專利名稱::疫苗施用方法、新貓杯狀病毒、及抗貓細小病毒和貓皰疹病毒的動物免疫方法
技術領域:
:本發明涉及提供新的向各種動物施用各種疫苗的方式。本發明公開幾種分離的貓杯狀病毒(felinecaliciviruses,FCV)。還^>開將FCV疫苗呈遞給貓的新方法。本發明還涉及編碼貓杯狀病毒的核酸克隆。涉及FCV衣殼蛋白、活的或死的疫苗、包含衣殼蛋白的亞單位疫苗、核酸疫苗、和包含編碼分離的貓杯狀病毒的衣殼蛋白的核酸的重組病毒載體疫苗。本發明也涉及鑒定可在疫苗組合物的制備中及在診斷感染貓杯狀病毒的貓的試驗中使用的貓杯狀病毒的方法。本發明也提供將新的和老的FCV疫苗施用給貓的新方式。
背景技術:
:杯狀病毒據報道是貓的一種重要的致病因素。可以觀察到多種癥狀,例如發燒、鼻炎、打噴噢、輕微的結膜炎、眼屎、在外鼻孔、口腔粘膜中或在舌上出現皰嚢、肺炎、氣管支氣管炎、腹瀉、肌肉疼痛、離子通道閘門僵直(stiffgate)以及感覺過敏。機會細菌感染常常伴隨FCV感染,這使得治療和痊愈變得復雜化。嚴重的FCV感染可以導致死亡,尤其是在幼貓中。應當注意,這些征候,盡管據報道在天然情況下是常見的,但是在實驗性感染中并不總是顯著的。似乎不同的貓杯狀病毒(FCV)野外毒林在其致病潛力上是不同的,或者與其它病因的共同感染將影響疾病癥狀。抗貓杯狀病毒疫苗已經存在有二十年以上。盡管存在大量的FCV血清型,但是發現某些毒株,例如F9,可以誘導針對廣譜FCV毒抹的抗體。見,J.L.Bittle和W.J.Rubic,Am.J.Vet.Res.37:275-78(1976)。因此,最早的抗貓杯狀病毒疫苗使用的是FCV-F9毒林的修飾的或減毒的形式。見J.L.Bittle和W.J.Rubic的美國專利號3,937,812,在此將其完整地并入作為參考。盡管來自FCV-F9的疫苗和其它商業可獲得的疫苗可以提供對抗許多野外分離林的保護作用,但是事實上這些疫苗并不能阻止所有毒林的感染。而且,由于FCV—直在不斷進化,基于FCV-F9的疫苗防衛越來越少的野外分離林(Lauritzen等,1997,VetMicrobiology,56:55-63)。此外,獸醫從業者也對基于單種血清型的疫苗的效力表現出擔心。實際上,野外研究提示,來源于FCV-F9毒林的疫苗對許多貓杯狀病毒林不能提供充分的免疫力。見例如,N.C.Pederson等,FelinePract.13(1):26-35(1983);S.Dawson等,Vet.Rec.132:346-50(1993)。從業者也對在某些情況下可能在原本健康的動物中引起疾病的修飾活病毒的施用產生了擔心。研究者已經報道,因疏忽將皮下施用的FCV疫苗通過口服途徑給藥導致了急性疾病。見R.C.Povey,FelinePract.7(5):12-16(1977)。因此,對于單獨地或者與其它疫苗組合可以在接種貓后提供期望保護作用的疫苗,一直存在研發興趣。我們在此描述幾種從貓上分離的分離林,并提供一種在免疫的貓中實現廣泛保護作用的手段。資料公開美國專利文獻39378121976年2月Bittle等,39444691976年3月Bittle等44865301984年12月David等,47865891988年11月Rounds等51697891992年12月Bernstein等,52292931993年7月Matsuura等52663131993年11月Esposito等,53386831994年8月Paoletti等54948071996年2月Paoletti等,55590411996年9月Kang等5561064月Feigner月Liscombe55894665656448等5693762月Stewart等5703055月DiCesare571682257258631996年10月Marquet等,55808591996年121996年12月Mond等,55893841996年121996年12月Feigner,56208451997年4月Gould1997年8月Kang等,56937611997年12月Queen1997年12月Queen等,56959281997年121997年12月Feigner,57167841998年21998年2月Wardley,57189011998年2月Wardley1998年3月Daniels等,57285871998年3月Kang1998年9月Acheson等,59773221999年112000年1月Maes等,63552462002年3月5800821月Marks等6010703Kruger等6,534,066Bl2003年3月Poulet等外國專利文獻04843821995年3月EP,W02004/083390其它出版物Burroughs,J.N和Brown,F.,J.Gen.Virol"22,pp.281-285(1974).Clarke和LambdeninJ.Gen,Virol.78:291-301(1997).Griest,N.R.,1979,Diagnosticmethodsinclinicalvirology(第3版),pp.84-85,BlackwellJ.L.Bittle&W.J.Rubic,Am.J.Vet.Res.37:275-78(1976).Lauritzen等,VetMicrobiology56:55-63(1997).Maky,BrianW.J.和Kangro,HillarO.1996,Virologymethodsmanual,pp.35—37,AcademicPress,NewYork.Motin等,Infect.Immun.64:4313-4318(1996).N.C.Pederson等,FelinePract.13(1):26-35(1983).Oglesby,A.S.,等,Virology44,pp.329-341(1971).Poulet等,VeterinaryMicrobiology106:17-31(2005).Poulet等,ArchivesofVirology145:243-261(2000).R.C.Povey,FelinePract,7(5):12-16(1977).S.Dawson等,Vet.Rec.132:346-50(1993).ScientificPublishers,Oxford,UK.Soergel,M.E.,等,Intervirology,5,pp239-244(1975).Yokoyama,N.,等,Vaccine,vol.14,No.17/18,pp.1657-1663(1996).發明概述本發明提供新的貓杯狀病毒林并涉及幾種分離的貓杯狀病毒(FCV)。本發明還公開將疫苗呈遞給動物,尤其是,將FCV呈遞給貓的新方法。本發明也涉及編碼貓杯狀病毒的核酸克隆。涉及FCV衣殼蛋白、活的或殺死的疫苗、包含衣殼蛋白的亞單位疫苗、核酸疫苗、和包含編碼該分離的貓杯狀病毒的衣殼蛋白的核酸的重組病毒載體疫苗。本發明也涉及鑒定可在疫苗組合物的生產中以及在診斷感染了貓杯狀病毒的貓的試驗中使用的貓杯狀病毒的方法。本發明也提供將新的和舊的FCV疫苗施用給貓的新方式。在此還描述使用疫苗治療和免疫動物,尤其是貓,以抵抗FPV或貓細小病毒(也稱作全白細胞減少癥或FPL)以及另一種疾病,FHV或貓皰滲病毒(也稱作貓鼻氣管炎病毒)的方法和材料。以下描述新的疫苗組合,該組合當以本文所述方式呈遞給貓時可以實現FPV和/或FHV疫苗的有效口服/口服以及皮下(subq)/口服遞送。具體地,本發明公開以下用于免疫貓以抵抗貓杯狀病毒的疫苗。FCV-21衣殼蛋白或分離的FCV-21衣殼蛋白,(SEQIDN0:13)及具有至少大約91.2%、95%和99%同一性的序列。包含編碼FCV-21衣殼蛋白或分離的FCV-21衣殼蛋白的核酸序列的DNA疫苗,其中所述DNA包括序列(SEQIDNO:12)和具有至少大約78.7%或79.2%序列同一性和允許保護替代的序列。包含FCV-49衣殼蛋白或分離的FCV-49衣殼蛋白的疫苗,其中所述衣殼蛋白包含來自FCV-49株的蛋白質序列(SEQIDNO:15)或具有至少大約92.7%、95%和99%同一性的序列;其中所述衣殼蛋白以有效的量提供。包含編碼FCV-49衣殼蛋白或分離的FCV-49衣殼蛋白的核酸序列的DNA疫苗,其中所述DNA包括序列(SEQIDN0:14)和具有至少大約78.9%,即79.4%(78.9+0.5),序列同一性和允許保護替代的序列。包含FCV-26391-4衣殼蛋白或分離的FCV-26391-4衣殼蛋白的疫苗,其中所述衣殼蛋白包含來自FCV-26391-4林的蛋白質序列。包含FCV-26391-4衣殼蛋白的疫苗,其中所述衣殼蛋白包括蛋白質序列(SEQIDN0:17)和具有至少大約91.8%、95%和99%同一性的序列。包含編碼FCV-26391-4衣殼蛋白或分離的FCV-26391-4衣殼蛋白的核酸序列的DNA疫苗,其中所述DNA包括序列(SEQIDN0:16)和具有至少大約78.4%,即78.9%(78.4+0.5),序列同一性的序列。疫苗,其中所述多核苷酸選自基本上由SEQIDN0:12、14和16組成的組。該疫苗可以是以下單獨的或者任何組合的形式其中該疫苗含有佐劑,其中該FCV成分是活的,其中該FCV成分是減毒的,其中該FCV成分是滅活的,其中該疫苗可以包括至少一種選自FCV-F9、FCV-LLK、FCV-M8、FCV-255和FCV-228G的其它貓杯狀病毒林。用于免疫貓以抵抗貓杯狀病毒的疫苗,其包含有效產生免疫應答的量的FCV衣殼蛋白核苷酸序列和藥學上可接受的載體,其中所述FCV衣殼蛋白選自與SEQIDNO:13、15或17有93%或更大同一性的多肽,其中該FCV分離林不是213-95林,并且其中該核酸序列與異源啟動子序列可操作連接。用于免疫貓以抵抗貓杯狀病毒的疫苗,其包含選自基本上由SEQIDNO:12、14和16組成的組的FCV衣殼蛋白的核苷酸序列。疫苗,其中所述核苷酸序列為以下任一種形式質粒、重組病毒載體或任何其它核苷酸載體。疫苗,其中重組病毒載體選自貓皰瘆病毒、浣熊痘病毒、金絲雀痘病毒、腺病毒、Semliki森林病毒、Sindbis病毒和痘苗病毒。本發明還描述免疫原性組合物,其包含獸醫學上可接受的賦形劑運載體和分離的FCV林,其中所述FCV林可以與選自本文描述為23、26、41、44和56的單克隆抗體的單克隆抗體結合。在本發明一些形式中,該免疫原性組合物包含獸醫學上可接受的賦形劑運載體和分離的FCV林,其中該FCV株選擇性地與選自本文描述為23、26、41、44和56的單克隆抗體的單克隆抗體結合。這些免疫原性組合物包括其中所述FCV林是滅活的、其中所述FCV林是疫苗、以及其中該組合物包含佐劑的那些組合物。本文描述的疫苗可以包括至少一種選自貓皰滲病毒、貓白血病病毒、貓免疫缺陷病毒、鸚鵡熱衣原體(Chlamydiapssittaci)和貓細小病毒、狂犬病毒和支氣管敗血性鮑特菌(Bordetellabronchiseptica)的其它貓病原體。該疫苗也可以另外地包含佐劑或者與佐劑一起施用。發明詳述本發明提供可以顯著地降低與貓杯狀病毒(FCV)相關的死亡率以及增加FCV疫苗的安全語的免疫接種方案。此外,本發明的免疫接種方案誘導比現有FCV-F9疫苗方案更寬的血清交叉中和譜,由此應提供更好的跨不同貓杯狀病毒林的免疫力。本發明一方面提供使用疫苗免疫動物,尤其是貓,以抵抗貓杯狀病毒的方法。本文還描述了另外兩種貓疾病,FPV和FHV,的新療法。所述方法包括將治療有效量的第一疫苗、第二疫苗施用給貓,并且任選地還可以在如上的120天內或者更經常的是在大約1年后作為每年一次的加強劑給予第三疫苗施用。第一疫苗通過胃腸外途徑(例如,皮下、肌內等)施用。第二疫苗通過口服或口鼻途徑在第一疫苗施用后大約N天施用,而第三疫苗通過胃腸外途徑、口服、或口鼻途徑在第一或第二疫苗施用后大約M天施用。在此,N和M獨立地是3至(包括3和120在內)的整數。也優選N為大約3周以及大約2-4周。此外,在本發明一方面中,某些所述疫苗可以以兩個口服劑量的形式施用而無需第一次胃腸外施用。也建議使用每年一次的加強劑。序列表簡述<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>定義和縮寫"大約",當與可測量的數值變量聯用時,指所給出的該變量的值以及該變量的位于該給出值的實驗誤差范圍內(例如,對于平均值而言在95%置信區間內)的所有值或者位于該給出值的百分之十范圍內的所有值,以范圍大的為準,但是"大約"與周為單位的時間間隔聯用時除外,在此"大約3周,,為17至25天,而大約2至4周為10至40天。"自動免疫"包括用本發明疫苗接種貓而誘導的抗貓病毒的體液免疫和/或細胞介導的免疫。"抗體,,指因針對特定抗原的免疫應答而導致的、能夠與該特定抗原結合的免疫球蛋白分子。免疫球蛋白是血清蛋白質,由具有"恒定區"和"可變區"的"輕鏈"和"重鏈"多肽鏈組成,并基于恒定區的組成而分類(例如,IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)。對給定抗原具有"特異性"的抗體意味著該抗體的可變區能夠專一地識別和結合特定抗原——例如,盡管在衣殼蛋白和其它多肽之間存在局部的序列同一性、同源性或相似性,該抗體仍能夠通過可測量的結合親和力差異而將特定衣殼蛋白與其它已知蛋白區分開。特異性抗體也可以與其它蛋白質(例如,金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)蛋白A或ELISA技術中的其它抗體)通過和抗體可變區外的序列,尤其是,該分子恒定區中的序列的相互作用而發生相互作用。確定抗體的結合特異性的篩選試驗是熟知的。對于此類試驗的全面討論,見Harlow等(編),Antibodies:ALaboratoryManual,第6章(1988)。如果抗體對FCV衣殼蛋白具有特異性,該抗體也可能識別和結合FCV衣殼蛋白的片段。抗體可以使用本領域已知的方法制備。"抗原"或"免疫原,,指含有一個或多個表位(線性的、構象的或兩者)的分子,在該分子接觸個體后將誘導特異于該抗原的免疫應答。表位是抗原中可以與T細胞受體或特異性抗體結合的特定位置,典型地包含大約3個氨基酸殘基至大約20個氨基酸殘基。術語"抗原"指亞單位抗原一一來自與抗原天然聯系的整個生物體的分離和離散的抗原——以及死的、減毒的或滅活的細菌、病毒、真菌、寄生蟲或其它微生物。術語抗原也指抗體,例如抗獨特型抗體或其片段,以及能夠模擬抗原或抗原決定簇(表位)的合成肽4莫擬表位(mimotope)。術語抗原也指在體內表達抗原或抗原決定簇的寡核苷酸或多核苷酸,例如在DNA免疫應用中。"賦形劑"指疫苗中非抗原的任何成分。FELOCELL3是無鸚鷸熱衣原體(Chlamydiapsittaci)的FELOCELL4。FELOCELL4含有修飾的活貓鼻氣管炎(rhiotracheitis)病毒[FHV]、杯狀病毒[FCV-F9]、全白細胞減少癥病毒[FPV]和鷚鷸熱衣原體[FCp]。FELOCELL4A含有修飾的活貓鼻氣管炎病毒[FHV]、杯狀病毒[FCV-21]、全白細胞減少癥病毒[FPV]和鸚鵡熱衣原體[FCp]。FELOCELL4A是無FCV-F9但具有FCV-21的FELOCELL4。FELOCELL3A是無FCV-F9但具有FCV-21的FEU)CEIX3。Felocel1⑧4、Felocel14或FELOCELL4或后面有數字"3"或"4"的這些詞是Felocel1的變體疫苗,Pfizer擁有名稱Felocell的任何變體疫苗。"第一疫苗"、"第二疫苗"、"第三疫苗"等指可分開施用的疫苗,它們可以相同或不同,并且一般可以以任何順序施用。因此,第三疫苗可以在第二疫苗之前或之后施用給個體。與多肽有關的氨基酸序列"同一性"百分數中,"同一性"在本文中定義為為達到最大序列同一性百分數而將候選序列與靶序列比對并在必要時引入缺口之后,在候選序列中與靶標序列中的殘基相同的氨基酸殘基的百分數。序列同一性百分數通過常規方法確定。簡而言之,兩個氨基酸序列使用ClustalW算法(Thompson等,Nuc.Ac.Res.22:4673-4680,1994)和PAM250;f又重矩陣(Dayhoff等,"AtlasofProteinSequenceandStructure.,,NationalBiomedicalResearchFoundation.Washington,DC5:345-358(1978)和程序MegAlign提供的默認參數(DNASTAR,Inc.;Madison,WI)進行比對以優化比對分數。