專利名稱：：雙功能錨定蛋白的制作方法雙功能錨定蛋白本發明涉及免疫學和疫苗遞送領域。更具體而言，涉及具有內在免疫調節性質的細菌疫苗遞送技術，其可以使任何目標抗原不經過預先的抗原修飾而固定。目前正在開發通過表達抗多種疾病的不同抗原決定簇的減毒細菌載體株的疫苗遞送或免疫。使用這種載體的粘膜(鼻或口)免疫已引起廣泛關注。例如，在口腔建群有在其表面表達所述抗原決定簇的基因工程人口腔共生格氏鏈球菌(&r印tococcwgw^"http://)的小鼠中檢測到抗大黃蜂毒液的抗原決定簇的系統和粘膜抗體應答(Medaglini等人，PNAS1995，2;6868-6872)。而且，通過口服遞送其中破傷風毒素C片段在乳酸乳球菌(Za"ocoww/acto)組成型表達的重組細菌疫苗可以引起保護性免疫應答(Robinson等人,NatureBiotechnology1997,15;653-657)。特別地，粘膜免疫，作為誘導針對粘膜表面的特異性病原體的IgG和分泌性IgA的一種方法，被認為是接種疫苗的有效途徑。由細菌載體表達的免疫原以顆粒形式呈遞到免疫系統的抗原呈遞細胞(例如M細胞)，因此其引起耐受性的可能性比可溶性抗原低。另外，共同粘膜免疫系統的存在允許在一特定粘膜表面免疫，從而誘導抗原特異性IgA的分泌，并在遠端粘膜位點誘導其它特異性免疫應答。這種方法的缺點在于菌株本身有可能引起炎癥和疾病，可能引起發燒和菌血癥。另一種方法通過選擇如乳桿菌(丄actoZwc/〃w^p)和乳球菌(i^"0COCCWSMP)的重組共生菌作為疫苗載體，避免了使用其本身會變為致病菌的減毒菌株。然而，使用這種重組生物的缺點在于它們可建群于粘膜表面，從而導致長期暴露于這些重組微生物表達和釋放的目標抗原。這種長期的暴露可以引起免疫耐受性。此外，單單這種生物體體被遺傳修飾并含有重組核酸這樣的事實，在整體上正面臨公眾(非專家的公眾)的極大反對，這是由于對含有重組DNA或RNA的產品的普遍接受性水平低。同樣存在對使用致病性菌株(即使是減毒的)的反對，或者反對使用來自致病菌株的蛋白質或蛋白質的部分。如上所述，常規使用的蛋白異源表面展示技術通常需要使用錨定或靶向蛋白，所述蛋白對有限的一系列一般為重組或致病性的微生物具有特異性和選擇性，因此極大限制了其潛在應用。我們先前在專利申請WO99/25836和WO02/101026中已經提出了該問題，所述專利描述了使用含有與抗原融合的AcmA(-樣)結合域的嵌合融合蛋白，將抗原連接于來自非重組革蘭氏陽性菌的無活力球狀肽聚糖顆粒。在與抗原結合前，革蘭氏陽性菌接受非酶預處理(參見WO02/101026)。以前被稱之為"外殼"的肽聚糖顆粒仍然包含具有免疫調節性質的細菌成分，如肽聚糖。因此，這些顆粒現在被稱為革蘭氏陽性增強基質("GEM")或"GEM顆粒"。因此，WO99/25836和WO02/101026中公開的方法避免了使用那些通常為重組的或具有致病性的活細菌和/或微生物。然而，以前公開的方法限于可以作為嵌合蛋白產物制備(重組)的蛋白抗原的附著。對于一些蛋白抗原這不是可行的方法。例如，制備所述抗原有特殊要求，抗原中存在AcmA(-樣)結合域的存在可起到干擾作用。另外，對于非蛋白抗原，當然不能進行基因融合。而且，該方法不允許顆粒抗原的附著。可以設想通過化學方法將目標抗原共價偶聯到肽聚糖顆粒上，例如使用與抗原和細菌顆粒均能反應的化學交聯劑。乳酸菌細胞壁的肽聚糖層被多種物質，例如(脂)胞壁酸、中性和酸性多糖和(表面)蛋白覆蓋。因為化學修飾可以干擾抗原誘導的免疫系統效力，所以這種化學方法不會適合于每種類型的抗原。此外，多數化學交聯劑需要特定的反應基(例如，SH)以調節共價相互作用，所述反應基可能不總是存在，或者在交聯分子中位于不合適的(例如，抗原結合)位點。本發明的目的是克服這些限制。為此目的，開發了雙功能多肽，其既含有結合(非共價地)目標抗原的功能性，又含有結合(非共價地)免疫原性載體(如GEM顆粒)的功能性。該系統可以使任何目標抗原不經過預先的修飾而固定在GEM顆粒的表面。所述抗原可以是(多)肽、糖類、脂類、DNA、RNA或任何其它生物有機化合物，甚至本身可以具有顆粒性質，例如病毒顆粒。因此，本發明涉及負載抗原的免疫原性載體復合物，其包含至少一種附著到免疫原性載體上的多肽，所述多肽包含融合于抗原結合域(ABD)的肽聚糖結合域(PBD)，所述多肽通過該肽聚糖結合域附著于所述載體，所述抗原結合域能夠結合目標抗原。在本發明的負載抗原的復合物中，至少一種目標抗原結合于(非共價地)ABD。所述PBD包含能夠結合于肽聚糖的氨基酸序列，該序列選自由如下(i)、(ii)和(iii)組成的組(i)LysM域，(ii)以乳酸乳球菌細胞壁水解酶AcmAC末端中三個LysM域(重復區域)(所述域在此也稱為AcmALysM域)其中之一在氨基酸序列數據庫中進行同源性檢索所檢索到的氨基酸序列，以及(iii)與所述三個AcmALysM域其中任何一個具有至少70%的相同性的序列。所述PBD能夠附著于革蘭氏陽性微生物的細胞壁。術語"抗原結合"意指結合目標抗原的能力。所述能力由至少一種雙功能多肽賦予。術語"雙功能"表示所述多肽具有至少兩種不同的功能性肽聚糖結合功能性和抗原結合功能性。所述功能性可以是多價的，例如雙功能多肽可以包含多個抗原結合位點。術語"免疫原性載體"是指在施用到對象時具有提高或修飾附著到其上的抗原的免疫刺激性的能力的部分。因此免疫原性載體具有佐劑性質。此外，其包含肽聚糖，使得通過其肽聚糖結合域(PBD)附著一種或多種雙功能接頭多肽。由于上述原因，優選非重組免疫原性載體。在一個優選實施方式中，所述免疫原性載體復合物為由革蘭氏陽性菌制得的無活力球狀肽聚糖顆粒(GEM顆粒，或者"外殼")。制備GEM顆粒的方法以前已經描述，例如在專利申請WO02/101026和WO2004/102199中。所述方法保留了所述細菌的天然球狀結構的大部分。簡而言之，所述方法包括用能夠從細胞壁物質除去細胞壁成分(如蛋白質、脂胞壁酸或糖類)的溶液處理革蘭氏陽性菌。隨后可以儲存制得的GEM顆粒，直到其與所需雙功能多肽接觸。GEM顆粒比未處理的革蘭氏陽性菌結合高得多的量的PBD融合物。因此，在GEM顆粒上可以實現對抗原的高負載能力(WO02/101026)。GEM顆粒比機械破碎的細胞壁物質更好地能夠結合到特定細胞或組織和/或更容易被特定細胞或組織占有。GEM顆粒靶向巨噬細胞或樹突細胞的能力提高了它們的功效。因此本發明的非重組、無活性免疫原性載體復合物適用作疫苗遞送載體。同樣參見WO02/101026和WO2004/102199。在本發明的一個優選實施方式中，提供了一種疫苗遞送技術，其基于GEM顆粒，所述GEM顆粒具有一種或多種通過使用雙功能多肽附著到所述顆粒上的抗原，其中GEM顆粒起到表面附著致病源化合物的免疫原性骨架的作用，從而模仿病原顆粒(圖1)。該遞送技術通過向免疫反應性位點遞送作為顆粒的亞單位疫苗而可以模仿病原體。原則上GEM顆粒可以由任何革蘭氏陽性菌制備。革蘭氏陽性菌的細胞壁包括肽聚糖層、蛋白質、脂胞壁酸和其它修飾的糖類的復雜網絡。