專利名稱：：用于治療呈現存活蛋白抗原的腫瘤的組合物和方法
技術領域：
：本發明涉及月于腫瘤治療的疫苗接種方案。具體地，本發明涉及疫苗組合物，其在人中刺激對人存活蛋白的免疫應答，因此攻擊過量表達存活蛋白的腫瘤患病細胞。具體地，本發明涉及疫苗組合物，其包含來自非哺
背景技術：
免疫系統通過監控細胞的蛋白質組成來部分地實現了其監視功能。在稱作T細胞抗原呈遞的過程中，細胞內的蛋白質被加工為肽。加工的肽的亞組(抗原)被運出至細胞表面，與一類受體的成員特異性結合，所述一類受體被稱作主要組織相容性復合體(MHC)受體。這些MHC肽復合體通過與已知為T細胞受體(TCR)的T細胞表面蛋白質相互作用，由特化的免疫細胞T細胞取樣。每個給定的T細胞在其表面攜帶獨特的TCR。當T細胞的TCR與MHC-肽復合體產生性相互作用時，免疫應答#^活化，這導致呈遞特定MHC-肽復合體的細胞的消除。通常，如果呈遞的抗原來自宿主(所謂的"自身"抗原)，相互作用為非生產性的。一般地，免疫應答由與來自外源蛋白質的抗原的相互作用來活化，例如與來自感染病毒的組成性蛋白質的抗原相互作用來活化。通過活化免疫治療腫瘤的目的是誘導免疫系統識別和消除腫瘤細胞。正如在任何其他細胞中，腫瘤細胞上的肽抗原來自表達的蛋白質的所有組成成分(repertoire)。正如病毒抗原在受感染的細胞中一樣，來自腫瘤中差別表達的蛋白質的腫瘤富含的抗原原則上是免疫監視的靶標。因此，為了消除腫瘤的目的，所述抗原可以被用來控制免疫系統的分支，其已經被進化為對抗細胞內感染。一種此類腫痛富含的蛋白質是存活蛋白。肺瘤細胞通常過量表達存活蛋白蛋白質，這4史認為阻斷了細胞凋亡并且因此干擾阻止腫瘤細胞異常生長的機制。另一方面，正常細胞表達非常少的存活蛋白。(見例如，Ambrosini等人，(1997)Nat.Med.，3:917-921)。因此，存活蛋白是理想的腫瘤特異性或腫瘤富含的抗原。可以有用地將存活蛋白蛋白質的抗原形式遞送到抗原呈遞細胞，從而可以刺激對存活蛋白的免疫應答。但是，與病毒感染的細胞相反，存話蛋白與許多其他在腫瘤中差別表達的蛋白質類似，是宿主蛋白質，并且不活化免疫系統。因此，在本領域中仍需要開發引發針對腫瘤細胞，特別是特征為過量表達存活蛋白的那些腫瘤細胞的有效免疫應答的有效組合物和方法。發明概述本發明提供了引發針對腫瘤細胞的有效免疫應答的有效組合物和方法。具體地，本發明提供了使用腫瘤富含的蛋白質的抗原形式作為T細胞抗原的接種方案。特別地，本發明提供了肺瘤富含的蛋白質存活蛋白的抗原形式。因此，本發明一方面涉及包含核酸的疫苗，所述疫苗編碼至少一種來自非哺乳動物存活蛋白的肽。備選地，本發明涉及包括至少一種來自非哺乳動物存活蛋白的肽的疫苗。如本文所用的，"非哺乳動物存活蛋白"包括至少任何具有BIR結構域(或IAP結構域)的存活蛋白蛋白質，所述結構域與人存活蛋白BIR結構域具有多于50%的氨基酸同一性但是少于90%的氨基酸同一性，例如與人存活蛋白BIR結構域具有至少55%、60%、65%、70%、75%、80%或85%的同一性。"非哺乳動物存活蛋白，，還包括質。如本文所用的，"肽"包括具有任何數量氨基酸的肽，包括全長存活蛋白蛋白質。特別地，肽可以包含至少8、9、10、15、20、25、30或更多個氨基酸。在一個優選的實施方案中，本發明的疫苗包括編碼來自非哺乳動物存活蛋白的肽的核酸。核酸可以包括哺乳動物啟動子。在一個實施方案中，核酸是棵DNA。在另一個實施方案中，核酸是用增強哺乳動物細胞轉染的試劑配制的。本發明的疫苗還可以包括佐劑。在一個實施方案中，核酸是病毒顆粒例如腺病毒顆粒的一部分。適合于本發明的腺病毒顆粒包括來自能夠復制的腺病毒的那些，或來自條件復制腺病毒("CRAD")(僅在某些細胞或僅在某些條件中復制)的那些，或來自無能力復制的腺病毒的那些。其他適當的病毒顆粒包括但不限于來自慢病毒或其他RNA病毒、腺伴隨病毒、輪狀病毒或痘苗病毒等的病毒顆粒。在一個實施方案中，疫苗包括含有核酸的細菌。優選地，細菌是腸細菌，如沙門氏菌屬(Salmonella)、埃希氏菌屬(Escherichia)或克雷伯氏菌屬(Klebsiella)。其他細菌(例如利斯特菌屬物種(Listeriaspecies))也可以用來作為此類核酸的宿主。細菌可以是野生型細菌或可以包含突變，所述突變例如減輕了其致病性。通常，優選使用細菌的突變形式，例如營養缺陷型。在另一個優選的實施方案中，本發明的疫苗編碼或包括來自非哺乳動物存活蛋白的肽。優選地，來自非哺乳動物存活蛋白的肽包括BIR結構域。通常，來自非哺乳動物存活蛋白的BIR結構域與人存活蛋白BIR結構域具有多于50%的氨基酸同一性，但是少于80。/。的氨基酸同一性。非哺乳動物存活蛋白來自鳥、魚、爬行動物、兩棲動物或其他脊推動物。在優選的實施方案中，非哺乳動物存活蛋白來自雞。在一些實施方案中，本發明的疫苗編碼或包括來自非哺乳動物存活蛋白的肽，其具有促進T細胞抗原呈遞的突變。例如，非哺乳動物存活蛋白突變肽可以在對應于人存活蛋白Asn97、Thr99、VallOO、或GlnlOl的位置處包含氨基酸取代。更具體地，來自雞或其他物種的非哺乳動物存活蛋白可以包含下列氨基酸取代之一N97E、T99M、V100L或Q101G。在另一實例中，來自蛙SIX存活蛋白的肽包含在等價位置ThrllO和/或Serl12的取代。在具體的實例中，來自蛙SIX存活蛋白的肽包含取代ThrllOMet和/或Serll2Gly。在其他實施方案中，本發明的疫苗編碼或包含來自非哺乳動物存活蛋白的肽，其具有可能消除BIR結構域生物學活性的突變。例如，來自非哺乳動物存活蛋白的肽可以包含在對應于人存活蛋白Argl8、Cys57、Cys60、His77或Cys84的位置處的至少一個氨基酸取代。另外，非哺泉動物存活蛋白可以任選地包含氨基酸缺失。在一個實例中，非哺乳動物存活蛋白部分包含C端缺失。在另一個實例中，非哺乳動物存活蛋白包含N端缺失。在其他實施方案中，本發明的疫苗能夠活化T細胞，所述T細胞識別癌細胞上與MHC分子復合的人存活蛋白肽序列。具體地，此類人存活蛋白肽序列可以是例如LTLGEFLKL(SEQIDNO:l)，CPTENEPDL(SEQIDNO:2)或EPDLAQCFF(SEQIDNO:3)。在一些實施方案中，來自非哺乳動物存活蛋白的肽與Fc部分融合或綴合。優選的Fc部分來自哺乳動物Fc區域，更優選來自人Fc區域。Fc部分可以包含突變，所述突變促進裝配，例如用絲氨酸取代IgGl鉸合部的序列EPKSCDK(SEQIDNO:4)中的半胱氨酸。因此，Fc部分可以包含4務飾的序列EPKSSDK(SEQIDNO:5)。Fc部分也可以包含突變，所述突變減少不需要免疫應答的區域的免疫原性，例如，融合蛋白部分之間的接頭。在選擇的實施方案中，來自非哺乳動物存活蛋白的肽與效應分子協同作用，所述效應分子有助于免疫應答。例如，此類效應分子可以是細胞因子部分，其包4舌但不限于IL-2、IL-7、IL-12、IL-18、IL-21、IL-23、GM-CSF或任何其他細胞因子，特別是能夠活化Thl免疫應答的那種。此類效應分子也可以是阻抑克疫系統的細胞因子的抑制劑，例如STAT3抑制劑(例如顯性失活STAT3蛋白質，如STAT3P)。細胞因子或其他效應分子還可以包含突變。例如，細胞因子可以在對應于IL-2的Cysl25的位置上包舍Ser取代。來自非哺乳動物存活蛋白的肽和有助于免疫應答的另一種肽，包括上述效應分子。編碼非哺乳動物存活蛋白肽和效應分子肽的區域可以在單個轉錄單元中，或在兩個分離的轉錄單元中。備選地，本發明的疫苗包括編碼來自非哺乳動物存活蛋白的肽的核酸和編碼另一肽的分離的核酸，所述另一肽包括上述有助于免疫應答的效應分子。在另一個實施方案中，本發明的疫苗包括來自非哺乳動物存活蛋白的肽和另一肽，所述另一肽包括上述有助于免疫應答的效應分子。在一個實施方案中，來自非哺乳動物存活蛋白的肽與包括效應分子的肽融合或綴合。非哺乳動物存活蛋白和效應分子融合蛋白質可以另外與上述Fc部分融合或綴合。在另一方面，本發明涉及疫苗，所述疫苗包括編碼修飾的哺乳動物存活蛋白肽的核酸。備選地，本發明涉及疫苗，所述疫苗包括修飾的哺乳動物存活蛋白肽。修飾的哺乳動物存活蛋白肽是生物學惰性的，但是在免疫上實質上與哺乳動物存活蛋白類似。如本文所用的，"生物學惰性"是指存活蛋白肽，其不能實質上行使或影響通常與正常存活蛋白相關的活性。例如，"生物學惰性"存活蛋白肽不具有實質的抗凋亡活性，其也不能實質上干擾通常與內源存活蛋白蛋白質相關的抗凋亡活性。生物學惰性存活蛋白一般不具有實質的顯性失活的效應。如本文用到的，"免疫上實質與哺乳動物存活蛋白類似"是指修飾的存活蛋白肽，如與對應于非修飾的哺乳動物存活蛋白肽一樣，所述修飾的存活蛋白肽能夠引發針對相同靶序列的至少一種免疫應答。可以例如通過響應乾序列的CD8+T細胞群體或CD8+T細胞的IF1NP/的釋放測量免疫應答。在一個優選的實施方案中，本發明的疫苗包括編碼修飾的哺乳動物存活蛋白肽的核酸。核酸可以包括哺乳動物啟動子，在一個實施方案中，核酸是棵DNA。在另一個實施方案中，核酸用增強哺乳動物細胞轉染的試劑配制。本發明的疫苗還可以包括佐劑。在一個實施方案中，編碼修飾的哺乳動物存活蛋白肽的核酸是病毒顆粒例如腺病毒顆粒的一部分。適合用于本發明的腺病毒顆粒包括來自能夠復制的腺病毒的那些，或來自條件性復制腺病毒("CRAD")(其僅在某些細胞或僅在某些條件下復制)的那些，或來自不能復制的腺病毒的那些。其他適當的病毒顆粒包括但不限于來自慢病毒或其他RNA病毒、腺伴隨病毒、輪狀病毒或痘苗病毒等的病毒顆粒。在一個實施方案中，疫苗包括含有編碼修飾的哺乳動物存活蛋白肽的核酸的細菌。優選地，細菌是腸細菌，例如沙門氏菌屬(Salmonella)、埃希氏菌屬(Escherichia)或克雷伯氏菌屬(Klebsiella)。其他細菌例如利斯特菌屬物種(Listeriaspecies)也可以被用于容納此類核酸。細菌可以是野生型細菌或可以包含突變，所述突變例如削弱了其致病性。通常優選使用細菌的突變形式，例如營養缺陷型。在另一個優選的實施方案中，本發明的疫苗包括修飾的哺乳動物存活蛋白肽。優選地，修飾的哺乳動物存活蛋白肽包括修飾的BIR結構域。修飾的BIR結構城可以在一定位置上包括至少一個氨基酸取代，所述位置對應于人存活蛋白的Argl8、Cys57、Cys60、His77和Cys84。備選地，或另外，修飾的哺乳動物存活肽包括修飾的螺旋結構域。修飾的螺i走結構域可以在一定位置上包括至少一個氨基酸取代，所述位置對應于人存活蛋白的Lysl22、Alal28和Ile135。例如，修飾的螺旋結構域可以在對應于人存活蛋白Alal28的位置上包含Pro。修飾的螺旋結構域還可以在對應于Ilel35的位置上包括Pro。修飾的哺乳動物存活蛋白肽優選包含一個或多個I類MHCT細胞表位。例如，修飾的哺乳動物存活肽可以包括氨基酸序列LTLGEFLKL(SEQIDNO:l)或LMLGEFLKL(SEQIDNO:6)。在一些實施方案中，修飾的哺乳動物存活蛋白肽與Fc部分融合。修飾的Fc部分來自哺乳動物Fc區域，更優選來自人Fc區域。Fc部分可以包含改善裝配的突變，例如在IgGl鉸合部的序列EPKSCDK(SEQIDNO:4)用絲氨酸取代半胱氨酸。因此，Fc部分可以包含修飾的序列EPKSSDK(SEQIDNO:5)。Fc部分也可以包含這樣的突變，所述突變減少不需要免疫應答的區域的免疫原性，所述區域例如融合蛋白部分之間的接頭。在某些實施方案中，修飾的哺乳動物存活蛋白肽與效應分子協調作用，所述效應分子有助于免疫應答。例如，此類效應分子可以是細胞因子部分，其包括但不限于IL-2、IL畫7、IL-12、IL畫18、IL-21、IL鬧23、GM隱CSF或任何其他細胞因子，特別是能夠活化Thl免疫應答的一個。此類效應分子也可以是抑制免疫應答的細胞因子的抑制劑，例如STAT抑制劑(例如顯性失活的STAT3蛋白質，例如STAT3卩)。細胞因子或其他效應分子也可以包含突變。例如，細胞因子可以在對應于IL2的Cysl25位置上包含Ser取代。因此，在優選的實施方案中，本發明的疫苗包括核酸，所述核酸編碼修飾的哺乳動物存活蛋白肽和另一種肽，所述另一種肽包括上述有助于免疫應答的效應分子。編碼修飾的哺乳動物存活蛋白肽和效應分子肽的區域可以是在單個的轉錄單元中，或在兩個分別的轉錄單元中。備選地，本發的有助于免疫應答的效應分子的另一種肽的分離的核酸。在其他實施方案中，本發明的疫苗包括修飾的哺乳動物存活蛋白肽和另一種肽，所述另一種肽包括上述的有助于免疫應答的效應分子。在一個實施方案中，修飾的哺乳動物存活蛋白肽與包括效應分子的肽融合或綴合。修飾的哺乳動物存活蛋白肽和效應分子融合蛋白可以另外與上述的Fc部分融合或綴合。在另一方面，本發明涉及能夠引發針對表達人存活蛋白的細胞的免疫應答的核酸。該核酸編碼包含氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列與人存活蛋白BIR結構域具有多于50%的同一性，但是少于80%的同一性，并且所述核酸包含能夠在哺乳動物細胞中表達肽的啟動子。本發明還涉及治療方法，包括施用上述疫苗或核酸。具體地，本發明提供了治療癌癥和其他疾病的方法，所述疾病包括不希望的細胞增殖。本發明的治療方法可以任選地包括其他步驟，例如首先測試表達高水平存活蛋白的患者腫瘤的步驟。另一任選的步驟是在施用本發明的疫苗或核酸之前用溫和的免疫抑制劑(例如低劑量的環磷酰胺)預治療患者。不希望被理論束縛，此類預治療的一個效果是減少T調節細胞的數量。因此，其他具有類似效果的預治療也包括在本發明中。除了存活蛋白，本發明還可以應用于可以用作抗原的多種蛋白質，例如腫瘤特異性抗^、病毒抗原和其他抗原。在腫瘤特異性抗原中，除了存活蛋白，本發明還可以應用于表皮細胞粘著分子，癌基因例如Ras、癌胚抗原和其他腫瘤特異性或腫瘤富含的蛋白質。在病毒抗原中，本發明可以應用于HIV的p24、流行性感冒血凝素、和其他病毒蛋白質。總體來說，本發明涉及下述,用于治療人中肺瘤和腫瘤相關疾病的疫苗，其包含(a)耒自非哺乳動物存活蛋白的肽或編碼所述肽的核酸，其中所述非哺禮動物存活蛋白包含BIR結構域，其與跨越人存活蛋白的Aspl6至Leu87的BIR結構域具有50%至90%的氨基酸同一性，或(b)來自f賢飾的哺乳動物存活蛋白的肽或編碼所述肽的核酸，其中所述修飾的哺乳動物存活蛋白包含BIR結構域中的突變，所述突變基本上消除了BIR結構域的生物學活性，以及(c)任選地佐劑；所述疫苗引發人中對人存活蛋白的免疫應答。相應的疫苗，其中所述由疫苗引起的免疫應答產生攻擊表達人存活蛋白的細胞的CD8+T細胞。參相應的疫苗，其中所述肽來自非哺乳動物存活蛋白。爭相應的疫苗，其中所述BIR結構域與所述人存活蛋白BIR結構域具有50%至80%的氨基酸同一性。爭相應的疫苗，其中非哺乳動物存活蛋白來自鳥、魚、爬行動物或兩棲動物，優選來自雞。參相應的疫苗，其中來自非哺乳動物存活蛋白的肽包含一個或多個突變，所述突變促進通過結合至MHC分子的T細胞抗原呈遞。*相應的疫苗，其中非哺乳動物存活蛋白是雞的，且突變是在雞存活蛋白的Asn97、Thr99、Val100或Glnl01的一個或多個位置處的氨基酸取代。