表1-1給出該PAM250權重矩陣表(氨基酸以標準單字母代碼表示)。表1-1CSTPAGNDEQHRKMILVFYWC12S02T-213P-3106A-21112G-310-l1N-410-1002D-500-10124E-500-100134Q-5-1-100-11224H-3_1-10-1-22136R40-10-2-30-1-1126K-500-l-1-21001035M-5-2-1-2-1-3-2-3-2-1-2006I-2-l0-2-1-3-2-2-2-2-2-2-225L-6-3-2-3-2-34-3-2_2-3-3426V-2-l0-10-1-2-2-2-2-2-2-22424F4-3-3-5-5■4-6-5-5-2-5,012-19Y0-3-3-5-3-5-2■4■440■44-2-1-1-27W-8-2-5-6-6-74-7-7-5-32-3■4-5-2-60然后按如下計算同一性百分數相同匹配的總數/[較長序列的長度+為比對兩個序列而引入該較長序列中的缺口數目]x100個體中的"免疫應答"指響應于抗原出現的體液免疫應答、細胞免疫應答、或體液及細胞免疫應答。"體液免疫應答"指由抗體介導的免疫應答。"細胞免疫應答"是由T淋巴細胞或其它白細胞或這兩者所介導的免疫應答,包括細胞因子、趨化因子及由活化的T細胞、白細胞或這兩者產生的類似分子的生成。免疫應答可以使用本領域已知的標準免疫試驗和中和試驗確定。抗原的"免疫學保護量"或"有效產生免疫應答的量"是可以有效地在受體中誘導足以預防或改善因病因(尤其是貓杯狀病毒)感染應答的量。可以誘導體液免疫或細胞介導的免疫或兩者。動物對疫苗組合物的免疫原性應答可以例如間接地通過測量抗體滴度、淋巴細胞增殖試驗,或者直接地通過監測野生型毒林攻擊后的征候和癥狀來評價。疫苗所賦予的保護性免疫可以通過測量,例如臨床征候例如,死亡率、發病率、個體的溫度數值以及整體身體情況及整體健康和表現的減少而評價。該免疫應答可以包含,但不限于,細胞和/或體液免疫的誘導。治療有效的疫苗量可以隨著所用的具體病毒或者貓的情況而改變,并且可以由獸醫從業者確定。"鼻內"施用指通過或者經由鼻將物質例如疫苗引入個體體內,并涉及物質主要通過鼻粘膜的運輸。"分離的",當用于描述任何具體限定的物質,例如,多核苷酸或多肽時,指所迷物質與正常發現該物質例如多肽或核酸所在的最初細胞環境相分離。因此正如本文中所用,僅僅作為例子,使用本發明多核脊酸構建的重組細胞系利用了該"分離的"核酸。備選地,FCV衣殼蛋白或特異的免疫原性片段可以用作疫苗,因此其將被認為是分離的,因為其已經得以鑒定、分離并且相對于其天然可能存在的狀況在一定程度上是純化的。如果該衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段在可以產生該抗原的重組細菌或真核表達栽體中產生,則其纟皮認為以分離的蛋白質或核酸形式存在。例如,用多核苷酸構建的重組細胞系利用了"分離的"核酸。"單克隆抗體"指由單個雜交瘤細胞系產生的抗體,這些抗體均指向特定抗原上的一個表位。用于制備單克隆抗體的抗原可以以分離的病原體蛋白質的形式或者以整個病原體的形式提供。雜交瘤是由雜種細胞組成的克隆細胞系,該雜種細胞通過骨髓瘤細胞和特定的抗體生產細胞融合而形成。一般地,單克隆抗體是小鼠來源的;然而,單克隆抗體也指通過噬菌體展示技術或者等同于噬菌體展示技術的方法產生的或者由非小鼠來源的雜種細胞產生的、抗抗原的特定表位而形成的克隆抗體群。"N天,,,"N"時間間隔或時間段或"M天"位于一個事件之后分別指該事件之后第N天或第M天上的任何時間。例如,在第一疫苗施用后3天用第二疫苗接種個體意味著第二疫苗在第一疫苗施用之后第3天的任何時間施用。該描述常常應用于第一和第二免疫接種之間的時間間隔。典型地,優選的N時間間隔是大約3周,或者17-25天,但大約2-4周或10-40天也是常見的,并且本發明采用3至120天的"N"時間段是有效的。"口服"或"經口"施用指通過或經由口將物質例如疫苗引入個體體內,涉及吞咽或通過口腔粘膜的運輸(例如,舌下或口頰吸收)或這兩者。"口鼻"施用指通過或經由鼻和口將物質例如疫苗引入個體體內,例如將一滴或多滴滴劑置于鼻內時所發生的。口鼻施用涉及與口服和鼻內施用相關的運輸過程。"胃腸外施用,,指通過或經由不包括消化道的途徑將物質例如疫苗引入個體體內。胃腸外施用包括皮下施用、肌內施用、經皮施用、皮內施用、腹膜內施用、眼內施用和靜脈內施用。為了本7>開的目的,胃腸外施用不包括主要涉及通過口、鼻、氣管和肺中的粘膜組織運輸物質的施用途徑。"被動免疫"指通過使用包含抗FCV林或其免疫原性成分或成分的片段的抗體的疫苗免疫接種貓而向貓提供的抗貓杯狀病毒保護作用。"藥學上可接受的"指屬于合理的醫學判斷范圍內的物質,該物質適于與個體組織接觸而不引起過度毒性、激惹、過敏反應等、與合理的收益風險比相稱、并對于其預期用途而言是有效的。"多克隆抗體"指針對特定病原體或抗原產生的混合的抗體群。一般地,該群體含有多組抗體,每一組均針對病原體或抗原的一個特定表位。為了制備多克隆抗體,可以通過接種或感染將整個病原體或分離的抗原引入宿主中,誘導宿主產生抗該病原體或抗原的抗體。"呼吸,,施用指通過或經由吸入霧化的(噴霧化的)物質而將物質例如疫苗引入個體體內。在呼吸施用中,主要的運輸機制涉及通過氣管、支氣管和肺的粘膜吸收霧化的物質,因此其不同于鼻內或經口施用。"單施用劑量"指于同一天或大約同一天施用,即,所有成分在大約l天內施用。這些成分可以在或者可以不在單——個容器中。"特異于",當用于描述本發明抗體時,指本發明抗體的可變區專一地識別和結合特定的病毒林(即,能夠借助于可測量的結合親和力差異而區分特定的FCV衣殼蛋白和其它已知的蛋白質,即使FCV衣殼蛋白和這些多肽之間存在局部的序列同一性、同源性或相似性)。可以理解,特異性抗體也可以與其它蛋白質(例如,金黃色葡萄球菌蛋白A或ELISA技術中的其它抗體)通過和抗體可變區外的序列,尤其是該分子恒定區中的序列相互作用而發生相互作用。確定本發明抗體的結合特異性的篩選試驗是本領域熟知和常規實踐的。對于此類試驗的全面討論,見Harlow等(編)Antibodies:ALaboratoryManual;ColdSpringHarborLaboratory;ColdSpringHarbor,NY(1988),第6章。也可以考慮識別和結合本發明FCV衣殼蛋白片段的抗體,條件是這些抗體對FCV衣殼蛋白具有特異性。本發明抗體可以使用本領域熟知和常規實踐的任何方法制備。"特異的免疫原性片段"指可以由特異于該序列的抗體識別的序列的部分,見下面的詳細定義。"個體"指具有免疫系統的任何動物,包括哺乳動物例如貓。"亞單位疫苗"指包括一個或多個抗原但不是所有抗原的一類疫苗,其中所述的抗原來源于目的病原體(例如,病毒、細菌、寄生蟲或真菌)的抗原或者與目的病原體的抗原同源。此類組合物基本上無完整的病原體細胞或者致病顆粒或者該細胞或顆粒的裂解物。因此,亞單位疫苗可以從自病原體至少部分純化的、或者基本上純化的免疫原性多肽或者其類似物制備。獲得亞單位疫苗中的抗原(一種或多種)的方法包括標準純化技術、重組生產或者化學合成。"TCID5。"指"組織培養物感染劑量",并定義為感染50%的給定批次的接種的細胞培養物所需的病毒稀釋度。可以使用各種方法計算TCID5。,包括本說明書中使用的Spearman-Karber法。對于Spea簡n-Karber法的描述,見B.W.Mahy&H.0.Kangro,VirologyMethodsManual25-46(1996)。"治療有效量"在本公開的上下文中指在接受抗原或疫苗的個體(例如貓)中誘導足以預防或改善因病原體(例如病毒,如FCV、細菌、寄生蟲或真菌)感染所致的疾病征候或癥狀(包括不良健康影響)或其并發癥的免疫應答的抗原或疫苗量。可以誘導體液免疫或細胞介導的免疫或者體液及細胞免疫兩者。動物對疫苗的免疫原性應答可以例如間接地通過測量抗體滴度、淋巴細胞增殖試驗,或者直接地通過監測野生型毒株攻擊后的征候和癥狀而評價。疫苗所賦予的保護性免疫可以通過測量,例如臨床征候(例如死亡率、發病率、個體的溫度數值和整體身體情況及整體健康和表現)的減少來評價。治療上有效的疫苗量可以隨著所用的具體病毒或者個體的情況而變,并且可以由醫師確定。"治療"指逆轉、減輕、抑制該術語所應用的病癥、狀況或疾病的進程,或者預防該病癥、狀況或疾病、或者預防該病癥、狀況或疾病的一個或多個癥狀。"療法"指緊上面定義的"治療"的行為。"疫苗,,指包含抗原的組合物,并且包括以下定義的所謂"亞單位疫苗"。將疫苗施用給個體導致免疫應答。疫苗可以直接地通過任何已知施用途徑,包括胃腸外、經口等,引入個體。第一部分本發明疫苗、病毒林、衣殼蛋白和抗體本發明提供基于活的或死的選自FCV-21、FCV-49和FCV26391-4的FCV林的疫苗。本發明還提供編碼來自本發明FCV林的FCV衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段的核酸疫苗。本發明還提供來源于本發明FCV林的分離的衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段。對于FCV林,產生自衣殼蛋白的抗原決定簇可以誘導良好的免疫應答。在此我們描述和要求保護幾種FCV林,包括密切相關的衣殼蛋白及其變體。具體地,我們描述FCV-21林和蛋白質序列(SEQIDN0:13)及具有91.2%、95%和99%或更高同一性的序列;FCV-49抹和蛋白質序列(SEQIDNO:15)及具有92.7%、95%和99°/。或更高同一性的序列;FCV-26391-4林和蛋白質序列(SEQIDNO:17)及具有91.8%、95%和99%或更高同一性的序列。本發明疫苗一般旨在是免疫貓以抵抗因貓杯狀病毒的毒性林導致的疾病的預防性療法。然而,疫苗也旨在用于治療已經感染了貓杯狀病毒的毒性林的貓。例如,包含通過使用FCV衣殼或其免疫原性成分免疫異源宿主而產生的抗體的疫苗,可用于治療被貓杯狀病毒感染的貓。然而,甚至是提供自動免疫的疫苗,即,包含選自FCV-21、FCV-49和FCV26391-4或其突變體的FCV林或者源于本發明FCV林的衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段的疫苗,當作為抵抗各種疾病的治療性療法給予時也預期有效。因此,通過本發明提供的免疫可以是自動免疫或被動免疫,而疫苗的預期用途可以是預防性的或治療性的。對于本發明疫苗的任一種實施方案,施用途徑包括,但不限于,口鼻、肌內、腹膜內、皮內、皮下、靜脈內、動脈內、眼內、和口服以及經皮、或者通過吸入或者栓劑。優選的施用途徑包括口鼻、肌內、腹膜內、皮內和皮下注射。疫苗可以通過任何手段施用,包括但不限于注射器、霧化器、噴霧器、無針頭注射裝置、或微粒轟擊基因槍(生物轟擊)。對于本發明任一實施方案,疫苗根據待使用的施用模式在藥學上可接受的載體中進行配制。本領域技術人員可以容易地配制包含如下成分的疫苗活的或死的FCV-21、FCV-49或FCV26391-4、源于本發明任何FCV林的衣殼蛋白或其免疫原性片段、編碼FCV-21、FCV-49或FCV26391-4衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段的重組病毒栽體、或編碼源于FCV-21、FCV-49或FCV26391-4的衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段的DNA分子。在優選肌內注射的情況下,優選等滲制劑。一般地,用于等滲的添加劑可以包括氯化鈉、葡萄糖、甘露糖醇、山梨糖醇和乳糖。在特定的情況下,優選等滲溶液例如磷酸鹽緩沖的鹽水。所述配制也可以提供穩定劑,例如明膠和白蛋白。在一些實施方案中,向制劑添加血管收縮劑。根據本發明的藥物制品以無菌及無致熱原的形式提供。然而,本領域技術人員熟知,對于包含本發明疫苗的藥學上可接受的載體,優選的制劑是獲得美國農業部或者等同的外國(例如加拿大或墨西哥或任——個歐洲國家)政府機構所頒布的條例批準用于活貓杯狀病毒疫苗、死貓杯狀病毒疫苗、多肽(抗原)亞單位疫苗、重組病毒載體疫苗、抗體疫苗和DNA疫苗的那些藥學載體。因此,用于商業生產本發明疫苗的藥學上可接受的載體是已經或將要得到美國或外國的適當政府機構批準的載體。疫苗還可以與藥學上可接受的佐劑混合。在本發明疫苗的某些制劑中,疫苗與其它貓疫苗聯合以產生多價疫苗產品,該產品可以針對由其它貓病原體引起的種類廣泛的疾病向貓提供保護作用。目前,貓疫苗的商業生產者以及最終用戶偏愛多價疫苗產品。因此,在一個優選實施方案中,本發明提供可以免疫貓以抵抗貓杯狀病毒以及至少一種其它的貓病原體的多價疫苗,其中所述其它貓病原體優選選自貓皰滲病毒、貓白血病病毒、貓免疫缺陷病毒、貓衣原體和貓全白細胞減少癥病毒。接種貓:在本i明另一實施方案中,給予3苗一系^免疫接種以產生完全而廣泛的免疫應答。當提供一系列免疫接種時,這些免疫接種的提供可以間隔大約1天至4周或更長的時間。在特定實施方案中,給貓在不同位置同時進行接種。關于途徑和施用的其它細節見下面題為"免疫貓以抵抗杯狀病毒的方法,,的章節。疫苗組合物任選地可以包括與疫苗相容的、藥學上可接受的(即,無菌的和無毒性的)液體、半固體或固體稀釋劑,這些稀釋劑可以充當藥學運載體(vehicle)、賦形劑或介質。稀釋劑可以包括水、鹽水、葡萄糖、乙醇、甘油等。等滲劑可以包括氯化鈉、葡萄糖、甘露糖醇、山梨糖醇和乳糖等等。穩定劑包括白蛋白等。本領域已知的任何佐劑均可以用于疫苗組合物中,包括基于油的佐劑,例如,弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑,基于霉菌酸的佐劑(例如,海藻糖二霹菌酸酯),細菌脂多糖(LPS)、肽聚糖(即,胞壁質、粘肽或糖蛋白例如N-Opaca、胞壁酰二肽[MDP]或MDP類似物)、蛋白聚糖(例如,提取自肺炎克雷伯氏桿菌(Klebsiellapneumoniae))、鏈球菌制品(例如OK432)、Biostim(例如,01K2)、EP109942、EP180564和EP231039的"Iscoms"、氬氧化鋁、皂苷、DEAE-葡聚糖、中性油(例如,miglyol)、植物油(例如花生油)、脂質體、?111!>011^@多元醇類。佐劑包括,但不限于,RIBI佐劑系統(RibiInc.)、明鞏、氫氧化鋁凝膠、膽固醇、水包油乳劑、油包水乳劑,例如,弗氏完全和不完全佐劑、嵌段共聚物(CytRx,AtlantaGA)、SAF-M(Chiron,Emeryvi1leCA)、AMPHIGEN佐劑、急脊、QuilA、QS—21(CambridgeBiotechInc.,CambridgeMA)、GPI-OIOO(GalenicaPharmaceuticals,Inc.,Birmingham,AL)或其它皂苷級分、單磷酰脂A、Avridine脂-胺佐劑、來自大腸桿菌(E.coli)的熱不穩定性腸毒素(重組的或者其它形式)、霍亂毒素、或胞壁酰二肽等等。該免疫原性組合物還可以包括一種或多種其它免疫調制劑,例如,白介素、干擾素或其它細胞因子。該免疫原性組合物還可以包括慶大霉素和石克柳汞。盡管可用于本發明上下文的佐劑和添加劑的量和濃度可以容易地由本領域技術人員確定,但本發明考慮組合物包含大約50jug至大約2000jug佐劑以及優選地大約500mg/2ml劑量的疫苗組合物。另一優選實施方案中,本發明考慮疫苗組合物包含大約1|ig/ml至大約60jig/ml抗生素,更優選地小于大約30|ag/ml的抗生素。本發明免疫原性組合物可以根據施用途徑制備為各種形式。例如,可以將免疫原性組合物制備成適于注射使用的無菌水溶液或分散體,或者使用冷凍干燥技術制備成凍干形式。凍干的免疫原性組合物典型地在大約4。C下維持,并且可以在帶有或不帶有佐劑的穩定化溶液,例如,鹽水或/和HEPES中重構(reconstitute)。此外,本發明的免疫原性組合物和疫苗組合物可以包括一種或多種藥學上可接受的載體。