對細菌細胞壁物質的化學處理可用于除去如蛋白質和脂胞壁酸的細胞壁成分，以制得具有改進的結合性質的GEM顆粒。優選地，本發明的抗原結合性免疫原性載體復合物包括使用酸溶液制得的GEM顆粒(參見WO02/101026)。在優選實施方式中，所述免疫原性載體復合物由非致病菌、優選食品級細菌或者G.R.A.S.(通常認為是安全的)級的細菌制備。在一個實施方式中，所述細胞壁物質來自乳球菌、乳桿菌、芽孢桿菌或者分支桿菌。使用如乳酸乳球菌的革蘭氏食品級細菌作為疫苗遞送載體比使用如沙門氏菌屬或分支桿菌屬的其它細菌具有顯著的優勢。乳酸乳球菌不在人組織中復制或者侵入人組織，據報道其具有低內源性免疫性(Norton等人，1994)。已經表明即使在施用前殺滅載體細菌，表達破傷風毒素片段C的乳酸乳球菌在粘膜遞送后仍誘導抗體，所述抗體保護小鼠抵御破傷風毒素的致死性攻擊。與本文公開的免疫原性載體復合物中的非重組GEM顆粒相比，這些細菌仍然含有會擴散到環境中的重組DNA，尤其是在大規模口服免疫項目中使用時。這種重組DNA不可控制的擴散到環境中會存在基因被其它細菌或其它(微)生物攝入的危險。本發明的多肽包含肽聚糖結合域(PBD)，其可以使任何目標抗原附著到如GEM的免疫原性載體上。在一個實施方式中，所述PBD包含能夠結合于肽聚糖的氨基酸序列，該序列為LysM域。所述多肽優選包含至少兩個、更優選至少三個LysM域。LysM(細胞溶素基序)域為約45個殘基長。其在參與細菌細胞壁降解的多種酶中被發現(Joris等人，FEMSMicrobiolLett1992;70:257-264)。認為LysM域具有普通的肽聚糖結合功能。該域的結構已知("ThestructureofaLysMdomainfromco//membrane-boundlyticmureintransglycosylaseD(MItD)".BatemanA，BycroftM;JMolBiol2000;299:1113-11192)。LysM域的存在不限于細菌蛋白。它們還可以存在于多種真核蛋白中，而它們在古細菌蛋白中缺乏。已經假說，很多含有LysM域的蛋白質具有細胞壁結合功能。部分純化的希氏腸球菌(￡"to'OCOCCMWrae)的胞壁質酶-2(與AcmA相似并包含六個LysM域的蛋白質)結合同一菌株的肽聚糖片段。單核細胞增多性李斯特氏菌(L^er/a歸mc;^gwey)的p60蛋白包含兩個LysM域并顯示出與細胞表面結合。枯草芽孢桿菌(Sac/〃船wto似)的Y-D-谷氨酸-內消旋二氨基庚二酸胞壁肽酶LytE和LytF分別在它們的N末端具有三個和五個重復，且它們均是結合細胞壁的。通過使用本領域己知的方法在公共的蛋白質序列數據庫中進行基于同源性的檢索，技術人員能夠鑒定LysM域氨基酸序列。多種已知算法己經公開，并且可以使用多種公開并且市場上可購買的軟件。例子包括但不限于MacPattern(EMBL)、BLASTP(NCBI)、BLASTX(NCBI)禾卩FASTA(弗吉尼亞大學)。在一個實施方式中，LysM域的PFAM登錄號PF01476(參見http:Vwww.sanger.ac.uk/cgi-bin/Pfam/getaccPF01476)用于檢索符合LysM域標準的氨基酸序列。PFAM網站提供兩個隱馬爾可夫模型(profileHMM)，其可以用于使用序列家族共有序列的統計描述進行敏感數據庫檢索。HMMER是用于蛋白質序列分析的profileHMM軟件的可免費傳播的執行工具。乳酸乳球菌主要的自溶素AcmA的C末端區域包含三個同源LysM域，其被非同源序列隔開。對于三個AcmALysM域的氨基酸序列，例如可以參見W099/25836的圖10，其中三個LysM域由Rl、R2和R3表示。表明AcmA的C末端區域調節自溶素的肽聚糖結合(Buist等人.[1995]J.Bacteriol.177:1554-1563)。在一個實施方式中，本發明的抗原結合性免疫原性載體復合物包含雙功能多肽，雙功能多肽通過其PBD結合于優選為GEM顆粒的免疫原性載體表面的肽聚糖，其中所述PBD包含至少一個如AcmA中存在的LysM域。如果保持肽聚糖結合功能性，那么還包含AcmALysM域確切的氨基酸序列中的變化。因此，在不失去肽聚糖結合能力的情況下，可以進行氨基酸的替換、缺失和/或插入。AcmALysM域的一些部分較少適于改變，例如全部三個域中發現的保守GDTL和GQ基序。然而可以改變其它部分而不影響PBD結合免疫原性載體的功效。例如，可以修飾AcmA三個LysM域中在具有非常不同性質(極性、非極性、親水性、疏水性)的位置的氨基酸殘基。優選地，所述PBD包含與乳酸乳球菌AcmA三個LysM域其中之一具有至少70%、優選80%、更優選90°/。，如92%、95%、97%或99。/。相同性的序列。用于本發明的多肽的PBD可以包含一個或多個這種(同源的)AcmALysM域，其可以是不同的或相同的。一般地，LysM域彼此相鄰，其可以被一個或多個氨基酸殘基隔開。LysM域可以被短距離(如分開115氨基酸)、中等距離(15100個氨基酸)、或長距離(如分開150或甚至200個氨基酸)分開。在某方面，本發明涉及PBD，其包含與AcmALysM域具有至少約80%的氨基酸序列相同性、或至少約81%的氨基酸序列相同性、或至少約82%的氨基酸序列相同性、或至少約83%的氨基酸序列相同性、或至少約84%的氨基酸序列相同性、或至少約85%的氨基酸序列相同性、或至少約86%的氨基酸序列相同性、或至少約87%的氨基酸序列相同性、或至少約88%的氨基酸序列相同性、或至少約89%的氨基酸序列相同性、或至少約90%的氨基酸序列相同性、或至少約91%的氨基酸序列相同性、或至少約92%的氨基酸序列相同性、或至少約93%的氨基酸序列相同性、或至少約94%的氨基酸序列相同性、或至少約95%的氨基酸序列相同性、或至少約96%的氨基酸序列相同性、或至少約97%的氨基酸序列相同性、或至少約98%的氨基酸序列相同性、以及或至少約99%的氨基酸序列相同性的氨基酸序列。多肽的"氨基酸序列相同性百分比"，如70%、80%、90%、95%、98%、99%或者100%的序列相同性，可以通過在比較窗口中比較兩個最佳比對的序列來確定，其中為了兩個氨基酸序列的最佳比對，與參考序列相比(其不包含添加或缺失)比對窗口中的多肽序列部分可以包含添加或缺失(即，缺口)。百分比如下計算:(a)確定兩個序列中出現相同氨基酸的位置的數目以得到配對位置的數目；(b訴配對位置的數目除以比對窗口中的位置總數；以及(c)結果乘以100以得到序列相同性百分比。可以通過計算機應用已知算法或者通過檢查來進行用于比較的序列的最佳比對。易于獲得的序列比較和多序列比對算法分別為基本的局部比對搜索工具(BLAST)(Altschul,S.F.等人.1990.J.Mol.Biol.215:403;Altschul,S.F.等人.1997.NucleicAcidRes.25:3389-3402)和ClustalW程序，其均可在因特網上得到。在另一實施方式中，PBD包含LysM域，該LysM域存在于自氨基酸序列數據庫中對AcmALysM域進行同源性檢索而檢索到的氨基酸序列，其中LysM域能夠使物質附著到革蘭氏陽性微生物的細胞壁上。