來起始感染，所述血凝素-神經氨酸酶蛋白質與宿主細胞中的神經氨酸受體特異性地結合。隨后，該病毒經過由Fl和F2受體介導的與細胞膜的融合而進入細胞。該病毒在細胞內和細胞外繁殖并侵入其他細胞。病毒繁殖在氣管細支氣管組織各處發生，引起粘液產生增強。喉氣管炎是喉和氣管的炎癥，當在狗中發生時這通常被稱為"犬舍咳"。主要癥狀是表現為短的干"咳"或一系列此類咳嗽的咳嗽。在其最嚴重時，該咳嗽可以是爆發性的，并且感染涉及整個呼吸道，通常產生肺炎。該咳嗽還表征為深的、持續的、非排痰性的，并且一般伴隨流眼淚和鼻弟。溫度可以是正常的，盡管它一般是升高的。該疾病的發作可以是突然的并且可以沒有預先征兆而發生。因為該疾病是非常具有接觸感染性的，所以受感染的狗應當被隔離以防止整個群體的感染。該疾病對狗舍所有者產生較大的經濟損失，并且盡管通常不是致命的，但它可以使狗變虛弱，從而產生由于其他疾病引起的嚴重效應0活的cPi2病毒和其他病毒例如CDV、狗腺病毒2型(CAV2)和狗細小病毒(CPV)可以在動物組織培養物中進行繁殖，直至兩者病毒變為非致病的，即所述病毒變為滅活的或者減毒的。cPi2病毒能夠在廣泛多樣的組織培養系統中繁殖，例如，雞胚胎、鴨胚胎、豬腎、豬睪丸、胚胎牛腎、貓腎、犬腎和猴腎；以及還能夠在建立的細胞系中繁殖，例如馬-達二氏牛腎(MDBK)、馬-達二氏犬腎(MDCK)和SerumInstitute兔角膜(SIRC)。對于例如犬腺病毒2型(CAV2)的繁殖，腎組織培養物是優選的，特別是衍生自牛和犬的那些，因為CAV2不像cPi2病毒那樣在其他動物組織培養系統中有利地復制。每種病毒的減毒作用可以通過標準連續傳代(包括末端稀釋傳代技術)來完成，其中可以使用在易感組織培養物中足夠數目的傳代，直至該病毒變為非致病的而不喪失免疫原性。由其制備的免疫原、免疫原性組合物或免疫原性懸浮液或溶液可以在對疾病易感的狗中刺激免疫應答，而不產生任何顯著程度的通常由于毒力因子而引起的臨床癥狀。繁殖可以在與如上所述的相同或不同的組織中進行。傳代時間間隔應當足以允許病毒在傳與代之間復制，并且溫育溫度優選維持于約30匸-約38匸。最佳的傳代時間間隔取決于所使用的具體培養系統和溫度。在任何情況下，病毒的充分復制是否已發生可以通過下述方式容易地進4亍確定通過標準才支術例如Shelokov，A.(1958)Proc.Soc.Exp.Biol.Med.夕7，802中描述的血細胞吸附技術(其對于cPi2病毒特別有用)，或者通過致細胞病變觀察，例如通過允許病毒在特定傳代過程中在這樣的點之前生長，在所述點時可以在持續溫育同時觀察到肉眼可見的致細胞病變效應。有利的繁殖方法利用犬腎細胞，特別是連續MDCK細胞系。例如，為了免疫原性或疫苗目的，可以以約3天的間隔和約30X:-約381的溫育溫度進行來自通過病毒的狗腎組織培養的分離過程的約至少15代且優選約20-約45代。優選使用較高的傳代材料，因為這將有利于在有此需要的受試者中產生有利的免疫應答。在制備免疫原性組合物或疫苗組合物中，有毒力的CDV可以在培養的哺乳動物細胞中在常規的病毒生長條件下進行生長。宿主細胞可以在細胞種植時用病毒進行接種，或當細胞單層達到90-100%匯合時用包含CDV的培養基替換物進行接種。感染復數(MOI)比率可以為約0.001-約0.05，優選約0.01。任何合適的哺乳動物細胞生長培養基可以用于產生所述病毒，例如但不限于Eagle極限必需培養基、Dulbecco改良的Eagle培養基、Iscove改良的Dulbecco培養基、Ham'sF12培養基、F15培養基、RPMI1640培養基，其包含約0%-約10%的動物血清例如胎牛血清、小牛血清、馬血清、犬血清等，補充物例如L-谷氨酰胺以及必需和非必需的其他氨基酸、Hanks平衡鹽溶液(HBSS)、Earle鹽溶液、丙酮酸鈉、碳酸氫鈉、胰島素、轉鐵蛋白以及抗生素和抗真菌劑，例如但不限于慶大霉素、青霉素、鏈霉素、多粘菌素B、兩性霉素和Fungizone,本發明還包括無血清的細胞培養基。在接種后，將感染的細胞培養物維持于約351C-約40X:的溫度下約2-約7天，在這時可以收獲病毒。受感染的培養物可以用細胞生長培養基進行接種，其可以在2-5天的另外溫育期后進行收獲。將病毒流體收獲到無菌容器中并且可以通過過濾進行澄清。病毒流體可以使用常規的超濾技術(例如，Mi11iporePe11icon系統)進一步濃縮，使用具有105道爾頓的顆粒大小排阻極限的過濾器。可以與本發明的穩定劑相混合的其他活的減毒病毒包括但不限于，狂犬病病毒，5危感病毒，副5危感病毒，a恩腺炎病毒，腺病毒例3口犬腺病毒2型(CAV2)，呼吸道合胞病毒，EB病毒，鼻病毒，痘病毒例:ft。痘苗病毒，豬痘病毒，淀熊痘病毒，禽痘病毒例如雞痘病毒，金絲雀痘病毒，鴒痘病毒(dovepox)，家鴒痘病毒(pigeonpox)，脊髓灰質炎病毒，柯薩奇病毒、艾柯病毒、冠狀病毒，麻滲病毒，風滲病毒，7jC痘-帶狀皰滲病毒，皰滲病毒(人和動物)，單純皰療病毒，細小病毒例如犬細小病毒(CPV)，巨細胞病毒，肝炎病毒例如犬接觸感染性肝炎病毒，人乳頭瘤病毒，曱病毒例如塞姆利基森林病毒，辛德畢斯病毒，羅斯河病毒，東方馬腦炎病毒，西方馬腦炎病毒，委內瑞拉馬腦炎病毒，奧尼永尼永病毒，黃病毒例如登革熱病毒和西尼羅河病毒，布亞病毒，沙粒病毒，輪狀病毒，嗜肝DNA病毒例如正嗜肝DNA病毒和禽嗜肝DNA病毒，線狀病毒，逆轉錄病毒例如豬內源性逆轉錄病毒，HTLV-1，HTLV-2,FeLV，BLV，MLV，匪SV，Mason-Pfizer猴病毒，慢病毒例如HIV-l,HIV-2，FIV,SIV，BIV，貓杯狀病毒，貓全白細胞減少癥病毒，貓感染性腹膜炎病毒，貓鼻氣管炎病毒，TGE病毒(豬)和口蹄疫病毒。將包含例如犬副粘病毒的免疫原性組合物或懸浮液或溶液與根據本發明的穩定劑相混合，以形成穩定化的免疫原性懸浮液或溶液。優選地，將1體積的犬副粘病毒懸浮液或溶液與1體積的穩定劑相混合。本發明的穩定劑還可以用于穩定多價免疫原性懸浮液或溶液，其可以包含例如犬副粘病毒免疫原性懸浮液或溶液，和來源于或衍生自除副粘病毒外的其他病原體的至少一種活性免疫原性組分。本文所定義的活性免疫原性組分可以包含活的減毒病原體，例如活的減毒病毒、細菌、真菌或寄生蟲。然而，活性免疫原性組分還可以包括被殺死的病毒、重組的異源免疫原、抗原、衍生自或來源于本文描述的一種或多種病原體的免疫原或抗原的免疫原性亞單位(例如蛋白質、多肽、肽、表位、半抗原)或表位，其可以從病毒栽體、細菌載體、質粒載體等表達。本發明的活性免疫原性組分可以包括選自犬病原體的一種或多種免疫原，所述犬病原體包括但不限于，狂犬病病毒、犬腺病毒2型(CAV2)、犬皰滲病毒(CHV)、犬細小病毒(CPV)、犬冠狀病毒、犬鉤端螺旋體(Ze/^o^7/raca/22'co/a)、出血黃疽鉤端螺旋體(Zepfosp/ra/"eroAae2Z7orr力agiae)、流感傷寒鉤端螺旋體(Ze;^os/7/ragr/p;7"7P力osa)、布氏疏螺旋體(_5oTre//fl6"r^/or/*er/)、支氣管炎博德特氏菌等，包括其組合。活性免疫原性組分可以尤其包括來自CDV的HA、F、NP基因，來自CPV的衣殼基因，來自犬冠狀病毒的刺突、M、N基因，來自cPi2的HN和F基因，來自鉤端螺旋體的基因，來自博德特氏菌的基因，來自疏螺旋體的基因，以及來自犬皰滲病毒的gB、gC和gD基因。這些組分可以用作免疫原性組合物或疫苗組合物，以用于保護犬不患由這些病原體引起的疾病。犬腺病毒2型(CAV2)是分布廣泛的并且對于犬是高度接觸傳染的。它產生類似感冒的癥狀。一般地，該接觸傳染性疾病的第一種征兆是發熱，這通常在l-2天內消退。受侵襲的狗可以具有扁桃體炎、腹部觸痛、肝胂大、嘔吐和腹竭。急性疾病通常是致命的。CAV2可以被滅活或減毒并且與CDV(和/或cPi2)相組合，以產生多價疫苗。備選地，可以使用CAV2的免疫原或抗原，或CAV2免疫原的表位，例如衣殼、基質或六鄰體蛋白。犬細小病毒(CPV)是可以在幼犬中引起嘔吐、腹瀉、胃腸炎、心肌炎和肝炎的常見腸病毒。它已被發現在狗中是分布廣泛的。CPV可以作為滅活的，活的減毒的，或CPV免疫原，抗原，或CPV免疫原的表位，例如VP1、VP2(衣殼)基因產物，存在于本發明的免疫原性組合物、懸浮液或溶液中。狗的2種常見的細菌感染也可以以其減毒形式在本發明的穩定化的免疫原性組合物、懸浮液或溶液中相組合；這些是犬鉤端螺旋體和出血黃疽鉤端螺旋體。鉤端螺旋體感染(Leptoinfections)在狗中是常見的，并且特別是在受CDV、cPi2或如在患有犬痙熱或犬舍咳的狗中經常觀察到的病毒組合感染的狗中是常見的，因此將它們包括在本發明的穩定化的免疫原性組合物、懸浮液或溶液具有顯著效用。在本發明的組合物和方法中有用的其他活性免疫原性組分可以包括選自禽病原體的一種或多種免疫原，所述禽病原體包括但不限于，鼠《另寒沙、門菌(^s7/zone/7flOT力7/z7"i^'"邊)，腸炎沙、門菌(i^//zo/7e//ae/^eri"V^)，感染性支氣管炎病毒(IBV)，新城疫病毒(NDV)，產蛋下降綜合征病毒(EDS)，感染性粘液囊病病毒(IBDV)，火雞病毒，禽流感病毒，馬立克氏病病毒，皰滲病毒例如感染性喉氣管炎病毒，禽感染性支氣管炎病毒，禽呼腸孤病毒，痘病毒包括禽痘，雞痘，金絲雀痘，家鴒痘，鵪鵓痘和鴒痘，禽多瘤病毒，禽肺病毒，禽鼻氣管炎病毒，禽網狀內皮組織增生病病毒，禽逆轉錄病毒，禽內源性病毒，禽成紅細胞增多癥病毒，禽肝炎病毒，禽貧血癥病毒，禽腸炎病毒，Pacheco病病毒，禽白血病病毒，禽細小病毒，禽輪狀病毒，禽造白細胞組織增生病病毒，禽肌腱膜纖維肉瘤病毒，禽成髓細胞白血癥病毒，禽成髓細胞白血癥相關病毒，禽髓細胞瘤病毒，禽肉瘤病毒，禽脾壞死病毒，及其組合。關于具體的免疫原，活性免疫原性組分還可以是新城疫病毒的HN和F基因，來自感染性粘液囊病病毒的多蛋白和VP2基因，來自感染性支氣管炎病毒的S和N基因，以及來自馬立克氏病病毒的gB和gD基因。這些組分可以用作免疫原性組合物或疫苗組合物，以用于保護禽類不患由這些病原體引起的疾病。備選地，活性免疫原性組分包含來自貓病原體的一種或多種免疫原，所述貓病原體例如為但不限于，貓皰滲病毒(FHV)、貓杯狀病毒(FCV)、貓白血病病毒(FeLV)、貓感染性腹膜炎病毒、貓全白細胞減少癥病毒、貓免疫缺陷病毒(FIV)、狂犬病病毒等，及其組合。活性免疫原性組分還可以包括來自貓皰滲病毒的gB、gC和gD基因，來自FeLV的env和gag/pro基因，來自FIV病毒的env、gag/po1和tat基因，來自貓杯狀病毒的衣殼基因，來自貓感染性腹膜炎病毒的S修飾基因、M和N基因，和來自貓細小病毒的VP2基因。這些組分可以用作免疫原性或疫苗組合物，以用于保護貓不患由這些病原體引起的疾病。活性免疫原性組分可以包括來自馬病原體的一種或多種免疫原，所述馬病原體例如為馬皰滲病毒(1型或4型)、馬流感病毒、馬腦脊髓炎病毒(EEV)、破傷風、西尼羅河病毒等或其組合。活性免疫原性組分還可以包括來自馬皰滲病毒1型的gB、gC、gD和即時早期基因，來自馬皰滲病毒4型的gB、gC、gD和即時早期基因，來自馬流感病毒的HA、NA、M和NP基因，來自東方馬腦炎病毒的基因，來自西方馬腦炎病毒的基因，來自委內瑞拉馬腦炎病毒的基因，來自西尼羅河病毒的prM—M-E基因，以及來自馬動脈炎病毒的基因，但不限于這些序列。