優選的突變是N97E、和/或T99M、和/或V100L、和/或Q101G。SEQIDNO:12的疫苗，其中突變是N97E、T99M、V100L和Q101G。*相應的疫苗，其中非哺乳動物存活蛋白包含BIR結構域中的突變，所述突變基本上喪失了BIR結構域的生物學活性。"目應的疫苗，其中所述被消除的生物學活性是細胞凋亡。相應的疫苗，其中所述來自非哺乳動物存活蛋白的肽在對應于人存活蛋白Argl8、Pro47、Cys57、Cys60、His77和Cys84的一個或多個位置包含氨基酸取代。"目應的疫苗，其中疫苗能夠活化識別與MHC分子復合時的人存活蛋白肽序列的T細胞，所述人存活蛋白肽序列選自下列肽LTLGEFLKL、CPTENEPDL和EPDLAQCFF。參相應的疫苗，其中肽來自修飾的哺乳動物存活蛋白，優選的人存活蛋白。爭相應的疫苗，其中所述來自修飾的人存活蛋白的肽包含人的存活蛋白Argl8、Pro47、Cys57、Cys60、His77和Cys84的一個或多個位置處的氨基酸取代。*相應的疫苗，其中來自修飾的哺乳動物存活蛋白的肽包含修飾的螺旋結構域，并且在人存活蛋白的Lysl22和/或Alal28和/或Ilel35的位置包含氨基酸取代。爭相應的疫苗，其中突變至少是Alal28P和/或11el35P。SEQIDNO:56的疫苗，其包含修飾的人存活蛋白，所述人存活蛋白具有下列突變R18E、P47L、Q56L、H77A、C84A、A128P、和1135P。參相應的疫苗，其中修飾的哺乳動物存活蛋白肽包含氨基酸序列LTLGEFLKL或LMLGEFLKL。，相應的疫苗，其中來自非哺乳動物存活蛋白的肽和來自修飾的哺乳動物存活蛋白的肽與Fc部分融合。參相應的疫苗，其中疫苗另外編碼或包括來自效應分子的肽，優選的選自IL-2、IL-7、IL-12、IL-18、IL-21、IL-23和GM-CSF的細胞因子。*相應的疫苗，其中編碼來自非哺乳動物存活蛋白或來自修飾的哺乳動物存活蛋白的肽的核酸包含哺乳動物啟動子，且優選是棵DNA。，相應的疫苗，其中核酸與增強哺乳動物細胞轉染的試劑一起配制。參相應的疫苗，其中核酸是病毒顆粒的部分，優選腺病毒顆粒的部分。參相應的疫苗，其中疫苗包含含有核酸的細菌，其中細菌優選是腸細菌，更優選是沙門氏菌屬。用于針對過量表達存活蛋白的腫瘤細胞免疫人的藥物組合物，其包含在權利要求和說明書中說明的疫苗，任選地與可接受的載體、稀釋劑或賦形劑一起。*相應的疫苗的用途，其用于制備針對過量表達人存活蛋白的腫瘤細胞免疫患者的藥物。附圖簡述圖l是存活蛋白同源物的蛋白質序列的比對。比對通過ClustalW方法進行(見Thompson等人，(1994)Nucl.AcidRes.22:4673-4680)。序列從NCBI數據庫獲得，使用下列檢索號人存活蛋白(檢索號NM—001168，SEQIDNO:8),狗存活蛋白(NP_001003019，SEQIDNO:9)，豬存活蛋白(NP—999306，SEQIDNO:39),奶牛存活蛋白(NP_001001855,SEQIDNO:40),貓存活蛋白(NP_001009280，SEQIDNO:41)，小鼠存活蛋白(NPJB3819,SEQIDNO:10)，大鼠存活蛋白(AAF82586,SEQIDNO:42),猩猩存活蛋白(CAH91231,SEQIDNO:43),雞存活蛋白(NP—001012318，SEQIDNO:ll)，光滑爪蟾(Xenopuslaevis)SIX(AAO20085，SEQIDNO:13)、光滑爪蟾存活蛋白同源物(AAM76714,SEQIDNO:46)、光滑爪蟾存活蛋白同源物2(AAH89271,SEQIDNO:47)、鯰魚存活蛋白同源物(CK419466,SEQIDNO:52)、斑馬魚存活蛋白同源物(NP_919378，SEQIDNO:48)，斑馬魚存活蛋白同源物2(NP_660196，SEQIDNO:49)，河豚魚存活蛋白樣同源物(CAG04432,SEQIDNO:50)、和河豚魚存活蛋白樣同源物2(CAG07433,SEQIDNO:51)。BIR結構域下劃線；星號指示了涉及Zn配位的標記殘基；破折號指示了比對中的空位。在非人序列中，與人殘^目同的殘基以句號表示；其他殘基以單字母氨基酸密碼子表示。圖2是多種存活蛋白同源物的BIR結構域比較的氨基酸同一性百分比的表。序列l是人序列；序列2來自狗；序列3來自豬；序列4來自奶牛；序列5來自貓；序列6來自小鼠；序列7來自大鼠；序列8來自猩猩；序列9來自雞；序列IO來自蛙屬的光滑爪蟾SIX蛋白質；序列ll來自蛙屬光滑爪蟾同源物；序列12來自蛙屬光滑爪蟾同源物2;序列13來自鯰魚同源物；序列14來自斑馬魚同源物；序列15來自斑馬魚同源物2;序列16來自河豚魚存活蛋白樣蛋白質1;并且序列17來自河豚魚存活蛋白樣蛋白質2。圖3是來自脊推動物的BIR結構域序列與人存活蛋白的比對。人存活蛋白BIR結構&戈序列顯示在SEQIDNO:63中。比對通過ClustalW方法進行(見Thompson等人(1994)，Nucl.AcidRes.22:4673-4680)。序列從NCBI數據庫獲得，使用下列檢索號人存活蛋白(NM—001168，BIR結構域序列，顯示在SEQIDNO:63中)，黑腹果蠅(D.melanogaster)(AAF55399,BIR結構域同源物，顯示在SEQIDNO:53中)和線蟲(C.elegans)(NP_505949，BIR結構域同源物，顯示在SEQIDNO:54中)。BIR結構域加下劃線；星號指示了涉及Zn配位的標記殘基；破折號指示了比對中的空位。在非人序列中，與人殘基相同的殘基以句號表示；其他殘基以單字母氨基酸密碼子表示。圖4是用帶有編碼存活蛋白多肽的質粒的沙門氏菌接種DNA的模式的圖示。腸腔中的沙門氏菌通過集合淋巴小結的M細胞侵入腸上皮。一旦穿過上皮，沙門氏菌侵入細胞例如巨噬細胞和樹突細胞。細菌死亡并且質粒轉移使得質粒通過巨噬細胞表達，導致來自編碼的存活蛋白多肽的肽在I類MHC分子中呈遞。另夕卜，通過樹突細胞對表達存活蛋白多肽的凋亡巨噬細胞的攝取導致由于肽在I類MHC和II類MHC分子中的呈遞而得到的交叉引發。圖5是柱狀圖，其描述了暴露給癌細胞時從存活蛋白接種的小鼠分離的T細胞的IFNy釋放。IFNy釋放在酶聯免疫斑點(ELISpot)測定中測量。C57B1/6小鼠用攜帶鼠或雞存活蛋白表達質粒的沙門氏菌接種，或不接種(x軸)，在T細胞暴露給B16/KSA(條紋柱)或LLC/KSA(黑柱)癌細胞系后，測量每5xl()S個平板接種細胞的IFNy點數。圖6是柱狀圖，其描述了分離自存活蛋白接種的小鼠的T細胞暴露給癌細胞時的IFNy釋放，所述T細胞。IFNy釋放在酶聯免疫斑點測定中測量。Balb/c小鼠用攜帶鼠或雞存活蛋白表達質粒的沙門氏菌接種，或不接種(x軸)，在T細胞暴露給4T1/KSA(條紋柱)或A20(黑柱)癌細胞系后，測量每5xl05個平板接種細胞的IFNy點數。圖7是用沙門氏菌SL7207雞存活蛋白或鼠存活蛋白接種的小鼠的存活圖。存活Balb/c小鼠(y軸)的百分比針對小鼠的CT26/KSA攻擊后的天數(x-軸)作圖，所述小鼠用攜帶有鼠存活蛋白(實心三角)或雞存活蛋白(實心方塊)或PBS(實心菱形)表達質粒的沙門氏菌接種。圖8是用沙門氏菌SL7207雞存活蛋白或鼠存活蛋白接種的小鼠的存活圖。存活C57B1/6小鼠(y軸)的％針對小鼠的LLC/KSA攻擊后的天數(x-軸)作圖，所述小鼠用攜帶有鼠存活蛋白(實心三角)或雞存活蛋白突變體——雞存活蛋白(N97E、T99M、V100L、Q101G)(實心方塊)或PBS(實心菱形)表達質粒的沙門氏菌接種。圖9是在第10天評估相對于腫瘤攻擊的接種計時(vaccinationtiming)效果的給藥日程表的圖示。"D"是"天"的縮寫。因此，例如，一些小鼠在第1天接受口月gi妻種，在第10天接受腫瘤攻擊，在第13天接受口服接種；其他小鼠在第10天接受肺瘤攻擊和口服接種，在第18天接受第二次口月l接種。在第29天評估肺腫瘤負荷。圖10是在第1和13天；7和13天；10和18天；或13和21天接受疫苗；或接受PBS的小鼠肺重量圖表。所有小鼠在第10天接受靜脈內LLC/KSA細胞的腫瘤攻擊。也提供了每只小鼠的肺轉移評分。圖ll是給藥日程表的圖示，包括在第1和15天用雞存活蛋白的沙門氏菌介導的接種；在第4天用LLC/KSA細胞的靜脈內腫瘤攻擊；以及在第11天的腹膜內環磷酰胺(CTX)治療和在第12-15天的吲哚美辛治療。在第28天就腫瘤負荷對肺評分。圖12是描述了以下小鼠的肺重量的圖所述小鼠只接受腫瘤攻擊(栽體)；在第一天(引發)和第15天(加強)接受用雞存活蛋白接種，且在第4天用肺瘤攻去(PCB);接受CTX和吲哚美辛和腫瘤攻擊C(CI);接受引發、攻擊、CTX、吲哚美辛和加強(PC(CI)B);接受引發、攻擊、CTX和吲咮美爭(PC(CI))或接受攻擊、CTX、吲哚美辛和加強C(CI)B。也提供了每只小鼠的肺轉移評分。圖13提供了外周血細胞的流式細胞數據的描述，所述數據表明了在接種了攜帶編碼非哺乳動物存活蛋白的質粒的沙門氏菌后在小鼠中CD44亮、CD33S田胞的新群體的出現。x-軸代表了CD3細胞，y-軸代表了CD44細胞。圖14是劑量方案的圖示，包括在第一天皮下腫瘤攻擊；在第4、11、18和25天用非哺乳動物存活蛋白的沙門氏菌介導的接種；以及在第8、9和10天的靜脈內免疫細胞因子處理。圖15是描迷了用PBS、免疫細胞因子、非哺乳動物存活蛋白；或免疫細胞因子和非哺乳動物存活蛋白處理的小鼠一定時間內的肺瘤體積。發明詳述進了癌癥或其他疾病的治療。癌癥是主要的靼標疾病，盡管本發明也可以應用到其他疾病和病癥，例如正常細胞例如纖維樣組織的不希望的增殖。本發明還涉及用于治療病毒感染，例如HIV感染、流感病毒感染和其他病毒感染的組合物和方法。具體地，對于癌癥或其他腫瘤的治療，本發明提供了用于將與腫瘤特異性或腫瘤富含的蛋白質相關的肽呈遞到抗原呈遞細胞以在哺乳動物中引發針對癌癥或腫痏細胞的適應性免疫應答的組合物和方法。其他優選的用于本發明的腫瘤特異性或腫瘤富含的抗原是存活蛋白。T細胞抗原呈遞綜述抗原呈遞是一種細胞過程，其中將細胞中的蛋白質處理成肽，然后沿著分泌途徑運輸到細胞表面。處理的肽是作為與特化的肽呈遞膜蛋白質(稱作MHC)的穩定復合體來運輸的。這一過程通過取樣MHC-肽復合體，允許免疫系統的組分例如輔助T-細胞(CD4+T細胞)和細胞毒性T-細胞*(CTL或CD8+T-細胞)來^L察細胞的組分。輔助T細胞與MHCII-肽復合體相互作用，而細胞毒性T-細胞與MHCI-肽復合體相互作用。相互作用通過在T-細月包表面表達的T-細胞受體(TCR)來發生。每個T-細胞表達獨特TCR。與抗體類似，通過在染色體TCR基因座的重排產生TCR多樣性。與產生抗體的細胞相同，在T-細胞分化過程中與自身抗原(即從細胞中存在的內源蚤白質產生的抗原肽)的相遇導致特定T-細胞的負選擇。在負選擇中未被消除的那些T細胞進一步發育成成熟T-細胞。最終，與和MHC復合的外源抗原的相互作用導致T細胞活化，特別在二次刺激存在時。存活蛋白存活蛋白的特征在于保守的、大約70個氨基酸結構域，稱作BIR結構域(或IAP結構域)。在人存活蛋白中，BIR結構域對應于跨越Asp16至Leu87的區域。癌癥和腫瘤細胞通常過量表達存活蛋白蛋白質，這認為將阻斷這些細胞的凋亡并且因此干擾防止癌癥或肺瘤細胞的異常生長的枳j制。另一方面，正常細胞表達非常少的存活蛋白。因此，存活蛋白是理想的腫瘤特異性或胂瘤富含的抗原。因此，本發明的目標是將存活蛋白蛋白質的抗原形式遞送到抗原呈遞細胞，從而可刺激對表達存活蛋白的肺瘤細胞的免疫應答。人和哺乳動物存活蛋白蛋白質和基因詳細描述在美國專利號No.6，245，523或WO2004/067023。非哺乳動物存活蛋白本發明的一個方面圍繞著令人驚奇的發現，即非哺乳動物存活蛋白基因和/或蛋白質可以用在癌癥和其他疾病的疫苗中。例如，用編碼雞存活蛋白的核酸免疫小鼠或人會產生將分別攻擊表達小鼠或人存活蛋白的細胞的CD8+T細胞。這一發現表明雞存活蛋白在免疫學上與人存活蛋白基本類似，提示雞存活蛋白可以用作存活蛋白蛋白質的抗原形式，來引發哺乳動物中的免疫應答。在圖1中比對了來自哺乳動物和非哺乳動物物種的存活蛋白蛋白質。包括在比對中的存活蛋白蛋白質是人存活蛋白(Genebank檢索號NM—001168或015392，SEQIDNO:8)，狗存活蛋白(Genebank檢索號NP—001003019，SEQIDNO:9)，豬存活蛋白(Genebank檢索號NP—999306,SEQIDNO:39),奶牛存活蛋白(Genebank檢索號NP—001001855，SEQIDNO:40)，貓存活蛋白(Genebank檢索號NP_001009280，SEQIDNO:41)，小鼠存活蛋白(Genebank檢索號NP—033819，SEQIDNO:IO)，大鼠存活蛋白(Genebank檢索號AAF82586，SEQIDNO:42)，猩猩存活蛋白(Genebank檢索號CAH91231,SEQIDNO:43)，雞存活蛋白(Genebank檢索號NP—001012318，SEQIDNO:ll，"野生型")，光滑爪蟾SIX(Xenopuslaevis)SIX存活蛋白(Genebank檢索號AAO20085,SEQIDNO:13)、光滑爪蟾存活蛋白同源物(Genebank檢索號AAM76714,SEQIDNO:46)、光滑爪蟾存活蛋白同源物2(Genebank檢索號AAH89271,SEQIDNO:47)、鯰魚存活蛋白同源物(Genebank檢索號CK419466,SEQIDNO:52)、斑馬魚存活蛋白同源物(Genebank檢索號NP—919378，SEQIDNO:48)，斑馬魚存活蛋白同源物2(Genebank檢索號NP—660196，SEQIDNO:49)，河豚魚存活蛋白樣同源物(Genebank檢索號CAG04432,SEQIDNO:50)、河豚魚存活蛋白樣同源物2(Genebank檢索號CAG07433,SEQIDNO:51)。將通過基因檢索號在本文公開的所有序列引入作為參考。包括在圖1中的序列也列在說明書的序列表中。另外，兩個雞序列也包括在相應的序列表中，變體l(Genebank檢索號NM_001012319，SEQIDNO:44)和變體2(Genebank檢索號NP—001012317,SEQIDNO:45)，所述變體1與SEQIDNO:ll顯示的野生型雞存活蛋白序列的差異開始于氨基酸殘基116，以給出不同的C端，所述變體2與SEQIDNO:ll顯示的野生型雞存活蛋白序列的差異開始于氨基酸殘基38。