本文中,"藥學上可接受的載體"包括任何及所有的溶劑、分散介質、包衣、佐劑、穩定劑、稀釋劑、防腐劑、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲劑、吸收延遲劑等。載體必須在與本發明成分相容并且無害于待免疫的個體這個意義上是"可接受的"。典型地,載體將是無菌的且無致熱原。活疫苗本發明疫苗的一個實施方案中,疫苗包含活的FCV疫苗,其中該FCV成分選自FCV-21、FCV-49和FCV26391-4。由于這些病毒林以無毒性形式分離,故尤其優選用于制備可以刺激貓的免疫系統但不引起疾病的活疫苗。病毒的減毒方法是本領域已知的,包括諸如在適宜細胞系上在細胞培養中連續傳代或者紫外線或化學誘變等方法。滅活疫苗在本發明另一實施方案中,疫苗包含含有選自FCV-21、FCV-49和FCV26391-4的FCV林的滅活的或死的FCV疫苗。滅活疫苗可以通過本領域熟知的方法制備。例如,一旦病毒增殖至高滴度后,本領域技術人員易于明了,可以通過本領域熟知的方法獲得該病毒的抗原性物質。例如,可以通過稀釋、濃縮或提取,獲得該病毒的抗原性物質。可以通過^f吏用福爾馬林、p-丙內酯(betapropriolactone,BPL)或者4吏用Binaryethyleneimine(BEI)處理,或者4吏用本領域已知的其它方法,滅活杯狀病毒。福爾馬林滅活通過將杯狀病毒懸浮液與37%甲醛混合至Q.05%甲醛終濃度而實現。杯狀病毒-甲醛混合物通過在室溫下持續攪拌大約24小時來混合。然后可以通過測試在適宜的貓細胞系例如CRFK細胞上的生長的試驗,檢測該滅活的杯狀病毒混合物中的殘余活病毒。BEI滅活通過將本發明的杯狀病毒懸浮液與0.1MBEI(0.175NNaOH中2-溴-乙胺)混合至最終BEI濃度為lmM而實現。該杯狀病毒-BEI混合物通過在室溫下持續攪拌大約48小時并之后添加1.0M硫代硫酸鈉至終濃度0.lmM而混合。再持續進行2小時的混合。通過測試在適宜的貓細胞系例如NLFK細胞上的生長的試驗,檢測該滅活的杯狀病毒混合物中的殘余活杯狀病毒。上述本發明滅活杯狀病毒與任何一種藥學上的載體混合以制備具有適當劑量水平的滅活病毒疫苗。除了選自FCV-21、FCV-49和FCV26391-4的FCV成分,該滅活疫苗還可以包括至少一種其它的貓杯狀病毒株,此其它的貓杯狀病毒優選地選自FCV-F9、FCV-M8、FCV-255和FCV-2280。在一個優選實施方案中,疫苗還包括用于免疫貓以抵抗一種或多種其它貓病原體的疫苗,其中所述其它貓病原體優選地選自貓皰滲病毒、貓白血病病毒、貓免疫缺陷病毒、貓衣原體和貓全白細胞減少癥病毒。重組疫苗在本發明再一實施方案中,疫苗包含含有編碼此處公開的FCV衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段的核酸的重組病毒載體。在一個特定的實施方案中,重組病毒載體是可以免疫貓以抵抗貓杯狀病毒及貓皰滲病毒兩者的貓皰滲病毒。在另一實施方案中,重組病毒載體包含一種或多種優選選自貓皰療病毒、貓白血病病毒、貓免疫缺陷病毒、貓衣原體和貓全白細胞減少癥病毒、狂犬病毒和支氣管敗血性鮑特菌的抗原。為了制備表達FCV衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段的重組病毒載體,將編碼該衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段的cDM插入病毒載體例如皰滲病毒、痘病毒或腺病毒的基因組中。Wardley等的美國專利號5,716,822描述了將編碼貓杯狀病毒林CFI-68FIV衣殼蛋白的DNA插入貓皰滲病毒胸苦激酶基因中的方法。本發明包括的其它重組病毒載體疫苗包括但不限于腺病毒、腺相關病毒、細小病毒和各種痘病毒載體以表達FCV衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段。本發明尤其包括表達FCV衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段的重組痘病毒載體疫苗,該疫苗根據Paoletti等的美國專利號5,338,683和5,494,807(在該專利文獻中教導了由表達外來抗原的痘苗病毒或金絲雀痘病毒組成的重組病毒載體);Esposito等的美國專利號5,266,313(該專利文獻教導了表達狂犬病毒抗原的重組浣熊痘病毒載體);以及Maes等的美國專利號6,010,703(該專利文獻教導了表達貓皰疹病毒gD或gB抗原的重組浣熊痘病毒載體)之任一中教導的方法制備。對于上述任何重組病毒栽體,編碼FCV衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段的cDNA與真核啟動子(位于編碼該抗原的cDNA的5'末端)以及真核終止信號和Poly(A)信號(位于編碼該抗原的cDNA的3,末端)可操作地連接。在本文中,術語"可操作地連接"指本發明多核苷酸(作為cDNA分子)和含有表達控制序列的多核苷酸(DNA),例如轉錄啟動子和終止序列,在載體或細胞中所處的位置使得該cDNA編碼的抗原的表達受到該表達控制序列的調節。用于克隆DNA例如編碼FCV衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段的cDNA及與其可操作連接的含有表達控制序列的DNA的方法,是本領域熟知的。適用于在重組病毒載體中表達FCV衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段的啟動子的實例是巨細胞病毒立即早期(CMV)啟動子、Rous肉瘤病毒長末端重復(RSV-LTR)啟動子、猿猴病毒40(SV40)立即早期啟動子,和誘導型啟動子例如金屬疏蛋白啟動子。具有終止信號和Poly(A)信號的DNA的實例是SV40的晚期poly(A)區。適用于產生抗原的另一病毒表達系統實例是可從InvUrogen獲得的Sindbis表達系統。這些商業可獲得的表達載體和系統的應用是本領域熟知的。核酸或DNA分子疫苗在本發明再一個實施方案中,提供核酸或DNA分子疫苗形式的疫苗,該疫苗可以在貓中引起自動免疫反應。該DM分子疫苗由具有編碼本文公開的FCV衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段的核酸序列的DNA組成。在一個優選實施方案中,該DNA分子疫苗包含SEQIDNO:l2、14或16的核酸序列、或該核酸序列中編碼SEQIDNO:13、15或17或SEQIDNO:13、15或17的特異的免疫原性片段的片段。編碼衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段的核酸可操作地連接在轉錄啟動子的位置或附近位置。這使得當該核酸被接種入貓細胞中時可以從該核酸實現衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段的轉錄。優選地,DM分子是質粒。可用于DNA疫苗的啟動子是本領域熟知的,包括但不限于RSVLTR啟動子、CMV立即早期啟動子和SV40T抗原啟動子。還優選該核酸在編碼衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段的序列的終止密碼子位置或附近位置可操作地連接至包含轉錄終止信號和poly(A)識別信號的核酸片段上。可以在可接受的藥學載體中或者在脂質或脂質替栽體(類似于Feigner的美國專利號5,703,055中乂^開的那些)中向貓提供DNA疫苗。可以通過各種方法,例如肌內注射、intrajet注射或生物轟擊,將DNA疫苗提供給貓。DNA疫苗的制備方法及其使用方法提供在Feigner的美國專利號5,589,466和5,580,859中。最后,制備藥品級質粒DNA的方法見Marquet等的美國專利號5,561,064中。因此,使用上述方法,可以使用表達FCV衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段的DNA疫苗免疫貓以抵抗毒性貓杯狀病毒。DNA疫苗的優點在于該DNA分子可以方^更地以質粒形式增殖,這是一種簡單而價廉的制備疫苗的方式,而且,由于該疫苗不是活的,故與活重組病毒載體疫苗相關的許多管理問題不成為DNA疫苗的問題。本領域技術人員將明了本發明DNA疫苗可以包含合成產生的核酸,該核酸可以通過本領域熟知的化學合成方法制備。分離的和純化的FCV衣殼蛋白在本發明再一實施方案中,疫苗由分離的和純化的FCV衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段組成。尤其是,其中FCV衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段包含SEQIDNO:13、15、17的氨基酸序列的疫苗。優選地,該衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段在可產生該抗原的重組細菌或真核表達載體中產生,該抗原可以被分離和純化以制備所述疫苗。例如,在微生物例如細菌、酵母或真菌中、在真核細胞例如哺乳動物或昆蟲細胞中、或通過重組病毒載體例如腺病毒、痘病毒、皰滲病毒、Semliki森林病毒、桿狀病毒、謹菌體、Sindbis病毒或Sendai病毒,產生FCV衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段。適用于產生FCV衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段的細菌包括大腸桿菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、或能夠表達異源多肽的任何其它細菌。適宜表達FCV衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段的酵母類型包括釀酒酵母(Saccha濯ycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、假絲酵母(Candida)、或負巨夠表達異源多肽的任何其它酵母。使用上述細菌、真核細胞或重組病毒栽體產生可用于疫苗的抗原的方法是本領域熟知的。為了制備由衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段組成的疫苗,可以將編碼FCV衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段的核酸克隆至質粒中,并使該核酸與能夠在微生物中實現該衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段的表達的啟動子可操作地連接。適宜的啟動子包括但不限于,T7噬菌體啟動子、T3噬菌體啟動子、p-半乳糖苷酶啟動子和Sp6噬菌體啟動子。FCV衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段在微生物中的表達使得可以使用商業上用于制備大量重組抗原性多肽的發酵技術生產該衣殼蛋白。分離和純化抗原的方法是本領域熟知的,包括例如凝膠過濾、親和層析、離子交換層析或離心等方法。為了利于分離FCV衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段,可以制備融合多肽,其中衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段與使得可以通過親和層析進行分離的另一多肽連接。優選地,融合多肽使用以下一種表達系統制備。例如,編碼FCV衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段的cDNA核酸序列在5,末端或3,末端與編碼多肽的核酸連接。這些核酸連接在正確的密碼子閱讀框中從而使得可以產生融合多肽,其中衣殼蛋白化地回收的多肽融合。融合多肽也可以防止抗原在純化過程中-皮降解。盡管包含融合多肽的疫苗是有效的,但是一些情況下可能期望在純化后除去該第二多肽。因此,也可以考慮該融合多肽在抗原和多肽之間的接合位置含有切割位點。該切割位點由氨基酸序列組成,該氨基酸序列可以被特異于該位點處的氨基酸序列的酶所切割。可以考慮的此類切割位點的實例包括腸激酶切割位點(被腸激酶切割)、因子Xa切割位點(被因子Xa切割)、和GENENASE切割位點(被GENENASE切割(GE腿ASE是NewEnglandBiolabs,Beverly,Mass.的商標))。以下是以融合多肽形式或者以無該多肽的分離的抗原形式生產衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段的方法。以融合蛋白形式制備用于疫苗中的FCV衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段的原核表達系統的實例是可獲自AmershamPharmaciaBiotech,Piscataway,N.J.的谷光苷肽S-轉移酶(GST)基因融合系統,該系統使用pGEX-4T-l表達載體質粒。編碼衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段的cDNA在正確的密碼子閱讀框中與編碼GST的DNA融合。該融合多肽的GST部分允許該融合多肽j吏用谷光苷肽Sepharose4B親和層析進行快速純化。純化后,融合多肽的GST部分可以通過使用位點特異性蛋白酶例如凝血酶或因子Xa切割除去而產生無GST多肽的抗原。無GST多肽的衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段可以通過第二輪谷光苷肽Sepharose4B親和層析產生。制備包含FCV衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段的疫苗的另一種方法是將編碼該抗原的cDNA和編碼多組氨酸的DNA密碼子在讀框內連接的方法。該多組氨酸優選地包含6個組氨酸殘基,這允許通過金屬親和層析(優選地,鎳親和層析)純化該融合多肽。為了制備無該多組氨酸的衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段,可以在正確讀框內在編碼多組氨酸的密碼子和編碼抗原的密碼子之間融合切割位點,例如腸激酶切割位點。通過腸激酶的切割,以及隨后第二輪結合游離多組氨酸的金屬親和層析,從該抗原上可以去除掉該多組氨酸。此方法被證實可以用于制備鼠疫耶爾森氏菌(Y.pestis)的LcrV抗原,見Motin等的公開(Infect.Immun.64:4313-4318(1996))。可從Invitrogen(Carlsbad,California)獲得的Xpress系統是可用于制備并之后分離多組氨酸-多肽融合蛋白的商業試劑盒的實例。再一可用于制備包含FCV衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段的疫苗的方法利用了Motin等,Infect.Immun.64:3021-3029(1995)公開的方法。Motin等公開了編碼融合多肽的DNA,該DNA由與編碼蛋白A部分的DM連接的抗原編碼DNA組成,其中編碼腸激酶切割位點的DNA在正確密碼子閱讀框中被置于編碼蛋白A的DNA和編碼抗原的DNA之間。蛋白A使得該融合蛋白可以通過IgG親和層析分離,并且無蛋白A的衣殼蛋白可以通過使用腸激酶切割而產生。然后可以通過第二輪IgG親和層析去除蛋白A。制備包含FCV衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段的疫苗的另一方法基于Daniels等的美國專利號5,725,863中^^開的方法(在此完整并入作為參考)。Daniels等的方法可以用于制備由腸毒素分子組成的FCV衣殼疫苗,其中每個分子在FCV衣殼蛋白的100個氨基酸的上游插入其中。