這些組分可以用作免疫原性組合物或疫苗組合物，以用于保護馬不患由這些病原體引起的疾病。活性免疫原性組分可以包括來自牛病原體的一種或多種免疫原，所述牛病原體例如為狂犬病病毒、牛輪狀病毒、牛副流感病毒3型(bCPI2-3)、牛冠狀病毒、牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)、口蹄疫病毒(FMDV)、牛呼吸道合胞病毒(BRSV)、感染性牛鼻氣管炎病毒(IBR)、大腸桿菌(^c力er/c力/aco//)、多殺巴斯德氏菌(戶s"ez/re"a鼎/^c/a)、溶血巴斯德氏菌(力ae節7/〃ca)等，及其組合。活性免疫原性組分還可以選自牛皰疹病毒1型的gB、gC、gD和即時早期基因，來自BRSV的F和G基因，來自BVDV的多蛋白、El、E2基因，來自PI3病毒的HN和F基因或來自輪狀病毒的基因。這些組分可以用作免疫原性或疫苗組合物，以用于保護牛不患由這些病原體引起的疾病。進一步地，活性免疫原性組分可以包括來自豬病原體的一種或多種免疫原，所述豬病原體例如為但不限于，豬流感病毒(SIV)、豬圓環病毒2型(PCV-2)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、偽狂犬病病毒(PRV)、豬細小病毒(PPV)、豬痘病毒(HCV)、FMDV、豬肺炎支原體(妙co/7/am2力yo;w7e咖o/7/'3e)、豬紅斑丹毒絲菌(f/7^//7e7oWr/jrr力^/o/7a^/ae)、多殺巴斯德氏菌、支氣管炎博德特氏菌、大腸桿菌等，及其組合。活性免疫原性組分還可以包括來自PRV的gB、gC、gD和即時早期基因，來自豬流感病毒的HA、NA、M和NP基因，來自豬瘟病毒的多蛋白、El、E2,來自PCV2病毒的0RF1和0RF2基因，來自PRRSV病毒的0RF3、0RF4、0RF5、ORF6或ORF7，或來自豬肺炎支原體的基因。這些組分可以用作免疫原性組合物或疫苗組合物，以用于保護豬不患由這些病原體引起的疾病。活性免疫原性組分可以包括編碼在病原體中表達的蛋白質的序列，所述病原體尤其是例如RNA或DNA病毒，如HIV、HCV、HBV、HPV、EBV、HSV、CMV、HTLV、漢坦病毒、埃博拉病毒、馬爾堡病毒、立夫特山谷熱病毒、拉沙病毒和流感病毒、出血性腸炎病毒(HEV)、感染性鼻氣管炎病毒(IBRV)。此類免疫原可以有利地用作免疫原性組合物或疫苗組合物，以保護受試者例如人不患由這些病原體引起的疾病。活性免疫原性組分還可以例如來自下述病原菌中的任何一種及其抗原尤其是放線桿菌屬(Jc"'"o6flCi7/z^)物種例如胸膜肺炎放線桿菌(i4c〃/7o6ac2'/_to/77ez/ro/w7e咖o/^ae)，百曰咳博德特氏菌(e/hpe",i、)，副百曰咳博德特氏菌(5ord"e"a/7ara/ei^z;^/s),支氣管炎博德特氏菌，鳥博德特氏菌("orcre"7/aar/"邁)，>^、目艮衣原、體(C力/3/z^^'fl^rac力o/zw〃s)，肺炎衣原體(C力/諸yd/fl/7/2e咖on/ae)，鶴鷸熱衣原體(C力/緒j^'""'"aci)，克雷伯氏菌屬(iS7e^/e7/a)物種例如肺炎克雷伯氏菌(A7e&/e//a;7/e鵬0/7/ae)，結核分枝桿菌(妙co6a"er/咖tz/6ercw/c^/s)，假結核分枝桿菌(炒co6s"er/咖；7sei/o"6erci//os/s)，肺炎分枝桿菌(妙c06a"er/咖/7/ei/邁o/72'ae)，A群鏈球菌(i^_re/7&coccus)，馬鏈球菌(57re/^oco"f/se《w/)，肺炎鏈球菌(Wre/^ococcz/s/7/ez;/z70i3/ae),無專L鏈球菌(i^re;^ococcwsagfl/ac〃'ae)，酉良腺鏈球菌(5Yre;7tococcws;yoge/7es)，綠色鏈球菌(i^re/7fococcz/s"'r油"s)，淋病奈瑟氏球菌(^ieYsser/sgo/20rr力oe3e),丹毒絲菌屬(^TW;e/o^77力物種，腸產毒性大腸桿菌，霍亂弧菌(r/6r/oc力o/erae),炭癥芽抱軒菌("ac/7/z;sfl/ztAraci's)，^充感嗜血菌(〃<26/0/7力//"^//7/7i/e/2Zae),睡目民嗜血菌(^36邁0/7力////5SOiZM2US)，副豬嗜血菌(〃<3<邁0/7力//"5/7arasi/is)，沙門氏菌屬(Sa7/z7one"a)物種，阿哥納沙門氏菌(&/邊0736//3a^/7fl)，布洛克蘭沙門氏菌(5Wi77o"e//a6/0cir/e7),腸炎沙門氏菌(^s/邁o/2e/7ae/^er/〃d/s),哈達爾沙門氏菌(^s7邊加e77a力adar)，海德爾堡沙門氏菌(^s//z70"e//a^e/cTe/6ei^)，蒙得維的亞沙門氏菌(&//z/o/7e//a邊o/^eWdeo)，森夫頓堡沙門氏菌(A/iPO/7e/7sse/7/7e/36erg),豬霍亂沙門氏菌(5W/Z7aoe"ac力(/er"z/h),立克次氏體屬(A/cire"s/a)物種，幽門螺桿菌(#e//co6a"erA7/0r/)，貓螺桿菌(^"c由"er尸e/")，志賀氏菌屬(W/ge/h)物種，李斯特氏菌屬(Z/Wer/a)物種，肺炎軍團菌(Zeg/o力e7/a;w7ewzzo/7/ae)，假單胞菌屬(尸seu^邁o/7as)物種，疏螺旋體屬(Aorre//a)物種，布氏疏螺旋體(Jore"/a^i^Y/or/eW),腦膜炎奈瑟氏球菌(iVe/sseWaiz/e/7//^/"es)，梭菌屬("o"rW咖)物種，難辨梭菌(C7o"rW咖d//Y7c//e),解脲尿支原體(〃refl/7/as/z7awres/y〃c咖)，葡萄球菌屬(A^a/7力y/ococci/s)物種,金黃色葡萄球菌(^ap力77ococci/saurews),糞腸球菌(f/7terococcws，鼠疫巴斯德氏菌(尸a"ei/re"a戸〃s)，彎曲桿菌屬(C，//o6a"er)物種，空腸彎曲桿菌(C諸/7y/o6a"er乂e乂w/7/),密螺旋體屬(Trepane邁s)物種，鉤端螺旋體屬(丄ep&s;7/ra)物種，白喉棒桿菌(&iy"e6flc^er/iMd/j!7AMeWa)，杜氏嗜血菌(〃e/z70/7力2'/u"ucrey/)，流感嗜血桿菌，埃里希氏體(^r7/c力/a)物種。活性免疫原性組分還可以衍生自真菌或霉菌，例如黃曲霉(y^er^7//z/s/7s7us)，煙曲霉(A;er^777ws/"咖/g"z/s),青霉菌屬(戶e力/c277/咖)物種，鐮刀菌屬(,i^ar/咖)物種，假絲酵母屬(Ca/7心&)物種例如Ca/7d/^"/'c力o/7力7"力，近平滑假絲酵母(CW油para/^/7o"'s)，光滑假絲酵母(Ca/2蘊sg/a6r"a)，杜氏假絲酵母(Ca"&Va^6////e/7s")和白色假絲酵母("6/c)，根霉屬(胸zo萍)物種，隱球酵母屬(C/t—coc，)物種侈'J:ft口新型隱球酵母(Crj7^ococci/s/2eo尸or邊a/7s)，Cr7pf0c0ccus^tw6/厶Ciy/^ococcws^s〃//,巴西富'J球孢子菌(戶aracocc油'o/cfes6ras///e/zs/s),莢膜組織胞漿菌(〃y"0/7/am2ca/^w/"咖)，以及其他真菌和霉菌。活性免疫原性組分還可以選自衍生自寄生蟲物種的寄生蟲抗原，所述寄生蟲物種包括但不限于，尤其是癡原蟲屬(戶7fl^^Z/咖)物種，錐蟲屬(rr/;^i3^咖e)物種，賈第蟲屬()物種，牛蜱屬("00/7力//1^)物種，巴貝蟲屬("a6es/a)物種，內變形蟲屬(^7"2Z7oe&)物種，艾美蟲屬(i57邊eWa)物種，利什曼蟲屬(Zeh力邊a/7")物種，裂體吸蟲屬(&力/Wo^鵬)物種，布魯線蟲屬(Aru^'fl)物種，片形吸蟲屬(尸wc/o/a)物種，惡絲蟲屬("/ro/7/sr/a)物種，吳策線蟲屬(/Twc力erer/a)物種，盤尾絲蟲屬(0"c力ocerca)物種，密if旋體屬物種，弓漿蟲屬(r^o/7/a^zw)物種，隱球酵母屬物種，球蟲亞綱(Cocc/d/a)物種，組織滴蟲屬(^/Wo邁o/2/fls/s)物種，六鞭毛蟲屬(^jra邊/〃as")物種，賈第蟲屬物種；尤其是線蟲類包括蛔蟲屬(hcar/s)物種，旋毛蟲屬(7Wc力/'/7e7/a)物種等，蠕蟲例如吸蟲，絳蟲；以及其他如病原生物。用于制備衍生自病毒、細菌、真菌、霉菌、原生動物、線蟲和蠕蟲的免疫原的方法是本領域已知的。其他有用的免疫原可以是例如純化的分泌的抗原毒力因子，例如毒素、細胞毒素等。可以通過修飾來進行去毒的毒素抗原(類毒素)，其可以與佐劑例如氫氧化鋁組合施用，并且可以用于刺激毒素中和抗體的形成。可以用作免疫原的毒素的例子包括細菌內毒素和外毒素例如脂多糖，腸毒素(包括熱不穩定腸毒素(LT)、熱穩定腸毒素(ST)、Vero細胞毒素(VT)等)。細菌外毒素免疫原被分泌到周圍介質中，并且包括例如白喉毒素(白喉棒桿菌)，破傷風毒素(破傷風梭菌("os"^f/咖fe""/))，由金黃色葡萄球菌分泌的腸毒素，肉毒桿菌毒素(肉毒梭菌("05"22'咖60^///3咖))；和由藻類產生的毒素例如神經毒素；等等。通過細菌自溶而釋放的熱穩定腸毒素包括，例如由革蘭氏陰性霍亂弧菌釋放的霍亂毒素，由腸道細菌例如大腸桿菌產生的大腸菌素(細菌素)。衍生自或來源于病毒、細菌、真菌等的免疫原可以使用合適的培養基或宿主細胞系和本領域普通技術人員眾所周知的常規方法通過體外培養方法來產生。例如，PRRSV可以在合適的細胞系例如MA-104細胞系中進行培養(參見尤其是美國專利號5,587,164;5,866,401;5,840,563;6,251,404)。以類似方式，PCV-2可以使用PK-15細胞系進行培養(參見美國專利號6，391,314);SIV可以在蛋上進行培養(美國專利號6,048,537);和豬肺炎支原體可以在合適的培養基中進行培養(美國專利號5,968,525;5,338,543;RossR.F.等人(1984)Am.J.Vet.Res.45:1899-1905)。有利地，CDV可以在貂肺細胞中進行培養，例如美國專利號5,178,862中描述的那些。用于制備病毒衍生免疫原的其他技術是本領域已知的，并且例如在Ulmer等人，Science259:1745(1993);Male等人，AdvancedImmunology,第14.1—14.15頁，J.B.LippincottCo.，Philadelphia,Pa.(1989)中得到描述。也有用的是模擬抗原肽序列的免疫原性合成肽。此類免疫原可以使用如例如在R.B.Merrifield，Science85:2149-2154(1963)中描述的固相技術來合成，純化，并任選地使用雙官能偶聯劑例如戊二醛等與載體蛋白相偶聯，所述栽體蛋白例如為胞壁酰二肽(MDP)、牛血清白蛋白(BSA)、匙孔血藍蛋白(KLH)等。合成抗原也可以被包括在例如多表位，側翼表位和其他重組或合成衍生抗原的定義內。參見，例如，Bergmann等人(1993)Eur.J.Immunol."