檢索到的氨基酸序列優選為來自革蘭氏陽性菌的氨基酸序列。例如其為細菌細胞壁水解酶的氨基酸序列。優選地，檢索到的氨基酸序列與AcmALysM域呈現至少70%、更優選80%、最優選至少90%的序列相同性。可以檢索到的序列的例子可以見專利申請W099/25836的圖11。從上清楚可見，可以多種方式在結構上對PBD進行定義。然而，在所有情況下可以將PBD定義為用于結合于微生物細胞壁的工具，其中所述用于結合的工具具有肽的性質。在一個實施方式中，PBD能夠結合到革蘭氏細菌或來自其的細胞壁物質(例如GEM顆粒)上。PBD的結合能力可以在結合試驗中容易地確定，該試驗包括如下步驟用報告分子標記PBD，使標記的PBD與革蘭氏陽性微生物接觸以使所述工具結合到所述微生物上；以及通過檢測微生物結合的報告分子的存在與否來確定所述PBD的結合能力。用于結合試驗的報告分子(還稱為可檢測分子)可以具有多種性質。在本領域己知多種類型的報告分子。例如其為熒光分子(例如FITC)、抗原、親和性標簽(例如生物素)、抗體或酶。報告分子可以通過本領域已知的方法偶聯于PBD上。在報告分子具有肽的性質情況下，用報告分子標記PBD的步驟優選包括PBD與報告分子之間產生基因融合。這種融合已在本領域中描述。例如，W099/25836描述了包含零、一、二或三個AcmALysM域的多肽與報告酶(在這種情況下可以是a-淀粉酶或P-內酰胺酶)之間產生融合構建體。為確定給定多肽是否為本發明的PBD，本領域的技術人員能夠使用標準重組DNA技術，以提供與隨后可以檢測細胞結合活性的報告多肽(酶、抗原等)的融合物。優選的酶報告分子為那些可比色或熒光檢測它們的活性的報告分子。本領域中描述了多種使用比色或熒光底物的報告酶體系，如辣根過氧化酶(HRP)/2,2，-連氮基-雙-(3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸)(ABTS);堿性磷酸酶/4-硝基苯基磷酸酯或卩-半乳糖苷酶/2-硝基苯基-(3-D-吡喃半乳糖苷(2-NPG)。在PBD用抗原標記的情況下，通過檢測與微生物結合的報告分子的存在與否來確定所述PBD的結合能力一般包括使用與所述抗原特異性反應的抗體(例如單克隆鼠抗體)。可以使用攜帶所謂的三明治形式的可檢測標記的二抗(例如，兔抗鼠IgG抗體)來檢測抗原-抗體復合物。例如為二抗提供其活性可以使用上述比色物質測量的報告酶。還可以用作為報告分子的一抗標記PBD，并且使用攜帶可檢測標記(酶、熒光染料)的二抗檢測與微生物結合的報告分子的存在與否。用于結合試驗的革蘭氏陽性微生物可以是有活力或無活力的。包括如芽孢桿菌、鏈球菌、分支桿菌、李斯特氏菌或梭菌的革蘭氏陽性菌。使標記的PBD與革蘭氏陽性微生物接觸以使所述工具結合到所述微生物上的步驟可以包括在包含標記的PBD的溶液或者含有標記的PBD的粗細胞提取物中重懸浮指數生長的革蘭氏陽性菌(如乳酸乳球菌)的沉淀的培養物。所述溶液還可以是表達和分泌標記的PBD的宿主細胞的培養物上清液。溫育一段時間后，例如440。C、1~120分鐘，如1040。C、1~30分鐘，沉淀并洗滌革蘭氏陽性菌，以除去任何非特異性結合的報告分子。此后，確定與沉淀的細菌結合的報告分子的量。在特定實施方式中，細胞結合試驗包括使用與PBD融合的來自地衣芽孢桿菌(Sacz7/w〃c/2em/onm;s)的a-淀粉酶或￡.co//TEMp-內酰胺酶作為報告分子。融合蛋白在將融合蛋白分泌到培養物上清液中的細菌宿主細胞中重組產生。在結合試驗中，GEM顆粒用作革蘭氏陽性微生物。它們可以如WO02/101026中和本申請下面所述進行制備。將載有兩種融合蛋白的GEM顆粒旋沉并用PBS洗滌兩次。結合的a-淀粉酶PBD融合物和卩-內酰胺酶PBD融合物的酶活性進行比色測定。通過在37。C和200rpm將負載的GEM顆粒在lml直鏈淀粉天青(Sigma)底物溶液(20mMK2HP04/KH2P04緩沖液中0.6mg/ml直鏈淀粉天青，50mMNaCl，pH7.5)，測定a-淀粉酶活性。60分鐘后，將GEM顆粒和不溶的直鏈淀粉天青旋沉，在595nm測定吸光度。通過向終體積為lml的PBS中的負載有p-內酰胺酶PBD融合蛋白的GEM顆粒加入40^1頭孢硝噻(Ca舊iochem)來測量P-內酰胺酶活性。包含PBD和ABD、在WO99/25836和WO02/101026中還稱為cA或錨定蛋白的多肽(其中PBD包含乳酸乳球菌細胞壁水解酶AcmA的三個LysM域)，在本申請中稱為"Protan接頭"。技術人員應該理解，在保持肽聚糖結合功能的情況下，Protan接頭與天然存在的AcmALysM序列相比可以包含一個或多個氨基酸替換。所述多肽中ABD和PBD的相對位置可以改變。然而，應該理解，一方面通過PBD使多肽附著到免疫原性載體上，另一方面通過ABD結合抗原，這在所述域之間需要一定程度的間隔，以避免或使互擾最小化。在一優選實施方式中，本發明的多肽包含通過接頭或間隔區序列融合到ABD上的PBD。所述接頭或間隔區可以是如1200個氨基酸的相對短鏈的接頭、如200600個氨基酸的中等大小的接頭、或超過600個殘基的較大的接頭。例如，在一實施方式中，所述多肽的N末端部分包含通過接頭融合到位于C末端部分的ABD上的PBD。在另一實施方式中，PBD構成多肽的C末端部分，而ABD構成N末端部分。ABD和/或PBD不是必須位于多肽的最兩端;在多肽任一端可以存在一個或多個既不是ABD的部分也不是PBD的部分的氨基酸殘基。本發明的多肽包含一個或多個抗原結合域(ABD)。單個多肽中的多個ABD使抗原以高密度存在于免疫原性載體復合物上。在一實施方式中，多肽包含兩個能夠結合相同或不同目標抗原的ABD。如果存在多個ABD，將它們彼此相鄰排列會是有利的，例如在其之間具有一個或多個氨基酸，以使多個抗原最優化地結合到多肽上。存在于本發明的多肽中的ABD是能夠結合到目標抗原上的蛋白質部分。如果存在合適的ABD可用，那么任何類型的抗原可以結合于本發明的抗原結合性免疫原性載體復合物。目標抗原可以選自多肽、糖類、脂類、多核苷酸和致病抗原(包括滅活病毒顆粒和純化的抗原決定簇)。在一實施方式中，目標抗原為不能以與PBD的融合物制備的抗原，如包含至少一個非蛋白部分的抗原。在一實施方式中，目標抗原為多核苷酸。用多核苷酸的免疫是疫苗開發中的最近的進展。該技術被稱為基因免疫或DNA免疫。該免疫方法的基礎在于細胞可以攝取質粒DNA并在轉染細胞中表達該基因。因此，接種疫苗的動物本身起到制備疫苗的生物反應器的作用。這使得疫苗制備相對便宜。多核苷酸免疫的一些優點在于極其安全、誘導寬范圍的免疫應答(細胞和體液應答)、長期免疫性，且最重要的是可以在存在母體抗體的情況下誘導免疫應答。雖然這在疫苗技術中是最吸引人的開發技術之一，但依然大大需要開發更好的遞送系統以提高體內轉染率。在本發明的一特定方面，本發明的免疫原性載體復合物用于遞送雙鏈RNA，例如基于RNA干擾(RNAi)的治療。這種治療尤其適合于對抗病毒感染。應該理解，ABD的結構特征將主要取決于目標抗原。