可以用于制備本發明疫苗的其它融合多肽疫苗制備方法公開在美國專利號5,585,100(Mond等)和美國專利號5,589,384(Liscombe)。最后,可從NewEnglandBiolabs獲得的pMAL融合及純化系統是融合多肽制備方法的另一實例,其中麥芽糖結合蛋白與衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段融合。該麥芽糖結合蛋白利于該融合多肽通過直鏈淀粉親和層析而分離。該麥芽糖結合蛋白可以與抗原通過一種以上提及的切割位點連接,由此該切割位點將使得可以制備無該麥芽糖結合蛋白的該抗原。盡管可以使用細菌方法制備用于疫苗的FCV衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段,但可能期望在真核表達系統中產生衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段。一個尤其有用的系統是Matsuura等的美國專利號5,229,293中公開的桿狀病毒表達系統(完整地并入此處作為參考)。適于產生衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段的桿狀病毒表達載體是來自Stratagene的pPbac和pMbac;和可獲自Invitrogen(Carlsbad,Calif.)的Bac-N-Blue載體、pBlueBac4.5載體、pBlueBacHis2-A,B,C和pMelBac。可用于表達在疫苗中使用的FCV衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段的另一真核系統是酵母表達系統,例如可從Stratagene獲得的ESP酵母蛋白表達和純化系統。另一酵母表達系統是來自Invitrogen的任何一種基于畢赤酵母(Pichia)的表達系統。哺乳動物表達系統也在本發明范圍內。哺乳動物表達系統的實例是Stratagene的LacSwithII系統、pBK噬菌粒、pXTl載體系統和pSG5載體系統;可從Promega公司(Madison,Wis.)獲得的pTargeT哺乳動物表達載體系統、pSI哺乳動物表達載體、pCI哺乳動物表達載體和pAdVantage載體;和可從Invitrogen獲得的蛻皮激素誘導型哺乳動物表達系統、pCDM8、pcDNAl.1和pcDNAl.1/Amp。本發明還包括由包含作為熱穩定性孢子遞送系統的成分的FCV衣殼蛋白或該衣殼蛋白的特定表位的疫苗組成的實施方案,其中所述遞送系統根據Acheson等的美國專利號5,800,821中教導的方法(完整地并入作為參考)制備。因此,本發明提供含有編碼FCV衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段的核酸的遺傳工程細菌細胞。當將重組細菌孢子疫苗通過口服施用給貓時,孢子在貓的胃腸道中萌發,并且該細菌表達衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段,該衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段與貓的免疫系統發生接觸并引發免疫應答。該疫苗具有熱穩定的優點;因此,可以在室溫下無限期的貯存。-皮動免疫疫苗盡管本發明上述實施方案提供了抗貓杯狀病毒的自動免疫,但本發明還包括提供對貓杯狀病毒的被動免疫力的疫苗。引發抗貓杯狀病毒的被動免疫的疫苗由抗FCV衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段或整個FCV病毒的多克隆抗體或單克隆抗體組成。為了制備包含多克隆抗體的被動免疫疫苗,可以將FCV衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段注射入適宜宿主中以產生這些抗體,優選地,所述宿主是馬、豬、兔、綿羊或山羊。從這些宿主產生多克隆抗體疫苗的方法是本領域熟知的。例如,可以將衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段或整個杯狀病毒FCV衣殼與佐劑例如弗氏完全佐劑或可從CytRx公司(Norcross,Ga.)獲得的毒性較低的TiterMax混合,然后通過本領域熟知的方法施用給宿主。監測抗體的產生,當已經產生了足夠抗體后,從宿主取出血清,并優選地從血清中回收該抗體。被動免疫疫苗可以包含抗FCV衣殼蛋白或整個FCV病毒的一個或多個表位的一種或多種單克隆抗體。用于生產單克隆抗體的方法和雜交瘤是本領域熟知的。盡管可以使用雜交瘤技術制備單克隆抗體,但是也可以根據噬菌體展示方法例如Marks等的美國專利號5,977,322體。可以根據已經用于使抗體人源化的方法,例如Queen等的美國專利號5,693,762和5,693,761(完整地并入此處作為參考)公開的方法,制備抗衣殼蛋白或其部分的貓源化抗體。一種可用于制備單克隆抗體的喧菌體展示試劑盒是可從AmershamPharmaciaBiotech獲得的重組嗟菌體抗體系統。多克隆和單克隆抗體本發明還包括、描述、和要求保護幾種非常重要的單克隆抗體。這些抗體在此研發以便快速地鑒定以及在一些情況下定義本文描述的病毒林。單克隆抗體的具體實例及其描述可以見以下實施例。尤其參見實施例1-2和表1-2,并特別參見實施例1-8,表1-4。以下實施例旨在促進而非限制對本發明的進一步理解。第1部分實施例實施例1-1.FCV-21的分離生長貓杯狀病毒(FCV)21林(FCV-21)于1993年6月自Michigan州AnnArbor的貓展示會上收集。將其稀釋在含有1%培養基的96孔微量管中,制成1:10稀釋液。將lOOju1該稀釋的樣品加入96孔板中的100ja1CRFK細胞中。通過在96孔板中有限稀釋,將該FCV-21病毒純化3次。自最終純化物獲取病毒上清液,用于感染于T25燒瓶中生長至75%匯合度的CRFK細胞。當觀察到100%CPE時,凍/融上清液三次,并等分至冷凍瓶(lml/瓶)。該病毒原液的滴度經測定是1.5x108TCID5。/ml。FCV-21保藏在美國典型培養物保藏中心(ATCC)(10801UniversityBlvd.,Manassas,VA,20110,USA),ATCC保藏號為PTA-。實施例1-2.使用各種商業或現有單克隆抗體對FCV-21進行的免疫焚光和ELISA分析對于免疫熒光分析試驗(IFA),使用FCV-21的病毒原液感染接種在24孔板中生長至大約90%匯合度的NLFK細胞。感染后大約20小時,用lxPBS洗滌板子2次,并用80%丙酮固定。將各種單克隆抗體稀釋至大約2jig/n1,并加入板子的各孔中(0.2ml/孔)。振蕩下室溫(RT)孵育1小時后,用1xPBS洗滌每孔2次,加入二抗(抗小鼠FITC,10lug/ml)。用鋁箔覆蓋板子并振蕩下RT孵育30分鐘后,用lxPBS洗滌每孔2次,并空氣干燥。然后在熒光顯微鏡下觀察每孔的FITC染色強度。對于ELISA試驗,用200m1以1:1500稀釋在碳酸鈉緩沖液(1.59g血20)3和2.93gNaHC0"溶解在1升水中)中的抗FCV兔多克隆抗體(Pfizer#16)包被96孔ELISA板。4。C過夜孵育板子。用含有0.05%Tween-20的1xPBS(pH7.4)(PBST)洗滌板子3次,然后用200ju1于PBST中的1%酪蛋白37C封閉1小時。將各種單克隆抗體稀釋至大約0.1jug/ml并加至各孔(100ju1/孔)。每種樣品進行一式三份試驗。37。C溫育l小時后,用PBST將每孔洗滌3次,并與100jall:200稀釋的過氧化物酶綴合的AffiniPure山羊抗小鼠IgG(H+L)(JacksonI,noResearch,cat.No.715-035-150)—起37C溫育1小時。然后用PBST洗滌每孔3次,之后向每孔加入100n1ABTS過氧化物酶底物(KPL,Gaithersburg,Maryland,cat.No.50-66-18)。RT大約IO分鐘后,使用ELISA讀數器于405-490nm(雙波長)讀板。基于信/噪比計算比活性。來自IFA和ELISA試驗的數據集彼此良好地相關(表l-2),說明FCV-21與F9(通常使用的FCV疫苗抹)在免疫學上是不同的。兩種單克隆抗體(FCVl-43和MAB791P)與F9反應,但不與FCV-21反應(表1-2)。<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>實施例1-3.FCV-21衣殼序列分析從FCV-21感染的細胞培養物上清液使用TRIzol試劑(Invitrogen;Carlsbad,CA)分離總RNA。4吏用隨才幾引物和SuperscriptII逆轉錄酶(Invitrogen)合成"第一鏈,,cDNA制備物。<吏用XLrTth聚合酶(AppliedBiosystems;FosterCity;CA)和寡核苷酸引物DEL-653(SEQIDNO:l)和DEL-651(SEQIDNO:2),進行PCR反應。使用BigDye化學和ABI377遺傳分析儀對所得PCR產物進行測序。完整衣殼序列顯示于SEQIDNO:12(核苷酸序列)和SEQIDNO:13(編碼的氨基酸序列)。實施例1-4.FCV-49的分離和生長貓杯狀病毒(FCV)49林(FCV-49,也稱作PHA-49)于1993年自Philadelphia,PA貓展示會收集。將該標本稀釋在含有1%培養基的96孔微量管中,制成1:10稀釋物。將lOOp1該稀釋的樣品加入96孔板中的100|i1CRFK細胞中。通過在96孔板中有限稀釋,將該FCV-49病毒純化3次。自最終純化物獲取病毒上清液,用于感染于T25燒瓶中生長至75%匯合度的CRFK細胞。當觀察到100%CPE時,凍/融上清液三次,并等分至冷凍瓶(lml/瓶)。該病毒原液的滴度經測定是6.8x107TCID5。/ml。FCV-49保藏在美國典型培養物保藏中心(ATCC)(10801UniversityBlvd.,Manassas,VA,20110,USA),ATCC保藏號為PTA-。實施例1-5.FCV-49衣殼序列分析從FCV-49感染的細胞培養物上清液使用TRIzol試劑(Invitrogen;Carlsbad,CA)分離總RNA。4吏用隨才幾引物和SuperscriptII逆轉錄酶(Invitrogen)合成"第一鏈"cDNA制備物。使用XLrTth聚合酶(AppliedBiosystems;FosterCity;CA)和寡核苷酸引物DEL-653(SEQIDNO:l)和DEL-651(SEQIDNO:2),進行PCR反應。使用BigDye化學和ABI377遺傳分析儀對所得PCR產物進行測序。完整衣殼序列顯示于SEQIDNO:14(核苷酸序列)和SEQIDNO:15(編碼的氨基酸序列)。實施例1-6.FCV-26391-4的分離和生長貓杯狀病毒(FCV)26391-4林(FCV-26391-4)于2003年自BayCounty的HumaneSociety(PanamaCity,Florida)收集。通過在含有具2%胎牛血清的DMEM培養基(Invitrogen)的96孔板中有限稀釋,將其純化1次。然后使用該純化的病毒感染T150燒瓶中所含的NLFK(Norden實驗室貓腎)細胞。一旦達到100。/。CPE,凍/融上清液三次,并等分至冷凍瓶(O.85ml/瓶)。該病毒原液的滴度經測定是S.6x107TCID5o/ml。FCV-26391-4保藏在美國典型培養物保藏中心(ATCC)(10801UniversityBlvd.,Manassas,VA,20110,USA),ATCC保藏號為PTA-。實施例1-7.FCV26391-4衣殼序列分析從FCV26391-4感染的細胞培養物上清液使用QIAamp病毒RNA分離試劑盒(Qiagen;Valencia,CA)分離總RNA。將大約1jag病毒RNA用于RT-PCR(使用PlatinumTaq的Superscript—步RT-PCR;來自Invitrogen)。反應條件為50°C30分鐘;2分鐘;之后40個循環,每個循環為15秒、55"C30秒和70t:2分鐘;之后72。C最后溫育10分鐘,并4匸儲存。所用引物是FCV-N2(SEQIDNO:3)和FCV-引物2(SEQIDNO:9)。然后使用各種寡核苷酸引物(SEQIDNO:3,4,5,6,7,8,9,lO和ll),對該PCR產物進行測序。FCV26391-4的完整衣殼序列顯示于SEQIDNO:16(核苷酸序列)和SEQIDNO:17(編碼的氨基酸序列)。FCV-21、FCV-49和FCV-26391-4的衣殼基因的氨基酸序列與GenBank中存在的所有全長FCV衣殼序列進^f亍比對。該比對使用ClustalW算法(Thompson等,1994)、PAM250權重矩陣(Dayhoff等,1978)和默認程序參數(MegAlign;DNASTAR,Inc;Madison,WI)進行。FCV-21和FCV213-95的衣殼蛋白序列之間的同一性是GenBank中所有條目中最高的,為90.7%。FCV-49和FCV213-95衣殼序列有92.2%35同一性。FCV26391-4和FCVCFI-68衣殼序列彼此有91.3%同一性。對于FCV-21、FCV-49和FCV26391-4,給出了單一一個衣殼序列,該序列基于對所獲PCR的直接測序。然而,這些序列每一個均代表一個病毒準種群體(已知存在于RNA病毒群體中)(綜述見Domingo等,VirusRes.82:39-44,2002)中的平均或共有序列。準種是RNA基因組復制過程中發生的錯誤的直接結果,由此產生基因組中具有突變的后代。因此,預期對于這些和其它FCV衣殼基因序列而言天然存在衣殼序列的微小變異。然而,每個序列中突變的分布將對毒株(包括FCV-21、FCV-49和FCV26391-4)之間的總體同一性幾乎不/完全不產生影響。實施例1-8.特異于FCV-21的單克隆抗體的制備A.FCV-21的純化。將來自感染了FCV-21的NLFK細胞的約200ml細胞培養物上清液以3,000rpm在IOC離心30分鐘。將"ml上清液轉移至BeckmanUltraclear離心管中,并將10ml10%蔗糖溶液鋪在管底。然后管子以27,000rpm、15。C離心2小時。離心后,取出上清液并丟棄,沉淀重懸浮在250ju1無菌水中。使用MicroBCA蛋白分析試劑盒(PierceChemicalCo.,Rockford,IL)測定蛋白濃度為7mg/ml。小鼠的免疫和雜交瘤細胞克隆的制備將大約100Mg純化的FCV-21病毒蛋白與弗氏佐劑一起注射入每只小鼠。免疫接種8只小鼠。使用100jLig純化的FCV-21和RIBI佐劑以4周為間隔進行兩次加強免疫。使用純化的FCV-21在ELISA中測定8只小鼠的免疫應答,具有31250或以上的效價。進行細胞融合產生雜交瘤克隆。培養68個此類細胞克隆,并檢測上清液與FCV-21的反應性。對于此ELISA,用100ju1純化的FCV以5jug/ml的濃度(稀釋在1xPBS中)包被96孔ELISA板。板子在非增濕的溫箱中37。C不加蓋干燥過夜。通過施用0.lml甲醇并室溫溫育5分鐘,固定板上的病毒。然后用蒸餾水洗滌板8次,然后用200ja1于1xPBS中的10%house血清4。C封閉過夜。再次用蒸餾水洗滌板子8次。將各種稀釋度的小鼠血清樣品加入各孔(lQO]Li1/孔)。每個樣品進行一式三份重復。37。C溫育l小時后,每孔用PBST洗涂3次,并與100iilU00稀釋的過氧化物酶綴合的AffiniPure山羊抗小鼠IgG(H+L)(JacksonI腿畫Research,Cat.No.715-035-150)37C溫育1小時。然后每孔用PBST洗涂3次,之后每孔加入100|i1ABTS過氧化物酶底物(KPL,Gaithersburg,Maryland,Cat.No.50-66-18)。RT大約10分鐘后,用ELISA讀數器于405-490nm(雙波長)讀板。基于信/噪比計算比活性。FCV-21特異性單克隆抗體的反應性使用以上雜交瘤細胞克隆的上清液在夾心ELISA試驗中檢測其對FCV-21和F9的反應性。