，2777-2781;Bergmann等人(1996)J.Immunol."7，3242-3249;Suhrbier，A.(1997)Immunol.CellBiol.7J，402-408;Gardner等人(1998)12thWorldAIDSConference,Geneva,Switzerland,1998年6月28日-7月3日。為了本發明的目的，免疫原性片段通常可以包含分子的至少約3個氨基酸、優選地至少約5個氨基酸、更優選地至少約10-15個氨基酸、和最優選地25個或更多個氨基酸。關于片段的長度沒有嚴格的上限，它可以包含幾乎全長的蛋白質序列，或甚至包含所述蛋白質的2個或更多個、或至少一個表位的融合蛋白。因此，表達表位的核酸的最低限度結構可以包含編碼蛋白質或多蛋白的表位、免疫原或抗原的核苷酸。編更有利地，碼總蛋白質或多蛋白的片段的核酸包含編碼總蛋白質或多蛋白的序列的最低限度約21個核苷酸，有利地至少約42個核苷酸，和優選地至少約57個、約87個或約150個連續或鄰接核苷酸，或基本上由所述核苷酸組成，或由所述核苷酸組成。無需過度實驗，可以在本發明的實踐中使用表位測定操作程序例如，產生重疊肽文庫(HemmerB.等人(1998)ImmunologyToday"〃入163-168)、Pepscan(Geysen等人(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USAW，3998-4002;Geysen等人(1985)Proc.Nat.Acad.Sci.USA《2，178-182;VanderZeeR.等人(1989)Eur.J.Immunol."，43-47;GeysenH.M.，(1990)SoutheastAsianJ.Trop.Med.PublicHealth"，523—533;MultipinPeptideSynthesisKitsdeChiron)和算法(DeGrootA.等人(1999)Nat.Biotechnol.533-561)，以及在PCT申請序列號PCT/US2004/022605中；所有所述參考文獻通過提及整體合并入本文。方法，還可以參考本文引用和合并入的其他文獻。在本發明中，活性免疫原性組分還可以包括治療劑、細胞因子、毒素、免疫調節劑、蛋白質、肽、抗體、抗體的抗原結合片段、佐劑、或可由DNA編碼并且對于遞送給動物或動物細胞或組織來說所希望的任何其他分子。本發明還考慮了在本發明的免疫原性組合物和疫苗組合物中包括反義、催化性或小干擾RNA種類，其可以靶向地針對存在于受者細胞內，或可能存在于受者細胞內的任何分子。這些包括但不限于，編碼細胞調節分子例如白介素-6的RNA種類，癌癥致病因子例如人乳頭瘤病毒，酶，病毒RNA和病原體衍生的RNA，例如HIV-1RNA。RNA還可以靶向非轉錄的DM序列，例如啟動子或增強子區，或者靶向受者細胞中存在的任何其他分子，例如但不限于，參與DNA合成的酶或tRNA分子。此外，細胞因子和免疫調節劑可以在本發明的免疫原性組合物和疫苗組合物中共表達。例子包括但不限于，IL-2、IL-4、TNF-a、GM-CSF、IL-IO、IL-12、IGF-1、IFN-a、IFN-p和IFN~y。可以將特異性的序列基序例如RGD基序插入到病毒或質粒載體的H-I環內，以增強其感染性。該序列已顯示是某些細胞外基質和粘著蛋白與稱為整聯蛋白的細胞表面受體超家族相互作用所必需的。RGD基序的插入可以有利地在無免疫應答的受試者中是有用的。通過將特異性抗原或免疫原或其片段克隆到任何載體例如本文描述的那些中可以構建重組載體。所述重組載體可以用于轉導脊推動物的細胞以用作免疫劑。(參見，例如，通過提及合并入本文中的美國專利申請序列號10/424,409)。優選地，編碼活性免疫原性組分例如抗原、免疫原和表位的密碼子是"優化的"密碼子，即該密碼子是在即高度表達的犬類基因中頻繁出現的那些，而不是被例如CDV或cPi2常用的那些密碼子。此類密碼子的使用提供了活性免疫原性組分在細胞中的有效表達。在其他實施方案中，例如，當活性免疫原性組分在細菌、酵母或其他表達系統中進行表達時，密碼子使用模式被改變從而關于在其中表達抗原或免疫原的生物中高度表達的基因表現出密碼子偏愛。關于許多物種的高度表達基因的密碼子使用模式在文獻中是已知的(例如，Nakamura等人，1996;Wang等人，1998;McEwan等人，1998)。在某些情況下，可能必需修改編碼序列從而使得它可以與具有合適方向的控制序列連接；即，以維持合適的讀碼框。還可以希望產生所需活性免疫原性組分的突變體或類似物。通過刪除編碼蛋白質的序列的一部分，通過插入序列，和/或通過置換序列內的一個或多個核普酸可以制備突變體或類似物。用于修飾核苷酸序列的技術例如定點誘變在例如Sambrook等人(同上)；DNACloning(同上)；NucleicAcidHybridization(同上)中得到描述。用作根據本發明的活性免疫原性組分的免疫原可以被包含在載體中。此類載體包括但不限于，體內重組表達載體例如核酸載體或質粒(EP申請號1001025;ChaudhuriP，(2001)Res.Vet.Sci.7《255-6)，病毒載體例如但不限于腺病毒載體、痘病毒載體例如雞痘(美國專利序列號5，174，993;5,505,941;和5，766，599)和金絲雀痘病毒載體(美國專利序列號5,756,103)、逆轉錄病毒載體、皰疹病毒載體、基于甲病毒的載體，真菌載體，或細菌載體(大腸桿菌或沙門氏菌屬物種)。在本發明中有用的載體的具體例子在本文中得到描述。載體可以是包含至少一種活性免疫原性組分或其表位或其片段的病毒栽體，有利地禽痘病毒載體。在一個特別有利的實施方案中，禽痘病毒載體是金絲雀痘病毒載體，有利地，減毒的金絲雀痘病毒載體例如ALVAC。減毒的金絲雀痘病毒在美國專利號5,756,103(ALVAC)和W001/05934中得到描述。禽痘病毒載體可以是雞痘病毒載體，有利地，減毒的雞痘病毒載體例如TROVAC。還可以參考涉及減毒的雞痘病毒毒林TROVAC的美國專利號5,766,599。在這點上，可以參考在登記號VR-lll下可從ATCC獲得的金絲雀痘病毒。許多雞痘病毒免疫接種毒林也是可獲得的，例如，由Merial銷售的DIFTOSECCT毒林，和由Intervet銷售的N0BILISVARIOLE疫苗；并且，還可以參考涉及減毒的雞痘病毒毒林TR0VAC的美國專利號5，766，599。也可用于遞送活性免疫原性組分的病毒栽體包括痘病毒，例如痘苗病毒或減毒的痘苗病毒(例如，MVA，其是Ankara疫苗林在雞胚成纖維細胞上傳代超過570次后獲得的修飾的Ankara株；參見SUckl&Hochstein-Mintzel，(1971)Munch.Med.Wschr.i"，1149-1153;Sutter等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89，10847-10851;可作為ATCCVR-15Q8獲得;或NYVAC，參見美國專利號5，494，807，例如討論了NYVAC的構建的美國專利號5，494，807的實施例1-6，以及NYVAC的變異體，其具有從Copenhagen株痘苗病毒基因組中刪除的另外0RF，和將異源核酸編碼序列插入到這種重組體的位點內，還使用匹配的啟動子；也可參見W096/40241)，禽痘病毒或減毒的禽疸病毒(例如，金絲雀痘、雞痘、鴿痘、牛痘、家鴿痘、鶴鶉痘、ALVAC或TROVAC;參見，例如美國專利號5，505，941、5,494,807)，豬痘，浣熊痘，駱駝痘，或粘液瘤病病毒。關于用于產生其重組體以及如何施用其重組體的方法的信息，技術人員可以參考本文引用的文獻和WO90/12882,例如關于痘苗病毒，尤其可以提及美國專利號4,769,330、4,722,848、4,603,112、5,110,587、5，494，807和5，762，938;關于雞痘，尤其可以提及美國專利號5，174，993、5,505,941和US-5，766，599;關于金絲雀痘，尤其可以提及美國專利號5,756,103;關于豬痘，尤其可以提及美國專利號5，382，425;和關于浣熊痘，尤其可以提及WO00/03030。當表達載體是痘苗病毒時，用于待表達的一種或多種核酸的一個或多個插入位點有利地在胸苷激酶(TK)基因或插入位點、血凝素(HA)基因或插入位點、編碼A型內含體(ATI)的區域處，所述核酸編碼活性免疫原性組分例如免疫原、抗原、表位等；還可參見本文引用的文獻，特別是涉及痘苗病毒的那些。在金絲雀痘的情況下，有利地所述一個或多個插入位點是0RFC3、C5和/或C6;還可參見本文引用的文獻，特別是關于金絲雀痘病毒的那些。在雞痘的情況下，有利地所述一個或多個插入位點是ORFF7和/或F8;還可參見本文引用的文獻，特別是涉及雞痘病毒的那些。關于MVA病毒區域的所述一個或多個插入位點有利地如在各種出版物中一樣，包括CarrollM.W.等人(1997)Vaccine""入387-394;StittelaarK.J.等人(2000)J.Virol.，2000，7""，4236-4243;SutterG.等人(1994)Vaccine"〃7入1032-1040;并且，在這點上還應當指出完整MVA基因組在AntoineG.，(1998)Virology244，365-396中得到描述，所述參考文獻使得技術人員能夠使用其他插入位點或其他啟動子。有利地，待表達的核酸可以插入置于特異性痘病毒啟動子的控制下，例如，尤其是痘苗啟動子7.5kDa(Cochran等人(1985)J.Virology30-35)、痘苗啟動子I3L(Riviere等人(1992)J.Virology66，3424-3434)、痘苗啟動子HA(Shida，(1986)Virology，，451-457)、痘苗啟動子42K(CooperJ.A.等人，(1981)J.Virol.，284-94)、牛痘啟動子ATI(Funahashi等人(1988)J.Gen.Virol."，35-47)、痘苗11K啟動子(美國專利號5，017，487)、痘苗啟動子H6(TaylorJ.等人(1988)Vaccine6，504-508;GuoP.等人(1989)J.Virol."，4189-4198;PerkusM.等人(1989)J.Virol."，3829-3836)、或合成的痘苗或痘病毒啟動子。有利地，對于哺乳動物的免疫接種，表達載體可以是金絲雀痘或雞痘載體。以這種方式，可以存在具有有限的或非生產性復制的異源蛋白質的表達。可用于遞送并表達活性免疫原性組分的另一種病毒載體是腺病毒。腺病毒是無包膜的DNA病毒。衍生自腺病毒的載體具有使得它們特別可用于基因轉移的許多特征。重組腺病毒栽體是攜帶一種或多種異源核苷酸序列(例如，2種、3種、4種、5種或更多種異源核苷酸序列)的腺病毒載體。例如，詳細地表征了腺病毒的生物學，該病毒在將其DM引入宿主細胞內方面是極其有效的，該病毒可以感染廣泛多樣的細胞并且具有廣泛的宿主范圍，該病毒可以以大的量并且相對容易地產生，并且該病毒可以通過病毒基因組的早期區1("El")中的缺失而變成復制缺陷的。與例如逆轉錄病毒不同，腺病毒不會整合到宿主細胞的基因組內，能夠感染非分裂性的細胞，并且能夠在體內有效轉移重組基因(Brody等人，1994)。