下列額外的序列包括在序列表中人存活蛋白(Genbank檢索號NM—001168.2，SEQIDNO:64);人(Homosapiens)存活蛋白(Genbank檢索號015392，SEQIDNO:65);家犬(Canisfamiliaris)存活蛋白(Genbank檢索號NM_001003019.1，SEQIDNO:66);豬(Susscrofa)存活蛋白(Genbank檢索號NP—999306.1,SEQIDNO:67);歐洲牛(Bostaurus)存活蛋白(Genbank檢索號NP一001001855.2，SEQIDNO:68);家貓(Feliscatus)存活蛋白(Genbank檢索號NP—001009280.1，SEQIDNO:69);小家鼠(Musmusculus)存活蛋白(Genbank檢索號NP—033819.1，SEQIDNO.70);褐家鼠(Rattusnorvegicus)存活蛋白(Genbank檢索號AAF82586.1,SEQIDNO:71);猩猩(Pongopygmaeus)存活蛋白(Genbank檢索號CAH91231.1,SEQIDNO:72);原雞(Gallusgallus)存活蛋白(Genbank檢索號NP一001012318.1，SEQIDNO:73);光滑爪蟾(Xenopuslaevis)SIX存活蛋白(Genbank檢索號AAO20085.1,SEQIDNO:74);光滑爪檐存活蛋白同源物(Genbank檢索號AAM76714.1,SEQIDNO:75);光滑爪檐存活蛋白同源物2(Genbank檢索號AAH89271.1，SEQIDNO:76);編碼河內鯰魚(Ictaluruspunctatus)存活蛋白的核酸(Genbank檢索號CK419466.1，SEQIDNO:77);鮐(Daniorerio)存活蛋白同源物(Genbank檢索號NP—919378.1，SEQIDNO:78);鮐存活蛋白同源物2(Genbank檢索號NP—660196.1，SEQIDNO:79);黑音斑河豚(Tetraodonnigroviridis)存活蛋白樣同源物(Genbank檢索號CAG04432.1，SEQIDNO:80);黑青斑河豚存活蛋白樣同源物2(Genbank檢索號CAG07433.1,SEQIDNO:81);黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)存活蛋白(Genbank檢索號AAF55399.1，SEQIDNO:82)和線蟲(Caenorhabditiselegans)存活蛋白(Genbank檢索號NP—505949.1，SEQIDNO:83)。本發明設想不僅使用在天然中發現的存活蛋白序列，例如在圖1中公開的存活蛋白序列，而且使用其他M^列，所述氨基M列與在圖1中公開的至少一種序列有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的氨基酸同一性。如在圖1中所示，盡管比對中的哺乳動物存活蛋白蛋白質與人存活蛋白超過80%的同一，但是比對中的非哺乳動物存活蛋白同源物與人存活蛋白的同一性不超過60%。但是，在BIR結構域中(圖l比對中用下劃線表示的區域)，非哺乳動物存活蛋白蛋白質與人存活蛋白的同一性大于60%但是小于80%，而哺乳動物存活蛋白蛋白質與人存活蛋白的同一性超過90。/。。存活蛋白同源物的BIR結構域的序列對同一性百分比總結在圖2中。例如，雞存活蛋白與人存活蛋白在BIR結構域上有大約78%的同一性。重要地，如圖1所示，在雞存活蛋白中，在BIR結構域中僅有一個9-mer肽(18-26:STRAATFRN)(SEQIDNO:7)，所述BIR結構域相對于對應的人序列包含超過50%的氨基酸變異(在此特定的9-mer肽中9個氨基酸中的5個)。雞存活蛋白的BIR結構域中的大多數9-mer肽包含兩個或更少的序列改變(64個肽中的48個)。不希望受到理論限制，要理解這一程度的序列保守性有效使得雞存活蛋白與人存活蛋白免疫學上基本相似。一般地，圖2中顯示的雞存活蛋白BIR結構域和哺乳動物存活蛋白BIR結構域之間的同一性百分比在大約72%和大約78%之間變化。另夕卜，大約75%的來自雞存活蛋白的BIR結構域的9-mer肽與對應的哺乳動物9-mer肽相比包含兩個或更少的序列改變。例如，雞存活蛋白與小鼠存活蛋白在BIR結構域上有75。/o的同一性百分比，這與以下結果相一致，即雞存活蛋白與小鼠存活蛋白在免疫學上基本相似，如在下面實施例6中所描述的。如在下列實施例中所說明的，非-哺乳動物存活蛋白組合物(例如雞存活蛋白組合物)在小鼠中誘導針對表達小鼠存活蛋白的腫瘤的免疫應答的功效強調了以下本發明的原理即用非哺乳動物存活蛋白分子接種哺乳動物可用于誘導針對哺乳動物存活蛋白或針對過量表達哺乳動物存活蛋白的細胞的免疫應答。因此，雞存活蛋白也可以用于在人中產生針對過量表達人存活蛋白的細胞(例如任何腫瘤細胞)的有效的免疫應答，因為在哺乳動物之間免疫應答是足夠保守的。相反，非脊椎動物的BIR結構域與人存活蛋白BIR結構域的比對顯示黑腹果蠅(AAF55399,SEQIDNO:53)和線蟲(NP_505949，SEQIDNO:54)BIR結構域與人存活蛋白BIR結構域序列有50%或更少的同一性，盡管對于Zn螯合作用的關鍵殘基是保守的(見圖3中的比對中的星號)。例如，蒼蠅存活蛋白BIR結構域與人存活蛋白BIR結構域有約50%的同一性。重要地，蒼蠅BIR結構域僅包含3個(64中的3個)這樣的9-mer肽，所述肽與對應的人肽相比具有兩個或更少的氨基酸取代。根據本發明，如本文所用的，術語"非哺乳動物存活蛋白"至少包括任一具有BIR結構域(或IAP結構域)的存活蛋白蛋白質，所述BIR結構域與人存活蛋白BIR結構域具有至少多于50%的氨基酸同一性，但是少于90%的氨基酸同一性，例如與人存活蛋白BIR結構域有至少55%、60%、65%、70%、75%、80%或85%的同一性。為了計算同一性百分比，將每個序列的比對的氨基酸順序比較。如杲氨基酸是非同一的，配對同一性分數是O,否則配對同一性分數是l.O。原始同一性得分是同一的比對氨基酸的總和。然后將原始分數除以較小的候選序列或參照序列中的氨基酸數并且將結果乘以100來標準化原始分數。標準化的原始分數是同一性百分比。為了計算百分比同一性的目的，忽略插入和缺失。因此，在此計算中不使用空位罰分。產生多重序列比對的方法是本領域技術人員熟知的。為了比對存活蛋白序列，使用DNASTARLasergeneTM6軟件的Megalign6.1模塊，應用ClustalV比對算法，使用缺省設置(Higgins和Sharp(1989)ComputApplBiosci.5:151-3)。對于存活蛋白BIR結構域的次級比對，應用ClustalW("'隻準確")方法，使用缺省設置(Thompson等人.(1994)NucleicAcidsRes.22:4673-80)。設想非哺乳動物存活蛋白也包含比哺乳動物存活蛋白更多的肽，所逸肽具有產生T輔助細胞應答的潛能。不希望受到理論限制，設想免疫效應II的T輔助細胞的的接合來實現的。內源人存活蛋白和非哺乳動物存活蛋白之間的序列差弄可能引起人免疫系統還沒有耐受的一些肽被呈遞。可以使用公開可用的預測算法，例如ProPredAnalysis(www.imtech.res,in/raghava/propred;Singh等人，(2001)Bioinformatics17:1236-1237，其內容在本文引用作為參考)，分析潛在的MHCII表位的存在。使用此類算法，發現相對于哺乳動物存活蛋白蛋白質，例如人或狗存活蛋白，非哺乳動物存活蛋白蛋白例如雞存活蛋白或蛙SIX存活蛋白械:預測為包含多個與MHCII分子結合的肽和/或與MHCII分子具有更高的結合親和性的肽(見表l)。表l:對人HLA-DR的肽結合預測<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>蛙SIX存活蛋白(seQIDN0:13》2SYNIATRLRT21S632(SEQIDNO:13的殘基26-34)2BLATRIiRTFS591(SEQIDNO:13的殘基28-36)32LRTFSNWPF207100(SEQIDNO:13的殘基32-40)56FVHCPTDNS21SB3(SEQIDNO:13的殘基56-64)67WKCFFCLIC2423(SEQIDNO:13的殘基67-75)6BVKCFFCUCE123742(SEQIDNO:13的殘基68-76)71FFCLKELEG810(SEQIDNO:13的殘基71-79)72FCLKELEGWs(SEQIDNO:13的殘基72-80)LF工ALKKKA30101S6(SEQIDNO:13的殘基98-106)"PIALKKKAE93256(SEQIDNO:13的殘基99-107)100134648(SEQID冊13的殘基10D-108)10941658(SBQIDNO:13的殘基109-117)111IiSEFI>KLDL81(SEQIDNO:13的殘基111-119)115IiKLDIiEHTIC1""7(SEQIDNO:13的殘基115-123)124IKMQKQMNI*287232(SEQIDNO:13的殘基124-132)12614413(SEQIDNO:13的殘基126-134)130MNLHIERFQ12410(SEQIDNO:13的殘基130-138)134IERFQAKAN1244(SEQIDNO:13的殘基134-142)144VRGHLiEKIiD41037(SEQIDNO:13的殘基144-152)表1顯示了結合至少一個HLA-DR等位基因的每個9-mer肽的起始位置(#)和序列(肽)。#結合是指肽在高于任意的結合閾值(在本案中是20%)下結合的等位基因的數目(50中的)。20%的閾值是指20%的理論最大結合分數，如由在Propred中執行的算法所計算的。分數是指該肽結合的所有HLA等位基因的累積分數。作為參考，來自已知會引起抗MBP抗體的蛋白質的一部分的人髓鞘堿性蛋白(MBP)肽VVHFFKNIV(SEQIDNO:14)以1087.6的累積分數結合29個HLA等位基因。希望提供包括或編碼來自非哺乳動物存活蛋白的肽的疫苗，所述疫苗能夠活化識別與MHC分子復合時的人存活蛋白肽序列的T細胞。此類人存活蛋白肽或來自其的肽包括但不限于EPDLAQCFF(SEQIDNO:3)、EPDLAQCFY(SEQIDNO:15)、CPTENEPDL(SEQID戮2)和CPTENEPDY(SEQIDNO:16)。可用于活化T細胞或增強T細l包活化的額外的人肽和修飾描述在美國專利申請公布號2004-0210035，其內容在本文被引用作為參考。因此，以下是有用的即將對應于已知的人存活蛋白表位的突變引入到非哺乳動物存活蛋白序列中，或引入將增強那些肽序列對MHC的結合的突變。例如，將氨基酸取代引入雞存活蛋白序列的第Asn97、Thr99、Val100或GlnlOl位是有用的。不希望受到任何理論的限制，在雞存活蛋白的第Thr99位的取代可以增強衍生的肽對MHC分子的結合。在具體的實例中，衍生自雞存活蛋白的肽可以包含下列氨基酸取代的至少一個Asn97Glu、Thr99Met、Vall00Leu和Glnl01GIy。在另一個實例中，將氨基酸取代在ThrllO或Serl12處引入到蛙SIX存活蛋白是有用的。爪蟾屬SIX存活蛋白的^t^酸序列(T110M、S112G)顯示在SEQIDNO:55中。不希望受到任何理論限制，在第ThrllO位的取代可以增強衍生的肽對MHC分子的結合。在具體的實例中，來自蛙存活蛋白的肽可以包含下列取代的至少一個ThrllOMet、Serll2Gly。適合于本發明的非哺乳動物存活蛋白肽也可以包含氨基酸缺失。例如，非哺乳動物存活蛋白肽可以包含C端截短或N端截短。可能在非哺乳動物存活蛋白蛋白質中某些不太保守的序列段與其他非存活蛋白人蛋白質的相同，它們不具有與人存活蛋白相同的表達模式，因此不是腫瘤特異性的。這可以通過進行BLAST搜索，以初始方式評估，所述BLAST搜索是將來自非哺乳動物存活蛋白的趨異區域的序列針對非冗余人蛋白質數據庫進行的，設置為鑒定短的、幾乎精確的匹配。例如，用雞存活蛋白序列的C端結構域(aa90-aa142)僅鑒定了具有近似精確匹配的一些人蛋白質(少于5個命中(hit))。然后可以將那些人蛋白質在它們的表達模式和它們產生抗原性肽的潛能方面進一步分析，最初是使用下文描述的在計算機芯片上的方法。修飾的存活蛋白另一方面，本發明通過向哺乳動物存活蛋白蛋白質引入4務飾而產生了存活蛋白的抗原形式。具體地，本發明設想修飾的哺乳動物存活蛋白肽，其為生物學惰性的但是與哺乳動物存活蛋白在免疫學上基本相似。本發明的這一方面還使用在抗原呈遞細胞的胞質中簡單表達存活蛋白蛋白質的筒單方法解決了兩個特定問題。第一個問題是生物學活性的存活蛋白蛋白質可以破壞抗原呈遞細胞的生理。第二個問題是當存活蛋白或基本上任何其他蛋白質在細胞中表達時，只有小部分的蛋白質以一定的方式#:降解，所述方式使得通過I類MHC將抗原肽呈遞到細胞表面上。因此，本發明涉及修飾的哺乳動物存活蛋白，包括人存活蛋白的突變形式或非人哺乳動物存活蛋白的突變形式。本發明還涉及不僅使用在天然中發現的存活蛋由序列，如在圖1中公開的存活蛋白序列，而且使用其4也氨基酸序列，所述氨基酸序列與圖1中公開的至少一種序列具有例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、或至少95%的#^酸同一性。已經確定了人存活蛋白的結構(Chantalat等人，(2000)Mol.Cell6:183-189;蛋白質結構的蛋白質數據文庫(PDB)儲存庫檢索號PDBID1E31;Verdecia等人(2000)Nat.Struct.Bio.7:602-608;蛋白質結構的蛋白質數據文庫(PDB)儲存庫檢索號PDBID1F3H，上述每個的教導在本文引用作為參考)。基于3D結構，人存活蛋白包含至少2個結構域包括鋅結合位點的N端球形結構域(稱為BIR或IAP結構域)，以及延伸的C端a螺旋結構域(在本文中稱為螺旋結構域)。在優選的實施方案中，本發明提供了在N端BIR結構域和/或在C端螺旋結構域中具有突變的存活蛋白形式。本發明指出可以通過突變兩個結構域來實現最優效果。不希望受到任何理論限制，認為N端BIR結構域和C端螺旋結構域各自具有生物學活性。例如，即使不存在螺旋結構域時，BIR結構域仍然具有一定水平的抗凋亡活性。另外，螺旋結構域具有細胞骨架結合活性，并且具有不同的生物學活性。具體地，在BIR結構域中，例如，優選的突變包括但不限于，在對應于人存活蛋白的Cys57、Cys60、His77或Cys84的位置的氨基酸取代。例如，修飾的BIR結構域可以包含下列取代的至少一種Cys57Ser、Cys60Ser、His77Phe、和Cys84Ser。任r何這些氨基酸向丙氨酸或脯氨酸的取代是優選的。認為這些突變破壞了BIR結構域中的鋅結合位點。也可以使用具有破壞鋅結合位點作用的其他突變。另外，在對應于人存活蛋白Argl8的位置的突變(優選向天冬氨酸或谷氨酸的突變)可以用來產生無活性的BIR結構域。其中在至少兩個、三個或四個位置突變鋅結合氨基酸的修飾的BIR結構域是特別優選的。通常有用的是在螺旋結構域的任何位置引入脯氨酸殘基，來破壞其功能。具體地，可以在對應于人存活蛋白Alal28或Ilel35的位置引入脯氨酸取代。其他可以破壞螺旋結構域的氨基酸取代也是優選的。