簡而言之,用200y1以1:1500稀釋在碳酸鈉緩沖液(l.59gNa2C03和2.93gNaHC03,溶解在1升水中)中的抗FCV兔多克隆抗體(Pfize"16)包被96孔ELISA板。4C過夜孵育板子。用含有0.05%Tween-20的1xPBS(pH7.4)(PBST)洗涂板子3次,然后用200jul于PBST中的1%酪蛋白37"封閉1小時。向每孔加入1:10稀釋的FCV-21和F-9上清液。37t:溫育1小時后,洗滌板子并按一式三份向各孔加入各種雜交瘤上清液和它們的各種稀釋物(100|u1/孔)。然后,板子在37C溫育1小時,用PBST洗滌3次,并與100ju11:200稀釋的過氧化物酶綴合的AffiniPure山羊抗小鼠IgG(H+L)(JacksonImm畫Research,Cat.No.715-035-150)—起37。C溫育1小時。洗滌后,向每孔加入100plABTS過氧化物酶底物(KPL,Gaithersburg,Maryland,Cat.No.50-66-18)。RT大約10分4中后,使用ELISA讀數器于405-490nm(雙波長)讀板。基于信/噪比計算比活性。表1-3.ELISA篩選各種雜交瘤細胞上清液對FCV-21及F9的特異反應性mAb未孝^釋的1:IO稀釋的mAb1:50稀釋的mAbmAb\病毒PHA-21F9PHA-21F9PHA-21F91sup30131212Asup212Bsup313sup2932111614sup115sup116sup117sup2632211718sup98319Asup119Bsup1110sup151310611sup1113sup2722191414Asup2214Bsup315sup1116sup212512117sup20114112118sup2722251120sup1121sup179722122sup2123sup12110110124sup14141126sup1127sup1578328sup1229sup24823129130sup17713118131sup1919161132sup28162112181033sup2017151334sup2018151335sup14129636sup17515121137sup124311138sup6539sup231517640sup16310113141sup19714142sup13115117143sup1144sup944145sup1146sup843247sup4348sup11115449sup12138750sup1138<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>B.特異于FCV-21而非其它FCV林的單克隆抗體。選擇18個雜交瘤細胞克隆(3、7、17、23、27、29、30、36、37、40、41、42、44、53、56、59、60和61),進一步檢測其對FCV-21的特異性。在本試驗中使用11種FCV病毒(FCV-21,49,26391-4,F9,CFI-68,33585,89391,255,J-l,2280和H)。再次使用如上所述的夾心ELISA。結果總結在表1-4中。<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>如上顯示的,雜交瘤細胞系23、41、44和56對FCV-21具有特異性而對任何其它的測試FCV不具有特異性。因此,這些單克隆抗體可以用作FCV-21的診斷工具。而且,雜交瘤36似乎僅與疫苗FCV林(FCV-21、49、26391-4)反應而不與任何其它的FCV林反應。雜交瘤細胞系23、36、41、44和56全部保藏在美國典型培養物保藏中心(ATCC)(10801UniversityBlvd.,Manassas,VA,20110,USA),并具有如下ATCC保藏號PTA-7349(23)PTA-7350(36)PTA-7353(41)PTA-7351(44)PTA-7352(56)實施例1-9.FCV-21和FCV-49的血清針對1993年分離的FCV病毒的血清交叉中和分初"A.同源抗血清的滴定。在無特定病原體(SPF)貓中產生抗12種FCV分離株的恢復期抗血清,并在第一和第二次接種后收集該抗血清。該病毒接種物根據原液滴度而變,范圍在104至108TCID5。/貓之間。初次給貓接種,3周后進行加強,然后于加強后2周放血取血清。所述12種分離林包括F9、CFI-68、LS012、JOK63、JOK92、和野外分離林18、21、49、50、54、27和11。這些野外分離林基于各林衣殼蛋白序列的高變區序列的系統發生分析而選擇。選擇最大趨異的分離林進行該研究。56°C30分鐘熱滅活血清,使用標準恒定病毒-可變血清技術(Griest1979,Mahy1996),針對其同源病毒進行滴定。簡而言之,向96孔組織培養板的每孔中加入培養基(100-150ja1)。向頂排的每孔加入血清(100-150ju1)(1:2或1:4最初的血清稀釋;F9和LS012為1:4),使用多道吸液器混合(l:2稀釋)后將100ja1在板上向下轉移。丟棄最后的100ji1。向每孔加入50ji1滴定過的同源病毒(稀釋至200TCID5。/50|u1),板子在C02溫箱中37C溫育2小時。溫育后,每孔加入50jnl1:IO稀釋的CRFK細胞懸浮液。使用該稀釋的病毒設置病毒滴度板以確保向每孔添加適當的接種物。在含有150ju1培養基的頂排使用50jul病毒;板的剩余部分含有180jli1/孔,并使用20jal在板上向下實施10倍稀釋。板子溫育4天,使用Karber^^式計算血清和病毒滴定(對于血清滴度,在等式中使用受保護的孔與未受保護的孔的比率)。當滴定血清時,TCIDs。定義為50。/。的中和終點稀釋度(Griest1979)。一個抗體單位(AU)定義為在50%測試培養物中能夠中和32-320TCID5。的同源病毒的該抗血清的最高稀釋度。因此,獲得的該TCIDs。等于1AU。針對2.5、5、10和20AU的血清濃度實施病毒交叉中和。B.病毒交叉中和試驗。每個病毒野外分離林以及病毒林F9、LS012、皿63、J0K92、SA113和CFI-68在交叉中和試驗中針對12種FCV抗血清之每一種進行測試。每種病毒需要5塊96孔板。每種血清稀釋至2.5、5、10和20AU,在板上向下8次重復接種(3種血清/板,總4塊板),以及一塊病毒滴度板(按用于血清滴定的相同方式設置)。通過首先將血清稀釋至20AU,然后向下進行2倍稀釋至2.5AU,在DMEM中制備抗血清稀釋物。然后將每種稀釋物的等分試樣(100jil)加入板的每一列孔。將病毒37X:快速融化,置于水上,然后稀釋至200TCID5。/孔(置于冰上)。為了維持均一性,對于大多數病毒原液使用3步稀釋法,在任一步都不超過1:100。將稀釋的病毒原液(50jal)加入血清板的所有孔,按前述進行滴定。板子在37'C于C02溫箱中溫育2小時,之后向每孔加入50ju11:10稀釋的之前生長至匯合的CRFK細胞懸浮液。在每一組5塊板后更換吸液器頭和儲液槽。4天后對板子進行評分。一些情況下,使用預先滴定的、預先稀釋的病毒。承SN中^吏用2,5、5、10、20個抗體單位,N-8/8-陂保護的孔n-4-7/8被保護的孔,-=0-3/8被保護的孔,空白=血清不足/未做表1-5.血清交叉中和結果腦3JOK92CFI68LS0122.5/5/10/20*一一nn2,5/5/10/202.5/5/10/20nNNN一一-n,〗H一一nN一nnnnnnnNXXXXnNnN一nNn一nn2.5/5/10/20nNNN一n—nn—一一nnnN一一nN112.5/5/10/20f二n謂,一一nxnNNx一XXX--Nx一xxxnxxx一XXX—Nnx一一nx一nnx一nnxNNNxnnNx一一一xNNNxnnNxNxxx一—nx一nnx一XXX一一—X一—nxnnnx一一NxNNNxnNNxNXXX一XXX一XXXNxxxNxxx一xxxNxxxF92.5/5/10/20NxNxNxNxIIxNxXX-nNx一XXXNXXX一XXXNXXX一一NxN,NNNNXN夷NNnN一42表l-5(續)<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>本SN中使用2.5、5、10、20個抗體單位N=8/8祐沐護的孔n=4-7/84皮保護的孔-=0-3/8被保護的孔空白=血清不足/未做交叉中和數據總結在表1-5中。每個數據點代表分析的8個重復孔。"N,,、"n,,或"-,,代表被保護的孔相對于未保護的孔的比率,該比率指示了交叉中和的程度。表中突出顯示的血清中和結果對應于每種單特異性血清針對其同源病毒檢測到的結果。這些血清應當完全地中和;對于大部分而言它們確是如此。少數例外,最顯著的是JOK63、JOK92和11,在較高AU值時表現出完全的中和作用,但是在2.5AU時則不。這可能是由于稀釋誤差導致的。該數據集中最顯著的結果是血清FCV-21和FCV-49,尤其是后者,所表現出的高度交叉中和作用。這些血清的交叉中和模式似乎類似于F9的。(應當注意,對于F9以及對于FCV-21和FCV-49在20AU下的數據集由于血清量不足而是不完全的)。盡管3種血清(FCV-21、FCV-49和F9)之間在中和模式上存在一些差異,但是分離林ll、38和39—貫地不被這三種血清中的任一種所中和。實施例1-10.FCV-21和FCV-49抗血清針對2003年分離的FCV病毒進行的交叉中和分析本研究中的FCV抗血清通過使用105至106TCID5。/mlFCV鼻內接種貓(4-5只貓/組)而產生。之后3周使用相同量的病毒進行加強接種。加強接種后2周收集血清,并56t:30分鐘熱滅活。將來自每只接種的貓的血清樣品用于血清中和試驗中針對26種FCV林之每一種進行分析(表1-6)。以1:8稀釋血清樣品并之后在600ju1體積中進行2倍系列稀釋至1:16384(總共12次稀釋)。將600u1中具有50-500TCID5。/ml滴度的FCV與稀釋的血清樣品一起混合,并室溫溫育45分鐘。然后,按一式四份將200ju1樣品轉移至接種有CRFK細胞的96孔板的每孔中。板子于37°C,5%0)2下溫育6天,確定終點中和滴度。根據Spearman-Karber的方法(Spea簡nC,1908,BritJPsychol2:227-242;KarberG,1931,ArchexpPathPharmak162:480-487),計算血清中和(SN)滴度和攻擊病毒的返滴定滴度(back-titer)。用>23和>15和>10的截斷滴度分析血清中和數據。結果顯示在表1-7中。數據提示FCV-21、FCV-49和FCV26391-4具有更寬的交叉中和譜,因此是比現有的FCV疫苗林F9更好的疫苗候選者。表1-6.交叉中和研究中使用的26種FCV林<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>表1-7.與F9相比較對FCV-21、FCV-49和FCV26391-4進行的交叉中和分析A.候選者超過F9°/。(SN滴度>23)%增加(IN)FCV-21IN43.968.9FCV-49IN33.930.4FCV26391-4IN28.911.2F9IN26B.候選者超過F9%(SN滴度>15)氧依FCV-21IN51.562.5FCV-49IN37.718.9FCV26391-4IN39.424.3F9IN31.7C.候選者超過F9^(SN滴度MO)%增加(IN)FCV-21IN74.636.1FCV-49IN63.115,2FCV26391-4IN63,515.9F9IN54.8實施例1-11.接種帶有和不帶有FCV-21的Felocell4成分的貓的死亡率和臨床得分約8周齡的家養短毛貓接種FELOCELL4成分,其中該成分含有修飾的活貓鼻氣管炎病毒[FHV]、杯狀病毒[FCV-F9]、全白細胞減少癥病毒[FP]和鸚鵡熱衣原體并含有或不含有另一種FCV林FCV-21。所評價的免疫接種方案包括初次皮下接種,之后于第21天皮下加強接種(SQ/SQ);初次皮下接種,之后在第21天進行一次口服加強免疫(SQ/口服);或者初次口服免疫接種,之后于第21天第二次口服免疫接種。46口服接種通過將疫苗施用于口中來實現。第42天,用大約lml強毒性系統性FCV-33585(3log的TCID5。/ml)攻擊所有的貓。攻擊后持續14天監測所有貓的疾病臨床征候(溫度、結膜炎漿液狀排出物、結膜炎含粘液膿性排出物、鼻炎漿液狀排出物、鼻炎含粘液膿性排出物、打噴嚏、可聽見的羅音、咳嗽、張嘴呼吸、厭食、脫水、〈4mm的一個口腔潰瘍、多個口腔潰瘍、〉4mm的口腔潰瘍、過量分泌唾液、非流血性表面潰瘍、流血性表面潰瘍)。將攻擊后表現出與杯狀病毒發病相一致的幾種臨床征候的貓處安樂死。如表1-8所示,添加新的毒林FCV-21顯著地增加FELOCELL4(有或無FCV-F9存在)的效力。SQ/SQ接種和SQ/口服接種兩者均似乎可以有效地預防FCV感染。而且,我們已經證實在FELOCELL4和FELOCELL3(FELOCELL3是無鸚鵡熱衣原體的FELOCELL4)中添加FCV-21但不存在F9的情況下甚至通過口服/口服免疫接種也可以有效地抗FCV感染。對于表1-9,所評價的免疫接種方案包括初次皮下接種之后于第21天和第42天進行兩次口服加強免疫(SQ/口服/口服)。我們證實,在FELOCELL4中添加FCV-21,無論是否存在FCV-F9,均顯著地降低了死亡率和臨床得分。表l-8<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>*FELOCELL4A:無FCV-F9但具有FCV-21的FELOCELL4"FELOCELL3A:無FCV-F9但具iFCV-21的FELOCELL3<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>實施例1-12.來自使用具有和不具有FCV-21的FEL0CELL4成分免疫接種的貓的血清的交叉中和分析從實施例1-11所描述的研究中在第二次接種后但在85攻擊之前的每只貓收集血清。樣品56匸熱處理30分鐘,并在血清中和試驗中針對之前實施例1-10中所述26種FCV林(表l-6)之每一種進行評價。使用〉23和〉15的截斷滴度分析血清中和數據,計算兩個截斷滴度的平均值(Ave)。結果顯示在表l-10種。數據顯示,含有FCV-21的所有疫苗制劑均比含有傳統FCV-F9林的疫苗具有更寬的交叉中和譜(大約60°/。對40%)。這導致被中和的FCV林數目增加了大約50%。表I-IO<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>*FELOCELL4A:無FCV-F94旦具有FCV-21的FELOCELL4"FELOCELL3A:無FCV-F9^fS^有FCV-21的FELOCELL3如表1-10所示,添加新毒林FCV-21,無論是否存在FCV-F9,均顯著地增加了FEL0CELL4的交叉中和鐠。使用SQ/SQ接種和SQ/口服接種均觀察到較寬的中和譜。而且,我們證實FEL0CELL4和FEL0CELL3中存在FCV-21但無F9時使用口服/口服免疫接種增強了交叉中和鐠。表l-ll中,所評價的免疫接種方案包括初次的皮下接種及之后于第21天和第42天的兩次加強免疫(SQ/口服/口服)。結果說明,在FEL0CELL4中添加FCV-21在有或無FCV-F9的情況下均導致顯著更寬的交叉中和譜(大約增加40%)。表l-ll<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>*FELOCELL4A:無FCV-F9^S^TFCT-21的FELOCELL4編號的本發明描述。本發明的其它描述和實施例。1.用于免疫貓以抵抗貓杯狀病毒的疫苗,其包含FCV-21衣殼蛋白或分離的FCV-21衣殼蛋白。2.用于免疫貓以抵抗貓杯狀病毒的疫苗,其包含FCV-21衣殼蛋白或分離的FCV-21衣殼蛋白和藥學上可接受的載體,其中所述衣殼蛋白包含蛋白質序列(SEQIDNO:13)和具有至少大約91.2%、95%和99%同一性的序列;其中所述衣殼蛋白以有效產生免疫應答的量提供。