這些特征使得腺病毒成為用于將例如目的異源核酸體內基因轉移到有此需要的細胞、組織或受試者內的吸引人的候選物。包含多重缺失的腺病毒載體是優選的，以增加載體的容納量，并且減少產生可復制腺病毒UCA)的重組可能性。當腺病毒包含多重缺失時，每種缺失在單獨存在時不一定必需產生復制缺陷型腺病毒。只要這些缺失之一使得腺病毒變成復制缺陷的，就可以包括另外的缺失用于其他目的，例如，用于增加腺病毒基因組對于異源核苷酸序列的容納量。優選地，超過一種的缺失阻止功能蛋白質的表達，并且使得腺病毒變成復制缺陷的。更優選地，所有缺失都是將會使得腺病毒變成復制缺陷的缺失。使用腺病毒重組體的本發明的實施方案可以包括El缺陷或刪除的，E3缺陷或刪除的，和/或E4缺陷或刪除的腺病毒載體，或者其中所有病毒基因被刪除的"空"腺病毒載體。腺病毒載體可以包含在El、E3或E4基因中的突變，或者在這些或所有腺病毒基因中的缺失。El突變增加了載體的安全限度，因為El缺陷型腺病毒突變體據說在非許可細胞中是復制缺陷的，并且至少來說是高度減毒的。E3突變通過破壞這樣的機制來增強抗原的免疫原性，腺病毒通過此機制下調I類MHC分子。E4突變通過抑制晚期基因表達來降低腺病毒載體的免疫原性，從而可以允許利用相同栽體進行重復的再次免疫接種。本發明考慮了在E1、E3、E4、E1和E3、以及El和E4中進行了刪除或突變的任何血清型或血清群的腺病毒載體。"空"腺病毒載體是腺病毒載體家族中的最新模型，并且衍生自人腺病毒序列。它的復制需要輔助病毒以及表達Ela和Cre的特定人"3細胞系，這是在天然環境中不存在的條件；該載體失去了所有病毒基因，因此該載體作為疫苗載體是非免疫原性的并且可以進行多次接種以用于再次免疫接種。"空"腺病毒載體還包含36kb空間以用于容納一種或多種目的異源核酸，從而允許將大量抗原或免疫原共遞送到細胞內。因此，本發明中的載體可以是任何合適的重組病毒或病毒載體，包括但不限于，痘病毒(例如，痘苗病毒、禽痘病毒、金絲雀痘病毒、雞痘病毒、浣熊痘病毒、豬痘病毒等)、腺病毒(例如，犬腺病毒)、皰瘆病毒、桿狀病毒、逆轉錄病毒(如在通過提及合并入本文中的文獻之中)；或者載體可以是質粒。本文引用的和通過提及合并入本文中的文獻，除了提供在本發明實踐中有用的栽體的例子外，還可以提供了關于由一種或多種載體表達的其他活性免疫原性組分的來源，所述載體在本發明的穩定化的免疫原性組合物、懸浮液或溶液中，或包括在本發明的穩定化的免疫原性組合物、懸浮液或溶液中。用于表達活性免疫原性組分的元件可以有利地存在于質粒載體中。術語質粒包括任何DNA轉錄單元，其包含根據本發明的核酸以及對于其在所希望宿主或靶的細胞中的體內表達來說所需的元件；并且在這點上，應當指出超螺旋或非超螺旋的環狀質粒以及線性形式，希望在本發明的范圍內。最低限度地，活性免疫原性組分例如抗原、免疫原和表位的表達包含起始密碼子(ATG)、終止密碼子和啟動子，以及任選地還包含多腺苷酸化序列(對于某些載體例如質粒和某些病毒載體例如除痘病毒外的其他病毒載體)。當核酸在栽體中編碼多蛋白片段時，將ATG置于讀碼框的5，末端處，和將終止密碼子置于3，末端處。可以存在用于控制表達的其他元件，例如允許蛋白質的表達、修飾和分泌的增強子序列、穩定化序列和信號序列。核酸"編碼序列"或"編碼特定蛋白質的核苷酸序列"是當置于合適的調節元件的控制下時，在體外或體內被轉錄和翻譯成多肽的DNA序列。編碼序列的邊界由在5，末端處的起始密碼子和在3，末端處的翻譯終止密碼子確定。編碼序列可以包括但不限于，原核生物序列、來自真核inRNA的cDM、來自真核生物(例如，哺乳動物)DNA的基因組DNA序列、和甚至合成的DNA序列。轉錄終止序列通常將位于編碼序列的3，。核酸"控制元件"總的來說指啟動子，RNA剪接位點，核糖體結合位點，多腺苷酸化信號(例如衍生自牛生長激素的多腺苷酸化信號、SV40多腺苷酸化信號)，轉錄終止序列，上游調節結構域，增強子，復制起點(這可以是細菌來源的，例如衍生自細菌栽體例如pBR322，或真核生物來源的，例如自主復制序列(ARS))，包裝信號，可以被包含或不被包含在活性免疫原性組分例如免疫原、抗原或表位的編碼序列中的前導序列。如果包括信號序列，那么它可以是天然的同源序列或異源序列。前導序列可以通過宿主在翻譯后加工中去除。參見，例如，美國專利號4,431,739;4,425,437;4，338，397等，所述專利總的來說提供了編碼序列在宿主細胞中的轉錄和翻譯。并非所有這些控制序列都必須始終存在于重組栽體中，只要所需基因能夠進行轉錄和翻譯。控制序列例如啟動子"指導"編碼序列在細胞中的轉錄，當RNA聚合酶與啟動子結合并且將編碼序列轉錄成mRM時。所得到的mRNA隨后被翻譯成由該編碼序列編碼的多肽。取決于所需水平和組織特異性表達，可以使用各種啟動子/增強子元件。取決于所需的表達模式，啟動子可以是組成型或誘導型的(例如，尤其是金屬硫蛋白啟動子、四環素誘導型啟動子和蛻皮激素誘導型啟動子)。啟動子可以是本來的或異源的，并且可以是天然或合成的序列。在這種背景下，"異源的"描述了這樣的轉錄起始區，所述轉錄起始區在它所引入其內的野生型宿主中未發現。選擇啟動子從而使得它將在一種或多種目的靶細胞或組織中起作用。本發明考慮了腦特異性、肝特異性和肌肉特異性(包括骨骼、心、平滑和/或橫隔特異性)啟動子。哺乳動物和鳥類啟動子也是優選的，特別是犬啟動子。啟動子可以有利地是"早期"啟動子。"早期"啟動子是本領域已知的并且被定義為驅動這樣的基因表達的啟動子，所述基因在不存在蛋白質從頭合成的情況下快速并瞬時表達。啟動子還可以是"強"或"弱"啟動子。術語"強啟動子"和"弱啟動子"是本領域已知的，定。"強"或"弱"啟動子還可以通過其與RNA聚合酶的親和力進行限定。異源基因可以置于啟動子、核糖體結合位點(對于細菌表達)和任選地增強子或操縱子的控制下，從而使得編碼所需蛋白質的DNA序列在由包含所述活性免疫原性組分的載體轉化的宿主細胞或受試者中被轉錄成RNA。控制元件及其他調節序列可以在插入至栽體中之前與編碼序列相連接，所述載體例如為上文描述的克隆載體。備選地，編碼序列可以直接克隆到已包含控制序列和合適的限制位點的表達載體中。更優選地，抗原或免疫原與下述啟動子可操作地連接例如人巨細胞病毒(CMV)主要即時早期啟動子、猿猴病毒40(SV40)啟動子、P-肌動蛋白啟動子、白蛋白啟動子、延伸因子l-oc(EFl-oc)啟動子、PyK啟動子、MFG啟動子或勞斯肉瘤病毒啟動子。其他表達控制序列包括衍生自免疫球蛋白基因、腺病毒、牛乳頭瘤病毒、皰滲病毒等的啟動子。除了任何犬病毒啟動子外，任何哺乳動物病毒啟動子也可以在本發明的實踐中使用。在病毒來源的犬啟動子中，感染性犬皰滲病毒的即時早期基因的啟動子，早期(即，胸苷激酶、DNA解旋酶、核糖核苷酸還原酶)或晚期啟動子，可以在本發明的方法和載體中使用。其他啟動子包括犬腺病毒的El啟動子，以及犬主要組織相容性復合物I啟動子。此外，選擇合適啟動子，所述啟動子使目的抗原或免疫原以足夠高的水平表達，從而誘導或引發針對所述抗原或免疫原的免疫應答，這完全在技術人員的能力范圍內，而無需過度實驗。已推測，用CMV啟動子驅動異源核苷酸轉錄可以導致免疫活性動物中的表達下調(參見，例如，Guo等人，1996)。因此，還優選使抗原或免疫原序列與例如經修飾的CMV啟動子可操作地連接，所述經修飾的CMV啟動子不導致抗原或免疫原表達的這種下調。47本發明的載體還可以包含多接頭或多克隆位點("MCS"),其可以有利地位于啟動子的下游。多接頭提供了用于插入與啟動子序列一起"在框內"的抗原或免疫原分子的位點，導致將啟動子序列與目的抗原或免疫原"可操作地連接"。多克隆位點和多接頭是本領域技術人員眾所周知的。本文描述的載體還可以包含抗生素抗性基因。可以摻入本發明的栽體內的此類抗生素抗性基因的例子包括但不限于，尤其是氨節青霉素、四環素、新霉素、zeocin、卡那霉素、博來霉素、潮霉素、氯霉素。在其中存在超過一種抗原或免疫原的實施方案中，抗原或免疫原序列可以與單個上游啟動子和一種或多種下游內部核糖體進入位點(IRES)序列(例如，小RNA病毒EMCIRES序列)可操作地連接。IRES序列允許從單個mRM序列進行2個或更多個編碼序列的多順反子翻譯。本發明的栽體隨后可以用于轉化合適的宿主細胞或受試者。許多哺乳動物細胞系是本領域已知的，并且包括可從美國典型培養物保藏中心(ATCC)獲得的永生化細胞系，例如但不限于，中國倉鼠卵巢(CH0)細胞、HeLa細胞、幼倉鼠腎(BHK)細胞、猴腎細胞(COS)、人肝細胞癌細胞(例如，HepG2)、馬-達二氏牛腎("MDBK")細胞、馬-達二氏犬腎("MDCK")細胞，以及其他。類似地，細菌宿主例如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌(AflC/7/MSi/6〃/2'"、沙門氏菌屬物種、志賀氏菌屬物種和鏈球菌屬物種，將可用于本發明中。在本發明中有用的酵母宿主尤其包括，釀酒酵母(5^"力ar,cescere"、/ae)、白色假絲酵母、麥芽糖假絲酵母(Ca/7^Va鵬〃osa)、多形漢遜酵母(^/7se/u/a;7o/戸,力a)、脆壁克魯維酵母(i7""er咖yces/Vag/7/"、乳酸克魯維酵母(r/w/rero/z^ces/ac〃s)、季也蒙畢赤酵母(尸/c力/a^/////er邁o/7力7)、巴斯德畢赤酵母(,/c力/a;asfor/s)、栗酒裂歹直酵母(ScA/zosacc力flro/z/yces/o/z/6e)和解月旨耶氏酵母(rarrw/a//po/y〃ca)。在本發明中有用的昆蟲宿主包括但不限于，草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)細胞。備選地，載體可以用于感染培養中的細胞以表達所需基因產物，例如，以產生目的蛋白質或肽。優選地，蛋白質或肽被分泌到介質中并且可以使用本領域已知的常規技術而從其中進行純化。指導蛋白質的直接胞外分泌的信號肽序列是本領域已知的，并且編碼其的核苷酸序列可操作地連接。備選地，可以使細胞裂解，并且可以從細胞裂解物中純化出表達的重組蛋白質。優選地，細胞是脊推動物細胞，更優選地哺乳動物細胞。