優選的修飾的哺乳動物存活蛋白可以包含在Argl8、Cys57、Cys60、His77和/或Cys84的突變和在螺旋結構域中的脯氨酸。在位置Argl8、Cys57、Cys60、His77、Cys84、Alal28和Ikl35的每個前述氨基酸在人和雞存活蛋白之間是保守的，因此可以引入相同的突變來產生生物學惰性的雞存活蛋白。類似的突變也可以引入到其他非哺乳動物存活蛋白蛋白質的對應位置中。任何上述突變可以與在對應于人存活蛋白的Leu98的位置的突變(例如Leu98Arg、Leu98Lys和Ley98Ala)組合。在雞存活蛋白中，對應于人Leu98的位置是VallOO。可以通過常規實驗鑒定其他有用的突變，如在實施例中描述的。例如，將突變引入到存活蛋白中并且就例如生物學活性的喪失和/或增強的降解、和/或誘導針對腫瘤的免疫應答的能力進行測試。這些測試的例示性測定在下文描述在實施例中并且是本領域已知的。通常，優選的修飾的存活蛋白肽包含3個、4個、5個或更多個突變。但是，本發明涉及的修飾的存活蛋白的一種效用是通過I類MHC分子呈遞來自存活蛋白的T細胞表位肽。因此，通常優選是突變少于50個(或少于30個或少于20個)氨基酸，以維持與哺乳動物存活蛋白的免疫學基本相似性。抗原呈遞本發明提供了將突變最優地引入存活蛋白或其他蛋白質序列從而使得I類MHC表位的加工相對地不被阻礙的指導。可能某些存活蛋白突變位于肽區段內，所述肽區段由I類MHC分予所呈遞并且由特定的T細胞受體所識別。還可能突變會改變存活蛋白向肽表位的蛋白水解加工，使得肽表位被切割，或該肽表位未被切割但是優先產生新的表位。為了解決抗原呈遞的問題，可以使用公開可用的數據庫和信息來鑒定存活蚤白蛋白質中候選I類MHC分子表位，然后確定突變是否改變了表位。例如，可以使用SYFPEITHI算法kxi;也見Rammensee等人，(1999)lmimmogenetics50:213-219，其教導在本文引用作為參考)。備選地，可以使用BIMAS算法(bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla—bind/;也見Parker等人(1994)J.Immunol.152:163-175,其教導在本文引用作為參考)。由于編碼人I類MHC蛋白質的HLA基因是高度多態性的(不同的I類MHC蛋白質結合不同的肽基序)，制作了潛在表位的表，其在一個軸上是不同的I類MHC分子，而在另一軸上是存活蛋白序列。表中的條目標識了給定I類MHC分子的表位位置。基于對多種表位的效應鑒定候選突變的故應。最后，基于疫苗的需要選擇一個或多個突變，要考慮到例如不同HLA等位基因的等位基因頻率或HLA等位基因的組特異性頻率。為了解決蛋白水解加工的問題，根據本發明，可以使用公開可用的數據庫和信息來備定候選蛋白酶體切割位點，然后確定突變是否改變了此類切割位點。例力口可以使用公開可用的數據庫NetChop(www.cbs.dtu.dk/services/NetChop/)。通常優選避免改變切割位點。為了舉例說明目的，實施例12提供了確定存活蛋白蛋白質中有用取代的例示性分析。根據本發明，考慮"免疫蛋白酶體"也是有用的。在抗原呈遞細胞中，蛋白酶體多少有些不同的蛋白質組成，并且其蛋白水解特異性受到將C端切割成疏水殘基的酶的控制。因此，蛋白酶體產生了可以用C端疏水錨定殘基結合I類MHC的肽。如果需要維持免疫蛋白酶體切割模式的特異性，優選避免此類疏水殘基的突變，特別是亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸。類似地，還優選避免將其他殘基突變成亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸。因此在Argl8、Cys57、Cys60、His77、和Cys84處的突變具有以下優勢去穩定存活蛋白的結構并且不消除免疫蚤白酶體切割位點。另外，優選避免在蛋白質序列中緊鄰N端的7至9個氨基酸中引入向亮氨酸、異亮氨酸、曱硫氨酸、酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸的突變。因此，本發明提供了在蛋白質序列中鑒定優選的突變位點以產生具有增強的免疫原性的蛋白質的一般方法。基于此方法，蛋白質序列中的優選的突變位點具有下列性質。第一，位點的一個或多個突變去穩定了蛋白質結構。第二，去穩定突變不引入亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、色氨酸或苯丙氨酸。第三，在該位置的正常氨基酸不是亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、色氨酸或苯丙氨酸。這一方法可以用于廣泛多種的蛋白質，所述蛋白質可以用作抗原，例如腫瘤特異性抗原、病毒抗原或其他抗原。在腫瘤特弄性抗原中，除了存活蛋白，該方法也可以用于表皮細胞^粘著分子、癌基因例如Ras、癌胚抗原和其他腫瘤特異性抗原。在病毒抗原中，該方法可以用于HIV的p24、流感血凝素和其他病毒蛋白質。包含非哺乳動物和/或^務飾的存活蛋白的融合蛋白質為了促進存活蛋白部分的降解和其加工成可以通過I類MHC分子呈遞的肽，希望將上述非哺乳動物存活蛋白或突變存活蛋白肽融合到適當的第二蛋白質上。例如，對于此目的，泛蛋白是特別優選的融合配偶體。可以以下列構型之一構建泛蛋白-存活蛋白融合蛋白質N端-泛蛋白-存活蛋白-C端或N端-存活蛋白-泛蛋白-C端。N端-泛蛋白-存活蛋白-C端是優選的方向。另外，希望將存活蛋白N端甲硫氨酸優選突變成精氨酸、天冬氨酸或谷氨酸。還希望在泛蛋白-存活蛋白融合蛋白質中在對應于人存活蛋白Ilel9或Val21的位置引入賴氨酸。還希望將本發明的存活蛋白融合到Fc部分。優選的Fc部分包含抗體CH2和CH3結構域，以及任選地包含鉸鏈區。可以將Fc部分融合到存活蛋白N端或C端。成熟人Fc-雞存活蛋白的蛋白質序列顯示在SEQIDNO:25中。成熟鼠Fc-雞存活蛋白的蛋白質序列顯示在SEQIDNO:27中。另外，包含存活蛋白和Fc部分的融合蛋白質還可以包含其他部分，例如在PCT公開WO01/07081中描述的刺激免疫系統的細胞因子。不希望受到理論限制，Fc部分的存在可以增強包含存活蛋白的融合蛋白質被攝取到抗原呈遞細胞中。通常優選Fc部分來自待治療的生物。例如，為了治療人，優選使用人Fc部分。Fc-存活蛋白融合蛋白質或編碼該融合蛋白質的核酸可以優選包含用于分泌的信號序列。信號序列的存在有助于融合蛋白質在哺乳動物細胞系例如NS/0細胞中的表達，并且如果對應的核酸被施用到患者中，可以允許融合蛋白質在體內的分泌。Fc-存活蛋白融合蛋白質的編碼序列優選以5，至3，方向開始，具有"前導序列"，所述"前導序列"來自例如抗體輕(L)鏈(符合讀框地與免疫球蛋白重鏈或其突變形式的至少一部分融合)，優選來自人免疫球蛋白yl基因的Fqrl區域。免疫球蛋白yl基因的Fcyl區域優選包括至少一部分的鉸鏈結構域和CH3結構域，更優選至少包括鉸鏈結構域、CH2結構域和CH3結構域。編碼信號序列的DNA部分優選編碼肽區段，所述肽區段指導Fc融合蛋白質的分泌并且其后被從Fc融合蛋白質的剩余部分切除掉。本發明的信號序列是編碼氨基酸序列的多核苷酸，所述氨基酸序列起始蛋白質轉運通過內質網的膜。可用于本發明中的信號序列包括抗體輕鏈信號序列，例如抗體14.18(Gillies等人(1989)J.Immunol.Meth，125:191)、抗體重鏈信號序列，例如MOPC141抗體重鏈信號序列(Sakano等人(1980)Nature，286:5774)，和本領域已知的任何其他信號序列(見例如Watson(1984)NuddcAcidResearch,12:5145)。信號序列已經在本領域中詳細表征并且已知通常包含16至30個氨基酸殘基，并且可以包含較多或較少的氨基酸殘基。典型的信號肽由三個區域組成堿性N端區域、中心疏水區域和更有極性的C端區域。中心疏水區域包含4至12個疏水殘基，它們在轉運新生多肽的過程中將信號肽錨定穿過膜脂雙層。在起始后，信號肽通常由已知為信號肽酶的細胞酶在內質網的腔內將其切割。信號肽的潛在切割位點通常依照"(-3、-1)規則"。因此，典型的信號肽在第-l和-3位具有小的中性氨基酸殘基，并且在該區域缺乏脯氨酸。信號肽酶將在-l和+l氨基酸之間切割此類信號肽。因此，可以在分泌過程中將信號序列從融合蛋白質的氨基端切割下來。這導致Fc融合蛋白質的分泌。可用于本發明的實踐中的信號肽序列是本領域已知的。見例如vonHdjine(1986)NucleicAcidRes"14:4683。術語"信號序列"、"信號肽"、"前導序列"或"前導肽"在本文中互換使用。分泌的融合蛋白質通常具有正確折疊的Fc結構域，但是具有不正確折疊的存活蛋白部分。不希望受到理論限制，認為當通過Fc-存活蛋白融合蛋白質的Fc部分迫4吏存活蛋白進入到分泌途徑中時，存活蛋白折疊受到損害，特別是因為存活蛋白包含可以參與二硫鍵合的多個半胱氨酸。存活蛋'白部分的正確折疊對于本發明疫苗的活性不是必需的。作為通過遺傳改造技術的蛋白質融合的備選，使用常規化學交聯劑的化學綴合可以用來連接蛋白質部分。核酸本發明還提供了編碼上述非哺乳動物和/或修飾的存活蛋白和包括該存活蛋白的融合蛋白質的核酸。例如，人存活蛋白的核苷酸序列顯示在SEQIDNO:57中，爪螗SIX存活蛋白的核苷^列顯示在SEQIDNO:58中，爪蟾SIX存活蛋白同源物的核苷^列顯示在SEQIDNO:59中，斑馬魚存活蛋白同源物的核苷^列顯示在SEQIDNO:60中，以及鯰魚存活蛋白同源物的核苷酸序列顯示在SEQIDNO:61中。核酸優選與允許在真核細胞特別是在哺乳動物細胞中表達的元件連接和交錯，以形成表達盒。通常，編碼存活蛋白的表達盒包括至少一個下列調節元件，例如啟動子、增強子、內含子、終止子、聚腺苷酸化信號等。優選地，包括哺乳動物啟動子。如本文用到的，"哺乳動物啟動子，，意思是來自在哺乳動物中或在通常生長在哺乳動物的病毒中發現的啟動子的基因啟動子。例如，優選的啟動子包括存在于生長在哺乳動物細胞中的病毒的那些，所述病毒例如巨細胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、EB病毒(EBV)、勞斯肉瘤病毒(RSV)、莫洛尼猴病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV);或優選的啟動子包括來自哺乳動物基因的那些，例如來自哺乳動物肌動蛋白、p-珠蛋白、肌球蛋白，或任選地來自優選表達在抗原呈遞細胞中的哺乳動物基因，例如Fascin或其他本領域已知的APC-特異性基因。有用的聚腺苷酸化信號的實例是來自SV40聚腺苷酸化信號的4言號。表達元件可以指導存活蛋白蛋白質在所有真核細胞中的表達，或者可以具有指導在例如抗原呈遞細胞中的表達的細胞類型特異性增強子。也優選將表達盒的編碼部分設計為具有在真核細胞(特別是在哺乳動物或人細胞)中最常用的密碼子。本發明的表達盒可以用來在培養的細胞中產生本發明的蛋白質。因此，i表達盒可以與適當的抗藥性基因、DNA復制原點和其他元件連接以促進表達盒的選擇和復制。在一個實施方案中，將表達盒的核酸序列摻入到能夠在細菌中復制的質粒中。適合于本發明的質粒具有用于在細菌細胞中選擇的標記，例如抗生素抗性基因。備選地，適當的質粒可以缺乏抗生素抗性基因但是可以任選地包括編碼代謝酶、阻抑型tRNA的基因、或在非抗藥性細菌的基因組中正常發現的其他此類基因。因此，本發明的例示性實施且沒有抗生素抗性標記的質粒。可以將此類質粒轉化到細菌中，并且然后可以將細菌用于接種患者，而不用將抗生素抗性基因引入患者。備選地，可以不用活載體將此類質粒引入患者。例如，可以將此類質粒作為棵DNA或作為包埋在珠子中或包被在珠子表面的DNA引入。可以將本發明的表達盒摻入到病毒基因組、適合于棵DNA施用的質粒或細菌基因組中。在病毒基因組的情形中，希望使用雙鏈DNA病毒例如腺病毒和腺伴隨病毒，以及RNA病毒例如逆轉錄病毒。通過標準技術將表達盒插入到此類病毒的基因組中。因此，本發明提供了核酸的DNA和RNA形式。效應分子本發明還提供了這樣的實施方案其允許非哺乳動物肽或修飾的哺孔動物存活蛋白肽與有助于免疫應答的效應分子協同起作用。例如，此類故應分子可以是細應因子部分，包括但不限于IL-2、IL-7、IL-12、IL-18、IL-21、IL-23、GM-CSF，或任何其他細胞因子，特別是能夠活化Thl免疫應答的細胞因子。此類效應分子也可以是抑制免疫系統的細胞因子抑制劑，例如STAT3抑制劑(例如顯性失活的STAT3蛋白質，例如STAT3卩)。細胞因子或其他效應分子也可以包含突變。例如，細胞因子可以在對應于11-2的Cys25的^f立置包含Ser取代。因此，在優選的實施方案中，本發明的疫苗包括編碼非哺乳動物或修-飾的哺乳動物存活蛋白肽和另一種肽的核酸，所述另一種肽包括上述有助于免疫應答的效應分子。編碼非哺乳動物或修飾的哺乳動物存活蛋白肽和l效應分子肽的區域可以在單個轉錄單元中，或在兩個分開的轉錄單元中。的核酸和編碼包括上述有助于免疫應答的效應分子的另一種肽的分離的核酸。在其他實施方案中，本發明的疫苗包括非哺乳動物或修飾的哺乳動物存活蛋白肽和另一種肽，所述另一種肽包括上述的有助于免疫應答的效應分子。在一個實施方案中，非哺乳動物或修飾的哺乳動物存活蛋白肽與包括效應分子的肽融合或綴合。存活蛋白肽和效應分子融合蛋白可以另外與上述的Fc部分融合或綴合。施用本發明的疫苗用于治療表現出與存活蛋白過量表達相關的疾病或處于所述疾病風險的人或哺乳動物。此類疾病包括以過量表達存活蛋白的細胞為特征的癌癥或其他腫瘤。可以將根據本發明產生的疫苗通過任何途徑施用給哺乳動物。蛋白質抗原的注射通常用來引發哺乳動物中的免疫應答。但是，也可以通過核酸例如DNA注射將本發明的疫苗遞送給APC。常用的技術是將編碼抗原蛋白質的DNA表達栽體注射到肌肉。相信特化的APC例如巨噬細胞和樹突細胞遷移到注射或施用位點，通過已知為抗原呈遞過程的過程獲得并且呈遞抗原。因此，根據需要，可以口服或腸胃外施用，包括靜脈內和腹膜內途4圣施用。另外，施月可以通過疫苗推注的周期性注射，或者可以通過從外部的儲存器(例如包)靜脈內或腹膜內施用來更連續地進行。在某些實施方案中，本發明的疫苗可以是藥物級別的，也就是說，某些實施方案符合純度標準和施用給人所需的質量控制。獸醫應用也在本文所用的預期的意義內。才艮據本發明疫苗的用于獸醫和人類藥物用途的制劑通常包括與可藥用佐劑、載體或任選的其他成分結合的疫苗。在與制劑的其他成分相容且對于其受體無害的意義下，載體是"可接受的"。在這一方面，可藥用的載體'意圖包括任何和所有溶劑、分散介質、包衣、抗真菌劑、等滲和吸收延遲劑等，其與藥物施用相容。此類介質和物質對藥物活性物質的用途是本々頁域已知的。除了在常規介質或物質不與活性化合物或其施用栽體相容的十青況，可以預期其月于組合物中。還可以將補充活性化合物(根據本發明備定的和/或本領域已知的)摻入到組合物中。可以以單位劑型容易地給出制劑，并且可以通過藥學/微生物學領域熟知的任何方法制備所述制劑。