3.用于免疫貓以抵抗貓杯狀病毒的DM疫苗,其包含編碼FCV-21衣殼蛋白或分離的FCV-21衣殼蛋白的核酸序列,其中所述DM包含序列(SEQIDNO:12)和具有至少大約78.7%和79.2%序列同一性并允許保守替代的序列。4.用于免疫貓以抵抗貓杯狀病毒的疫苗,其包含FCV-49衣殼蛋白或分離的FCV-49衣殼蛋白,其中所述衣殼蛋白包含來自FCV-49林的蛋白質序列。5.用于免疫貓以抵抗貓杯狀病毒的疫苗,其包含FCV-49衣殼蛋白或分離的FCV-49衣殼蛋白和藥學上可接受的載體,其中所述衣殼蛋白包含蛋白質序列(SEQIDNO:15)和具有至少大約92.7%、95%和99%同一性的序列;其中所述衣殼蛋白以有效產生免疫應答的量提供。6.用于免疫貓以抵抗貓杯狀病毒的DNA疫苗,其包含編碼FCV-49衣殼蛋白或分離的FCV-49衣殼蛋白的核酸序列,其中所述DNA包含序列(SEQIDNO:14)和具有至少大約78.9%,即79.4%(78.9+0.5)序列同一性并允許保守替代的序列。7.用于免疫貓以抵抗貓杯狀病毒的疫苗,其包含FCV-26391-4衣殼蛋白或分離的FCV-26391-4衣殼蛋白,其中所述衣殼蛋白包含來自FCV-26391-4林的蛋白質序列。8.用于免疫貓以抵抗貓杯狀病毒的疫苗,其包含FCV-26391-4衣殼蛋白和藥學上可接受的載體,其中所述衣殼蛋白包含蛋白質序列(SEQIDN0:17)和具有至少大約91.8%、95%和99%同一性的序列;其中所述衣殼蛋白以有效產生免疫應答的量提供。9.用于免疫貓以抵抗貓杯狀病毒的DNA疫苗,其包含編碼FCV-26391-4衣殼蛋白或分離的FCV-26391-4衣殼蛋白的核酸序列,其中所述DNA包含序列(SEQIDNO:16)和具有至少大約78.4%,即78.9%(78.4+0.5)序列同一性的序列。10.權利要求l-3之任一項的疫苗,其中多核苷酸選自基本上由SEQIDN0:12、14、16組成的組。11.權利要求1-3之任一項的疫苗,還包含以下的單獨一項或任何組合其中疫苗包含佐劑,其中FCV成分是活的,其中FCV成分是減毒的,其中FCV成分是滅活的,該疫苗可以包括至少一種選自FCV-F9、FCV-LLK、FCV-M8、FCV-255和FCV-2280的其它貓杯狀病毒林。12.權利要求1、4和7的疫苗,其中疫苗包括至少一種選自貓皰滲病毒、貓白血病病毒、貓免疫缺陷病毒、鸚鷸熱衣原體和貓細小病毒、狂犬病毒和支氣管敗血性鮑特菌的其它貓病原體。13.免疫貓以抵抗貓杯狀病毒的疫苗,其包含有效產生免疫應答的量的FCV衣殼蛋白的核苷酸序列和藥學上可接受的栽體,所述衣殼蛋白選自與SEQIDNO:13、15或17具有93%或更高同一性的多肽,其中所述FCV分離林不是213-95林,并且其中所述核酸序列與異源啟動子序列可操作地連接。14.權利要求13的疫苗,其中核苷酸序列選自基本上由SEQIDNO:12、14和16組成的組。15.權利要求13的疫苗,其中核苷酸序列以以下任一種形式存在質粒、重組病毒載體。16,權利要求13的疫苗,其中重組病毒載體選自貓皰滲病毒、浣熊痘病毒、金絲雀痘病毒、腺病毒、Semliki森林病毒、Sindbis病毒和痘苗病毒。17.包含獸醫學上可接受的賦形劑載體和分離的FCV株的免疫原性組合物,其中所述FCV林可以與選自本文描述為23、26、41、44和56的單克隆抗體的單克隆抗體結合。18.包含獸醫學上可接受的賦形劑載體和分離的FCV林的免疫原性組合物,其中所述FCV抹選擇性地與選自本文描述為23、26、41、44和56的單克隆抗體的單克隆抗體結合。19.權利要求17和18的免疫原性組合物,其中FCV林是滅活的,其中所述FCV林是疫苗并且其中該組合物包含佐劑。20.用于免疫貓以抵抗貓杯狀病毒的方法,包括給貓施用有效劑量的權利要求l-14之任一項的疫苗,其中該疫苗還包含佐劑。第2部分以下部分提供有關免疫動物以抵抗病毒,尤其是免疫貓以抵抗杯狀病毒的方法的詳細信息除非另行指明,否則以下的公開使用上面和下面給出的定義。此處描述使用疫苗治療和免疫動物,尤其是貓以抵抗貓杯狀病毒(FCV)的方法和材料。該方法包括給貓施用治療有效量的第一和第二疫苗,所述疫苗能夠誘導免疫應答,尤其是在貓中誘導抗FCV的免疫應答。第一疫苗典型地通過胃腸外途徑施用,但在一些情況下可以通過口服施用,而第二疫苗通過口服或者口鼻途徑于第一疫苗施用后N天施用。這些疫苗典型地首先通過胃腸外途徑施用,因為如果最初通過口服途徑施用,它們典型地將造成口腔損傷。令人驚奇的是,在此我們公開了FCV-21、FCV-49和FCV26391-4林,這些病毒林十分安全和有效以致可以按照第一次口服施用之后第二次口服施用的方式進行施用。在此,N為3至120(包括3和120)的整數,但典型地是7至42(包括7和42)的整數,或者14至28(包括14和28)的整數,優選是大約3周以及大約2-4周。備選地,第二疫苗可以在貓出現大約1:6、1:9、1:12、1:15、1:18或更高的FCV血清中和滴度后施用。該方法也可以包括在第一疫苗或第二疫苗施用后M天再進行一次或多次胃腸外、口服或口鼻FCV疫苗施用,其中M是l至120(包括l和120)的整數。因此,代表性的免疫接種方案包括(l)皮下施用第一FCV疫苗,之后口服施用笫二FCV疫苗;(2)相繼皮下施用第一和第三FCV疫苗,之后口服施用第二FCV疫苗;和(3)皮下施用第一FCV疫苗,之后相繼口服施用第二和第三FCV疫苗。如上所述,第一疫苗通過胃腸外途徑(例如皮下)施用,第二疫苗通過口服或口鼻施用,并且任選的第三疫苗可以通過胃腸外途徑、口服或口鼻施用。可以使用任何裝置施用這些疫苗,包括注射器、滴管、無針頭注射裝置等等。對于口鼻施用,裝有套管的注射器可用于將疫苗滴入貓的鼻子和嘴。該方法可以使用能夠在貓中誘導抗FCV的免疫應答的任何疫苗,只要可以使第一疫苗適應于胃腸外施用而使第二疫苗適應于口服或口鼻施用即可。如上所述,使任選的第三疫苗適應于胃腸外、經口或口鼻途徑施用。第一、笫二和任選的第三疫苗可以是相同或不同的并且各自可以獨立地包含來源于一種或多種FCV林的一種或多種抗原。因此有用的疫苗包括活的病毒疫苗、修飾的活病毒疫苗、和滅活的病毒疫苗。活的和修飾的活的FCV疫苗包含在貓中不造成疾病并且已經以非毒性形式分離或者已經使用熟知方法(包括在適宜的細胞系中連續傳代或者暴露于紫外線或者化學誘變劑)而減毒的FCV抹。滅活的或死的FCV疫苗包含已經通過已知方法,包括利用福爾馬林、0-丙內酯(BPL)或者BEI等進行處理而滅活的FCV林。示例性疫苗包括含有選自FCV-F9、FCV-M8、FCV-255、FCV-2280、FCV-21、FCV-49、FCV-26391-4等的單獨的或任何組合的非毒性林的那些疫苗。54其它有用的來源于一種或多種FCV林的疫苗包括重組疫苗和DM疫苗(即,亞單位疫苗)。重組疫苗包括重組病毒載體,每一個均含有編碼來源于FCV林的抗原的核酸。此類載體可以通過將編碼源于FCV林的抗原(例如衣殼蛋白)的cDNA插入非毒性病毒(包括皰滲病毒、痘病毒、腺病毒等的林系)的基因組中而制備。對于病毒載體,該cDNA在抗原編碼序列5,末端與真核轉錄啟動子可操作地連接,并在抗原編碼序列的3,末端與真核終止信號和poly(A)信號可操作地連接,由此該轉錄啟動子和終止序列可以調節該抗原的表達。有用的轉錄啟動子包括Rous肉瘤病毒長末端重復啟動子(RSV-LTR)、巨細胞病毒(CMV)主要立即早期啟動子、猿猴空泡病毒40(SV40)T抗原啟動子,和誘導型啟動子,例如金屬硫蛋白啟動子。對于重組FCV疫苗的討論,參見Wardley等的美國專利號5,716,822,在此完整地并入作為參考。DNA疫苗包括具有編碼FCV抗原例如FCV衣殼蛋白或其特異的免疫原性片段的核酸序列的DNA分子(例如質粒),其中所述抗原在貓中引起抗FCV的免疫應答。該核酸編碼序列與使得該DNA能夠在其接種入貓細胞中時實現表達的轉錄啟動子可操作地連接。有用的啟動子包括RSV-LTR啟動子、CMV主要立即早期啟動子、和SV40T抗原啟動子。此外,該核酸還可以在編碼該FCV抗原的序列的終止密碼子位置或附近位置與包含轉錄終止信號和poly(A)識別信號的核酸片段可操作地連接。對于DNA疫苗的討論,參見美國專利號5,580,859、美國專利號5,589,466和美國專利號5,703,055(Feigner等)。其它有用的疫苗包括含有一種或多種亞單位抗原,例如FCV衣殼蛋白或該衣殼蛋白的免疫原性片段的疫苗,其中所述抗原已經得以分離和純化。該亞單位抗原可以在能夠通過上述方法體外產生該抗原的重組表達栽體中產生。所得抗原隨后進行分離和純化。有用的表達載體包括各種微生物,包括細菌、酵母和真菌,以及真核生物,例如哺乳動物和昆蟲細胞。其它有用的表達栽體包括病毒,例如腺病毒、痘病毒、皰滲病毒、Semliki森林病毒、桿狀病毒、謹菌體、Sindbis病毒、Sendai病毒等。FCV亞單位抗原在微生物中的表達使得可以使55用商業規模的發酵技術生產該抗原性蛋白。可以使用各種方法分離和純化該抗原,包括凝膠過濾、親和層析、離子交換層析、離心等。這些疫苗中的一種或多種還可以含有用于免疫貓以抵抗一種或多種FCV之外的病原體的抗原,其中所述病原體包括貓皰疹病毒、貓白血病病毒、貓免疫缺陷病毒、貓全白細胞減少癥病毒和貓衣原體。疫苗的其它成分可以包括藥學上可接受的賦形劑,包括載體、溶劑和稀釋劑、等滲劑、緩沖劑、穩定劑、防腐劑、免疫調節劑(例如,白介素、干擾素和其它細胞因子)、血管收縮劑、抗細菌劑、抗真菌劑等。典型的栽體、溶劑和稀釋劑包括水、鹽水、葡萄糖、乙醇、甘油等。代表性等滲劑包括氯化鈉、葡萄糖、甘露糖醇、山梨糖醇、乳糖等。有用的穩定劑包括明膠、白蛋白等。疫苗還可以包括一種或多種增強對抗原的免疫應答的佐劑。代表性佐劑包括基于油的佐劑,例如弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑、基于霉菌酸(mycolate)的佐劑(例如,海藻糖二霉菌酸酯),細菌脂多糖、肽聚糖(即,胞壁質、粘肽或糖蛋白例如N-0paca、胞壁酰二肽或其類似物)、蛋白聚糖(例如,提取自肺炎克雷伯氏桿菌(Klebsiellapneumoniae))、鏈球菌制品(例如0K432)、Biostim(例如,01K2)、Iscoms(例如,見歐洲專利申請號EP109942、EP180564和EP231039)、氫氧化鋁、皂苷、二乙基氨基乙基-葡聚糖、中性油(例如,miglyol)、植物油(例如花生油)、脂質體、Pluronic⑧多元醇類。其它佐劑包括RIBI佐劑系統、明礬、氫氧化鋁凝膠、膽固醇、水包油乳劑、油包水乳劑、嵌段共聚物(CytRx,AtlantaGA)、SAF-M(Chiron,EmeryvilleCA)、AMPHIGE^佐劑、急苷、QuilA、QS-21(CambridgeBiotechInc.,CambridgeMA)、GPI-OIOO(GalenicaPharmaceuticalsInc.,Birmingham,AL)或其它皂苷級分、單磷酰脂A、Avridine脂-胺佐劑、來自大腸桿菌(Escherichiacoli)的熱不穩定性腸毒素(重組的或者其它形式)、霍亂毒素、或胞壁酰二肽等等。FCV疫苗劑量的大小范圍典型為大約lmL至大約2mL,包括lmL和2mL。每一劑均含有治療有效量的所述FCV抗原(一種或多種),其中該有效量可以隨著貓的年齡和總體狀況、施用途徑、FCV抗原的性質及其它因素而變。對于含有修飾的活病毒或減毒的病毒的疫苗,治療有效劑量一般為大約106TCIDs。至大約108TCID5。(包括106TCIDs。和108TCIDs。在內)。對于含有亞單位抗原,例如FCV衣殼蛋白的疫苗,治療有效劑量一般為大約10yg至大約100jag(包括10ng和100|ig在內)。可以對疫苗的其它成分進行調整以修飾疫苗的物理和化學性質。例如,佐劑典型地包含lmL劑量大約25yg至大約1000pg(包括25jjg和1000ug在內)。類似地,抗生素典型地包含lmL劑量大約1jng至大約60jig(包括ljng和60"g在內)。FCV疫苗可以根據施用途徑、儲存要求等因素以各種形式提供。例如,可以將疫苗制備成適于在注射器、滴管等中使用的無菌水溶液或分散體,或者可以制備成可以在用前于鹽水、HEPES緩沖液等中復水的凍干的粉末。第2部分實施例和表以下實施例旨在舉例說明而非限制,并代表本發明的幾個特定的實施方案。實施例2-1.^吏用FELOCELL4和FEL-0-VAX⑧的皮下/口月l疫苗接種方案4-5月齡的家養短毛貓用FELOCELL4(PfizerInc.;修飾的活貓鼻氣管炎病毒[FHV]、杯狀病毒[FCV]、全白細胞減少癥病毒[FP]和鸚鵡熱衣原體)、用FEL-O-VAX(FortDodge;死的FHV、FCV、FP和鸚鷸熱衣原體)、或用無菌稀釋劑(對照組)免疫接種。所評價的免疫接種方案包括最初的皮下接種之后于第21天和第42天皮下加強(SQ/SQ/SQ);最初的皮下接種之后于第21天和第42天兩次口服加強免疫(SQ/口服/口服);或者最初皮下接種之后于第21天第二次皮下接種及第42天口服加強。所有劑量均為lml。口服接種通過將疫苗施用至口中而實現。于第99天,用大約3,5ml強毒性系統性FCV-33585(4.8log的TCID5。/ml)攻擊所有的貓。該攻擊通過在罐狀貓糧中施用該劑量的大約3ml并通過鼻滴注0.05ml而進行。攻擊后持續14天監測所有貓的疾病臨床征候。將攻擊后表現出與杯狀病毒發病相一致的嚴重臨床征候的貓處安樂死。如表2-1所示,通過該SQ/口服/口服方案接種的組具有僅10%的死亡率,而對照組具有90%死亡率。通過該SQ/SQ/SQ方案接種的組具有50%死亡率,而通過SQ/SQ/口服方案接種的組具有20%死亡率。這些結果提示,SQ接種后進行口服加強顯著地增強FELOCELL4免疫接種抗毒性FCV攻擊的效力。當口服接種作為接種方案的一部分時不僅死亡率從50%(SQ/SQ/SQ)降低至10。/。(SQ/口服/口服)或20。/0(SQ/SQ/口服),而且如表2-2所示,臨床征候例如皮膚損傷(SL)、食欲不振(IA)、抑郁(DP)、口腔潰瘍(OU)、跛足(LN)、打噴嚷(SZ)、鼻排出物(ND)、和淚汪汪的眼(WE)的嚴重程度也降低。表2-1.在免疫接種后被強毒性FCV-33585攻擊的貓的死亡率(實施例2-1)表2-1組別處理免疫接種#動物途徑#動物攻擊死亡率'/。Tl對照10SQ/SQ/SQ1090T2FELOCELL45SQ/SQ/SQ450T3FELOCELL410SQ/SQ/口服1020T4FELOCELL410SQ/口服/口服1010T5FEL-0-VAX5SQ/SQ/SQ560表2-2.免疫接種和隨后FCV-33585攻擊后的臨床癥狀(%動物)(實施例2-1)_"^表2一2組別途徑SLIABPOUSZNDWETlSQ/SQ/SQ5010010070100309070T2SQ/SQ/SQ1001001001001002510025T3SQ/SQ/口服7070506070203010T4SQ/口月良/口月艮104020405010300T5SQ/SQ/SQ4080606060406020實施例2-2.SQ/口服免疫接種后平均FCV血清中和滴度58在第0、21、42、63、98和113研究日自實施例2-1的貓收集血液樣品,并在血清中和(SN)試驗中評價它們中和FCV的能力。血清樣品1:8稀釋,之后在600pl體積中2倍系列稀釋至1:16384(總共l2次稀釋)。將600|i1中具有50-500TCID5。/ml滴度的貓杯狀病毒與稀釋的血清樣品混合,室溫溫育45分鐘。然后,按一式四份將每種稀釋的樣品各200p1轉移至接種有Crandel貓腎(CrFK)細胞的96孔板的各孔中。板子在37。C、5%0)2下溫育6天,在此時間測定終點中和滴度。施用Spearman-Karber的方法計算血清中和(SN)滴度和攻擊病毒的返回滴定滴度。見C.Spearman,Brit,J.Psychol.2:227-242(1908)和G.Karber,Arch.Exp.Path.Pharmak.162:480-487(1931)。如表2-3所示,通過SQ/口服/口服或SQ/SQ/口服接種方案施用的FELOCELL4具有顯著更高的FCVSN滴度。