用于制備和/或施用栽體或重組體或質粒以用于在體內或體外表達本發明基因的基因產物的方法可以是任何所需方法，例如由下述參考文獻公開的方法或與之類似的方法，或者由在下述參考文獻中引用的文獻公開的方法或與之類似的方法美國專利號4,603,112;4，769，330j4，394，448;4，722，848j4,745，051;4，769，3314，945，050;5，494，807j5，514，375j5，744，140;5，744，1415,756，103j5，762，938j5，766，599，5，990,091;5,174，9935，505，941j5，338，683j5，494，807j5，591，639j5，589，4665,677，178j5，591，439j5，552，143j5，580，859;6，130，0666，004，777j6，130,066j6，497，883j6，464，984j6，451，7706，391，314;6,387，376j6，376，473;6,368，603;6，348，1966，306，400;6，228，846，6,221，362j6，217，883j6，207，1666,207，165;6，159，477;6，153，199j6，090，393j6，074，6496，045，803;6，033，670j6，485，7296，103，526j6，224，8826，312，682;6,348，450和6;312，683;1986年10月16日提交的國專利申請序列號920，197;W090/01543;W091/11525;W094/16716;W096/39491;W098/33510;EP265785;EP0370573;Andreansky等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA"，11313-11318;Ballay等人(1993)EMBOJ.4,3861-65;Feigner等人(1994)J.Biol.Chem.269，2550-2561;Frolov等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA夕J，11371—11377;Graham,F.L.(1990)TrendsBiotechnol.《，85-87;Grunhaus等人(1992)Sem.Virol.J，237-52;Ju等人(1998)Diabetologia"，736-739;Kitson等人(1991)J.Virol.",3068-3075;McClements等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA",11414-11420;Moss,B.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA"，11341-11348;Paoletti，E.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA",11349-11353;Pennock等人(1984)Mol.Cell.Biol.《399-406;Richardson(編輯)，(1995)MethodsinMolecularBiology"，"BaculovirusExpressionProtocols,"HumanaPressInc.;Smith等人(1983)Mol.Cell.Biol.，2156-2165;Robertson等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA",11334-11340;Robinson等人(1997)Sem.Immunol.夕，271;和Roizman，B.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA夕J，11307-11312。異源序列在受試者中的表達可以在受試者中導致針對抗原或免疫原的表達產物的免疫應答。因此，本發明的活性免疫原性組分可以在免疫原性組合物或疫苗組合物中使用，以提供誘導免疫應答的手段，所述免疫應答可以是但無需是保護性的。在本發明的背景下使用的分子生物學技術由Sambrook等人(2001)描述。再進一步備選地或另外地，在由本發明所包括的免疫原性或疫苗組合物中，可以從編碼抗原或免疫原的核苷酸序列中刪除編碼跨膜結構域的部分。另外再進一步備選地或另外地，載體或免疫原性組合物可以進一步包含核苷酸序列并在宿主細胞中表達核苷酸序列，所述核苷酸序列編碼異源tPA信號序列，例如哺乳動物tPA，和/或穩定化內含子，例如兔P-珠蛋白基因的內含子II。可以以一定的量給受試者施用載體，以達到對于基因產物(例如，表位、抗原、治療劑和/或抗體)組合物所規定的量。本發明設想了在本文例示的那些之下和之上的劑量，并且對于待施用給受試者的任何組合物，包括其組分，以及對于任何具體施用方法，優選測定毒性，例如通過測定在合適的受試者中的半數細胞培養感染劑量(CCID5。)、致死劑量(LD)和LD5。；以及引發合適應答的組合物的劑量、其中組分的濃度和施用組合物的時機，例如通過血清滴定及其分析，例如通過ELISA和/或血清中和分析。根據技術人員的知識、本公開內容和本文中引用的文獻，此類測定無需過度實驗。包含活的減毒CAV2、活的減毒CDV、活的減毒cPi2和活的減毒CPV，并且包含根據本發明的穩定劑的多價免疫原性組合物和/或疫苗組合物和/或免疫原性懸浮液或溶液，已在本文的實施例中進行測試。這些多價疫苗顯示了關于CDV、cPi2、CAV2和CPV的良好穩定性。這證實了本發明的穩定劑能夠保持CDV、cPi2、CAV2和CPV的生存力和感染性。這還證實了本發明的穩定劑能夠保持除犬副粘病毒外的其他各種病毒，特別是犬細小病毒和犬腺病毒的生存力和感染性。根據本發明的穩定劑還可以用作包含CAV、CPV、CDV或cPi2的單價免疫原性組合物或疫苗組合物。優選地，使1體積的多價懸浮液或溶液(即犬副粘病毒和衍生自除副粘病毒外的其他病原體的至少一種活性免疫原性組分)與l體積的穩定劑相混合。本發明還提供了用于產生包含例如犬副粘病毒的、冷凍千燥的、穩定化的活的減毒免疫原性組合物或疫苗組合物的方法，所述方法包括使穩定化的懸浮液或溶液凍干的步驟，所述穩定化的懸浮液或溶液通過使活的減毒犬副粘病毒懸浮液或溶液與根據本發明的穩定劑相混合而形成。本發明的另一個方面是用于產生冷凍千燥的穩定化的多價免疫原性組合物或疫苗組合物的方法，所述方法包括使穩定化的多價懸浮液或溶液凍干的步驟，所述穩定化的多價懸浮液或溶液包含例如活的減毒犬副粘病毒懸浮液或溶液和衍生自除副粘病毒外的其他病原體的至少一種活性免疫原性組分，與根據本發明的穩定劑相混合。"冷凍干燥"涉及凍干，并且指這樣的方法，即通過其來冷凍懸浮液，這之后通過在低壓下升華來去除水。如本文所使用的，術語"升華，，指組合物的物理性質的變化，其中組合物直接從固態變為氣態而不變成液體。如本文所使用的，"T，g值"被定義為玻璃化轉變溫度，這相應于在其下冷凍的組合物變成玻璃質的溫度。用于使根據本發明的免疫原性懸浮液或溶液冷凍干燥的方法可以包括下述步驟(a)使所述免疫原性懸浮液或溶液與本發明的穩定劑接觸，從而形成穩定化的免疫原性懸浮液或溶液；(b)在大氣壓下使所述穩定化的免疫原性懸浮液或溶液冷卻至低于大約所述穩定化的免疫原性懸浮液或溶液的T，g值的溫度；(c)通過使冰在低壓下升華來干燥所述穩定化的免疫原性懸浮液或溶液(即，初次脫水或升華步驟)；和(d)通過進一步降低壓力并增加所述穩定化的免疫原性懸浮液或溶液的溫度來去除過量的殘留水(即，二次千燥或解吸步驟)。冷卻步驟(b)可以在低于約-40t:的溫度下進行(水冷凍步驟)。通過使冰在低壓下升華來干燥穩定化的免疫原性懸浮液或溶液(c)可以在例如低于或等于約200pbar的壓力下進行，而壓力的進一步降低可以在低于或等于約100jibar的壓力處進行。最后，在過量的殘留水去除(d)期間，穩定化的免疫原性懸浮液或溶液的溫度可以為例如約20匸-約30"C的溫度。冷凍干燥方法還可以用這樣的免疫原性懸浮液或溶液來進行，其包含與根據本發明的穩定劑相混合的活的減毒犬副粘病毒和衍生自除副粘病毒外的病原體的至少一種活性免疫原性組分，以獲得冷凍干燥的穩定化的多價免疫原性或疫苗組合物。冷凍干燥的材料的含濕量可以為約0.5%-約5%w/w,優選地約0.5%-約3%w/w，和更優選地約1.0%-約2.6%w/w。有利地，包含至少一種填充劑的穩定化的免疫原性懸浮液或溶液具有約-36'C至約-30C的高T，g值。高T，g值允許在冷凍方法和/或冷凍干燥方法的水冷凍步驟期間更高的溫度，從而減少活的減毒病毒和活性免疫原性組分對于應激的暴露，避免活性的大量喪失。每個步驟，包括水冷凍及其在初次和二次脫水期間的去除，使在本發明的免疫原性懸浮液或溶液中的生物成分例如病原體經歷機械、物理和生物化學沖擊，所述沖擊對于病原體或生物成分的結構、外觀、穩定性、免疫原性、感染性和生存力潛在地具有不利影響。本發明的穩定劑允許活的減毒病原體如犬副粘病毒的良好的穩定性，并且在冷凍干燥過程中和貯藏期間維持特別是CDV和cPi2的感染性。通過冷凍千燥步驟前的感染性滴度和冷凍干燥的穩定化的免疫原性組合物或疫苗組合物于4C貯藏12個月后的感染性滴度之間的差異可以計算出穩定性。良好的穩定性可以有利地包括僅1.2logl。，和優選地僅1.01og,。的差異。用于測定感染性滴度的方法是本領域技術人員眾所周知的。用于測定感染性滴度的某些方法在本文的實施例中得到描述。此外，通過使用線性回歸計算和/或算法使在貯藏期間的log10滴度和滴定時間點相擬合，也可以估計穩定性。進一步，本發明的穩定劑允許冷凍干燥的軟錠具有良好的外觀，換言之，具有規則的形狀和均勻的顏色。不規則的形狀的特征可以在于存在全部或部分軟錠與容器的底部粘著，并且在翻轉和剪切后保持不動(粘著外觀)。此外，具有線軸形狀的軟錠(線軸外觀)，或沿水平面分開成兩個部分的軟錠(兩分式外觀)，或具有有著不規則小孔的木司(mousse)外觀的軟錠(海綿狀外觀)，或具有容器內的泡沫外觀的軟錠(蛋糖霜外觀)具有不規則的形狀并且不被接受(圖U和IB)。本發明包括了使用根據本發明的穩定劑并且通過上述冷凍干燥方法獲得的穩定化的冷凍干燥的免疫原性組合物或疫苗組合物。在一個實施方案中，冷凍干燥的穩定化的活的減毒免疫原性或疫苗組合物或冷凍干燥的穩定化的多價免疫原性組合物或疫苗組合物包含(i)終濃度為約20%-約50%w/w的至少一種還原性單糖，和(ii)終濃度為約1.5%-約6%w/w的至少一種酸抗氧化劑。在另一個實施方案中，冷凍干燥的穩定化的活的減毒免疫原性或疫苗組合物或冷凍干燥的穩定化的多價免疫原性或疫苗組合物包含(i)終濃度為約20%-約50%w/w的至少一種還原性單糖，(ii)終濃度為約1.5%-約6%w/w的至少一種酸抗氧化劑，和(iii)終濃度為約15%-約70%w/w的至少一種填充劑。根據本發明的穩定化的冷凍干燥的免疫原性組合物或疫苗組合物可以在干燥氣氛中于冷藏溫度和室溫特別是約21C-約35'C，和更特別地約-約25C下進行貯藏。本發明的一個進一步方面提供了試劑盒，其包含含有本發明的冷凍干燥的穩定化的活的減毒免疫原性組合物或疫苗組合物或者冷凍干燥的穩定化的多價免疫原性組合物或疫苗組合物的第一個管形瓶，和含有溶劑的第二個管形瓶。關于其的用途和給受試者的施用，冷凍干燥的穩定化的免疫原性組合物或疫苗組合物可以通過用溶劑再水化來進行重構。溶劑通常是水，例如去礦質水或蒸餾水、注射用水，但還可以包括生理溶液或緩沖液，例如磷酸鹽緩沖溶液(PBS)，或者佐劑，包括但不限于，油包水乳狀液、小棒桿菌(Cory力e6a"er/wzparra/z)、卡介苗、氫氧化鋁、葡聚糖、硫酸葡聚糖、氧化鐵、藻酸鈉、Bacto-Adjuvant、某些合成聚合物例如聚氨基酸和氨基酸共聚物、皂苷、"REGRESSIN"(Vetrepharm、Athens、Ga.)、"AVRI訓E"(N，N-雙十八烷基-N'，『-二(2-羥乙基)-丙二胺)、石蠟油、胞壁酰二肽等。佐劑和佐劑組合物的其他具體例子在本文中得到描述。