目標抗原的己知結合伴侶或這種己知結合伴侶的部分可以用作ABD。例如，可以通過使用病原體正常的宿主受體使多肽具有結合如病毒或細菌的病原體的能力。病原體宿主受體在本領域己知，且它們的序列已經確定并保存于公共數據庫中。例如ICAM-1為人鼻病毒(HRV)的宿主受體，而CD4為HIV的宿主受體。在另一方面，ABD包含具有抗原結合位點的抗體或其功能片段(如Fab片段)，或其它結合目標抗原的多肽。本領域已知的許多特異性抗體(片段)可以用于本發明。例如，結合到病毒表面的保守決定簇的抗體(片段)，如脊髓灰質炎病毒上的VP4、或HIV上的gp120、或流感病毒上的HA。工業上的分子親和體(iMab⑧)同樣適用作根據本發明的ABD(參見，例如來自荷蘭CatchMabsBV的WO2004108749)。同樣可以使用由比利時Ablynx,Gent開發的NanobodiesTM。WO02/101026以申請人的名義公開了使用GEM顆粒作為AcmA型錨定蛋白與如蛋白質、肽和抗體的反應基之間的多肽融合的遞送載體。在此，抗體不用作抗原的載體，而它們本身為治療性物質，即通過與內源性抗原的特異性相互作用。當然，為此目的，抗體必須不是"預負載"有抗原，如本申請中的情況。因此WO02/101026沒有公開或暗示附著到GEM顆粒上的抗體負載有目標抗原。對基本上任何抗原(其可以是肽、糖、脂、核酸或整個生物體等)具有特異性的抗體片段和肽可以通過本領域已知的方法選擇。市場上可購買到肽文庫，包含大量隨機合成的肽，所述肽可用于選擇目標抗原合適的結合伴侶。例如，NewEnglandBiokbs提供預制隨機肽文庫以及用于構建常規文庫的克隆載體M13KE。所述預制文庫由直鏈七肽和十二肽文庫以及含二硫化物的七肽文庫組成。含二硫化物的七肽的隨機化片段兩側連接有一對半胱氨酸殘基，其在噬菌體組裝過程中氧化成二硫鍵，從而導致所展示的肽以環呈遞于耙點。所有文庫具有超過20億個獨立克隆的復雜度。在全部三個文庫中的隨機化肽序列在次要衣殼蛋白pm的n末端表達，從而導致每個病毒體5拷貝展示蛋白的效價。全部文庫在展示的肽與pIII之間包含短的接頭序列(Gly-Gly-Gly-Ser)。最令人感興趣的是使用噬菌體展示技術。多篇噬菌體展示技術的綜述可用，例如參見Smith和Petrenko[1997]Chem.Rev.97:391-410。簡而言之，表面展示技術為選擇技術，其中多種肽的文庫或人單鏈Fv抗體在噬菌體病毒體的外部表達，而編碼各變體的遺傳物質位于內部。這在各變體蛋白序列和編碼它的DNA之間形成物理連接，其可以通過稱為淘選的體外選擇方法進行基于與給定目標分子(抗體、酶、細胞表面受體等)的結合親和力的快速分選。以其最簡單的形式，淘選通過如下步驟進行用覆有目標(即目標抗原)的平板(或珠)溫育噬菌體展示肽文庫，洗去未結合的噬菌體，以及洗脫特異性結合的噬菌體。然后將洗脫的噬菌體擴增并通過另外的結合/擴增循環以豐富所需結合序列庫。34個循環后，一般通過DNA測序和ELISA表征單個克隆。包含在所需噬菌體中編碼特殊肽序列的DNA然后可以用作在編碼本發明的多肽的核酸構建體中編碼ABD的核酸。本領域中存在一些成功應用噬菌體展示技術以鑒定與微生物選擇性結合的肽的例子。這些技術可以用于鑒定可以用作根據本發明的抗原結合域的肽。例如，Knurr等人(Appl.EnvironMicrobiol.2003Nov;69(ll):6841)描述了在噬菌體展示肽文庫中篩選與枯草芽孢桿菌及近緣種的孢子緊密結合的7肽和12肽。Lindquist等人(Microbiology.2002Feb;148(Pt2):443-51)使用噬菌體呈遞人單鏈Fv抗體文庫以選擇對結合在沙眼衣原體(Oz/aw;^/arac/zoma^)原體(EB)表面的成分具有特異性的結合伴侶。而噬菌體展示在本領域中主要用以選擇純化成分的特異性抗體，這些數據顯示該技術適于由復合抗原(如微生物病原體表面)選擇特異性探針。作為另一個有用的例子，JP2002284798公開了由噬菌體展示技術獲得的與流感病毒/血球凝集素(HA)特異性結合的肽。而本發明尤其感興趣的是Kim等人(J.BiochemBiophysResCommun.2005Apr1;329(1):312)的最新研究，其描述了使用環氧珠由噬菌體展示文庫篩選LPS特異性肽。LPS(脂多糖；內毒素)是革蘭氏陰性菌外膜主要的表面暴露結構成分。其結構可以分為三個區域(l)負責其主要生物活性的磷脂(脂質A)、(2)核心寡糖、以及(3)0-特異性鏈，其為由高度可變的重復寡糖亞單位鏈構成的抗原性多糖。Kim等人在偶聯LPS的環氧珠上使用生物淘選重復富集了編碼AWLPWAK禾nNLQEFLF的克隆。發現這些肽與在革蘭氏陰性菌種中高度可變的LPS的多糖部分相互作用。另外，發現編碼這些肽的噬菌體優選結合到沙門氏菌屬的LPS。偶聯AWLPWAK的珠可以用于從溶液中吸附腸炎沙門氏菌(6b/zwo"e〃"ew/en'/Wj)。雖然本發明可以使未修飾的抗原固定到免疫原性載體上，但是其不限于未修飾的抗原。在本發明一實施方式中，ABD能夠通過(化學)修飾的或標記的目標抗原結合到目標抗原上。例如，可以向抗原提供親和性標簽，該標簽可以結合到ABD上。本申請下面的實施例2中展示了生物素標記的酶通過使用雙功能鏈霉抗生物素蛋白-Protan雙功能接頭結合到GEM顆粒上。本申請還提供一種制備本發明的抗原結合性免疫原性載體復合物的方法。如下文所述，該方法包括如下步驟提供免疫原性載體，提供包含融合于抗原結合域(ABD)的肽聚糖結合域(PBD)的多肽，以及允許所述多肽附著于所述免疫原性載體以產生抗原結合性免疫原性載體復合物。如上所述，噬菌體展示技術的使用對于獲得特殊目標抗原的ABD尤其有用。可以使用商業肽或抗體片段文庫。通過構建通常被接頭序列隔開的各個域的融合基因，以及使用本領域公知的方法在合適(細菌)宿主細胞中表達所述基因，可以容易地制備包含ABD和PBD的雙功能多肽。如下面實施例中所示例，可以簡單地將重組制得的多肽與免疫原性載體接觸，以允許雙功能多肽結合于顆粒表面的肽聚糖，從而制得本發明的抗原結合性免疫原性載體復合物。在一特定技術方案中，制備免疫原性載體的步驟包括由革蘭氏陽性菌制備無活力球狀肽聚糖顆粒(GEM顆粒)。制得的載體復合物與一種或多種目標(修飾)抗原接觸，以制備其中至少一種目標抗原結合到ABD上的本發明的負載抗原的免疫原性載體復合物。然而，還可以顛倒結合的順序，即在將負載抗原的多肽通過PBD附著到免疫原性載體之前，將目標抗原通過ABD結合到多肽上。在一實施方式中，本發明提供一種藥物組合物，其包含本發明的負載抗原的免疫原性載體復合物。例如，提供包含負載抗原的免疫原性載體復合物的免疫原性組合物。所述免疫原性組合物能夠誘導生物體中的免疫應答。在一實施方式中，所述免疫原性組合物為能夠誘導動物中的保護性免疫應答的疫苗組合物。由于粘膜表面疫苗施用更簡易、更安全，所以免疫原性組合物(如疫苗)可以被遞送到粘膜表面而不是被注射。乳酸乳球菌來源的免疫原性載體復合物可以用于粘膜接種疫苗，由于該菌是腸源性的，且通常預計乳酸乳球菌沒有免疫副反應。