這些數據與實施例2-1中所述的死亡率顯著降低相關。表2-3.在不同研究日的平均FCVSN(血清中和)滴度(實施例2-2)表2-3<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>*免疫接種后第Q天、第21天、第42天、第63天、第98天和笫133天測量的。實施例2-3.FELOCELL4和FEL-O-VAX⑧的SQ/口服施用的抗貓全白細胞減少癥病毒的效力還分析來自實施例2-1的貓的血清樣品的平均FP滴度。如表2-4所示,所有的貓均在研究開始時為血清反應陰性。隨后,在取樣間隔期間(第21和42天),對照組的平均滴度保持在1。然而,其它4個接種組的平均滴度顯著地增加。表2-4.針對貓全白細胞減少癥病毒的平均血清抗體滴度(實施例2-3)<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>*免疫接種后第0天、第21天和第42天測量的。實施例2-4.通過各種施用途徑免疫接種FEL0CELL4的貓的臨床癥狀通過將液滴滴注入動物鼻孔,進行FEL0CELL⑧4的口鼻(ON)施用。如表2-5所示,6-7月齡的貓,每組10只(T1,T2,T3),按照表2-5所示方案接種并于第21天進行加強皮下接種和加強(SQ/SQ);皮下接種和口鼻加強(SQ/ON);或者口鼻接種和加強(ON/ON)。疫苗于頸右側皮下施用(lmL);口鼻施用通過將0.5ml疫苗遞送入每個鼻孔進行。于第1天開始,觀察所有貓每日的總體健康情況。表2-5.通過不同施用途徑接種FEL0CELL4的貓的臨床癥狀(實施例2-4)<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>如表2-5所示,接受2次口鼻免疫接種的貓具有高水平的臨床癥狀,包括鼻潰瘍(NU)、口腔潰瘍(0U)、持續打噴嚏(SZ)、鼻排出物(ND)、淚汪汪的眼(WE)和短暫的食欲不振(IA)。然而,通過SQ/ON方案免疫接種的貓比ON/ON免疫接種的貓表現出較少的臨床癥狀,沒有鼻潰瘍、口腔潰瘍、鼻排出物(ND)或淚汪汪的眼的跡象。而且,SQ/0N組的個體比0N/0N組的貓表現出較少的噴噢。SQ/0N組的安全i普與SQ/SQ組的相似。實施例2-5.不同免疫接種途徑對FEL0CELL4抗原的血清學應答的影響分析在實施例2-4所述研究中入選的貓的血清樣品對于FEL0CELL4疫苗中存在的各種病毒抗原的血清學反應性。在研究的第0、21和42天測定對FCV、FHV和FP的平均血清中和抗體滴度。如表2-6所示,所有三種免疫接種方案均導致對FP的強免疫應答。對于FHV的免疫應答由于該試驗的困難而幾乎檢測不到。然而,抗FCV的血清中和滴度在0N/0N和SQ/0N組比SQ/SQ組顯著高。這些結果提示0N/0N和SQ/0N組的貓將獲得抵抗毒性FCV攻擊的保護作用,而SQ/SQ組則可能不能獲得該保護作用。表2-6.通過不同途徑免疫接種FEL0CELL4的貓的血清學應答(實施例2-5)表2-6<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>*于接種后第0天、第21天和第42天測量。實施例2-6.對通過SQ或0N途徑施用的FCV-F9的血清中和滴度通過SQ或0N,使用FEL0CELL4中存在的FCV-F9抗原免疫接種貓,每組6只貓。最初免疫接種后3周,所有貓使用相同抗原通過與之前相同的途徑進行加強免疫。所有劑量均為lml。加強免疫后3周收集血清樣品。如表2-7所示,測定這些樣品針對一組26種FCV抹的血清中和滴度。選用于該組的FCV林是基于遺傳多樣性(按照它們的衣殼高變區的序列所確定的)以及地理分布而選擇的。此外,還考慮每林的毒性表型。來自0N免疫接種F9的貓的血清樣品,與來自SQ免疫接種的貓相比,在該組26個成員中中和更多的FCV林。使用23作為中和滴度的截斷值,ON免疫接種導致該組26%的成員具有等于或高于該截斷值的滴度,而SQ免疫接種導致僅16。/。符合該標準。對于15的滴度截斷值,0N免疫接種產生32%的組成員等于或高于該截斷值;SQ產生僅17%。表2-7.對于FCV-F9的SQ與0N產生的血清抗一組26種FCV病毒的血清交叉中和滴度(實施例2-6)<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>*>23的中和滴度作為截斷值;或者>15的中和滴度作為截斷值實施例2-7.免疫接種兩劑FELOCELL4或FELOCELL3成分以及修飾的活FCV-21的貓的死亡率和臨床得分給約8周齡的家養短毛貓施用含有修飾的活貓鼻氣管炎病毒(FHV)、全白細胞減少癥病毒(FP)、鸚鷸熱衣原體,以及(l)FCV-F9(FELOCELL4或FELOCELL3)、(2)FCV-F9和FCV-21(FELOCELL4加FCV-21或FELOCELL3加FCV-21)或(3)FCV-21(FELOCELL4A或FELOCELL3A)的疫苗。免疫接種方案包括初次皮下免疫接種,之后在第21天皮下加強(SQ/SQ);初次皮下免疫接種,之后在第21天一次口服加強免疫(SQ/口服);或初次口服免疫接種,之后在第21天進行第2次口服免疫接種(口服/口服)。不同給藥方案中的每只貓(T1至T10組,每組10只貓)各接受lml疫苗。口服免疫接種通過將疫苗施用于口中而實現。在第42天,所有貓施用大約lml強毒性系統性FCV-33585(3log的TCID5。/ml)進行攻擊。攻擊后持續14天,監測所有貓的疾病臨床征候,包括升高的溫度、結膜炎漿液狀排出物、結膜炎含粘液膿性排出物、鼻炎漿液狀排出物、鼻炎含粘液膿性排出物、打噴嚏、可聽見的羅音、咳嗽、張嘴呼吸、厭食、脫水、"mm的一個口腔潰瘍、多個口腔潰瘍、〉4fflin的口腔潰瘍、過量分泌唾液、非流血性表面潰瘍、流血性表面潰瘍。攻擊后表現出與杯狀病毒發病一致的嚴重臨床征候的貓被處安樂死。如表2-8所示,當與SQ/SQ免疫接種相比時,對于FEL0CELL⑧4接種的貓,SQ/口服免疫接種方案將死亡率由44%降低至10%并且將平均臨床得分由12改善至5.5。而且,向FELLOCELL3和向FELLOCELL4添加FCV-21林導致攻擊后無死亡。用FCV-21林置換FELLOCELL3及FELLOCELL4中的FCV-F9林導致與含有FCV-F9及FCV-21兩者的疫苗相似的效力,甚至是在口服/口服免疫接種方案中也是如此。表2-8.免疫接種2劑帶有或不帶有FCV-F9和/或FCV-21的FEL0CELL3或4后以毒性FCV-33585攻擊的貓的死亡率(實施例2-7)表2-8<table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table>FELOCELL4A:無FCV-F9但具有FCV-21的FELOCELL4FELOCELL3A:無FCV-F9但具有FCV-21的FELOCELL3實施例2-8.以FELOCELL4成分和修飾的活FCV-21進行3劑免疫接種的貓的死亡率和臨床得分給大約8周齡的家養短毛貓施用含有修飾的活貓鼻氣管炎病毒(FHV)、全白細胞減少癥病毒(FP)、鸚鵠熱衣原體,以及(l)FCV-F9(FEL0CELL4)、(2)FCV-F9和FCV-21(FEL0CELL4A)或(3)FCV-21(FEL0CELL4B)的疫苗。在每一種情況下,給貓進行最初的皮下免疫接種并隨后于第21天和第42天進行相繼的口服施用(SQ/口服/口服)。不同給藥方案中的每只貓(T1至T4組,每組10只貓)接受lmL疫苗。口服接種通過將疫苗施用于口中而實現。第63天,所有貓施用大約lml的毒性系統性FCV-33585(3log的TCID5。/ml)攻擊。攻擊后持續14天,監測所有貓的如實施例2-7所述的疾病臨床征候。將攻擊后表現出與杯狀病毒發病相一致的嚴重臨床征候的貓處于安樂死。如表2-9所示,按照攻擊后死亡率和臨床得分測量的,此三劑量方案的效力與實施例2-7中所述的2劑量方案的效力相當。表2-9.在使用FCV-F9和/或FCV-F21進行3劑量免疫接種后被毒性FCV-33585攻擊的貓的死亡率(實施例2-8)表2-9<table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table>FELOCELL4A:無FCV-F9但具有FCV-21的FELOCELL4實施例2-9.來自以帶有和不帶有FCV-21的FELOCELL4成分免疫接種的貓的血清的交叉中和分析對在實施例2-7所述研究中的每只貓,在第二次免疫接種后但在攻擊之前,收集其血清樣品。樣品56。C30分鐘熱處理,并且如之前實施例1-10中所述針對26種FCV林(表l-6)之每一種的血清中和試驗之每一種的血清中和試驗中進行評價。使用>23和>15的截斷滴度分析血清中和數據,并計算兩個截斷滴度的平均值(Ave)。結果顯示在表2-10中。該數據說明,無論施用途徑是SQ/SQ還是SQ/口服,FELOCELL4(含有FCV-F9)的交叉中和譜保持不變。然而,添加FCV-21后,當疫苗以SQ/SQ或SQ/口服方式施用時,該交叉中和譜顯著增強。而且,對于FELOCELL4A(含有FCV-21但不含有FCV-F9),對于SQ/SQ、SQ/口服以及甚至口服/口服免疫接種途徑,該交叉中和語均得以增強。表2-10<table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table>*FELOCELL4A:無FCV-F9姊有FCV-21的FELOCELL4"FELOCELL3A:無FCV-F9^SA^"FCV-21的FELOCELL3在表2-11中,所評價的免疫接種方案包括最初的皮下接種以及之后于第21天和第42天的兩次口服加強免疫(SQ/口服/口服)。結果說明,在FELOCELL4中添加FCV-21,無論有或無FCV-F9,都導致顯著更寬的交叉中和譜(增加大約40%)。<table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table>*FELOCELL4A:無FCV-F9但有FCV-21的FELOCELL4我們還公開了我們的如下發現對于本文描述的與FCV林FCV-21、FCV-49和FCV26391-4相關的肽、蛋白和DNA形式的疫苗,可以首先進行口服或口鼻(ON)施用之后,進行第二次口服或口鼻施用,而沒有以上在實施例2-4和表2-5中提及的先前公開的副作用。應當注意,在本說明書和所附權利要求書中,除非上下文中清楚地另行說明,否則單數形式的冠詞例如"a"、"an"和"the",可以指一個對象或者多個對象。因此,例如,提及含有"化合物"的組合物可以包括單--種化合物或者兩種或更多種化合物。應當理解,上述實施例和描述旨在舉例說明而非限制。許多實施方案對于本領域技術人員而言在閱讀以上描述后將是明顯的。因此,本發明范圍應當參考所附權利要求以及這些權利要求有權要求的整個等同范圍來確定。所有文章和參考文獻,包括專利、專利申請及出版物,的公開為了所有的目的均完整地并入此處作為參考。在表2-1至表2-9中,Felocell4、Felocel14或FELOCELL4或后面有數字"3"的這些詞是Felocell的變體疫苗,Pfizer擁有名稱Felocell的任何變體。提及Felocell4A指無FCV-F9的Felocell4,提及Felocell3A指無FCV-F9的Felocel13。注意,這些研究中使用的實際抗原并非來自該商業產品,相反地這些抗原僅為研究目的而小批地制備,但是制備方法和該商業產品的制備方法相同。鑒于本公開,本文公開和要求保護的所有組合物和/或方法可以無需過度實驗即可制備和實施。盡管本發明組合物和方法以優選實施方案的形式已經進行描述,但是對于本領域技術人員而言明顯地可以對這些組合物和/或方法以及本文描述的該方法的步驟或者步驟的順序進行改變而不偏離本發明的概念、精神和范圍。更具體地,明顯地,可以將本文描述的藥劑替代為化學及生理學上相關的某些藥劑而仍獲得相同或相似的結果。本領域沖支術人員明了的所有這些相似的替代物和修飾被認為落入所附權利要求定義的本發明的精神、范圍和概念之內。編號的本發明描述。其它描述和實施例。1.免疫貓以抵抗貓杯狀病毒(FCV)的方法,該方法包括給貓施用治療有效量的第一和第二疫苗,其中第一和第二疫苗適應于在貓中誘導抗FCV免疫應答,第一疫苗通過胃腸外途徑施用而第二疫苗通過口服或者口鼻途徑施用,并且第二疫苗在第一疫苗施用后N天施用,其中N是3至120天(包括3和120天)的整數,也描述N為大約3周和大約2-4周。2.權利要求l的方法,其中所述疫苗獨立地包含活病毒疫苗、修飾的活病毒疫苗、滅活病毒疫苗、重組疫苗、DNA疫苗或亞單位抗原疫苗中的任一種或其組合。3.權利要求1的方法,其中至少一種疫苗包括一種或多種FCV抹。4.權利要求3的方法,其中所述一種或多種FCV林包括F9或FCV-21或F9和FCV-21。5.權利要求1的方法,其中所述疫苗是相同的。6.權利要求1的方法,其中至少一種疫苗也適應于誘導抗一種或多種選自皰療病毒、貓白血病病毒、貓免疫缺陷病毒、貓全白細胞減少癥病毒和貓衣原體的病原體的免疫應答。7.權利要求1的方法,其中第一疫苗通過皮下施用。8.權利要求1的方法,其中第二疫苗經口或口鼻施用。9.權利要求1的方法,其中第二疫苗或隨后的疫苗在貓出現大約1:6或更高的FCV血清中和滴度之后施用。10.權利要求1至9之任一項的方法,還包括給貓施用治療有效量的第三疫苗,其中該第三疫苗適應于在貓中誘導抗FCV的免疫應答并通過胃腸外、口服或口鼻途徑在笫一或第二疫苗施用后M天施用,其中M是1至120(包括1和120)的整數。11.權利要求10的方法,其中第三疫苗通過皮下途徑施用。12.免疫貓以^氐抗貓杯狀病毒(FCV)的方法,該方法包括給貓施用治療有效量的第一和第二疫苗,其中第一和第二疫苗適應于在貓中誘導抗FCV免疫應答,其中第一疫苗通過口服或口鼻施用而第二疫苗通過口服或口鼻施用,并且第二疫苗在第一疫苗施用后N天施用,其中N是3至120(包括3和120)的整數,也規定N是大約3周和大約2-4周。13.權利要求12的方法,其中FCV林選自FCV-21、FCV-49、FCV26391-4。14.免疫動物的方法,包括給動物施用治療有效量的第一和第二疫苗以及任選的第三疫苗,其中第一和第二疫苗以及任何的第三疫苗適應于誘導免疫應答,并且第一疫苗通過胃腸外或口服施用,第二疫苗通過口服或口鼻施用,第二和任何的第三疫苗在第一疫苗施用后N天施用,其中N是包括3和120在內的3至120的整數,也規定N是大約3周和大約2-4周,并且該方法可以包括任選的該疫苗的每年一次加強施用,包括大約1年的M期。第3部分該部分提供免疫動物以抵抗貓細小病毒(FPV)和貓皰疹病毒(FHV)的方法和組合物此處描述使用疫苗治療和免疫動物,尤其是貓以抵抗由貓杯狀病毒(FCV)引起的貓呼吸道疾病、由貓細小病毒(FPV)引起的貓全白細胞減少癥、由貓皰滲病毒(FHV)(也稱作貓鼻氣管炎病毒)引起的貓病毒性鼻氣管炎的方法和材料。以下描述新的疫苗組合,該組合當以描述的方式給予貓時允許有效的單次口服和口服/口服及皮下/口服遞送FPV和/或FHV疫苗。單次口服意味著可以賦予被免疫接種的動物有效的保護作用的單次口服遞送。口服/口月l指給予兩次口服遞送,類似于以上第2部分中的描述,即,口服后一段時間然后通過口服途徑再給一劑,而皮下/口服是通過皮下給予第一劑之后一段時間然后通過口服途徑再給一劑。此處描述修飾的活FPV和/或修飾的活FHV與修飾的活衣原體疫苗、或修飾的活衣原體疫苗的任何成分,例如生長培養基、細胞裂解物或整個細胞,衣原體本身的任何成分的聯合的遞送。衣原體也稱作貓衣原體或者貓鸚鷸熱衣原體或FCp。當修飾的活FPV獨自或者與修飾的活FCV或修飾的活FHV疫苗聯合給予時,該FPV在以口服/口服方式遞送時是無效的,并且在使用SQ/口服施用途徑時表現出降低的SN滴度。類似地,當修飾的活FHV獨自或者與修飾的活FCV或者與修飾的活FPV疫苗聯合給予時,該FHV在以口服/口服方式遞送時是無效的,并且在使用SQ/口服施用途徑時表現出降低的效力。只有當FPV和/或FHV與修飾的活衣原體疫苗聯合給予時,通過皮下/口服或口服/口服途徑遞送該聯合疫苗才可以提供充足的抗FPV和/或FHV的保護作用。