合適的佐劑包括fMLP(N-甲酰基-甲硫氨酰基-亮氨酰基-苯丙氨酸；美國專利號6,017,537)和/或丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物和/或馬來酸酐與烯基衍生物的共聚物。丙烯酸或曱基丙烯酸聚合物可以是例如與糖或多元醇的聚烯基醚交聯的。這些化合物已知位于術語"卡波姆"下(戶力fli"邁e"i^/7a,第8巻，No.2,1996年6月)。本領域技術人員還可以參考美國專利號2,909,462(通過提及而合并入本文)，所述專利討論了與包含至少3個羥基的多羥基化的化合物交聯的此類丙烯酸聚合物；多羥基化的化合物包含不超過8個的羥基；作為另一個例子，至少3個羥基的氫原子被包含至少2個碳原子的不飽和脂肪族原子團替換。原子團可以包含約2-約4個碳原子，例如乙烯基、烯丙基及其他烯鍵式不飽和基團。不飽和的原子團自身可以包含其他取代基，例如曱基。在名稱Carbopol(NoveonInc.，Ohio,USA)下出售的產品特別適合于作為佐劑使用。它們與烯丙基蔗糖或與烯丙基季戊四醇交聯，關于這個可以提及產品Carbopol974P、934P和971P。關于馬來酸酐與烯基衍生物的共聚物，可以提及的是EMA⑧產品(Monsanto),它是馬來酸酐與乙烯的共聚物，它可以是線性或交聯的，例如與二乙烯基醚交聯。此外，還可以參考美國專利號6，713，068和Regelson，W.等人，1960;(通過提及而合并入本文)。包含季銨鹽的陽離子脂質在美國專利號6,713,068中得到描述(所述專利的內容通過提及而合并入本文)也可以在本發明的方法和組合物中使用。在這些陽離子脂質中，優選的是DMRIE(N-(2-羥乙基)-N，N-二甲基-2，3-二(十四烷氧基)-l-丙烷銨；W096/34109)，有利地與中性脂質結合，有利地與DOPE(二油酰-磷脂酰乙醇胺；BehrJ.P.等人，1994)結合從而形成DMRIE-DOPE。在重構的即注型(ready-to-inject)本發明免疫原性組合物或疫苗組合物中的組分總含量可以用于提供等滲濃度的注射液，例如，在約100-600m0sm內，一般地在約250-450m0sm內，和優選地約330mOsm。在冷凍干燥的穩定化的免疫原性組合物或疫苗組合物中或在重構的即注型免疫原性組合物或疫苗組合物中的活的減毒病原體特別是CDV和cPi2的劑量，可以為約102-約107CCID5。/劑。關于在冷凍干燥的穩定化的多價免疫原性組合物或疫苗組合物中或在重構的即用型多價免疫原性組合物或疫苗組合物中的蛋白質、多肽或糖蛋白，在滅活前可以為約105-約109CCID5。/劑，優選地約106-約108CCIDs。/劑的等價滴度。重構的即用型免疫原性組合物或疫苗組合物可以通過經由腸胃外或粘膜途徑的注射，優選地肌內和皮下注射施用給動物。然而，此類表皮、局部或口部施用。用于注射的劑量體積可以為約0.1ml-約2.0ml，并優選地約1.0ml。本發明現在將通過下述非限制性實施例進一步描述，所述實施例為了舉例說明本發明的各種實施方案而給出并且不意欲以任何方式限制本發明。實施例實施例1:穩定劑的制備穩定劑的組成和穩定劑中組分的量顯示于表l中。"葡聚糖"包括具有40，000Da的分子量的葡聚糖-40,000。表l:穩定劑的組成<table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>對于每種穩定劑，在攪動下將1升蒸餾水加熱至約55X:的溫度。以促進其溶解。在最后一次添加后維持攪動約30分鐘，從而導致獲得均質的溶液。然后使溶液冷卻至室溫。溶液冷卻后，穩定劑通過經由具有0.22的孑L徑截止值的過濾器(OptiscaleDurapore)進行無菌過濾來滅菌。然后，將穩定劑F2、F2B、F6B、F33、F37、A、H、K和U的滅菌溶液貯藏于室溫。實施例2:冷凍干燥方法將實施例1中獲得的每種穩定劑用于使病毒懸浮液穩定化。在室溫和攪動下，將4體積的穩定劑加入至6體積的4種活的減毒犬病毒的混合物中。所述活的減毒犬病毒是犬副流感病毒2型(cPi2)、犬瘟熱病毒(CDV)、犬腺病毒2型(CAV2)和犬細小病毒(CPV)。這些穩定化的懸浮液的T，g值用差示掃描量熱計(MettlerToledo;Viroflay、France)進行測量并且顯示于表2中。表2:穩定化的懸浮液的T，g值<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>將用所述穩定劑配制的穩定化的懸浮液進一步冷凍干燥。冷凍干燥循環包括3個階段(1)冷凍階段將匯集在小瓶中的穩定化的懸浮液置于冷凍干燥器內，并且通過在大氣壓下與架子接觸進行冷卻，直至它們被完全冷凍。架子的溫度低于或等于約-50匸。(2)升華階段(或初次脫水)將冷凍千燥器中的壓力調整至足夠低的壓力，以獲得水的升華(低于或等于120pbar的壓力)。調節溫度從而使得在低于或等于-22iC的產品溫度下，在升華期間沒有發生融化。將由于升華而產生的蒸汽冷凍到位于真空泵之前的冰冷凝器中。(3)解吸階段(或二次脫水)在升華結束時，當所有的冰從待冷凍干燥的產品中消失時，通過進一步使冷凍干燥器中的壓力再次降低至低于或等于30一ar和通過使溫度增至約30C來消除過量的游離和/或結合的殘留水。冷凍干燥后，使用無菌氮氣破壞真空。隨后將瓶關閉，并從冷凍干燥器中取出。測量每種穩定化的冷凍干燥的疫苗的含濕量，并且顯示于表3中。表3:穩定化的冷凍干燥的疫苗的含濕量<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>實施例3:冷凍干燥后的穩定性研究觀察在如實施例2中所述進行穩定化的懸浮液的冷凍干燥后獲得的冷凍干燥的軟錠，以區分異常的軟錠與具有規則的形狀的那些。包含本發明穩定劑并進一步包含填充劑的冷凍干燥的軟錠(即F2、F2B、F33、A、H、K和U)具有良好的外觀；110個中只有5個含F2穩定劑的軟錠具有粘著外觀(4.5%)。隨后將冷凍干燥的穩定化的疫苗貯藏于+4t:。通過計算對于相同疫苗重復進行的3次滴定的平均滴度來測定冷實施例2中所述進行冷凍干燥后獲得的冷凍干燥的疫苗在lml注射用水中進行再水化。每種疫苗隨后進行稀釋以獲得約-3.8logw至-6.8logu的稀釋物。對于cPi2滴定，將每種稀釋物以50n1/孔的量6次置于滴定平板上，與50ju1抗肝炎抗體的溶液和以150n1濃度為100，000細胞/ml的馬-達二氏犬腎細胞(MDCK細胞)的細胞懸浮液一起。MDCK細胞在補充有2%胎牛血清的F15培養基中進行培養。作為對照，將100jul稀釋物和150jli1MDCK細胞置于相同孔中。將所有滴定斑于37。C保持7天。溫育后，從滴定平板的每個孔中取出上清液并置于具有圓錐形孔的新滴定平板中。將豚鼠紅細胞(Alseversp.)加入至每個包含上清液的孔中。紅細胞溶液的稀釋度在所有孔中都是相同的。于+4C3-4小時后，通過將平板置于白紙上而獲得結果。隨后通過可容易鑒定的粒狀沉淀的存在來檢測病毒攻擊。對于CDV滴定，將每種稀釋物以50n1/孔的量6次置于滴定平板上，與50ji1抗cPi2抗體的溶液和150p1濃度為120，000細胞/ml的VERO細胞(猴腎細胞)的細胞懸浮液一起。Vero細胞在補充有2%胎牛血清的Eagle極限必需培養基(MEM培養基)中進行培養。作為對照，將100nl稀釋物和150plVERO細胞置于相同孔中。將所有滴定斑于37。C保持7天。溫育后，將滴定平板置于顯微鏡下。隨后通過VERO細胞的降解來檢測病毒攻擊。病毒滴度以50%細胞培養感染劑量/毫升(CCID5。/ml)的logn來表示。表4顯示了在冷凍干燥步驟和于4"C12個月的貯藏期后，以logl。CCID5。/ml表示的cPi2和CDV滴度的減少。表4:在冷凍干燥和于4C貯藏12個月后，cPi2和CDV滴度的減少。<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>結果顯示，CDV和cPi2病毒對于在4C下的長貯藏期均具有非常良好的穩定性。對于這些冷凍干燥的穩定化的疫苗中的一些，一式三份地進行CAV2和CPV的滴定。這些滴定的結果作為由3次滴定獲得的平均值的減少在表5中給出，以logl。CCID5。/ml表示，緊在冷凍干燥步驟后和在于4匸3個月的貯藏期(T0+3)后。表5:在冷凍千燥和于4"C貯藏3個月后,CAV2和CPV滴度的減少。<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>研究了穩定劑的各種化合物對于在冷凍干燥步驟期間和之后CDV和cPi2的穩定性的影響。特別地，檢查了非還原性寡糖對于CDV的穩定性的影響。結果在圖2A和表6中通過統計分析而給出。表6:用包含非還原性寡糖的穩定劑進行穩定化的CDV在冷凍干燥步驟結束時(在T0時)的平均滴度和標準差(n=72)。<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>穩定劑中非還原性寡糖的存在對于CDV滴度沒有影響(AN0VAp"值=0.5142)。檢查了還原性單糖對于CDV的穩定性的影響。對結果實施統計分析，并且顯示于圖2B和表7中。表7:用包含還原性單糖的穩定劑進行穩定化的CDV在冷凍千燥步驟<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>如表7和圖2B中所示，穩定劑中還原性單糖的存在對于CDV滴度具有正面影響(ANOVA;=0.0000)。還研究了抗氧化劑化合物對于cPi2的穩定性的影響。在圖3A和3B以及表8和9中，對結果實施統計分析。表8:在冷凍干燥步驟結束時(在T0時)，用含或不含天冬氨酸的穩定劑進行穩定化的cPi2的平均滴度和標準差(n=15)。<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>0.155.410.960.256.090.13表9:在冷凍干燥步驟和于3個月的貯藏期后(在T0+3個月時)，用含或不含天冬氨酸的穩定劑進行穩定化的cPi2的平均滴度和標準差(n=15)。天冬氨酸計數cPi2的平均滴度標準差(%w/v終濃度)(log10CCID5。/ml)054.270.810.154.921.000.255.820.35已發現穩定劑中抗氧化劑化合物的存在對于在冷凍干燥步驟期間和貯藏期間cPi2滴度具有正面影響(ANOVA，0.0000)。實施例4:穩定劑組分的比較研究F2穩定劑(實施例1)用作參照，以測量與其他穩定化的冷凍干燥的制劑相比較，冷凍干燥的疫苗的滴度的下降。這些制劑通過如表10中所示的每種組分的修飾來獲得。穩定劑F63等同于F2，但缺乏抗氧化劑化合物。穩定劑F62等同于F2，但包括苯丙氨酸而不是天冬氨酸。穩定劑F42等同于F2，但包括天冬氨酸單鈉鹽而不是天冬氨酸。穩定劑F32等同于F2，但包括甜菜堿而不是還原性單糖。表10:制劑的組成酸錄儲或變體填，溶劑F63葡萄糖(5%w/v)#f#(5%w/v)葡鱗(10%w/v)錄用水(足量磨ov/v)<table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table>這些制劑已用于使實施例2的疫苗穩定化，并且根據本文描述的方法進行冷凍千燥。