還提供了本發明的抗原結合性免疫原性載體復合物用于將(保護性)目標抗原遞送至對象的免疫系統的用途。所述抗原結合性免疫原性載體復合物包含至少一種附著到免疫原性載體上的雙功能多肽，所述多肽包含融合于抗原結合域(ABD)的肽聚糖結合域(PBD)，所述多肽通過PBD附著于所述載體，所述抗原結合域(ABD)能夠結合所述目標抗原，其中所述PBD包含選自由如下(i)、(ii)和(iii)組成的組的氨基酸序列(i)LysM域，(ii)以AcmALysM域C末端的LysM域在氨基酸序列數據庫中進行同源性檢索所檢索到的氨基酸序列，以及(iii)與AcmALysM域顯示至少70%的序列相同性的序列，條件是該PBD能夠將物質附著于革蘭氏陽性微生物的細胞壁。還提供了所述負載抗原的免疫原性載體復合物用于向對象、優選人類對象的免疫系統遞送(保護性)目標抗原的用途。向免疫系統的遞送優選包括向粘膜位點的抗原遞送，如鼻內遞送，例如通過噴霧或口服、陰道或直腸遞送。在一優選實施方式中，本發明提供基于在此公開的免疫原性載體復合物的亞單位疫苗。亞單位疫苗是開發的針對單個病毒或細菌成分的疫苗，其還稱為在誘導保護性免疫中起到關鍵作用的"免疫決定簇"。為了開發亞單位疫苗，重要的是確定對誘導保護重要的病原體的那些成分(通常(糖)蛋白)，并去除其它成分。一些蛋白質如果包含在疫苗中會是免疫抑制性的，而在其它情況下，對一些蛋白質的免疫應答實際上會加重疾病。結合基因組學與我們對病理學的理解，可以確定在誘導免疫應答中關鍵的多數病原體的特定蛋白(參見WO2004A02199)。除了使用全蛋白作為疫苗，可以在這些保護性蛋白中確定單個表位并開發肽疫苗。使用亞單位作為疫苗的潛在優點在于提高的安全性以及由于只有少數成分包含在疫苗中而具有較少的抗原競爭，將疫苗靶向需要免疫的位點的能力，以及從感染的動物中區分接種疫苗的動物的能力(標記疫苗)。本領域中已知的亞單位疫苗的缺點之一在于它們通常需要強的佐劑，而這些佐劑經常會引起組織反應。在此公開的免疫原性載體復合物具有內在的免疫調節性質，并能有效地向免疫反應位點遞送作為顆粒的抗原決定簇。特別是GEM顆粒將被特異性細胞或組織結合和域攝取。GEM顆粒靶向巨噬細胞或樹突細胞的能力提高了它們的功效。事實上，根據其抗原成分，現在可以模擬病原體，而避免其它成分不需要的影響，同時保持佐劑性質。當然，可以向免疫原性載體提供多種多肽。這些多肽中一些為雜合抗原-Protan融合物(例如WO99/25836和WO02/101026中所述)，而一些為在此公開的雙功能Protan融合物，其各自包含至少一個ABD(參見圖1)。使用包含不同ABD的多肽可允許不同的目標抗原結合到單個免疫原性載體上。使用為單個多肽部分或不同多肽部分的多個ABD可以制備多表位疫苗。在另一方面中，本發明涉及一種診斷方法，該方法包括使用本發明的免疫原性載體復合物。還提供了一種診斷試劑盒，該試劑盒包括使用本發明的免疫原性載體復合物。ABD可以用于捕獲樣品(如生物樣品)中的目標抗原并固定于載體復合物上。這種'負載'的載體復合物適用于從剩余的樣品中分離目標抗原，例如通過離心。隨后，可以檢測并定量結合目標抗原的載體的量。因此，所述免疫原性載體復合物(例如GEM顆粒)可以用作'生物親和珠'以分離目標抗原，任選地隨后分析目標抗原。通過下面的實施例說明本發明。圖l.本發明的疫苗遞送技術的示意圖。右側顯示的為負載有幾種不同抗原的免疫原性GEM顆粒，所述抗原通過使用抗原-Protan融合蛋白和/或包含抗原結合域(ABD)和肽聚糖結合域(PBD)的雙功能多肽而結合到所述顆粒上，在這種情況下為Protan。圖2.ProtA-Protan雙功能多肽的GEM結合分析。M-全藍色預染精確分子量標記(BioRad)BG=結合到GEM顆粒上之前ProtA-Protan制備培養基的TCA沉淀(200}il上清液)AG^吉合到GEM顆粒上并除去GEM顆粒后制備培養基的TCA沉淀(200|_il上清液)G二負載有ProtA-Protan的GEM顆粒(800(11上清液0.4單位GEM)箭頭表示ProtA-Protan融合蛋白預期的遷移位置(50.7千道爾頓[kDa])圖3.小鼠IgG與附著有ProtA-Protan的GEM顆粒的結合。上面部分根據堿性磷酸酶(AP)活性獲得的比色值。AP偶聯于識別小鼠IgG的二抗。因此，如果結合鼠IgG，可以檢測AP活性。下面部分上面部分中相應的樣品的樣品成分的描述。圖4.鏈霉抗生物素蛋白-Protan的GEM結合分析。M-全藍色預染精確分子量標記(BioRad)BG=結合到GEM顆粒上之前含鏈霉抗生物素蛋白-Protan的培養基的TCA沉淀(200pl上清液)AG^吉合到GEM顆粒上并除去GEM顆粒后培養基的TCA沉淀(200pl上清液)G-負載有鏈霉抗生物素蛋白-Protan的GEM顆粒(800pl上清液0.4單位GEM)箭頭表示鏈霉抗生物素蛋白-Protan融合蛋白預期的遷移位置(35.8kDa)圖5.生物素-HRP與附著有鏈霉抗生物素蛋白-Protan的GEM顆粒的結合上面部分該圖顯示根據辣根過氧化物斷HRP)活性獲得的比色值。生物素結合到HRP上。因此，如果結合生物素，可以測量HRP活性。下面部分描述本圖上面部分中相應樣品的樣品成分。如果沒有鏈霉抗生物素蛋白-Protan融合物存在(樣品1和3)，只有Protan存在于GEM顆粒上(樣品3)，沒有生物素-HRP(樣品2)或GEM顆粒(樣品5)加入正如所預期的，測不到活性。僅在樣品4中測到活性，這說明GEM顆粒上的鏈霉抗生物素蛋白-Protan結合生物素-HRP偶聯物。結論是，鏈霉抗生物素蛋白-Protan雙功能接頭可以附著到GEM顆粒上，且這種復合物可以結合生物素化的化合物。試驗部分實施例l:在GEM顆粒上負載抗體本實施例描述了抗原結合性免疫原性載體復合物的制備，使用GEM顆粒作為免疫原性載體以及蛋白A作為抗原結合域，將作為目標抗原的抗體附著于載體復合物。金黃色葡萄球菌(6^p/^/ococcwawrew)的蛋白A(ProtA)為結合到IgG抗體的Fc區的42kDa蛋白。其可以用于從溶液中捕獲抗體并將它們固定于表面。在此制備ProtA與包含三個AcmALysM域的乳酸乳球菌細胞壁水解酶AcmA的肽聚糖結合域(cA)的融合基因，在此還稱為錨定蛋白或者'Protan接頭'。由重組乳酸乳球菌表達和分泌制得的ProtA-Protan雙功能接頭。除去重組的制備細胞后，通過雜合接頭中的Protan部分將雙功能接頭附著到乳酸乳球菌的GEM顆粒上。相同的雜合接頭中的ProtA部分仍然能夠結合IgG抗體，從而將這些固定在GEM顆粒上。菌株和生長條件本研究中使用的菌株列于表l中。乳酸乳球菌于3(TC在作為標準培養基的M17肉湯(DIFCO)中或含有1.5%瓊脂的M17平板上進行培養。所有培養基添加0.5。/。葡萄糖(w/v)(GM17)，且如果需要，添加5fig/ml氯霉素(SIGMA)用于質粒篩選。用如前所述產生乳酸鏈球菌肽的乳酸乳球菌株NZ9700的培養物上清液誘導PnisA驅動的基因表達(Kuipers等人[1997]TrendsBiotechnol.15:135-140)。