通常，一些制劑通過將疫苗與液體載體或細分的固體載體或前述二者相結合制備，然后根據需要，將產品成型為所需的制劑。將本發明的疫苗組合物配制成與其想要的施用途徑相容。施用途徑的實例包括口服或腸胃外，例如靜脈內、皮內、吸入、經皮(局部)、經粘膜、和直腸施用。用于腸胃外、皮內或皮下應用的溶液劑或混懸劑可以包括下列成分用于注射的無菌稀釋劑例如水、鹽溶液、不揮發性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑；抗氧化劑例如抗壞血酸或亞硫酸氬鈉；螯合劑例如乙二胺四乙酸；緩沖劑例如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽，以及用于調整張力的物質如氯化鈉或右旋糖。可以用酸或堿，如鹽酸或氬氧4匕鈉調整pH。可以用藥學領域中熟知的任何方法制備用于口服或腸胃外施用的有用溶液，例如在Remington'sPharmaceuticalSciences,(Gennaro,A.編著)中所描述的。用于腸胃外施用的制劑也可以包括用于含服施用的甘膽酸鹽、用于直腸施用的甲氧基水楊酸鹽、或用于陰道施用的檸檬酸。腸胃外制品可以封裝在安瓿、一次性注射器或用玻璃或塑料制備的多劑量瓶中。用于直腸施用的栓劑也可以通過將藥物與非刺激性賦形劑例如可可脂、其他甘油酯或其他在室溫下是固體而在體溫下是液體的組合物混合來制備。制劑還可以包括例如聚(亞烷基)二醇例如聚乙二醇、植物來源的油、氫化*萘等。用于直接施用的制劑可以包括甘油和其他高粘度的組合物。其他潛在有用的用于這些疫苗的腸胃外載體包括乙烯-乙酸乙烯酯共聚物顆粒、滲透泵、可植入的灌注系統和脂質體。用于吸入施用的制劑可以包含作為賦形劑的例如乳糖，或可以是包含例如聚氧乙烯-9-月桂醚、甘膽酸鹽和脫氧膽酸鹽的水溶液，或者是用于以滴鼻劑形式施用的油溶液劑，或可以作為待鼻內施用的凝膠劑。滯留灌腸劑也可以用于直腸遞送。適合用于口服施用的本發明制劑可以是離散單位的形式，例如膠嚢劑、明膠膠嚢劑、嚢劑、片劑、含片(troches)或錠劑，各自包含預定量的藥物；可以是粉劑或膠囊劑的形式；水性液體或非水性液體中的溶液或懸浮液的形式；或可以是水包油乳劑或油包水乳劑的形式。疫苗也可以推注、煎膏劑或糊劑的形式施用。可以任選地與一種或多種輔助劑壓制或制模藥物來制備片劑。可以通過在適當的機器中壓制自由流動形式例如粉末或膠嚢的藥物，任選地與粘合劑、潤滑劑、惰性稀釋劑、表面活性或分散劑混合來制備壓制的片劑。通過在合適的機器中將粉狀藥物與用惰性液體稀釋劑濕潤的合適載體的混合物制膜來制備模制片。口服組合物通常包括惰性稀釋劑或可食用的載體。為了口服疫苗施用的目的，活性化合物可以與賦形劑混合。使用液體載體制備的用作漱口劑的口服組合物包括在液體載體中的化合物，并且口服應用，漱口并吐出或吞下。藥物相容的粘合劑和/或輔劑材料可以作為組合物的部分包括在內。片劑、丸劑、膠囊劑、含片等可以包含任何下列成分或類似性質的化合物粘合劑例如微晶纖維素、黃蓍膠或明膠；賦形劑如淀粉或乳糖；崩解劑，例如海藻酸、Primogel或玉米淀粉；潤滑劑例如硬脂酸鎂或Sterote;助流劑例如膠體二氧化硅；甜味劑例如蔗糖或糖精；或芳香劑例如薄荷油、水楊酸甲酯、橙調-糾(orangeflavoring)。適合于注射使用的疫苗組合物包括無菌水溶液(其中水溶性的)或分散劑和用于即時制備無菌注射液或^t劑的無菌粉末。對于靜脈內施用，適當的栽體包括生理鹽水、抑菌水、克列莫佛ELTM(BAST，Parsippany，NJ)或磷酸緩沖的鹽溶液(PBS)。在所有情形中，組合物可以是無菌的，并且可以使其流動到容易注射的程度。在制備和儲存條件下其是穩定的并且可以保存防止微生物例如真菌的污染。載體可以是溶劑或分散劑介質，包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)，以及其適當的混合物。可以維持適當的流動性，例如，通過使用包衣如卵磷脂、通過在分散劑的情形中維持所需顆粒大小、以及通過使用表面活性劑。在許多情形中，優選在組合物中包括等滲劑，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨糖醇和氯化鈉。可以通過在組合物中包括延遲吸收的物質例如單硬脂酸鋁或明膠造成可注射的組合物延長的吸收。可以通過在具有(根據需要)上述列舉的成分之一或組合的適當的溶劑中摻入所需量的活性化合物，然后過濾滅菌來制備無菌可注射的溶液。通常，通過將活性化合物摻入包含基本分散介質和所需的其他來自上述列舉的成分的無菌栽體來制備分歉劑。在用于制備無菌可注射物質的無菌粉末的情形中，制備方法包括真空干燥和冷凍干燥，這產生了活性成分的粉末和來自其以前無菌過濾的溶液的任何其他所需成分。適合于關節內施用的制劑可以是疫苗的無菌含水制品的形式，其可以是微晶形式，例如含7JC微晶混懸劑的形式。脂質體制劑或生物可降解的聚合物系統也可以用于將疫苗用于關節內施用和眼睛施用。適合于局部施用的制刑包括液體或半液體制品例如搽劑、洗劑、凝膠劑、applicants、水包油或油包水乳劑例如乳貪劑、軟骨劑或糊劑；或溶液劑或混懸劑例如滴劑。用于皮膚表面的局部施用的制劑可以通過將疫苗用皮膚病學可接受的載體*來制備，例如洗劑、乳骨劑、軟骨劑或肥皂。在一些實施方案中，有用的是能夠在皮膚上形成膜或層以定位應用和阻止移除的載體。當希望粘著到組織表面時，組合物可以包括分散在血纖蛋白原-溶血酶組合物或其他生物粘合劑中的疫苗。然后可以將疫苗涂布、噴霧或以其他方式應用到所需組織表面。對于局部施用到內部組織表面，可以將活性劑分散到粘連的液體組織或其他已知將增強組織表面吸收的物質中。例如，使用幾丙纖維素或血纖蛋白原/凝血酶溶液是有利的。備選地，可以使用組織涂布溶液，例如包含果膠的制劑。對于吸入治療，可以使用用噴霧器、噴灑器或霧化器分散的粉末(自身推進或噴霧制劑)的吸入.此類制劑可以是用于從粉末吸入裝置進行經肺施用的精細研碎的粉末、或自身推進粉末分散制劑的形式。在自身推進溶液和噴霧制劑的情形中，效果可以通過選擇具有所需噴霧特征(即能夠產生具有所需顆粒大小的噴霧)的閥或通過將活性成分以受控顆粒大小的懸浮的粉末摻入來實現。對于吸入施用，疫苗還可以以氣霧劑噴霧的形式從受壓的容器或分液器或噴灑器遞送，所述容器或分液器包含適當的推進物質，例如氣體如二氧化碳。也可以使用滴鼻劑。全身施用也可以通過經粘膜或經皮的方式。對于經粘膜或經皮施用，在制劑中也可以使用適合于待透過的屏障的滲透劑。此類滲透劑通常是本領域已知的，包括例如用于經粘膜施用的去污劑、膽汁鹽和梭鏈孢酸衍生物。經粘膜施用可以通過使用鼻噴霧劑或栓劑來實現。對于經皮施用，通常將疫苗配制進軟膏劑、油膏劑、凝膠劑或乳膏劑，這是本領域公知的。在一個實施方案中，用載體制備疫苗，所述載體將保護免于從機體十夾速消除，例如控釋制劑，包括埋植劑和微型膠嚢遞送系統。也可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐、聚羥乙酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。制備此類制劑的方法對于本領域技術人員是已知的。也可以從AlzaCorporation和NovaPharmaceuticals,Inc通過商業途徑獲得所述材料。也可以將脂質體混懸液用于可藥用的載體。這些可以根據本領域技術人員已知的方法制備，例如在美國專利號4，522，811中描述的。也可以《吏用孩丈粒體和孩吏顆粒。可以將口服或腸胃外組合物以劑量單位形式配制用于容易的施用和劑量均一。劑量單位形式是指物理上分離的單位，其適合于作為用于待治療受試者單一劑量；每個單位包含預先確定量的活性化合物，所述量,皮計算用來產生與需要的藥物載體聯合產生所需的疫苗效果。本發明的劑量單位形式的規格由以下因素所控制并且直接依賴于以下因素活性化合物的獨特性質和待實現的特定疫苗效果，以及配制此類活性化合物用于個體治療的領域中固有的限制。通常，可以將根據本發明鑒定的疫苗配制用于腸胃外或口服施用給人或其他哺乳動物，例如，以治療有效的量，例如提供適當濃度的藥物到靶組織足夠的時間來誘導所需效果的量。另外，本發明的疫苗可以獨自施用或與其他分子組合施用，所述分子已知對于特定疾病或目的適應癥具有有'益效果。僅僅為了舉例，有用的輔因子包括減輕癥狀的輔因子，包括防腐劑、抗生素、抗病毒劑和抗真菌劑，以及鎮痛劑和麻醉劑。種因素而變化，所述因素包括待施用藥物的最終所需劑量和施用途徑。待施用的優選劑量也可能取決于此類變量，例如待治療的疾病或適應癥的類型和程度、特定患者的總體健康狀態、遞送疫苗的相對生物學功效、疫苗的劑型、制劑中賦形劑的存在和類型，以及施用途徑。在一些實施方案中，可以使用典型的劑量單位向個體提供本發明的疫苗，所述劑量單位為使用非人靈長類和嚙齒類，從早先描述的哺乳動物研究中推論得到。如上所述，劑量單位是指單一的，即單次劑量，其能夠施用給患者，并且可以被容易的操作和包裝，保持為物理和生物穩定的單位劑量，其包含原樣的疫苗或所述疫苗與固體或液體藥物稀釋劑或載體的混合物。存活蛋白核酸與珠子的遞送結構在另一個實施方案中，可以將本發明的核酸用遞送運載體例如珠子裝配。例如，才艮據在美國申請^^開號2003-0166594(其教導在本文引用作為參考)描述的方法，可將本發明的核酸包被到纖維素珠子上。根據在美國專利號5783567(其教導在本文引用作為參考)描述的方法，可以將本發明的核酸摻入聚合珠子內。在某些實施方案中，改造生物(例如細菌、哺乳動物細胞和病毒顆粒)以產生本發明的存活蛋白。這些生物可以釋放用于收集的存活蛋白，或者可以將其作為疫苗直接引入到患者中。病毒中存活蚤白核酸的遞送結構可以用病毒遞送運載體裝配本發明的核酸。病毒遞送運載體任選地具有輔助效果。例如，適當的病毒包括但不限于腺病毒、腺伴隨病毒、反轉錄病毒或疫苗病毒。通常優選使用病毒的突變體或削弱的形式，例如復制機能不全的病毒。將本發明的核酸插入到病毒基因組中并且另外摻入到病毒顆粒中。使用基因療法領域中熟知的輔助病毒系統包裝核酸。細菌中存活蛋白核酸的遞送結構可以在孩吏生浙宿主中裝配本發明的核酸用于遞送，例如由Gentschev等人(2000)J.Biotechnol.，83:19-26;或由StockerBAD(2000)J.Biotechnol.,83:45-50描述的，所述文獻各自的教導在本文引用作為參考。用于核酸(例如DNA)遞送的適當的細菌包括但不限于沙門氏菌屬(Salmonella)"志賀氏菌屬(Shigella)、利斯特菌屬、或大腸桿菌(E.coli)。通常優選使用細茵的突變的減毒形式，例如營養缺陷型。例如適當的沙門氏菌屬菌林包括但不限于鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium營養缺陷型SL7202(見例如Darji等人，(1997)Cell,91:765-775)、鼠傷寒沙門氏菌aroA、dam-營養缺陷型RE88(見例如Heithoff等人，(1999)Science.284:967-70)、鼠傷寒沙門氏菌msb_、purl營養缺陷型VNP20009(見例3口Clairmont等人，(2000)J.Infect.Dis..181(6):1996-2002;Low等人，(2004)MethodsMol.Med.，90:47-60)，或鼠傷寒沙門氏菌原養型LT2(ATCC#70072O)。通過沙門氏菌屬的DNA接種的例示性模式顯示在圖4中。組合療法本發明的疫苗可以與在患者護理中使用的其他治療形式組合。在治療的一個實施方案沖，疫苗與腫瘤的手術切除協同使用。在另一組治療實施方案中，疫苗與減小腫瘤尺寸、可能破壞腫瘤脈管系統或使得腫瘤對免疫應答敏感的化學療法或放射療法組合。特別用于與本發明疫苗的組合療法的化學療法或放射治療劑包括但不限于DNA損傷劑如環磷酰胺；抗代謝物例如吉西他濱，以及破壞細胞骨架功能的活性劑例如紫杉醇。此類活寸生劑減少了腫瘤生長并且可以^c壞腫瘤脈管系統，不希望受到理論限制，相信這將使得腫瘤對免疫應答更敏感。在組合療法中，通常在化學療法或輻射后以這樣的方式施用疫苗，所述方式使得有效抗腫瘤免疫應答的形成不被先前治療的潛在剩余效果所破壞。在組合療法的另一實施方案中，疫苗治療可以與免疫細胞因子治療纟且合。不希望受到理論限制，當促進免疫應答的細胞因子在腫瘤微環境中存在時，相信疫苗產生更有效的免疫應答。例如，特別有用的免疫細胞因子是引發Thl應答的那些，例如IL-2或IL-12。在組合療法過程中，例如患者可以首先接受本發明的疫苗以產生針對腫瘤的免疫應答，然后接受能夠靶向肺瘤并且支持腫瘤中免疫應答的免疫細胞因子。優選的免疫細胞因子一般具有例如識別腫瘤的表面抗原特征的抗體部分(例如EpCAM)，或識別腫瘤的壞死核心的特征(例如DNA)的抗體部分。免疫細胞因子一般具有細胞因子部分例如IL-2、IL-12，或優先指導Thl應答的其他細胞因子部分。適合于本發明的免疫細胞因子描述在美國專利號5650150，其內容在本文引用作為參考。實施例本發明的實踐將從下列實施例中更充分理解，所述實施例在本文被給出僅用于例示性目的，并且不應當被理解為以任何方式限制本發明。實施例l.克隆雞存活蛋白、產生雞存活蛋白變體、構建在沙門氏菌中復制并且在哺乳動物細胞中表達雞存活蛋白的質粒分離所需DNA分子的方法是本領域技術人員熟知的。例如，當所需DNA分子的序列是已知的，通常使用反轉錄和聚合酶鏈式反應(RT-PCR)，或者可以通過使用商用提供者如BlueHeronBiotechnologyInc.(Bothwell，WA)通過化學合成獲得DNA分子。為了獲得編碼野生型雞存活蛋白的DNA，對從雞肝分離的多聚A+mRNA(BDBiosciences,貨號636307)進行RT-PCR，在笫一輪反轉錄和擴增中使用長模板上標一步PT-PCR試劑盒(SuperscriptOne-StepRT-PCRforLongTemplatesKit)(Invitrogen，Carlsbad,CA)和一組外部引物，并且使用Supermix高保真試劑盒(HighFidelityKit)(Invitrogen)和一組內部引物用于第二輪擴增。外部引物是有義引物5'-0入人入八入100€00<:<:1入10<:-3，(SEQIDNO:17)和反義引物5'-CACCGTAGACCCAGAGGAACC曙3'(SEQIDNO:18)，內部引物分別是有義引物5'畫CTCTAGAATGGCGGCCTATGCTG-3'(SEQIDi]VO:19)(摻入XbaI限制性位點(以下劃線表示))和反義引物5，-CCTCGAGACCTAAGGGCCCATGTTCTC-3'(SEQIDNO:20)(摻入了Xhol限制性位點(以下劃線表示))。將擴增的PCR產物用凝膠電泳分開、分離并且克隆到pCR2.1載體(Invitrogen)，并且檢驗其序列。野生型雞的核苷酸和氨基酸序列分別以SEQIDNO:21和SEQIDNO:ll顯示在序列表中。中表達的表達栽體中。例如將野生型雞存活蛋白編碼序列的Xbal/Xhol消化的片段插入到類似切割的質粒pdCs中(見Lo等人，(1998)ProteinEngineering11:495)，將野生型雞存活蛋白基因放置在受到CMV啟動子調控之下。