冷凍干燥的疫苗在lml注射用水中進行再水化。如實施例3中所做的，通過計算對于相同疫苗重復進行的3次滴定的平均滴度來測定疫苗的cPi2滴度和CDV滴度。對于每種制劑在冷凍干燥過程后測量滴度。以logl。CCID5。/ml表示的這些滴度在表11中給出。表11:用各種制劑穩定化的冷凍干燥/再水化的疫苗在冷凍干燥步驟期間滴度的減少。<table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table>這些結果顯示，抗氧化劑化合物的不存在產生cPi2的滴度的顯著損失。缺乏抗氧化劑效應的氨基酸苯丙氨酸的包含也導致cPi2和CDV的滴度的損失。類似地，抗氧化劑天冬氨酸的單鈉鹽的包含產生cPi2和CDV的滴度的損失。這些結果還證實，還原性單糖的不存在導致cPi2以及CDV的滴度的高度損失。實施例5:穩定化的疫苗在狗中的安全性評估在將某些在實施例2中描述的冷凍干燥的疫苗在無菌注射水中再水化后，將其施用給狗。所述疫苗包含在實施例1中描述的A、H、K和F2B穩定劑。4只年齡3-5個月大的無特定病原體(SPF)的狗和4只年齡3-5個月大的普通狗被隨機分配到具有2只動物的4個組內，其中每個組具有1只SPF狗和1只普通狗。對于每個組，在第0天時用加倍劑量(2ml)的其相應的穩定化的疫苗皮下免疫2只狗。在第14天時，用單劑量(1ml)的相同的穩定化的疫苗皮下免疫狗。觀察了立即的局部反應和立即的全身反應、直腸溫度、局部反應、全身反應和臨床癥狀。在施用后沒有觀察到局部或全身反應。因此，所述穩定化的疫苗的安全性看起來很高。盡管本發明的優選實施方案因此已得到詳細描述，但應當理解，由所附權利要求限定的本發明不受上文說明書中所述的具體細節限制，因為其許多顯而易見的變化是可能的而不背離其精神或范圍。本發明將通過下述經編號的段落進一步描述1.用于冷凍干燥的活的減毒犬瘟熱病毒(CDV)和犬副粘病毒2型(cPi2)免疫原性組合物的穩定劑，其包含至少一種還原性單糖和至少一種酸抗氧化劑化合物，其中所述至少一種酸抗氧化劑化合物包括天冬氨酸、谷氨酸、抗壞血酸或其組合。2.段落l的穩定劑，其中所述至少一種還原性單糖包括葡萄糖、半乳糖、果糖、甘露糖、山梨糖或其組合。3.段落1或2的穩定劑，其進一步包含至少一種填充劑。4.段落3的穩定劑，其中所述至少一種填充劑包括葡聚糖、麥芽糖糊精、聚乙烯吡咯烷酮、羥乙基淀粉或其組合。5.段落l-4中任一項的穩定劑，其進一步包含至少一種糖醇。6.段落5的穩定劑，其中所述至少一種糖醇包括山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、麥芽糖醇或其組合。7.段落1-6中任一項的穩定劑，其進一步包含至少一種非還原性寡糖。8.段落7的穩定劑，其中所述至少一種非還原性寡糖包括海藻糖、蔗糖、棉子糖或其組合。9.段落1-8中任一項的穩定劑，其進一步包含至少一種糖醇和至少一種非還原性寡糖。10.段落9的穩定劑，其中所述至少一種糖醇包括山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、麥芽糖醇或其組合，并且其中至少一種非還原性寡糖包括海藻糖、蔗糖、棉子糖或其組合。11.免疫原性懸浮液或溶液，其包含與段落1-10中任一項的穩定劑相混合的活的減毒副粘病毒，包括CDV和cPi2。12.段落11的免疫原性懸浮液或溶液，其中所述免疫原性懸浮液或溶液是多價免疫原性懸浮液或溶液，其進一步包含衍生自除副粘病毒外的其他病原體的至少一種活性免疫原性組分。13.段落12的免疫原性懸浮液或溶液，其中所述至少一種活性免疫原性組分衍生自包括腺病毒科、細小病毒科、冠狀病毒科、皰滲病毒科、痘病毒科、彈狀病毒科或其組合的病原體。14.段落12或13的免疫原性懸浮液或溶液，其中所述至少一種活性免疫原性組分包括活的減毒犬腺病毒2型(CAV2)和活的減毒犬細小病毒(CPV)。15.段落12-14中任一項的免疫原性懸浮液或溶液，其中所述至少一種活性免疫原性組分包括病毒載體，所述病毒載體包含一種或多種異源免疫原。16.段落12-15中任一項的免疫原性懸浮液或溶液，其中所述至少一種活性免疫原性組分包括質粒載體，所述質粒載體包含一種或多種異源免疫原。17.段落11-16中任一項的免疫原性懸浮液或溶液，其中所述穩定劑包含終濃度為約1%-約5%w/v的至少一種還原性單糖。18.段落11-16中任一項的免疫原性懸浮液或溶液，其中所述穩定劑包含終濃度為約1.5%-約5%w/v的至少一種還原性單糖。19.段落11-16中任一項的免疫原性懸浮液或溶液，其中所述穩定劑包含終濃度為約1.5%-約4%w/v的至少一種還原性單糖。20.段落11-16中任一項的免疫原性懸浮液或溶液，其中所述穩定劑包含終濃度為約2.5%-約3%w/v的至少一種還原性單糖。21.段落11-20中任一項的免疫原性懸浮液或溶液，其中所述穩定劑包含終濃度為約0.1%-約0.3%w/v的至少一種酸抗氧化劑化合物。22.段落11-20中任一項的免疫原性懸浮液或溶液，其中所述穩定劑包含終濃度為約0.1%-約0.25%w/v的至少一種酸抗氧化劑化合物。23.段落11-20中任一項的免疫原性懸浮液或溶液，其中所迷穩定劑包含終濃度為約0.2%w/v的至少一種酸抗氧化劑化合物。24.段落11-23中任一項的免疫原性懸浮液或溶液，其中所述穩定劑包含終濃度為約0.5%-約7.5%w/v的至少一種填充劑。25.段落11-24中任一項的免疫原性懸浮液或溶液，其中所述穩定劑包含終濃度為約1.5%-約5%w/v的至少一種填充劑。26.段落ll的免疫原性懸浮液或溶液，其中所述穩定劑包含終濃度為約0.5%-約5%w/v的至少一種糖醇，和至少一種還原性單糖，條件是所述至少一種還原性單糖和所述至少一種糖醇的終濃度等于或小于約7.5%w/v。27.段落ll的免疫原性懸浮液或溶液，其中所述穩定劑包含終濃度為約0.5%-約5%w/v的至少一種非還原性寡糖，和至少一種還原性單糖，條件是所述還原性單糖和所述非還原性寡糖的終濃度等于或小于約7.5%w/v。28.段落ll的免疫原性懸浮液或溶液，其中所述穩定劑包含終濃度為約0.5%-約5%w/v的至少一種糖醇，終濃度為約0.5%-約5%w/v的至少一種非還原性寡糖，和至少一種還原性單糖，條件是還原性單糖、糖醇和非還原性寡糖的終濃度等于或小于約12.5%w/v。29.段落11的免疫原性懸浮液或溶液，其中所述穩定劑包含(i)終濃度為約1%-約5%w/v的兩種還原性單糖的混合物，(ii)終濃度為約0.1%-約0.3%w/v的至少一種酸抗氧化劑，和(iii)終濃度為約0.5%-約7.5%w/v的至少一種填充劑。30.段落11的免疫原性懸浮液或溶液，其中所述穩定劑包含(i)終濃度為約1%-約5%w/v的至少一種還原性單糖，(ii)終濃度為約0.5%-約5%w/v的至少一種非還原性寡糖，(iii)終濃度為約0.1%-約0.3%w/v的至少一種酸抗氧化劑，和(iv)終濃度為約0.5%-約7.5%w/v的至少一種填充劑，條件是(i)和(ii)的終濃度等于或小于約7.5%w/v。31.段落11的免疫原性懸浮液或溶液，其中所述穩定劑包含(i)終濃度為約1.5%-約4%w/v的至少一種還原性單糖，(ii)終濃度為約O.5%-約2.5%w/v的至少一種非還原性寡糖，(iii)終濃度為約0.1%-約0.25%w/v的至少一種酸抗氧化劑，和Uv)終濃度為約1.5%-約5%w/v的至少一種填充劑，條件是(i)和(ii)的終濃度等于或小于約5%w/v。32.段落11的免疫原性懸浮液或溶液，其中所述穩定劑包含(i)終濃度為約1%-約5%w/v的至少一種還原性單糖，(ii)終濃度為約0.5%-約5%w/v的至少一種糖醇，(Ui)終濃度為約0.1%-約0.3%w/v的至少一種酸抗氧化劑，條件是(i)和(ii)的終濃度等于或小于約7.5%w/v。33.段落11的免疫原性懸浮液或溶液，其中所述穩定劑包含(i)終濃度為約1.5%-約4%w/v的至少一種還原性單糖，(ii)終濃度為約1.5%-約3%w/v的至少一種糖醇，和(iii)終濃度為約0.1%-約0.25%w/v的至少一種酸抗氧化劑，條件是(i)和(ii)的終濃度等于或小于約5%w/v。34.段落11的免疫原性懸浮液或溶液，其中所述穩定劑包含(i)終濃度為約1%-約5%w/v的至少一種還原性單糖，(ii)終濃度為約0.5%-約5%w/v的至少一種糖醇，(iii)終濃度為約0.5%-約5%w/v的至少一種非還原性寡糖，和(iv)終濃度為約0.1%-約0.3%w/v的至少一種酸抗氧化劑，條件是(i)、(ii)和(iii)的終濃度等于或小于約12.5%w/v。35.段落ll的免疫原性懸浮液或溶液，其中所述穩定劑包含(i)終濃度為約1.5%-約4%w/v的至少一種還原性單糖，(ii)終濃度為約0.5%-約5%w/v的至少一種糖醇，(iii)終濃度為約0.5%-約2.5%w/v的至少一種非還原性寡糖，和(iv)終濃度為約0.1%-約0.25%w/v的至少一種酸抗氧化劑，條件是(i)、(ii)和(iii)的終濃度等于或小于約10%w/v。36.用于使段落11-35中任一項的活的減毒CDV和cPi2免疫原性懸浮液或溶液冷凍干燥的方法，其包括(a)使所述懸浮液或溶液與所述穩定劑接觸，從而形成穩定化的免疫原性懸浮液或溶液；(b)在大氣壓下使所述穩定化的免疫原性懸浮液或溶液冷卻至低于大約所述穩定化的免疫原性懸浮液或溶液的T，g值的溫度；(c)通過使冰在低壓下升華來干燥所述穩定化的免疫原性懸浮液或溶液；和(d)通過進一步降低壓力并增加所述穩定化的免疫原性懸浮液或溶液的溫度來去除過量的殘留水。37.段落36的方法，其中步驟(b)中的所述溫度低于約-40X:。38.段落36或37的方法，其中步驟(c)中的所述壓力小于或等于約200pbar。39.段落36或37的方法，其中步驟(d)中的所述壓力小于或等于約100inbar。40.段落36-39中任一項的方法，其中步驟(d)中的所述溫度為約20°C-約30匸。41.段落36-40中任一項的方法，其進一步包括衍生自除副粘病毒外的其他病原體的至少一種活性免疫原性組分。42.段落41的方法，其中所述至少一種活性免疫原性組分衍生自包括腺病毒科、細小病毒科、冠狀病毒科、皰滲病毒科、痘病毒科、彈狀病毒科或其組合的病原體。43.段落41或42的方法，其中所述至少一種活性免疫原性組分包括活的減毒犬腺病毒2型(CAV2)和活的減毒犬細小病毒(CPV)。44.段落41-43中任一項的方法，其中所述至少一種活性免疫原性組分包括病毒栽體，所述病毒載體包含一種或多種異源免疫原。45.段落41-44中任一項的方法，其中所述至少一種活性免疫原性組分包括質粒載體，所述質粒載體包含一種或多種異源免疫原。46.冷凍干燥的穩定化的活的減毒CDV和cPi2免疫原性組合物，其通過段落36-45中任一項的方法產生。47.冷凍干燥的穩定化的活的減毒CDV和cPi2免疫原性組合物,其包含(i)終濃度為約20%-約50%w/w的至少一種還原性單糖，(ii)終濃度為約1.5%-約6%w/w的至少一種酸抗氧化劑，所述至少一種酸抗氧化劑包括天冬氨酸、谷氨酸、抗壞血酸或其組合。48.