<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>普通分子生物學酶和緩沖液購自NewEnglandBiolabs或Fermentas。乳酸乳球菌的電轉化使用Bio-RadGenePulser(Bio-Rad)如前所述(HoIo和Nes[1995]MethodsMol.Biol.47:195-199)進行。通過BaseClear(Leiden,荷蘭)進行核苷酸序列分析。含有ProtA-Protan的融合構建體的制備夾自僉昔色葡萄球菌的ProtA(NCBI登錄號BAB93949.1:US5,151,350;Uhlen等人[1984]J.Biol.Chem.259:1695-1702)含有五個各自由大約58個氨基酸組成的同源IgG-Fc結合區。對于ProtA與Protan的融合，只通過使用引物SpA.fw和SpA.rev(見表2)的PCR擴增Fc結合域。表2:本研究中使用的引物_名稱序列(5'—3')_限制,切位點_SpA.fwCCGTCTCCCATGGTTGCTGATGCGCAACAAAATAACEsp31(以下劃線標示，產生Ncol粘性末端)SpA.revCCGTCTCGAATTCGTTTTGG丁GCTTGAGCATCGEsp31_(以下劃線標示，產生EggEL粘性末端)由金黃色葡萄球菌基因組擴增Fc結合部分后，從凝膠中分離710bpPCR片段并用&p3I消化，產生7VcoI和五coRI粘性末端。消化產物連接到用&oRI和iVcoI消化的pPA3上。通過電穿孔將連接混合物轉移到乳酸乳球菌PA1001中，并產生pPA217質粒。菌株乳酸乳球菌(pPA217)產生分泌的ProtA-Protan多肽。產生的融合蛋白的TCA沉淀為了檢測無細胞培養基中產生的多肽的量，進行TCA沉淀。TCA沉淀通過向1ml含有Prolan融合蛋白的無細胞培養基中加入200pl50%三氯乙酸(TCA)進行。渦旋后將混合物冰上放置1小時。將沉淀的蛋白質在離心機中以14,000rpm(4。C)旋沉20分鐘，丙酮洗滌，真空容器(exicator)中干燥并在SDS樣品緩沖液中重懸浮。GEM制備和結合條件用于制備GEM的乳酸乳球菌NZ9000通常用氯化氫(HCl,pHl.O)按照如下步驟進行化學預處理通過離心收集穩定期培養物細胞，并用0.5體積的磷酸緩沖鹽溶液(PBS:58mMNa2HP04,17mMNa2H2P04，68mMNaCl,pH7.2)洗滌一次。在1/5體積的HC1，pH1.0溶液中重懸細胞并煮沸30分鐘。然后，用PBS洗滌依此方式形成的GEM顆粒三次，在PBS中重懸，直到用Burker-Turk血球計測定為平均2.5xlO"GEM顆粒/ml。GEM顆粒可立即用于結合實驗，或者以1.0ml等分試樣在-8(TC保存直至使用。在典型的結合試驗中，2.5xl09GEM顆粒(l單位)用2ml含有雙功能多肽(Protan融合蛋白)的無細胞培養基在軸向旋轉器(over-endrotator)中于室溫溫育30分鐘。結合后，通過離心收集GEM顆粒，用PBS洗滌兩次，并通過SDS-PAGE或者酶活性分析。AP酶分析比色測定結合的兔抗鼠IgG堿性磷酸酶(AP)(Sigma)的酶活性。將0.5單位負載有ProtA-Protan融合蛋白、小鼠IgGl(K輕鏈)(Sigma)(lml,PBS中1:100稀釋)和兔抗鼠IgGAP(Sigma)(lmlPBS中1:10,000稀釋)的GEM顆粒旋沉并用PBS洗滌兩次。通過將負載的GEM顆粒在1ml4-硝基苯基磷酸酯(Sigma)(50mM碳酸鈉緩沖液，pH9.6,1mMMgCl2中1mg/ml)中于室溫溫育來測定堿性磷酸酶活性。5分鐘后，通過加入0.5ml2MNaOH終止反應。旋沉GEM顆粒，通過分光光度計(BioRadSmartspec300)測定所述上清液在405nm的吸光度。ProtA-Protan多肽附著于GEM顆粒如上所述誘導多肽的制備。誘導過夜后，通過向0.5U的GEM中加入1ml制備株的上清液進行GEM結合試驗，以此來進行蛋白質表達的檢測。結果示于圖2中。可清楚看到，多數制備的ProtA-Protan融合肽(泳道BG)被特異性地從制備培養基(泳道AG)中除去，并有效地結合到GEM顆粒上(泳道G)。泳道G中成片條帶是由GEM顆粒中存在的降解的乳酸乳球菌蛋白引起。小鼠IgG結合于ProtA-Protan-GEM顆粒如上所述使用報告酶堿性磷酸酶(AP)測定附著于GEM顆粒的ProtA-Protan多肽的抗體結合活性。如圖3所示，對于該試驗，考慮不同的對照組。結果清楚地證實小鼠IgG結合于用附著的ProtA-Protan融合蛋白活化的GEM顆粒(樣品1)。正如所預期的，在沒有ProtA-Protan加到GEM顆粒(樣品2)時，或沒有偶聯AP的二抗加入(樣品5)時，檢測不到活性。含有偶聯的AP的抗小鼠二抗同樣為IgG抗體，即使在不存在小鼠IgG(樣品4)的'瞎況下，仍結合ProtA-Protan-GEM復合物。在不存在GEM顆粒的情況下，檢測到一些活性(樣品3)，很可能是由于在制備過程中旋沉的ProtA-Protan融合蛋白的一些團聚或由于一些蛋白質與塑料反應管的特異性結合。總之，ProtA-Protan雙功能接頭可以附著到GEM顆粒上，且該復合物可以結合IgG抗體。總之，ProtA-Protan雙功能多肽可以附著到GEM顆粒上以產生免疫原性載體復合物，且該復合物可以負載有IgG抗體。實施例2:在GEM顆粒上固定生物素化的化合物阿維丁鏈霉菌(&z^^om;;c"aw'力'm7)的鏈霉抗生物素蛋白為一種15kDa蛋白質，作為四聚體起作用，并結合生物素。鏈霉抗生物素蛋白可以用作抗原結合域(ABD)，以從溶液中捕獲生物素化的物質并在表面固定它們。如實施例1中所述，我們制成鏈霉抗生物素蛋白與Protan接頭的融合基因。制得的鏈霉抗生物素蛋白-Protan雙功能多肽由重組的乳酸乳球菌表達和分泌。除去重組的制備細胞后，將雙功能接頭通過多肽的Protan部分的肽聚糖結合域(PBD)附著到乳酸乳球菌的GEM顆粒上。相同的多肽中ABD仍然起作用，并用于結合作為目標抗原的生物素化的辣根過氧化物酶到并將其固定于GEM顆粒上。菌株、質粒和培養過程的條件、普通分子生物技術、GEM制備以及結合條件和制備的融合蛋白的TCA沉淀與實施例1中的相同。HRP酶檢測比色測定結合的生物素-辣根過氧化物酶(HRP)(分子探針)的酶活性。將0.5U負載有鏈霉抗生物素蛋白-Protan融合蛋白和生物素-HRP融合蛋白(lml，PBS中1:2000生物素-HRP(lmg/ml)的GEM顆粒旋沉，并用PBS洗滌兩次。通過將負載的GEM顆粒在1mlABTS(Fluka)(10mg，在100ml0.05M磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液中，pH5.0)和1(ilH202(100%)中于室溫溫育來測定辣根過氧化物酶活性。5分鐘后，通過加入100pl10%SDS終止反應。