作為另一個實例，將編碼野生型雞存活蛋白的片段摻入到表達載體pdCs陽huFc(見Lo等人，(1998)ProteinEngineering11:495)，將缺乏起始甲硫氨酸的全長野生型雞存活蛋白片段置于編碼人Fc序列的下游，產生編碼huFc-雞存活蛋白融合蛋白質的質粒。簡言之，使用PflMI/XhoI野生型雞存活蛋白片段(PflMI位點是在野生型雞存活蛋白的核苷酸26)、Smal/XholpdCs畫huFc質粒片段(見Lo等人，(1998)ProteinEngineering11:495)，以及恢復野生型雞存活蛋白序列5，末端(省略起始ATG密碼子)的接頭寡核苷酸雙鏈體分子來進行三元連接。通過雜交互補寡核苷酸有義5'-GGGTGCAGCGGCCTATGCTGAAATGCTGCCCAAGGA-3，(SEQIDNO:22)和反義5，TTGGGCAGCATTTCAGCATAGGCCGCTGCACCC-3'(SEQIDNO:23)寡核苷酸形成雙鏈體接頭分子。通過測序檢驗正確編碼的融合蛋白質的產生。成熟人Fc，雞存活蛋白(雞存活蛋白減去起始Met)核苷酸序列以SEQIDNO:24顯示在序列表中。為了獲得編碼muFc-雞存活蛋白的表達載體，將來自pdCs-huFc-雞存活蛋白的用SmaI/Xhol消化的野生型雞存活蛋白片段轉移到類似處理的pdCs-muFc衍生的表達載體，得到muFc和野生型雞存活蛋白之間的嵌合序列，其中雞存活蛋白符合讀框地直接位于編碼imiFc的CH3部分的序列下游。通過此表達栽體編碼的muFc部分是IgG2a同種型的。成熟muFqr2-雞存活蛋白的核苷酸序列(雞存活蛋白減去起始Met)顯示在SEQIDNO:26中。成熟mu-Fc雞存活蛋白的氨基酸序列顯示在SEQIDNO:27中。編碼雞存活蛋白(N97E、T99M、V100L、Q101G)的雞存活蛋白序列通過摻入誘變引物的PCR方法來產生。在誘變有義引物(Mutls)5'-CCTCTGAACTGATGTTGGGGGAGTTCTTGAAGCTGGAT-3，(SEQIDNO:28)和反義引物(Mutla)5，-AACTCCCCCAACATCAGTTCAGAGGGATCTTTCTG-3'(SEQIDNO:29)中的密碼子取代以下劃線表示，并且消除EcoRI位點的A到G的取代以粗體表示。從野生型雞存活蛋白DNA模板產生兩個重疊的PCR片段，上游片段使用側翼引物Prls(5'-CCGCGGCCGCCCCCTTCACCATGGCGGCCTATGCTGAAATG-3')(SEQIDNO:30)和Mutla，并且下游片段4吏用側翼引Prla(5'-AGATCTGGATCCCTAAGGGCCCATGTTCTCTATC-3')(SEQIDN0:31)和Mutls分別用于擴增。用得到的PCR片段進行PCR反應，結合引物Prls和Prla,產生全長產物，將所述全長產物克隆到pCR2.1載體(Invitrogen)，并且檢驗其序列。將編碼雞存活蛋白(N97E、T99M、V100L、Q101G)的片段用Notl/BamHI切割并且連接到類似消化的pdCs表達載體中。雞存活蛋白(N97E、T99M、V100L、Q101G)的蛋白質序列顯示在SEQIDNO:12中，并且氨基酸序列顯示在SEQIDNO:62中。實施例2從其他非哺乳動物合成存活蛋白基因并且構建哺乳動物表達載體根據本發明，在疫苗組合物中使用來自其他脊推動物非哺乳動物的存活蛋白基因和蛋白質。例如，通過與實施例1中描述的類似的方法或通過分子生物學領域技術人員已知的其他方法獲得來自魚例如河豚魚、鯊魚、鯰魚或斑馬魚，或來自兩棲動物如爪蟾屬，或來自爬行動物如短吻鱘、絝i魚、龜、蜥蜴或火蜥蜴，或來自除雞外的其他鳥的存活蛋白基因。在一些情形中，例如已經描述了爪蟾屬、斑馬魚、鯰魚和河豚魚的存活蛋白同源物(其序列在本申請的序列表中提供)存活蛋白同源物并且是從公共數據庫例如PubMed可得到的。當已知存活蛋白同源物的基因序列時，從可商業的DNA合成公司(例如BlueHeronBiotechnology(Bothell，WA))獲得相應的DNA。通過與實施例3、4和5中類似的方法將來自此類魚、兩棲動物、爬行動物和鳥的存活蛋白同源物構建到疫苗組合物中。例如，將來自爪蟾、斑馬魚、鯰魚和河豚魚的存活蛋白基因在編碼序列的末端添加了5，Xbal位點和3'Xho1位點后，放置到質粒pdCs中。這是例如使用與實施例1中類似的PCR方法或通過連接體側接的相關編碼序列的總基因合成來進行。然后將pdCs-存活蛋白質粒通過實施例3中描述的方法放置到沙門氏菌屬菌林中。備選地，如實施例1中的，將存活蛋白基因構建到表達Fc存活蛋白融合蛋白質的質粒中，并且將Fc-存活蛋白融合蛋白質用作疫苗。例如，將來自爪蟾、斑馬魚、鯰魚或河豚魚的存活蛋白基因在編碼序列的末端添加了5'Xmal位點和3，XhoI位點后，放置到質粒pdCs中。這是例如使用與成來進行。然后將Fc-存活蛋白質粒放置到適合于高水平表達的哺乳動物細胞系，例如NS/0細胞，將得到的分泌的蛋白質收集并且按照實施例4中的純化，與佐劑一起配制，并且如實施例5所示接種人或動物。實施例3.構建包含本發明質粒的沙門氏菌屬菌林通過本領域凈支術人員熟知的下面說明的標準電穿孔方案產生用于接種的攜帶本發明質粒的沙門氏菌屬菌林。例如，將質粒pdCs-雞存活蛋白轉化到沒有質粒的沙門氏菌屬菌林(例如減毒的鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)aroA菌林SL7207)中。其他減毒的沙門氏菌屬菌林也可以使用，例如具有基因型aroA，dam-的RE88、具有基因型msb、purl的VNP20009或備選地原養型LT2菌林。也可以使用傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphii)菌抹，優選是減毒的。為了制備電感受態細菌，在至少0.5的OD600時收獲50ml沙門氏菌屬的對數期培養物，將其在水上冷卻，繼而將細胞在等體積然后在一半體積的冰凍lmMHEPES中洗滌，并且再次沉淀。然后將細胞重懸在lml冷的10%甘油、lmMHEPES中，沉淀并且通過溫和吹打最終重懸在0.5ml冷的10%甘油、lmMHEPES中。將細胞保持在冰上直到使用，或者等分試樣儲存在-80。C.對于電穿孔，將40亳升電感受態的細菌添加到預冷的1.5ml微量離心管中，與高達2微升體積中的高達200ng的超螺旋質粒pdCs-雞存活蛋白組合，并且通過輕打混合。將細菌-DNA混合物轉移到預冷的0.2cm有口樣品池(gapcuvette)(Bio-Rad，Hercules,CA)，并且用2500V、25fiF、200ohm的電脈沖電穿孔，通常導致4.5+/-0.2的時間常數，其后添加lml的SOC培養基。在37。C溫育1小時后，將0.1ml的細胞接種在LB抗生素選擇平板(100微克/ml氨節青霉素)上。獲得并且培養單菌落隔離群，并且分離質粒DNA以通過限制性分析證實其身份。將新生長的確認的培養物補充15%的甘油，以500毫升等分試樣速凍，并且儲存在-80'C中。實施例4Fc-存活蛋白融合蛋白質的轉染、表達、初步表征和純化A.Fc-存活蚤白融合蛋白質的轉染和表達例如，對于蛋白質表達、質粒表達的快速分析，通過使用脂質轉染胺試劑(Invitrogen)的瞬時轉染，通常將muFc-雞存活蛋白或muFc-mu存活蛋白引入到細胞系，例如人胚胎腎HEK293細胞(ATCC#CRL-1573)。為了獲得表達Fc-存活蛋白的穩定轉染的克隆，例如，通過電穿孔將適當的質粒DNA引入到小鼠骨髓瘤NS/0細胞。NS/0細胞生長在Dulbecco的修飾的Eagk培養基，所述培養基補充了10%熱-滅活胎牛血清培養基、2mM谷氨酰胺和青霉素/鏈霉素。將大約5xl(^細胞用PBS洗滌一次，并且重懸在0.5ml的PBS中。然后將10jig線性化的質粒DNA與細胞一起在GenePulserCuvette(0.4cm電極間隙，BioRad，Hercules,CA)中在》K上溫育10分鐘。使用設置為0.25V和500mF的GenePulser(BioRad)進行電穿孔。將細肫在冰上恢復10分鐘，然后將它們重懸在生長培養基中并且在2個96孔板上平板接種。穩定轉染的克隆通過在100nm氨甲喋呤(MTX)存在下選擇，其中氨甲喋呤在轉染后兩天添加到生長培養基。每3天向細胞喂飼兩次或多次，在2到3周中出現MTX-抗性克隆。通過抗-FcELISA測定來自克隆的上清液來鑒定高生產者。分離高生產克隆并且將其在包含100nmMTX的生長培養基中繁殖。通常使用H-SFM或CD培養基(Invitrogen)生長培養基。備選地，通過與上述描述方法類似的方法，用氨甲喋呤選擇在人胚緊HEK293細胞中獲得穩定表達Fc-存活蛋白融合蛋白質的克隆。將HEK293克隆保持在補充10%FBS的DMEM上。B.Fc-存活蛋白融合蛋白質的純化和分析基于Fc蛋白質部分對A蛋白的親和性進行包含Fc的融合蛋白質的標準純化。簡言之，用編碼Fc-存活蛋白融合蛋白質的質粒轉染的細胞通常在補充了O.ljiMMTX的H-SFM中在滾瓶中生長，并且將包含融合蛋白質的細胞上清液上樣到預先平衡的(50mM磷酸鈉、150mMNaCl、中性pH的0.01%TWEEN80)A蛋白瓊脂糖快速流動(SepharoseFastFlow)4主上。將柱子在此緩沖液中充分洗滌，在低pH(pH2.5)下在與上面相同的緩沖液中洗脫結合的蛋白質，將級分用1M的Tris堿(pHll)變成pH6.7.將A蛋白瓊脂糖-純化的Fc-存活蛋白融合蛋白質通過分析型大小排阻層析(SEC)進^ff分析，并且發現通常大部分物質處于聚集狀態。這一結果是意料之外的，因為存活蛋白通常是細胞質蛋白質。不希望受到理論卩艮制，認為當存活蛋白被Fc-存活蛋白融合蛋白質的Fc部分強制i^分泌途徑中時，存活蛋白折疊受損害，特別是因為存活蛋白包含很多參與二硫健形成的半胱氨酸。由于這一聚集會干擾生物學活性，因此當蛋白質要被使(用作疫苗時，聚集是不希望的。融合蛋白質的完整性和純度是通過還原性SDS-PAGE電泳來驗證的。在大約45kDa(即融合蛋白質的希望大小)看到最強的條帶。也存在大量次級條帶蛋白質確實聚集的另一證據。C.ELISA步驟通過抗-FcELISA測定MTX-抗性克隆和其他測試樣品的上清液中包含Fc的蛋白質產物的濃度。i包被平板用PBS中的5ng/mL的AffmiPure山羊抗鼠IgG(H+L)(JacksonImmunoResearchLaboratories,WestGrove，PA)包#皮ELISA，包凈皮為96孑L板中100jiL/孑L(Nunc-ImmunoplateMaxisorp)。蓋上包被的平板并且在4。C過夜溫育。然后用PBS中的0.05%Tween(Tween20)將平板洗滌4此，并且用PBS中的1。/。BSA/l。/。山羊血清以200nl/孔封閉。在用封閉緩沖液在37。C溫育2小時后，用PBS中的0.05%Tween將平板洗滌4次，并且在紙巾上吸千。ii.用測試^"品和二級抗體溫育根據需要在樣品緩沖液(PBS中的1%BSA/1%山羊血清/0.05%Tween)中稀釋測試樣品。使用濃度已知的嵌合抗體(具有人Fc)制備標準曲線。為了制備標準曲線，在樣品緩沖液中進行順序稀釋以提供范圍在125ng/mJL到3.5ng/mL內的標準曲線。將稀釋的樣品和標準品以100nl/孔添加到平板上，并且在37。C將平板溫育2小時。溫育后，將平板用PBS中的0.05%Tween洗滌8次。向每孔添加lOOjil的二級抗體(辣才艮過氧化酶綴合的抗人IgG(JacksonImmunoResearch))，所述抗體在才羊品緩沖液中稀釋大約1:120000。對于每批來說，待使用的二級抗體的精確稀釋度是不同的。在37。C溫育2小時后，用PBS中的0.05%Tween洗滌8次。iii.顯色將底物溶液以100fiL/孔添加到平板中。底物溶液按照以下制備將30mg的OPD(鄰苯二胺二鹽酸鹽)(OPD)(1片)溶解到15mL的0.025M檸檬^/0.05MNa2HP04緩沖液(pH5,其包含0.03%新鮮添加的過氧化氫)中。在室溫下黑暗中顯色大約30分鐘。顯色時間可以根據包被的平板、二級抗體等的批次間的差異而改變。通過以100jiL/孔添加4N疏酸來終止反應。通過平板讀數器讀出平板，所述讀數器設定在4卯和650nm，并且i殳定程序為從490nmOD減去650nm的背景OD。實施例5疫苗遞送和腫瘤攻擊的方法從JacksonLaboratories(BarHarour，ME)購買C57B1/6和Balb/c小鼠(7-8周齡)。在EMDLexigenResearchCenterCorp"Billerica，MA，保持小鼠，并且根據許可的動物設施操作程序(AnimalFacilitiesOperatingProcedure)進4亍所有動物實驗。為了制備沙門氏菌屬疫苗樣品，將5mlLB/AMP培養物用單個轉化的細菌菌落接種，在37。C生長過夜，在2000xg下離心10分鐘，在PBS中洗滌1次，并且重懸在2ml的PBS中。測量PBS中1:10稀釋的培養物的OD600,將培養物的濃度用PBS調整成109細胞/ml，其中假設1個OD600單位對應大約109細菌/1111(從將培養物的連續稀釋液涂布到LB/氨節青霉素平板來測量)。用配備有20Gxl.5，，的一次性進樣針(穿入到胃中)的注射器進行通過經口管銅的接種。小鼠用O.lml的10%碳酸氫鈉的管飼預先處理小鼠，來中和胃酸，5分鐘后，對小鼠施用O.lml的疫苗樣品(108細菌)。測量疫苗對表達哺乳動物存活蛋白并且將存活蛋白衍生的抗原呈遞到MHC上的腫瘤細胞系的效應。下面實施例中使用的腫瘤細胞系是小鼠肺癌細胞系D121、小鼠淋巴瘤細胞系A20、小鼠乳腺腫瘤系4T1、小鼠Lewis肺癌細胞系LLC、小鼠結腸癌細胞系CT26和小鼠黑素瘤細胞系B16,也可以使用表達哺乳動物存活蛋白并呈遞存活蛋白衍生的抗原的其他細月包系。在一些實驗中，使用已經被改造為表達人上皮細胞粘著分子(EpCAM)的腫瘤細胞系，其被稱為"KSA，，(例如LLC/KSA)。可以通過標準方法，用Western印跡容易地評估存活蛋白表達。以1:500稀釋使用針對人和鼠存活蛋白的兔多克隆抗體(AHP604，Serotec，Raleigh，NC)。在下列實施例中使用的腫瘤細胞系維持在下列培養基中。D121生長在補充了1%青霉素/鏈霉素(P/S)1。/。L-谷氨酰胺、1%的丙酮酸鈉和1%的非必需氨基酸的具有10%胎牛血清(FBS)的DMEM中。A20和4T1生長在具有10%FBS、1%P/S、1。/oL-谷氨酰胺的RPMI。LLC生長在具有10%FBS、1%P/S、ly。L-谷氨酰胺的DMEM中。CT26生長在具有10%FBS、1%P/S、1。/oL-谷氨酰胺和lV。維生素B16的DMEM培養基中。CT26/KSA培養基也包括1。/。丙酮酸鈉和1%非必需氨基酸。另外表達EpCAM的細胞系的培養基也包含ljig/mlG418。