冷凍干燥的穩定化的活的減毒CDV和cPi2免疫原性組合物，其包含(i)終濃度為約20%-約50%w/w的至少一種還原性單糖，(ii)終濃度為約2%-約6%w/w的至少一種酸抗氧化劑，所述至少一種酸抗氧化劑包括天冬氨酸、谷氨酸、抗壞血酸或其組合，和(iii)終濃度為約15%-約70%w/w的至少一種填充劑。49.冷凍干燥的穩定化的多價免疫原性組合物，其包含活的減毒CDV、活的減毒cPi2和衍生自除副粘病毒外的其他病原體的至少一種活性免疫原性組分，并且包含(i)終濃度為約20%-約50%w/w的至少一種還原性單糖，(ii)終濃度為約1.5%-約6%w/w的至少一種酸抗氧化劑，所述至少一種酸抗氧化劑包括天冬氨酸、谷氨酸、抗壞血酸或其組合。50.段落49或50的多價免疫原性組合物，其中所述至少一種活性免疫原性組分衍生自包括腺病毒科、細小病毒科、冠狀病毒科、皰療病毒科、痘病毒科、彈狀病毒科或其組合的病原體。51.段落49的多價免疫原性組合物，其中所述至少一種活性免疫原性組分包括活的減毒犬腺病毒2型(CAV2)和活的減毒犬細小病毒(CPV)。52.段落49-51中任一項的多價免疫原性組合物，其中所述至少一種活性免疫原性組分包括病毒載體，所述病毒栽體包含一種或多種異源免疫原。53.段落41-52中任一項的多價免疫原性組合物，其中所述至少一種活性免疫原性組分包括質粒載體，所述質粒載體包含一種或多種異源免疫原。54.冷凍干燥的穩定化的多價免疫原性組合物，其包含活的減毒CDV、活的減毒cPi2和衍生自除副粘病毒外的其他病原體的至少一種活性免疫原性組分，并且包含(i)終濃度為約20%-約50%w/w的至少一種還原性單糖，(ii)終濃度為約2%-約6%w/w的至少一種酸抗氧化劑，所述至少一種酸抗氧化劑包括天冬氨酸、谷氨酸、抗壞血酸或其組合，和(iii)終濃度為約15%-約70%w/w的至少一種填充劑。55.段落54的多價免疫原性組合物，其中所述至少一種活性免疫原性組分衍生自包括腺病毒科、細小病毒科、冠狀病毒科、皰滲病毒科、痘病毒科、彈狀病毒科或其組合的病原體。56.段落54或55的多價免疫原性組合物，其中所述至少一種活性免疫原性組分包括活的減毒犬腺病毒2型(CAV2)和活的減毒犬細小病毒(CPV)。57.段落54-56中任一項的多價免疫原性組合物，其中所述至少一種活性免疫原性組分包括病毒載體，所述病毒載體包含一種或多種異源免疫原。58.段落54-57中任一項的多價免疫原性組合物，其中所述至少一種活性免疫原性組分包括質粒載體，所述質粒載體包含一種或多種異源免疫原。59.試劑盒，其包含含有段落46-58中任一項的冷凍千燥的穩定化的免疫原性組合物的第一管形瓶，和含有溶劑的第二管形瓶。60.段落59的試劑盒，其中所述溶劑選自去礦質水、蒸餾水、注射用水、緩沖液和佐劑。權利要求1.用于冷凍干燥的活的減毒犬瘟熱病毒(CDV)和犬副粘病毒2型(cPi2)免疫原性組合物的穩定劑，其包含至少一種還原性單糖和至少一種酸抗氧化劑化合物，其中所述至少一種酸抗氧化劑化合物包括天冬氨酸、谷氨酸、抗壞血酸或其組合。2.權利要求l的穩定劑，其中所述至少一種還原性單糖包括葡萄糖、半乳糖、果糖、甘露糖、山梨糖或其組合。3.權利要求l的穩定劑，其進一步包含(a)至少一種填充劑，或(b)至少一種填充劑，其中所述至少一種填充劑包括葡聚糖、麥芽糖糊精、聚乙烯吡咯烷酮、羥乙基淀粉或其組合，或(c)至少一種糖醇，或(d)至少一種糖醇，其中所述糖醇包括山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、麥芽糖醇或其組合，或(e)至少一種非還原性寡糖，或(f)至少一種非還原性寡糖，其中所述至少一種非還原性寡糖包括海藻糖、蔗糖、棉子糖或其組合，或(g)至少一種糖醇和至少一種非還原性寡糖，或(h)至少一種糖醇和至少一種非還原性寡糖，其中所述至少一種糖醇包括山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、麥芽糖醇或其組合，和其中所述至少一種非還原性寡糖包括海藻糖、蔗糖、棉子糖或其組合。4.免疫原性懸浮液或溶液，其包含與權利要求l的穩定劑相混合的活的減毒副粘病毒，包括CDV和cPi2。5.權利要求4的免疫原性懸浮液或溶液，其中所述免疫原性懸浮液或溶液是多價免疫原性懸浮液或溶液，其進一步包含衍生自除副粘病毒外的其他病原體的至少一種活性免疫原性組分。6.權利要求5的免疫原性懸浮液或溶液，其中(a)所述至少一種活性免疫原性組分衍生自包括腺病毒科、細小病毒科、冠狀病毒科、皰瘆病毒科、痘病毒科、彈狀病毒科或其組合的病原體，或(b)所述至少一種活性免疫原性組分包括活的減毒犬腺病毒2型(CAV2)和活的減毒犬細小病毒(CPV)，或(c)所述至少一種活性免疫原性組分包括病毒載體，所述病毒載體包含一種或多種異源免疫原，或(d)所述至少一種活性免疫原性組分包括質粒載體，所述質粒載體包含一種或多種異源免疫原。7.權利要求4的免疫原性懸浮液或溶液，其中所述穩定劑包含(a)至少一種還原性單糖，其終濃度為約1%-約5%w/v，或約l.5%-約5%w/v,或約l.5%-約4%w/v，或約2.5%-約3%w/v，或約O.1%-約O.3%w/v，或(b)至少一種酸抗氧化劑化合物，其終濃度為約O.1%-約O.25%w/v，或約O.2%w/v,或約O.5%-約7.5%w/v，或(c)終濃度為約1.5%-約5%w/v的至少一種填充劑，或(d)終濃度為約O.5%-約5%w/v的至少一種糖醇，和至少一種還原性單糖，條件是所述至少一種還原性單糖和所述至少一種糖醇的終濃度等于或小于約7.5%w/v。(e)終濃度為約O.5%-約5%w/v的至少一種非還原性寡糖，和至少一種還原性單糖，條件是所述還原性單糖和所述非還原性寡糖的終濃度等于或小于約7.5%w/v，或(f)終濃度為約O.5%-約5%w/v的至少一種糖醇，終濃度為約0.5%-約5%w/v的至少一種非還原性寡糖，和至少一種還原性單糖，條件是還原性單糖、糖醇和非還原性寡糖的終濃度等于或小于約12.5%W/Vo8.權利要求4的免疫原性懸浮液或溶液，其中所述穩定劑包含(a)(i)終濃度為約1。/。-約5%w/v的兩種還原性單糖的混合物，(ii)終濃度為約O.1%-約O.3%w/v的至少一種酸抗氧化劑，和(iii)終濃度為約O.5%-約7.5%w/v的至少一種填充劑，或(b)(i)終濃度為約1%-約5%w/v的至少一種還原性單糖，(ii)終濃度為約O.5%-約5%w/v的至少一種非還原性寡糖，(iii)終濃度為約O.1%-約O.3%w/v的至少一種酸抗氧化劑，和(iv)終濃度為約O.5%-約7.5%w/v的至少一種填充劑，條件是(i)和(ii)的終濃度等于或小于約7.5%w/v，或(c)(i)終濃度為約1.5%-約4%w/v的至少一種還原性單糖，(ii)終濃度為約O.5%-約2.5%w/v的至少一種非還原性寡糖，(iii)終濃度為約O.1%-約O.25%w/v的至少一種酸抗氧化劑，和(iv)終濃度為約1.5%-約5%w/v的至少一種填充劑，條件是(i)和(ii)的終濃度等于或小于約5%w/v，或(d)(i)終濃度為約1%-約5%w/v的至少一種還原性單糖，(ii)終濃度為約O.5%-約5%w/v的至少一種糖醇，(iii)終濃度為約0.1%-約0.3%w/v的至少一種酸抗氧化劑，條件是(i)和(ii)的終濃度等于或小于約7.5%w/v，或(e)(i)終濃度為約1.5%-約4%w/v的至少一種還原性單糖，(ii)終濃度為約1.5%-約3%w/v的至少一種糖醇，和(Hi)終濃度為約O.1%-約O.25%w/v的至少一種酸抗氧化劑，條件是(i)和(ii)的終濃度等于或小于約5%w/v，或(f)(i)終濃度為約1%-約5%w/v的至少一種還原性單糖，Ui)終濃度為約O.5%-約5%w/v的至少一種糖醇，UU)終濃度為約O.5%-約5%w/v的至少一種非還原性寡糖，和(iv)終濃度為約0.1%-約O.3%w/v的至少一種酸抗氧化劑，條件是(i)、(ii)和(Hi)的終濃度等于或小于約12.5%w/v,或(g)(i)終濃度為約l.5%-約4%w/v的至少一種還原性單糖，(ii)終濃度為約O.5%-約5%w/v的至少一種糖醇，(iii)終濃度為約0.5%-約2.5%w/v的至少一種非還原性寡糖，和(iv)終濃度為約O.1%-約O.25%w/v的至少一種酸抗氧化劑，條件是(i)、(ii)和(iii)的終濃度等于或小于約10%w/v。9.冷凍干燥的穩定化的活的減毒CDV和cPi2免疫原性組合物，其包含(i)終濃度為約20y。-約50%w/w的至少一種還原性單糖，(ii)終濃度為約1.5%-約6%w/w的至少一種酸抗氧化劑，所述至少一種酸抗氧化劑包括天冬氨酸、谷氨酸、抗壞血酸或其組合。10.權利要求9的免疫原性組合物，其中包括天冬氨酸、谷氨酸、抗壞血酸或其組合的至少一種酸抗氧化劑(ii)的終濃度為約2%-約6%w/w的包括天冬氨酸、谷氨酸、抗壞血酸或其組合的至少一種酸抗氧化劑，并進一步包含(iii)終濃度為約15。/。-約70%w/w的至少一種填充劑。11.權利要求9的免疫原性組合物，其進一步包含衍生自除副粘病毒外的其他病原體的至少一種活性免疫原性組分。12.權利要求ll的免疫原性組合物，其中所述至少一種活性免疫原性組分(a)衍生自包括腺病毒科、細小病毒科、冠狀病毒科、皰滲病毒科、痘病毒科、彈狀病毒科或其組合的病原體，或(b)包括活的減毒犬腺病毒2型(CAV2)和活的減毒犬細小病毒(CPV)，或(c)包括病毒載體，所述病毒載體包含一種或多種異源免疫原，或(d)包括質粒載體，所述質粒載體包含一種或多種異源免疫原。13.冷凍干燥的穩定化的多價免疫原性組合物，其包含活的減毒CDV、活的減毒cPi2和衍生自除副粘病毒外的其他病原體的至少一種活性免疫原性組分，并且包含U)終濃度為約20%-約50%w/w的至少一種還原性單糖，(ii)終濃度為約2n/。-約6°/。w/w的至少一種酸抗氧化劑，所述至少一種酸抗氧化劑包括天冬氨酸、谷氨酸、抗壞血酸或其組合，和(iii)終濃度為約15%-約70%w/w的至少一種填充劑。14.權利要求13的多價免疫原性組合物，其中所述至少一種活性免疫原性組分(a)衍生自包括腺病毒科、細小病毒科、冠狀病毒科、皰滲病毒科、痘病毒科、彈狀病毒科或其組合的病原體，或(b)包括活的減毒犬腺病毒2型(CAV2)和活的減毒犬細小病毒(CPV)，或(c)包括病毒載體，所述病毒載體包含一種或多種異源免疫原，或(d)包括質粒載體，所述質粒載體包含一種或多種異源免疫原。全文摘要總的來說，本發明涉及免疫學和疫苗工藝學領域。更具體而言，本發明涉及用于冷凍干燥的、活的、減毒的免疫原性和/或疫苗組合物的穩定劑，所述免疫原性和/或疫苗組合物尤其可以包含犬副粘病毒。本發明進一步涉及穩定化的、冷凍干燥的、活的、減毒的免疫原性和/或疫苗組合物，例如犬副粘病毒的免疫原性和/或疫苗組合物，其可以包含這些穩定劑。本發明的其他方面在下述公開內容中得到描述，或由于下述公開內容是顯而易見的，并且在本發明的范圍內。文檔編號A61K39/295GK101312742SQ200680043029公開日2008年11月26日申請日期2006年9月15日優先權日2005年9月16日發明者D·M·拜林-珀普特,N·Y·H·J·詹尼恩申請人:梅瑞爾有限公司