旋沉GEM顆粒，通過分光光度計(BioRadSmartspec300)測定上清液在405nm的吸光度。含有鏈霉抗生物素蛋白-Protan的融合構建體的制備只有鏈霉抗生物素蛋白的核心用作制備雙功能多肽(鏈霉抗生物素蛋白-Protan)的ABD。該核心為鏈霉抗生物素蛋白的生物素結合單元(NCBI登錄號CAA00084)，其包含A37-S163的氨基酸(Argarafia等人[19S6]NucleicAcidResearch14:1871-1882，P能ler等人[1987]J.Biol.Chem.262:13933-13937)。為了鏈霉抗生物素蛋白核心與包含PBD的Protan部分的融合，設計了8個引物。在兩個不同的PCR反應中，這些引物，首先StrepLfw至Strep4.rev以及Strep5.fw至Strep8.rev可以相互進行擴增。兩種PCR產物混合并用兩個外端引物Str印l.fw和Str印8.rev擴增，其中產生397bp的鏈霉抗生物素蛋白核心基因片段，其使用乳酸乳球菌密碼子最優化。用于制備這種基因片段的引物在表3中描述。為能夠篩選包含正確DNA序列的PCR片段，使用ZeroBluntTOPO克隆試劑盒(Irwitrogen)。用EcoM和JVcoI消化包含正確的鏈霉抗生物素蛋白核心基因片段的ZeroBlm^TOPC^質粒。該消化產物連接到同樣用和TVcoI消化的pPA3上。通過電穿孔將連接產物轉移到乳酸乳球菌PAIOOI，從而產生pPA218質粒。在培養基中，乳酸乳球菌(pPA218)產生并分泌鏈霉抗生物素蛋白-Protan多肽。多肽附著于免疫原性載體如上所述誘導融合蛋白的產生。誘導過夜后，通過向0.5單位的GEM顆粒中加入lm制備株的上清液進行GEM結合試驗，以此來進行蛋白質表達的檢測(圖4)。可清楚看到，多數制備的鏈霉抗生物素蛋白-Protan融合蛋白(泳道BG)特異性地從制備培養基(泳道AG)中除去，并有效地結合于GEM顆粒(泳道G)。泳道G中成片條帶是由GEM顆粒中存在的降解的乳酸乳球菌蛋白引起。表3.用于制備鏈霉抗生物素蛋白核心基因的引物。斜體、下劃線、雙下劃線、小寫字母、斜體并下劃線、小寫字母并下劃線、或者小寫字母并斜體且下劃線的核苷酸序列可以相互退火。<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>生物素-HRP結合于鏈霉抗生物素蛋白-Protan-GEM顆粒在此如下所述使用HRP作為報告酶測定結合于GEM的融合蛋白的生物素結合活性。如圖5所示，對于該實驗，考慮不同的對照組。如果不存在鏈霉抗生物素蛋白-Protan融合蛋白(樣品1和3)，只有Protan存在于GEM顆粒上(樣品3)，不加入生物素-HRP(樣品2)或GEM顆粒(樣品5)，正如所預期的，測定不到活性。只有在樣品4中檢測到活性，表明GEM顆粒上的鏈霉抗生物素蛋白-Protan結合生物素-HRP偶聯物。總之，鏈霉抗生物素蛋白-Protan雙功能多肽可以附著到免疫原性GEM顆粒上，且該復合物可以結合生物素修飾的目標抗原。實施例3:使用雙功能Protan接頭在GEM顆粒上固定滅活的全脊髓灰質炎病毒噬菌體展示(Smith和Petrenko[1997]Chem.Rev.97:391-410)已經成為選擇特異性結合肽的強大技術(Sidhu等人[2000]Meth.Enzymol.328:333-344;Cwirla等人[1990]Proc.Natl.Acad.Sci.USA.87:6378-6382)。編碼所述肽的DNA序列翻譯性地融合到編碼基因3次要衣殼蛋白的DNA上，從而在噬菌體表面展示所述肽。依此方式，在展示的肽和編碼該肽的DNA之間建立物理性連接。通過在特定目標上篩選，噬菌體肽文庫可以用于有效地從多種變體中搜索出特異性連接物(binder)。然后，可以在大腸桿菌中擴增選擇的噬菌體并進行另外的淘選循環，以富集特異性結合于目標的肽。隨機肽文庫己用于多種應用，例如，結合于蛋白質(Sidhu等人[2000]Meth.enzymol.328:333-344)、結合于多糖Kim等人[2005]Biochem.Biophys.Res.Commun.329:312-317)、結合于細菌芽孢Knurr等人[2003]Appl.Environ.Microbiol.69:6841-6847)、結合于全細胞(Brown[2000]Cuit.Opinion.Chem.Biol.4:16-21)以及結合于無機物質(Whaley等人[2000]Nature405:665-668)。在目前應用中，噬菌體展示可以用于篩選隨后用于構建雙功能Protan接頭的特異性結合肽。如Protan接頭的雙功能多肽的應用可以允許目標化合物(如蛋白質、多糖、細菌、病毒或真菌)附著于GEM顆粒。肽比結合蛋白優越的地方在于它們免疫原性較低且易于制備。在該實施例中描述基于噬菌粒的肽文庫的構建，其用于篩選目標為滅活的全脊髓灰質炎病毒的特異性結合肽。篩選的特異性結合于全脊髓灰質炎病毒的肽遺傳融合于Protan，且該雙功能Protan接頭附著到乳酸乳球菌GEM顆粒上。其可以非共價偶聯滅活的全脊髓灰質炎病毒。制得的GEM顆粒與滅活的全脊髓灰質炎病毒的負載抗原的免疫原性載體復合物可以直接用于疫苗中。肽噬菌體展示載體的構建由pCANTAB5EST(AmershamPharmacia)構建噬菌粒pPEP，用于展示短肽序列。肽的展示需要肽與噬菌體M13的次要衣殼蛋白3(g3p)的框內融合。因此，去掉pCANTAB5EST中/7/wniI和j5a"2ffl識別序列之間的多余核苷酸序列，并由只編碼相關序列元件的PCR擴增片段替換。另外，插入^/7l和識別序列，以在基因3的5'端克隆肽序列。此外，為了改進展示的肽的靶向性，在克隆的肽和次要衣殼蛋白之間包含三個甘氨酸殘基的小間隔序列。肽噬菌體展示載體的構建需要多種聚合酶鏈反應(PCR)步驟。首先，通過兩個連續的重疊PCR合成由W/"dIII識別序列到基因3的起始的DNA片段。由寡核苷酸Cb1F2.fw,5'-ggagccttttttttggagattttcaacgtgaaaaaattattattcgcaattcctttagtggta;Cb1F.3.fw，5'-gcaattcctttagtggtacctttctatgcggcccagccggccatggcccagggcgctgggaga;以及CblF4.rev,5'-ttcaacagtaccgccaccccgtcttctcccagcgccctgggc制備暫時擴增的PCR產物。純化暫時的擴增子，并與外側引物CblFl,fw，5'-atgattacgccaagcttt-ggagccttttttttggag禾口CblF5.rev5'-aggttttgctaaacaactttcaacagtaccgccacc—起在第二重疊PCR中用作模板，從而產生最終擴增的PCR片段。使用寡核苷酸Cb2.fw，5'-actgttgaaagttgtttagcaaaacct和Cb2.rev5'-agacgattggccttgatattcacaaac通過PCR制備包含基因3的第一617個核苷酸的第二DNA片段。