為了評估疫苗對小鼠存活蛋白或對待治療小鼠的肺腫瘤負荷的效應，將肺瘤細胞靜脈內施用。將腫瘤細胞用PBS洗涂，胰蛋白酶化3分鐘，并且用條件培養基中和胰蛋白酶。將細胞沉淀并且用PBS洗滌2次，或在D121細胞的情形中，用PBS、1%胎牛血清、50|iMEDTA洗滌。通過將重懸的細胞應用到多個一次性lOOfiM尼龍網篩(BDFalcon)來獲得單細胞*懸液。以每只小鼠200nl體積的細胞懸浮液，使用27計量注射針對小鼠靜脈內注射到尾部靜脈中。移除肺，稱重并且通過評估肺被腫瘤所覆蓋的面積的百分比來評分，以比較轉移腫瘤負荷。實施例6.用編碼雞存活蛋白的DNA免疫產生與哺乳動物存活蛋白交叉反應的抗體白交叉反應的抗體，進行下列實驗。使用Davis((1996)Adv.DrugDeliveryReviews21:33)所描述的免疫方案作為實驗基礎。用編碼野生型雞存活蛋白(ChSur)或imiFc-雞存活蛋白(FcChSur)的表達質粒或用編碼muFc-癌胚抗原(CEA)(FcCEA)的對照表達質粒，對7-8周齡的雌性Balb/c小鼠(每個處理紐n-2)免疫一次(第一天)或三次(笫1、21和46天)。用lOOfil的10jiM心臟毒素在脛骨前肌中注射小鼠，5天后用lOOpg的質粒DNA注射小鼠。在第62天，對小鼠取血，并且測定血清中針對鼠存活蛋白的抗體。將順序稀釋的血清應用到用muFc-mu存活蛋白融合蛋白質包被的ELISA平板上，洗滌平板，將樣品與過氧化物酶綴合的抗小鼠IgG2a抗體一起溫育。通過比色測定與陰性對照幼稚小鼠相比，ELISA檢測到抗存活蛋白抗體的存在。表2中顯示的結果表明存活蛋白DNA疫苗在引發對鼠存活蛋白反應的抗體中是有效的，而對照DNA疫苗則無效。表2:抗鼠存活蛋白抗體效價<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>在Western印跡或ELISA中，進一步測試小鼠抗-存活蛋白抗體對人存活蛋白的交叉反應性。期望通過用雞存活蛋白疫苗組合物接種小鼠獲得的小鼠存活蛋白抗體也結合人存活蛋白蛋白質。實施例7.用編碼存活蛋白的DNA接種哺乳動物引發對癌細胞的T細胞免疫應答為了確定基于沙門氏菌屬的存活蛋白疫苗刺激針對癌細胞的T細胞應答的能力，進行下列實驗。如實施例5所示，用SL7207沙門氏菌屬菌林在第0和第14天接種Balb/c小鼠，所述沙門氏菌屬菌林攜帶AroA突變(Medina等人，(1999)InfectionandImmunity,第1093-1099頁)，并且還攜帶編碼鼠存活蛋白(n=2)或野生型雞存活蛋白(n=2)的哺乳動物表達載體。在此實驗中將幼稚的未免疫的小鼠(n=2)用作陰性對照。第一次接種后一個月，提取并且合并每組的脾細胞.將CD8+T細胞純化并且在鼠IFNyELISpot測定中用作應答者，基本上如下述。在此測定中，將A20和4T1腫瘤細胞系用作效應細胞(圖6)。4T1細胞已被改造為表達人上皮細胞粘著分子(EpCAM)，但是認為這與本實驗無關。與對照動物相比，接種的小鼠中存在顯著更多的IFNy應答T細胞。用包含鼠或雞存活蛋白表達質粒的沙門氏菌屬接種與響應不同腫瘤細胞系的IFNy分泌前體T細胞的數量提高相關。對C57B1/6小鼠也進4亍相同的接種方案。在鼠IFNyELISpot測定中，將這些小鼠脾的CD8+T細胞與Lewis肺癌細胞(LLC)或B16黑素瘤細胞一起溫育。LLC和B16細胞已被改造為表達人上皮細胞粘著分子(EpCAM)，但是i^為這與本實驗無關。與幼稚C57B1/6動物相比，兩種疫苗都導致了應答性T細胞的相對數量的增加，所述應答T細胞針對在I類MHC背景中表達的靼抗原的肽。與用SL7207鼠存活蛋白接種的小鼠相比，在用SL7207雞存活蛋白接種的小鼠中產生了顯著更多的針對LLC腫瘤細胞和B16細胞的IFNy分泌細胞。總之，這些結果表明兩種接種方法都引發了CD8+T細胞前體的數量增加，所述前體與在I類MHC表位背景中展示哺乳動物存活蛋白肽的癌細胞反應。這些觀察也表明用雞存活蛋白免疫在破壞耐受性以及產生針對表達哺乳動物存活蛋白的靶細胞的免疫應答中是更有效的。在本實施例和若干下列實施例中，使用鼠傷寒沙門氏菌菌抹SL7207,但是可以使用其他沙門氏菌屬菌林，例如傷寒沙門氏菌。當用人中的傷寒沙門氏菌治療人時，通常優選使用營養缺陷型，其任選地攜帶額外的減毒突變。鼠IFNyELISpot測定方案基本上如Tower等人(Power等人，(1999)J.Immunol.Meth.227:99-107)所述進行ELISpot測定。使用MiltenyiCD8+T細胞分離試劑盒(MiltenyiBiotech,Auburn,CA),從脾細胞分離CD8+T細胞，并且將其在自動磁珠分選艱上根據制造商說明書分選。將CD8+T細胞保持在補充0.7ng/mlIL-2(R&DSystems)的RPMI中。24小時內，將活細胞在Lympholyte⑧梯度上純化并且重懸終濃度106細胞/ml。將CD8+T細胞以從105細胞/孔起始的連續稀釋接種在鼠IFNyELISpot平板(BDBiosciences,SanJose，CA)沖，所述平板用5ng/ml的抗鼠IFNy抗體預包被。所有腫瘤細胞系以5xlV細胞/孔的濃度添加。18-24小時后，移除細胞，將抗IFNy包被的膜用PBS中的0.05。/。Tween洗滌，與在PBS中的針對IFNy的二級生物素化抗體和2%胎牛血清一起溫育，通過暴露于鏈霉抗生物素蛋白綴合的HRP和AEC(3-氨基-乙基呼唑)乙酸鹽溶液顯示結合的二級抗體。將對應于分泌IFNy的CD8+T細胞的點用ZeissKSELISpot系統(Muenchen-HaIIergmoss，德國)定量。實施例8.用雞存活蛋白體外免疫來自人的免疫細胞為了證實非哺乳動物存活蛋白序列例如雞存活蛋白序列對引發人中抗存活蛋白應答的能力，使用患者外周血細胞(huPBMC)進行體外免疫測定。大體上，從huPBMC純化樹突細胞(DC)和T細胞，用所選擇的抗原裝載樹突細胞，并將其與T細胞一起溫育，并且使用本領域技術人員熟悉的標準方法，測定暴露于例如以表達人存活蛋白的耙細胞的形式存在的存活蛋白肽的T細胞的應答。例如，DC(來自HLA-A2+患者的huPBMC并且使用IL-4和GM-CSF衍生)用已知為HLA-A2+等位基因表位的對照存活蛋白肽序列力口LMLGEFLKL(SEQIDNO:6)脈沖，或者用實驗肽脈沖，所述實驗肽例々口(i)30-mer雞存活蛋白衍生的肽GCAFAALQKDPSELMLGEFLKLDRERAKNV(SEQIDNO:32);(ii)野生型雞存活蛋白肽；或(iii)突變的雞存活蛋白肽，例如雞存活蛋白(N97E，T99M,V100L，Q101G)(SEQIDNO:12)。備選地，將表達這些序列的DNA構建體引入DC中。在與肽或蛋白質溫育后，或在表達了引入的DNA后，將DC輻射并且洗滌以移除過量的外源添加的肽，然后與同基因的T細胞在IL7和IL-2的存在下混合。在每周基礎上通過混合培養的T細胞與新鮮處理的和輻射的DC再次刺激T細胞。在一個測定中，存活蛋白反應T細胞的存在通過IFNyELISpot測定檢測，基本上如實施例7所描述的。備選地，常規["Cr釋放測定用于評估這些細胞的功能活性，其中在I類MHC分子背景中呈遞存活蛋白肽的靶胂瘤細胞被裝載["Cr，并且與這些T細胞一起溫育，通過"Cr釋放定量月中瘤細胞裂解。將不表達存活蛋白的對照粑細胞系用作陰性對照。希望實驗制品在產生T細胞中至少與對照制品一樣有效，所述T細胞應答存活蛋白，這表明雞存活蛋白衍生的序列可以作用為指導針對表i^A存活蛋白的特異性免疫應答的表位。實施例9.對肺癌的接種效應為了確定在第二次治療被延遲到腫瘤攻擊后，疫苗引發的免疫應答是否能夠抑制轉移肺瘤的生長，進行下列實驗。在第0天，C57B1/6小鼠(每個處理條件n=5)用lOOpl的10%碳酸氫鈉口服接種，隨后用108個SL7207沙門氏菌接種，所述沙門氏菌包舍編碼突變的雞存活蛋白(雞存活蛋白(N97E,T99M，V100L，Q101G))的質粒；編碼muFc-雞存活蛋白的質粒；或具有兩個轉錄單元的質粒，其中一個編碼雞存活蛋白(N97E，T99M，V100L,Q101G)，另一個編碼作為佐劑的融合蛋白質muFc-muIL2。用PBS處理對照小鼠。小鼠用100nl的10%碳酸氫鈉口服預先給藥，并且施用在PBS中的SL7207沙門氏菌(如上文描述制備)。引發接種10天后，將小鼠用200^1的PBS中的lxl06LCC/KSA細胞的單細胞懸液靜脈內注射，并且使用相同濃度的沙門氏茵用第二次口服接種加強。在第32天處死小鼠。典型結果顯示在下表(表3)中。結果顯示用攜帶有雞存活蛋白構建體的表達載體的沙門氏菌接種提供了針對轉移肺癌的相似保護。表3.用存活蛋白疫苗治療的具有肺癌的小鼠的肺重量和轉移評分。平均值士標準差(g)肺瘤分數*PBS1.12±0.253、3、3、3、3雞存活蛋白(N97E，T99M，V100L,Q101G))0.23±0.05i、i、L7,'雞存活蛋白(麗E，T99M，扁0L，Q101G)+muFc-MuIL20.21±0.13J、1、2、1、1muFc-雞存活蛋白0.24±0.031、1、1、1、1表3中，(*)腫瘤負荷在0-3(0=肺中沒有胂瘤、1=<5%腫瘤負荷、2=5-50%腫瘤負荷、3=>50%的肺被腫瘤覆蓋)的標度上評分。斜體并且粗體的腫瘤分數表明在尾根部發現額外的肺腫瘤。實施例10.用SL7207雞存活蛋白或鼠存活蛋白接種顯著延遲了死亡為了確定用攜帶存活蛋白表達質粒的沙門氏菌SL7207接種是否降寸氐了腫瘤負荷并且增加了存活，將Balb/c小鼠(每個處理條件n-5)如前所述用經口管祠法用PBS、具有鼠存活蛋白表達質粒的SL7207沙門氏菌或具有野生型雞存活蛋白表達質粒的SL7207沙門氏菌給藥兩次，間隔兩周。第二次接種兩周后，將小鼠靜脈內注射200jil5xl05細胞/mlCT26/KSA同基因細胞(其還表達人EpCAM蛋白質，這認為與本實驗不相關)的PBS懸液。監測小鼠的存活。如在圖7中所示，與用PBS或SL7207鼠存活蛋白處理的小鼠相比，在用SL7207雞存活蛋白處理的小鼠中存活鐠更長。實施例ll.由于用攜帶存活蛋白表達載體的沙門氏菌接種，具有癌轉移的哺乳動物的延長的存活為了解決具有預先存在的癌癥的哺乳動物是否可以用攜帶存活蛋白表達質粒的沙門氏菌接種，進行下列實驗。在該實驗中，用0.1ml的10。/o碳酸氫鈉預處理C57B1/6，然后在第0天用PBS中的大約1億個包含鼠存活蛋白(n=5)或雞存活蛋白(N97E，T99M，V100L，Q101G)(n-5)的載體的SL7207沙門氏菌(如上所述制備)口服接種。用碳酸氬鈉和PBS(i^5)管飼對照小鼠。在引發接種10天后，將小鼠靜脈內注射200^1lxl06LLC/KSA細胞(其還表達人EpCAM蛋白質，這認為與本實驗不相關)的PBS懸液。所有小鼠用在肺瘤注射4小時施用的第二次口服接種加強，使用相同濃度的為引發免疫應答所施用的沙門氏菌。在腫瘤攻擊后，在12周內跟蹤存活。所有對照小鼠在肺瘤施用35天內死亡。重要地，所有用一種存活蛋白構建體接種的小鼠在第35天仍然存活。在SL7207雞存活蛋白(N97E，T99M，V100L,Q101G)處理組中的所有小鼠在LLC/KSA注射10周內死亡。在用SL7027鼠存活蛋白處理的組中三個月后有一只動物存活。兩個處理組之間沒有顯著差異(p=0.243)。在圖8中，顯示了針對用LLC/KSA細胞的腫瘤攻擊的接種的存活曲線。實施例12.使用預測算法評估存活蛋白序列中的取代預測算法可以用來評估本發明的存活蛋白變體是否包含潛在的抗原表位，或相反，亞優勢的抗原表位是否可能是改良的。例如，hu存活蛋白變體huSur(R18E,H77A，C84A，A128P)(SEQIDNO:84)可以使用公開可用的數據庫就蛋白體切割位點預測進行分析，所述數據庫例如NetChop(www.cbs.dtu.dk/NetChoD)，并且使用數據庫就主要的MHCIHLA超型的表位預測進行分析，所述數據庫例如SYFPEITHI(www.svfpheithi.de)。使用NetChop,發現將取代R18E、H77A、C84A、A128P引入人存活蛋白不劇烈改變切割模式("S"表明高于閾值0.8的潛在切割位點)，如所示:mgaptlppawqpf!LlcdhristfknwpflegcactpentiaeagfihcptenepdlS____S...S..SSSS..S..SS......S.......S...............S野生型s.…s….s,ssss,,s…ss......s.......s...............s變體AAaacffcfkeleqwepdddpieehkkhssgcaflsvkJcgfeeltlgeflkldrer…SS.SS.S............SSS.......S........SSS…SS…野生型…SS.SS.S............SS........s...s.…s.ss…ss....'變體pAknkiaketnnkklsefeetakkvrraieqiaamd(SEQIDMO:B)____S.......SS.....S.SS......S..S.野生型____S.......SS,S.....SS.S----s..s.變體以粗體和下劃線顯示預先鑒定的結合HLA-A0201亞型的的抗原表位，并且NetChop不預測此表位的C端切割位點。使用SYFPEITHI，就結合HLA超型A2、A3和B7的表位分^f斤huSur(R18E，H77A，C84A，A128P)(SEQIDNO:84)，所述超型一起覆蓋了大約至少85%的人群(見Sette等人，(1999)Immunogen.50:201-212)。當與野生型hu存活蛋白相比時，對HLA-A0201和HLA-A03，頂端級別的表位是相同的，而對于HLA-B0702,變體存活蛋白序列提供了頂端級別的表位，這是因為取代H77A實現的更偏好的C端錨定殘基。因此，肽EPDDDPIEEA(SEQIDNO:33)可以是比肽EPDDDPIEEH(SEQIDNO:34)更好的抗原肽。如NetChop分析所表明的，另外的取代如P47L和Q56L，可以被引入到huSur(R18E，H77A，C84A，A128P)，并且該序列可以通過上逸SYFPEITHI再次分析。人存活蛋白(R18E，H77A，C84A,A128P)的序列顯示在SEQIDNO:84中。人存活蛋白(R18E,P47L，Q56L，H77A，C84A，A128P，I135P)的序列顯示在SEQIDNO:56中。具體地，突變P47L加強了肽CPTENEPDL(SEQIDNO:2)(其被改變為CLTENEPDL(SEQIDNO:35))中的錨定位置2。類似地，取代Q56L產生了肽ALCFFCFKEL(SEQIDNO:36),其與AQCFFCFKEL(SEQIDNO:37)(其被預測為是HLA-A0201的弱結合物)相比在位置2具有優選的錨定殘基。