根據上述提供以下實施例。以下實施例旨在舉例說明而非限制,并代表本發明的幾個具體的實施方案。實施例3-1(純理論的).使用FPV和衣原體的皮下/口服免疫接種方案。在帶有或不帶有其它成分的聯合疫苗中提供FPV和衣原體(或修飾的活衣原體疫苗的任何成分)。該修飾的活疫苗可以通過皮下/口服遞送。實施例3-2(純理論的).使用FPV和衣原體的口服/口服免疫接種方案。在帶有或不帶有其它成分的聯合疫苗中提供FPV和衣原體(或修飾的活衣原體疫苗的任何成分)。該修飾的活疫苗可以通過口服/口服遞送。實施例3-3(純理論的).使用FPV、FHV和衣原體的皮下/口服免疫接種方案。在帶有或不帶有其它成分的聯合疫苗中提供FPV、FHV和衣原體(或修飾的活衣原體疫苗的任何成分)。該修飾的活疫苗可以通過皮下/口服遞送。實施例3-4(純理論的).使用FPV、FHV和衣原體的口服/口服免疫接種方案。在帶有或不帶有其它成分的聯合疫苗中提供FPV、FHV和衣原體(或修飾的活衣原體疫苗的任何成分)。該修飾的活疫苗可以通過口服/口服遞送。實施例3-5(純理論的).使用FPV、FHV、FCV和衣原體的皮下/口服免疫接種方案。在帶有或不帶有其它成分的聯合疫苗中提供FPV、FHV、FCV和衣原體(或修飾的活衣原體疫苗的任何成分)。該修飾的活疫苗可以通過口服/口服遞送(表3-1)。實施例3-6(實際的).使用FPV、FHV、FCV和衣原體的口服/口服免疫接種方案。在帶有或不帶有其它成分的聯合疫苗中提供FPV、FHV、FCV和衣原體(或修飾的活衣原體疫苗的任何成分)。該修飾的活疫苗可以通過口服/口服遞送。見表3-l。約8周齡家養短毛貓用FEL0CELL4A和3A成分(含有修飾的活貓鼻氣管炎病毒[FHV]、杯狀病毒[FCV-21]、全白細胞減少癥病毒[FPV]和鸚鵡熱衣原體[FCp])免疫接種。所評價的接種方案包括最初皮下接種之后于第21天皮下加強免疫(SQ/SQ);最初皮下接種之后于第21天一次口服加強免疫(SQ/口服);或者最初口服接種之后于笫21天第二次口服接種。口服接種通過將疫苗施用于口中來實現。第二次免疫接種后從每只貓收集血清樣品,并56。C熱處理30分鐘。樣品在針對FPV的血清中和試驗中評價。表3-1<table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table>FEL0CELL4A:FPV/FHV/FCV-21/FCpFEL0CELL3A:FPV/FHV/FCV-21表3-l的結果提示,如以前文獻中報道的,貓對FPV抗原產生極樣t弱的應答。(口J良施用減毒的貓全白細胞減少癥病毒后無免疫應答。SchultsRD,ScottFW,InfectI隨n.1973,Apr7(4):547-9)。然而,存在衣原體或者與衣原體疫苗有關的任何成分時,該FPVSN滴度高得多,說明體內抗FPV攻擊的效力。而且,我們觀察到不僅SQ/SQ、SQ/口服而且口服/口服組均具有增強的FPV免疫原性。實施例3-7(實際的).使用FPV、FHV、FCV的口服/口服免疫接種方案。在帶有或不帶有其它成分的聯合疫苗中提供FPV、FHV和FCV。該修飾的活疫苗可以口服/口服遞送。見表3-2。約8周齡家養短毛貓用FEL0CELL3A(含有修飾的活貓鼻氣管炎病毒[FHV]、杯狀病毒[FCV-21]和全白細胞減少癥病毒[FPV])免疫接種。所評價的接種方案包括最初皮下接種之后于第21天皮下加強(SQ/SQ);最初皮下接種之后于第21天一次口服加強免疫(SQ/口服);或者最初口服接種之后于第21天第二次口服接種。口服免疫接種通過將疫苗施用于口中來實現。第一次和第二次免疫接種后從每只貓收集血清樣品,并56C熱處理30分鐘。在針對FPV的血清中和試驗中分析這些樣品。表3-2<table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table>表3-2的結果說明,存在于FELOCELL3A疫苗中的FPV抗原當通過口月1/口服給予時誘導了極小的免疫應答(與表3-1的結果一致)。然而,當這些疫苗以SQ/SQ或SQ/口服給予時,觀察到高FPVSN滴度,說明了體內效力。編號的本發明描述。其它描述和實施例。以下注意,FCV是貓杯狀病毒,FPV是貓細小病毒(也稱作全白細胞減少癥或FPL),以及最后FHV是貓皰滲病毒。1.免疫原性組合物,包含在一個施用刑量中施用的修飾的活FPV和修飾的活衣原體兩者。2.疫苗,包含在兩個分開的單施用劑量中遞送給貓的修飾的活FPV和修飾的活衣原體,所述的兩個單施用劑量通過口服或口鼻途徑遞送并且在時間上間隔3至120天,或者大約3周或大約2周。3.免疫貓以抵抗FPV的方法,該方法包括給貓施用治療有效量的第一和第二疫苗,其中第一和第二疫苗適應于在貓中誘導抗FPV的免疫應答,第一疫苗通過口服或口鼻施用而第二疫苗通過口服或口鼻施用,第二疫苗在第一疫苗施用后N天施用,其中N是包括3和120在內的3至120的整數,或者其中N是大約3周或其中N是大約2周,其中所述第一和第二疫苗由修飾的活FPV和修飾的活衣原體組成。4.免疫原性組合物,包含在單個施用劑量中施用的修飾的活FHV和修飾的活衣原體。5.疫苗,包含在兩個分開的單施用劑量中遞送給貓的修飾的活FHV和修飾的活衣原體,所述兩個單施用劑量通過口服或口鼻途徑施用,并且在時間上間隔3至120天,或者大約3周或大約2周。6.免疫貓以抵抗FHV的方法,該方法包括給貓施用治療有效量的第一和第二疫苗,其中第一和第二疫苗適應于在貓中誘導抗FHV的免疫應答,第一疫苗通過口服或口鼻施用并且第二疫苗通過口服或口鼻施用,第二疫苗在第一疫苗施用后N天施用,其中N是包括3和120在內的3至120的整數,或者其中N是大約3周或其中N是大約2周,其中所述第一和第二疫苗由修飾的活FHV和修飾的活衣原體組成。7.免疫原性組合物,包含在單個施用劑量中施用的修飾的活FCV和修飾的活衣原體。8.疫苗,包含在兩個分開的單施用劑量中遞送給貓的修飾的活FCV和修飾的活衣原體,所述兩個單施用劑量通過口服或口鼻途徑施用,并且在時間上間隔3至120天,或者大約3周或大約2周。9.免疫貓以抵抗FCV的方法,該方法包括給貓施用治療有效量的第一和第二疫苗,其中第一和第二疫苗適應于在貓中誘導抗FCV的免疫應答,第一疫苗通過口服或口鼻施用并且第二疫苗通過口服或口鼻施用,第二疫苗在第一疫苗施用后N天施用,其中N是包括3和120在內的3至120的整數,或者其中N是大約3周或其中N是大約2周,其中所述第一和第二疫苗由修飾的活FCV和修飾的活衣原體組成。10.免疫原性組合物,包含在單個施用劑量中施用的修飾的活FPV、修飾的活FHV和修飾的活衣原體。11.疫苗,包含在兩個分開的單施用劑量中遞送給貓的修飾的活FPV、修飾的活FHV和修飾的活衣原體,所述兩個單施用劑量通過口服或口鼻途徑施用,并且在時間上間隔3至120天,或者大約3周或大約2周。l2.同時免疫貓以抵抗FPV和FHV的方法,該方法包括給貓施用治療有效量的第一和第二疫苗,其中第一和第二疫苗適應于在貓中誘導抗FPV和FHV的免疫應答,第一疫苗通過口服或口鼻施用并且第二疫苗通過口服或口鼻施用,第二疫苗在第一疫苗施用后N天施用,其中N是包括3和120在內的3至120的整數,或者其中N是大約3周或其中N是大約2周,其中所述第一和第二疫苗包含修飾的活FPV、修飾的活FHV和修飾的活衣原體。13.免疫原性組合物,包含在單個施用劑量中施用的修飾的活FPV、修飾的活FCV和修飾的活衣原體。14.疫苗,包含在兩個分開的單施用劑量中遞送給貓的修飾的活FPV、修飾的活FCV和修飾的活衣原體,所述兩個單施用劑量通過口服或口鼻途徑施用,并且在時間上間隔3至12Q天,或者大約3周或大約2周。15.同時免疫貓以抵抗FPV和FCV的方法,該方法包括給貓施用治療有效量的第一和第二疫苗,其中第一和第二疫苗適應于在貓中誘導抗FPV和FHV的免疫應答,第一疫苗通過口服或口鼻施用并且第二疫苗通過口服或口鼻施用,第二疫苗在笫一疫苗施用后N天施用,其中N是包括3和120在內的3至120的整數,或者其中N是大約3周或其中N是大約2周,其中所述第一和第二疫苗包含修飾的活FPV、修飾的活FHV和修飾的活衣原體。16.免疫原性組合物,包含在單個施用劑量中施用的修飾的活FHV、修飾的活FCV和修飾的活衣原體。17.疫苗,包含在兩個分開的單施用劑量中遞送給貓的修飾的活FHV、修飾的活FCV和修飾的活衣原體,所述兩個單施用劑量通過口服或口鼻途徑施用,并且在時間上間隔3至120天,或者大約3周或大約2周。18.同時免疫貓以抵抗FHV和FCV的方法,該方法包括給貓施用治療有效量的第一和第二疫苗,其中第一和第二疫苗適應于在貓中誘導抗FHV和FCV的免疫應答,第一疫苗通過口服或口鼻施用并且第二疫苗通過口服或口鼻施用,第二疫苗在第一疫苗施用后N天施用,其中N是包括3和120在內的3至120的整數,或者其中N是大約3周或其中N是大約2周,其中所述第一和第二疫苗包含修飾的活FHV、修飾的活FCV和修飾的活衣原體。19.免疫原性組合物,包含在單個施用劑量中施用的修飾的活FPV、修飾的活FHV、修飾的活FCV和修飾的活衣原體。20.疫苗,包含在兩個分開的單施用劑量中遞送給貓的修飾的活FPV、修飾的活FHV、修飾的活FCV和修飾的活衣原體,所述兩個單施用劑量通過口服或口鼻途徑施用,并且在時間上間隔3至120天,或者大約3周或大約2周。21.同時免疫貓以抵抗FPV、FHV和FCV的方法,該方法包括給貓施用治療有效量的第一和第二疫苗,其中第一和第二疫苗適應于在貓中誘導抗FPV的免疫應答,第一疫苗通過口服或口鼻施用并且第二疫苗通過口服或口鼻施用,第二疫苗在第一疫苗施用后N天施用,其中N是包括1和120在內的1至120的整數,或者其中N是大約3周或其中N是大約2周,其中所述第一和第二疫苗包含修飾的活FPV、修飾的活FHV、修飾的活FCV和修飾的活衣原體。權利要求1.用于免疫貓以抵抗貓杯狀病毒的疫苗,其包含FCV-21衣殼蛋白或分離的FCV-21衣殼蛋白。2.用于免疫貓以抵抗貓杯狀病毒的疫苗,其包含FCV-21衣殼蛋白或分離的FCV-21衣殼蛋白和藥學上可接受的載體,其中所述衣殼蛋白包含蛋白質序列(SEQIDN0:13)和具有至少大約91.2%、95%和99%同一性的序列;其中所述衣殼蛋白以有效產生免疫應答的量提供。3.用于免疫貓以抵抗貓杯狀病毒的DNA疫苗,其包含編碼FCV-21衣殼蛋白或分離的FCV-21衣殼蛋白的核酸序列,其中所述DNA包含序列(SEQIDNO:12)和具有至少大約78.7%和79.2%的序列同一性和允許保守替代的序列。4.用于免疫貓以抵抗貓杯狀病毒的疫苗,其包含FCV-49衣殼蛋白或分離的FCV-49衣殼蛋白,其中所述衣殼蛋白包含來自FCV-49林的蛋白質序列。5.用于免疫貓以抵抗貓杯狀病毒的疫苗,其包含FCV-49衣殼蛋白或分離的FCV-49衣殼蛋白和藥學上可接受的載體,其中所述衣殼蛋白包含蛋白質序列(SEQIDNO:15)和具有至少大約92.7°/。、95%和99%同一性的序列;其中所述衣殼蛋白以有效產生免疫應答的量提供。6.用于免疫貓以抵抗貓杯狀病毒的DNA疫苗,其包含編碼FCV-49衣殼蛋白或分離的FCV-49衣殼蛋白的核酸序列,其中所述DNA包含序列(SEQIDN0:14)和具有至少大約78.9%,即,79,4%(78.9+0.5)的序列同一性和允許保守替代的序列。7.權利要求l-6之任一項的疫苗,其還包含以下的單獨一項或任何組合其中該疫苗含有佐劑,其中該FCV成分是活的,其中該FCV成分是減毒的,其中該FCV成分是滅活的,其中該疫苗可以包括至少一種選自FCV-F9、FCV-LLK、FCV-M8、FCV-255和FCV-2280的其它貓杯狀病毒林。8.免疫貓以^氐抗貓杯狀病毒(FCV)的方法,該方法包括給貓施用治療有效量的第一和第二疫苗,其中該第一和第二疫苗適應于在貓中誘導抗FCV的免疫應答,該第一疫苗通過胃腸外施用且第二疫苗通過口服或口鼻施用,該第二疫苗在第一疫苗施用后N天施用,其中N是包括3和120在內的3至120的整數。9.權利要求8的方法,其中所述疫苗獨立地包含活病毒疫苗、修飾的活病毒疫苗、滅活病毒疫苗、重組疫苗、DM疫苗或亞單位抗原疫苗中的任一種或其組合。10.權利要求9的方法,其中所述疫苗中的至少一種包括一種或多種FCV抹。11.權利要求10的方法,其中所述一種或多種FCV林包括F9或FCV-21或F9和FCV-21。12.免疫原性組合物,其包含在單個施用劑量中施用的修飾的活FPV和修飾的活衣原體,和/或包含在單個施用劑量中施用的修飾的活FHV和修飾的活衣原體,和/或包含在單個施用劑量中施用的修飾的活FCV和修飾的活衣原體,和/或包含在單個施用劑量中施用的修飾的活FPV、<務飾的活FHV和^f務飾的活衣原體,和/或包含在單個施用劑量中施用的修飾的活FPV、修飾的活FCV和修飾的活衣原體,和/或包含在單個施用劑量中施用的》務飾的活FHV、修飾的活FCV和修飾的活衣原體,和/或包含在單個施用劑量中施用的修飾的活FPV、修飾的活FHV、修飾的活FCV和修飾的活衣原體。13.疫苗,其包含在兩個分開的單施用劑量中遞送給貓的修飾的活FPV和修飾的活衣原體,和/或包含在兩個分開的單施用劑量中遞送給貓的修飾的活FHV和修飾的活衣原體,和/或包含在兩個分開的單施用劑量中遞送給貓的修飾的活FCV和修飾的活衣原體,和/或包含在兩個分開的單施用劑量中遞送給貓的修飾的活FPV、修飾的活FHV和修飾的活衣原體,和/或包含在兩個分開的單施用劑量中遞送給貓的修飾的活FPV、修飾的活FCV和修飾的活衣原體,和/或包含在兩個分開的單施用劑量中遞送給貓的修飾的活FHV、修飾的活FCV和修飾的活衣原體,和/或包含在兩個分開的單施用劑量中遞送給貓的修飾的活FPV、^修飾的活FHV、^修飾的活FCV和^"飾的活衣原體,所述兩個單施用劑量通過口服或口鼻途徑施用且時間上間隔3至120天。14.免疫貓以抵抗FPV、FCV和/或FHV的方法,該方法包括給貓施用治療有效量的第一和第二疫苗,其中第一和第二疫苗適應于在貓中誘導抗FPV和/或FCV和/或FHV的免疫應答,第一疫苗通過口服或口鼻施用且第二疫苗通過口服或口鼻途徑施用,第二疫苗在第一疫苗施用后N天施用,其中N是包括3和120在內的3至120的整數,其中所述第一和第二疫苗由如下組合物組成,所述組合物a)包含修飾的活FPV和修飾的活衣原體;和/或b)包含修飾的活FHV和纟務飾的活衣原體;和/或c)包含修飾的活FCV和修飾的活衣原體;和/或d)包含修飾的活FPV、修飾的活FHV和修飾的活衣原體;和/或e)包含修飾的活FPV、{務飾的活FCV和^f務飾的活衣原體;和/或f)包含修飾的活FHV、修飾的活FCV和修飾的活衣原體;和/或g)包含lt飾的活FPV、^修飾的活FHV、<務飾的活FCV和^務飾的活衣原體,或其任何組合。15.本文所述的用于治療動物,尤其是貓的任何免疫原性組合物、疫苗和方法。全文摘要本發明涉及用于免疫貓以抵抗貓病毒的疫苗。本發明還涉及編碼分離的貓杯狀病毒的衣殼蛋白的核酸克隆。本發明還涉及含有分離的貓杯狀病毒的活或死疫苗、含有分離的貓杯狀病毒的衣殼蛋白的亞單位疫苗、含有分離的貓杯狀病毒的核酸克隆的核酸疫苗、和包含編碼分離的貓杯狀病毒的衣殼蛋白的核酸的重組病毒載體疫苗。本發明也涉及鑒定可用于疫苗組合物的制備以及診斷感染貓杯狀病毒的貓的試驗中的貓杯狀病毒的方法。本發明還公開免疫動物,特別是貓以抵抗疾病,尤其是,貓杯狀病毒(FCV)的方法。該方法包括給貓施用治療有效量的第一和第二FCV疫苗。所述第一疫苗通過口服或腸胃外途徑(例如,皮下、肌內等途徑)施用。所述第二疫苗在第一疫苗使用后N天通過口服或口鼻途徑施用,其中N是包括3和120在內的3至120的整數。也可以給予第三疫苗施用。本發明也描述使用疫苗治療和免疫動物,尤其是貓以抵抗FPV或貓細小病毒(也稱作全白細胞減少癥或FPL)以及另一種疾病,FHV或貓皰疹病毒(也稱作貓鼻氣管炎病毒)的方法和材料。文檔編號A61K48/00GK101563096SQ200680035988公開日2009年10月21日申請日期2006年7月17日優先權日2005年7月28日發明者C·M·塔克爾,D·E·洛沃里,P·M·克萊爾,P·M·吉蒙德,T·J·紐比,欣容申請人:輝瑞產品公司