當與野生型hu存活蛋白相比時，Q56L變體存活蛋白序列產生了預測作為抗原的肽，所述肽與驗證的hu存活蛋白抗原肽ELTLGEFLKL(SEQIDNO:38)—樣強(Andersen等人(2001)CancerRes.61:869-872)。根據本發明，此類分析可以產生存活蛋白序列，所述序列包含高抗原肽，所述肽是CTL較不可能耐受的，例如，通過促進應答亞優勢的表位。實施例13.用包含表達非哺乳動物存活蛋白的疫苗治療人癌癥患者根據本發明，如下用本發明的疫苗治療患癌的人。首先，用診斷試劑>任選地將用于治療的候選者分類，所述診斷試劑測試他們的癌細胞是否過量表達存活蛋白。例如，可以用抗存活蛋白抗體通過免疫熒光分析腫瘤樣品。備選地，候選患者的胂瘤樣品可以通過與檢測存活蛋白mRNA水平的基因芯片的雜交、通過反轉錄酶PCR、或通過檢測存活蛋白mRNA或蛋白質水平的任何其他方法進行分析。也可以同樣基于其他診斷測試將患者分類，所述測試為例如MHC表達水平的測試、已知涉及T細胞介導的殺傷的信號轉導分子的水平，或基于功能未被了解但是其通過經驗已知與免疫治療的應答相關的分子的水平。特別有用的是選擇已經經歷了大多數腫瘤手術切除的人類患者。這允許如上所述進行腫瘤的診斷分析。另外，不希望受到理論限制，有利地在手術切除后治療，因為大塊肺瘤可以簡單的逐步增強免疫系統。另外，腫瘤分泌可擴散的免疫抑制因子，其在大塊中比在小的轉移中更容易達到更高的濃度。選擇用來治療的患者具有黑素瘤、結腸癌、乳腺癌、胰腺癌、肺癌、腎癌、成膠質細胞瘤、頭頸癌和其它癌癥。在適當的診斷和患者選擇后，用具有非哺乳動物存活蛋白表達載體(在哺乳動物細胞中用于表達非哺乳動物存活蛋白的載體)的沙門氏菌菌林治療患者。例如，患者可以接受大約109到1013個活的沙門氏菌LT2，所迷LT2攜帶具有哺乳動物啟動子驅動的雞存活蛋白表達的質粒。優選地，使用大約101()-1012個細菌，更優選大約2xl()U個沙門氏菌被施用。沙門氏菌菌株優選是營養缺陷型的，可以使用實施例中提到的任一種菌林。可以使用兩種備選方法解決在胃的酸性環境中沙門氏菌細菌的存活問題。通過第一種方法，患者首先攝入安全和有效量的碳酸氫鈉以中和胃酸。通過另一種方法，將沙門氏菌細菌與腸包衣一起配制為丸劑，所述腸包衣允許通過胃并且在小腸中溶解。當使用鼠傷寒沙門氏菌細菌菌林時，副作用可以包括輕微的腹瀉；鼠傷寒沙門氏菌天然是小鼠病原體并且對于人通常不是致病性的。優選針對癥狀治療此類溫和腹瀉，但是不用抗生素治療，因為后一治療會破壞疫苗效果。實施例14.相對于腫瘤攻擊的接種定時進行實驗來測試相對于腫瘤攻擊時間，用雞存活蛋白接種的定時的重要性。將小鼠通過經口管飼用包含編碼雞存活蛋白(N97E，T99M，V100L，Q101G)的質粒的沙門氏菌給藥。給藥方案顯示在圖9中。如所示，在第1和13天；第7和13天；第10和18天或第13和21天進行經口管伺，沖目對的在第10天由LLC/KSA細胞靜脈內攻擊并且在第29天評估肺瘤肺負擔。如圖10所示，用包含編碼雞存活蛋白(N97E，T99M，V100L，Q101G)的質粒的沙門氏菌經口管飼對于減少肺腫瘤負荷是有效的，而無論所使用的給藥方案如何。當腫瘤攻擊之前3天以上施用引發疫苗劑量時，疫苗效果更顯著。也評估了改變給藥方案對肺轉移的效果。肺轉移如下評分，肺表面月中瘤覆蓋超過50%的小鼠得分為3;肺表面腫瘤覆蓋5-50%的小鼠得分為2;肺表面腫瘤覆蓋不足5%的小鼠得分為1;沒有可見的肺腫瘤集落的小鼠《尋分為0。如圖10所示，與更靠后的給藥方案相比，或與未用雞存活蛋白(N97E，T99M,V100L，Q101G)口服免疫的小鼠相比，包括在腫瘤攻擊前的首次劑量的給藥方案傾向于減少肺轉移分數。實施例15.用存活蛋白疫苗與化學療法的組合療法也評估了組合針對存活蛋白接種的化學療法的效果。測試方案顯示在圖11中。如圖中所示，接受完全治療的小鼠用具有編碼野生型雞存活蛋白的質粒的沙門氏茵在第1天引發。將LLC/KSA細胞在第4天靜脈內引入(攻擊)。在第ll天腹膜內施用環磷酰胺(CTX)，在第12-15天施用丐l哚美辛。在第15天，用攜帶野生型雞存活蛋白質粒的沙門氏菌為小鼠提供第二次經口管詞(加強)，在第28天評估肺腫瘤負荷。其他小鼠僅接受部分治療，接受例如:只有引發、攻擊和加強(PCB)、攻擊、CTX和吲哚美辛，^旦是沒有引發或加強(C(CI));引發、攻擊、!CTX和吲哚美辛，但是沒有加強(PC(CI));或攻擊、CTX、吲哚美辛和加強，但是沒有引發(C(CI)B)。如圖12所示，與陰性對照相比，僅接受引發、攻擊和加強的小鼠表現出減少的腫瘤負荷和減少的肺轉移評分。CTX和吲咮美辛對于肺轉移具有類似的效果，并且對腫瘤負荷具有更大的總體上減少。最低的腫瘤負荷和最低的肺轉移評分在至少接受了引發和CTX和吲哚美辛的小鼠中觀察到，表明接種治療和化學療法可以協同減少肺瘤負荷和肺轉移。實施例16.用編碼非哺乳動物存活蛋白的DNA的基于沙門氏菌的接種與具有激活的-記憶表型的T細胞的出現相關從進行了前述實施例中描述的PCB、CI、PC(CI)、C(CI)B或完全(PC(CI)B)治療的小鼠中分離外周血淋巴細胞。通過流式細胞儀分析細胞以確定治療是否導致激活的記憶T細胞的出現。記憶T細胞的存在或不存在通過監測高表達CD44和低表達CD3(CD44亮CD3低)的細胞來確定。如圖13所示，用引發-攻擊-加強(PCB)方案治療的小鼠顯現出具有CD44亮表達模式的T細胞，這表明激活的記憶T細胞的出現。類似的模式在包括用攜帶編碼雞存活蛋白的質粒的沙門氏菌免疫的每個方案中觀察到，而沒有在僅用化學療法治療的小鼠中觀察到(也沒有在陰性對照中觀察到)。實施例17.用免疫細胞因子和用編碼非哺乳動物存活蛋白的DNA接種的組合療法為了確定使用非哺乳動物存活蛋白的接種是否可以增強基于免疫細胞因子的腫瘤治療的功效，將小鼠在第l天用LLC/KSA細胞皮下攻擊，并且根據圖14中顯示的方案治療。接受用具有編碼雞存活蛋白(N97E，T99M,V100L，Q101G)經口管飼的小鼠在第4、11、18和25天給藥。選擇用于本實驗中的免疫細胞因子是與IL-2與去免疫的抗-EpCAM抗體的融合，如在美國專利申請公布2003-0157054中所描述的。接受免疫細胞因子的小鼠在第8、9、10天靜脈內接受20照的免疫細胞因子。在一定時間內得到的腫瘤體積顯示在圖15中。用免疫細胞因子的接種或治療隨時間足夠減緩腫瘤生長。接受疫苗和免疫細胞因子的小鼠甚至更好，表明腫瘤生長速度與僅僅接種或與僅僅免疫細胞因子治療相比進一步減少。實施例18.本發明的存活蛋白構建體的生物活性的評估將本發明的某些存活蛋白變體設計為生物學惰性的。因此，當在一定條件下在細胞中表達時，蛋白質本身不表現出抗凋亡活性，所述條件通常誘導細胞凋亡，其可以通過野生型存活蛋白蛋白質阻止。類似地，所述蛋白質不干擾內源野生型存活蛋白保護細胞免受凋亡誘導劑的影響的活性。存活蛋白蛋白質的生物學惰性可以使用BaF3淋巴細胞前體細胞測試。BaF3細胞依賴于IL-3生長，并且在生長因子撤除時經歷凋亡，這是可以通過存活蛋白活性來抵消的(見例如Ambrosini等人，(1997)Nat.Med.3:917-921)。將BaF3細胞用編碼本發明存活蛋白構建體、野生型存活蛋白蛋白質或空的插入片段以及額外的標記蛋白質如GFP(使得可以監測外源引入的DNA)的質粒轉染。在從轉染回收后，從培養基中撤除IL-3，并且監測BaF3-細胞的凋亡，通過例如在第1、2、3和4天評估％生存力，或者通過本領域技術人員熟悉的指示凋亡的測定法，例如通過核形態(DNA濃縮和斷裂)。發現盡管用野生型存活蛋白轉染的BaF3細胞在4天時間內大部分保持存活，但是用空質粒或本發明存活蛋白變體轉染的BaF3細胞不保持存活并且主要表現出指示凋亡的核形態。本發明存活蛋白構建體的生物學惰性也可以使用Hela細胞測試。Hela細胞以顯著水平表達內源存活蛋白，并且已知特定的突變(如hu存活蛋白(C84A))作為存活蛋白的顯性失活形式(DN存活蛋白)并且在這些細胞中資導凋亡(見例如Li等人，(1999)Nat.CellBiology1:461-466)。將Hela細胞用編碼DN存活蛋白或本發明的存活蛋白構建體(還有標記蛋白質如GFP，從而表達外源引入的DNA可以^J^測)的質粒轉染。在從轉染回收后，Hela細胞生長48小時，固定，將核酸用DAPI染色，并且細'胞的核形態用免疫熒光顯微術分析分析。發現盡管用DN存活蛋白轉染的Hela細胞通常具有經歷細胞凋亡的標志，例如濃縮和斷裂的細胞核，但是用本發明存活蛋白構建體轉染的Hela細胞正常生長。實施例19:本發明存活構建體穩定性的評估為了評估存活蛋白構建體的穩定性，其可以從載體表達，所述載體另外表達標記基因如GFP從而可以相對于標準品測量表達的存活蛋白蛋白質的量。將組織培養細胞例如BHK細胞瞬時轉染，并且在Western印跡中測定存活蛋白構建體的表達水平，標準化到標記表達。如果可用的抗存活蛋白抗體不識別該蛋白質，那么可以使用這些變體的C端標記的形式。發現與野生型存活蛋白相比，本發明某些優選修飾的存活蛋白構建體，如具有多個去穩定突變的那些以大量降低的水平凈皮檢測得。除了測定穩態水平，在時間進程實驗中也評估降解速度。在時間0向細胞添加翻譯抑制劑方文線酮，將細胞溫育4小時。在0、2、5、10、20、60和240分鐘，移除樣品進行Western印跡分析。為了比較修飾的存活蛋白構建體和野生型存活蛋白之間的速度，將量標準化成0時間點。發現本發明某些優選修飾的存活蛋白構建體比野生型存活蛋白降解更快。為了評估降解是否通過蛋白酶體介導的途徑加工，將細胞任選在蛋白酶體抑制劑例如乳胱素存在或不存在時溫育(2小時，100nM)，再次通過Western印跡測定存活蛋白水平。在乳胱素存在時，發現以類似的水平檢測到本發明的存活蛋白變體和野生型hu存活蛋白。權利要求1.用于治療人中腫瘤和腫瘤相關疾病的疫苗，其包含(a)來自非哺乳動物存活蛋白的肽或編碼所述肽的核酸，其中所述非哺乳動物存活蛋白包含BIR結構域，所述BIR結構域與人存活蛋白的跨越Asp16至Leu87的BIR結構域具有50％至90％的氨基酸同一性，或(b)來自經修飾的哺乳動物存活蛋白的肽或編碼所述肽的核酸，其中所述經修飾的哺乳動物存活蛋白包含BIR結構域中的突變，所述突變基本上消除了BIR結構域的生物學活性，和(c)任選地佐劑，所述疫苗在人中引起針對人存活蛋白的免疫應答。2.權利要求l的疫苗，其中所述疫苗引起的免疫應答產生了攻擊表達人存活蛋白的細胞的CD8+T細胞。3.權利要求1或2的疫苗，其中所述肽來自非哺乳動物存活蛋白。4.權利要求3的疫苗，其中所述BIR結構域與所述人存活蛋白BIR結構域具有50%至80%的氨基酸同一性。5.權利要求3或4的疫苗，其中所述非哺乳動物存活蛋白來自鳥、魚、爬行動物或兩棲動物。6.權利要求5的疫苗，其中所迷非哺乳動物存活蛋白來自雞。7.權利要求3-6任一項的疫苗，其中來自非哺乳動物存活蛋白的肽包含一個或多個突變，所述突變促進通過結合至MHC分子而發生的T細胞抗原呈遞。8.權利要求7的疫苗，其中所述非哺乳動物存活蛋白是雞的，且所迷突變是在雞存活蛋白的Asn97、Thr99、Val100或Glnl01的一個或多個位置的氨基酸取代。9.權利要求8的疫苗，其中所述突變是下列一個或多個:N97E、T99M、V100L或Q101G。10.權利要求9的疫苗，其中所述突變是N97E、T99M、V100L和Q101G,且具有SEQIDNO:12的氨基酸序列。11.權利要求3-10任一項的疫苗，其中所述非哺乳動物存活蛋白包舍BIR結構域中的突變，所述突變基本上消除了BIR結構域的生物學活性。12.權利要求ll的疫苗，其中所述被消除的生物學活性是細胞凋亡。13.權利要求11或12的疫苗，其中所述來自非哺乳動物存活蛋白的肽在對應于人存活蛋白的Argl8、Pro47、Cys57、Cys60、His77和Cys84的一個或多個位置包含氨基酸取代。14.權利要求3-13任一項的疫苗，其中所述疫苗能夠活化T細胞，所述T細胞識別與MHC分子復合時的人存活蛋白肽序列。15.權利要求14的疫苗，其中所述人存活蛋白肽序列選自下列肽:LTLGEFLKL、CPTENEPDL和EPDLAQCFF。16.權利要求1或2的疫苗，其中所述肽來自經修飾的哺乳動物存活蛋白。17.權利要求16的疫苗，其中所述經修飾的哺乳動物存活蛋白是人存活蛋白。18.權利要求17的疫苗，其中所述來自經修飾的人存活蛋白的肽在人存活蛋白的Arg18、Pro47、Cys57、Cys60、His77和Cys84的一個或多個位置包含氨基酸取代。19.權利要求16-18任一項的疫苗，其中來自經修飾的哺乳動物存活蛋白的肽包含修飾的螺旋結構域。20.權利要求19的疫苗，其中來自經修飾的人存活蛋白的肽在人存活蛋白的Lysl22、Alal28和Ilel35的一個或多個位置包含氨基酸取代。21.權利要求20的疫苗，其中所述突變是下列一個或多個:Alal28P和112135P。22.權利要求17-21任一項的疫苗，其包含經修飾的人存活蛋白，所迷人存活蛋白具有下列突變R18E、P47L、Q56L、H77A、C84A、A128P、和I135P,以及在SEQIDNO:56中說明的氨基餅列。23.權利要求16或17的疫苗，其中所述經修飾的哺乳動物存活蛋白肽包含氨基酸序列LTLGEFLKL或LMLGEFLKL。24.權利要求l-23任一項的疫苗，其中來自非哺乳動物存活蛋白的肽和來自經修飾的哺乳動物存活蛋白的肽與Fc部分融合。25.權利要求l-24任一項的疫苗，其中該疫苗另外編碼或包括來自政應分子的肽。26.權利要求25的疫苗，其中所述效應分子是選自IL-2、IL-7、IL-12、IL-18、IL-21、IL-23和GM-CSF的細胞因子。27.權利要求l-26任一項的疫苗，其中編碼來自非哺乳動物存活蛋白28.權利要求27的疫苗，其中所述核酸是棵DNA。29.權利要求l-28任一項的疫苗，其中用增強哺乳動物細胞轉染的試劑配制所述核酸。30.權利要求l-29任一項的疫苗，其中所述核酸是病毒顆粒的部分。31.權利要求30的疫苗，其中所述病毒顆粒是腺病毒顆粒。32.權利要求l-32任一項的疫苗，其中所述疫苗包含含有所述核酸的細菌。33.權利要求32的疫苗，其中所述細菌是腸細菌。34.權利要求33的疫苗，其中所述細菌是沙門氏菌。35.用于針對過量表達存活蛋白的腫瘤細胞免疫人的藥物組合物，其包含在權利要求l-34任一項中說明的疫苗，任選地以及可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。36.權利要求l-34任一項中說明的疫苗的用途，用于生產針對過量表達人存活蛋白的胂瘤細胞免疫患者的藥物。全文摘要本發明提供了疫苗組合物，其在人中刺激對人存活蛋白的免疫應答，因此攻擊過量表達存活蛋白的腫瘤患病細胞。具體地，本發明提供了疫苗組合物，其包含來自非哺乳動物存活蛋白以及來自修飾的哺乳動物的特別是人的存活蛋白的肽。文檔編號A61K39/00GK101267833SQ200680034598公開日2008年9月17日申請日期2006年9月27日優先權日2005年9月27日發明者P·A·斯泰因,S·D·吉利斯,S·G·克林茨,T·A·O·黑特曼申請人:默克專利有限公司