在最終重疊PCR中，后面的擴增子與第一擴增PCR產物以及外側引物CblFl.fw和Cb2.rev結合，產生711bpPCR片段。用歷"cHn和5麵HI消化該擴增產物并連接到pCANTAB5EST的相同位點中，從而產生噬菌粒pPEP。隨機肽文庫的構建噬菌粒pPEP在基因3的5'端包含A^"I和識別位點，以作為N端g3p融合物展示隨機肽。由于pPEP為噬菌粒，所以以單價形式展示肽，即每個噬菌體顆粒的表面只有1或2拷貝g3p將會融合于克隆的肽。根據Noren和Noren[2001](Methods23:169-178)構建編碼12個氨基酸直鏈隨機肽的寡核苷酸文庫。簡而言之，用序列5'-accgaagaccccacc(BNN)i2ctgggccatggccggctgggccgcatagaaaggtacccggg(B=C或G或T)設計92核苷酸文庫寡核苷酸，PEP12Lib.rev。在Klenow反應中退火并延伸通用延伸引物PEPext.fw5'-catgcccgggtacctttctatgcgg。純化得到的雙鏈文庫寡核苷酸，用和￡^'1消化，并連接到已經用相同的酶消化的pPEP中，產生pPEP12。通過電穿孔將連接混合物轉染進五.co//XLl-blue或TG1細胞中(Stratagene)，直至獲得-109個獨立的克隆。用30倍的過量M13K07輔助噬菌體轉染包含pPEP12的￡.co//TG1或XLl-blue細胞，以制備噬菌粒顆粒。通過PEG沉淀，從轉染的培養物純化噬菌粒顆粒。生物淘選使用滅活的全脊髓灰質炎病毒用于親和篩選特異性結合蛋白。脊髓灰質炎病毒被涂敷有兔抗脊髓灰質炎病毒IgG(0.5-llag/ml)的ELISA板捕獲。或者，脊髓灰質炎病毒在負載有結合于ProtA-Protan融合蛋白的抗脊髓灰質炎病毒IgG的GEM顆粒上展示。使來自十二肽文庫的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)+O.P/。Tween20(PBS-T)中大約1011個噬菌粒顆粒在孔中反應，或者與攜帶滅活的脊髓灰質炎病毒的-l(^個GEM顆粒在室溫下反應1小時。用PBS-T洗滌GEM或孔十次，用0.2M甘氨酸/HCl(pH2.2)稀釋結合的噬菌體。用2MTris堿中和稀釋的噬菌體懸浮液。稀釋的噬菌體用于轉染￡.co//TG1或XLl-blue細胞。總共進行6個循環的篩選，此后分離單個的噬菌體克隆用于進一步分析。結合分析為評價肽與脊髓灰質炎病毒的結合，用抗脊髓灰質炎病毒IgG(0.5-1嗎/ml)涂敷多孔板。用PBS-T洗滌后，在室溫用PBS-T中的1。/。BSA封閉孔1小時。將滅活的全脊髓灰質炎病毒加入PBS-T+1%BSA中，并在室溫溫育1小時。將PBS-T中選擇的肽-噬菌體(10"cfU/ml)加入孔中。室溫1小時后，用PBS-T洗滌板三次。使用ABTS[2,2'-連氮基雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)]作為底物用偶聯HRP的抗M13抗體(Pharmacia)檢測結合于脊髓灰質炎病毒的肽-噬菌體。合適的時間后，測量410nm處的吸光度。篩選兩種對脊髓灰質炎病毒呈現最佳結合的肽-噬菌體，用以通過序列分析進一步鑒定。這兩種噬菌粒稱為pPEP-PVl和pPEP-PV2。PEP-Protan融合蛋白的構建基于pPEP-PVl和pPEP-PV2中結合肽的核苷酸序列，用^al和^/I懸垂5，端設計并制備對應于結合肽PV1和PV2的兩種互補寡核苷酸。在總體積為100^的10mMTris-HCl(pH8.0)中將等摩爾濃度的兩種寡核苷酸退火。在熱循環儀中將混合物加熱至94t:并緩慢冷卻至室溫。退火的寡核苷酸連接到用^al和5pz'I消化的pPA224中。質粒pPA224為pPA3的衍生質粒(Steen等人[2003]J.Biol.Chem.278:23874-23881)，其缺少c-,，c序列并在信號序列和Protan序列之間具有修飾的多克隆位點。連接后將混合物通過電穿孔轉移至乳酸乳球菌PAIOOI。得到質粒pPA224-PVl和pPA224-PV2，其中PV1和PV2分別轉錄性融合于Protan序列的5'端。乳酸乳球菌PA1001(pPA224-PVl)和乳酸乳球菌PA1001(pPA224-PV2)分別向生長培養基中分泌PVl-Protan和PV2-Pi'otan雙功能接頭。通過微過濾和/或離心將制備細胞從制備培養基中去除。滅活的脊髓灰質炎病毒與抗原結合性GEM顆粒的結合雙功能多肽PV1-Protan和PV2-Protan各自單獨地或者通過結合的方式有效地附著到乳酸乳球菌GEM顆粒上。由此得到的抗原結合性免疫原性載體復合物PVl-Protan-GEM、PV2-Protan-GEM禾卩PVl+PV2-Protan-GEM與含有滅活的脊髓灰質炎病毒顆粒的懸浮液混合。在所有情況中，脊髓灰質炎病毒顆粒有效地結合于GEM-雙功能Protan復合物。該實施例說明使用噬菌體展示可以選擇特異性抗原結合域，甚至對于整個病毒顆粒，并說明該結合域可以用于雙功能多肽以將整個病毒固定在免疫原性載體上。此外，實施例說明無論已知的抗原結合域還是由隨機肽文庫新篩選的結合域都可以用于Protan融合物中而作為雙功能Protan接頭，以將目標化合物(例如抗原)固定在GEM顆粒上，而無需在結合到免疫原性載體之前修飾目標化合物。權利要求1.一種負載抗原的免疫原性載體復合物，其包含至少一種附著于免疫原性載體的雙功能多肽，所述多肽包含融合于抗原結合域(ABD)的肽聚糖結合域(PBD)，所述多肽通過該肽聚糖結合域附著于所述載體，所述抗原結合域能夠結合目標抗原，其中所述PBD包含選自由如下(i)、(ii)和(iii)組成的組的氨基酸序列(i)LysM域，(ii)以乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)細胞壁水解酶AcmAC末端中的LysM域(所述域在此還稱為AcmALysM域)在氨基酸序列數據庫中進行同源性檢索所檢索到的氨基酸序列，以及(iii)與AcmALysM域顯示至少70％的序列相同性的序列，條件是所述PBD能夠附著于革蘭氏陽性微生物的細胞壁，以及，其中至少一種目標抗原結合于所述ABD。2.根據權利要求1所述的復合物，其中至少兩種雙功能多肽附著于所述載體，各雙功能多肽具有不同的ABD和不同的目標抗原。3.根據權利要求1或2所述的復合物，其中所述免疫原性載體包含自革蘭氏陽性菌獲得的無活力球狀肽聚糖顆粒(GEM顆粒)。4.根據權利要求1-3中任一項所述的復合物，其中所述細菌為非致病菌，優選為食品級細菌。5.根據權利要求1-4中任一項所述的復合物，其中所述細菌選自乳球菌、乳桿菌、芽孢桿菌和分支桿菌。6.根據權利要求1-5中任一項所述的復合物，其中所述肽聚糖結合域(PBD)包含乳酸乳球菌細胞壁水解酶AcmAC末端的肽聚糖結合域。7.根據上述權利要求中任一項所述的復合物，其中所述ABD能夠結合選自多肽、糖類、脂類、多核苷酸和包括滅活的病毒顆粒和純化的抗原決定簇的致病抗原的抗原。8.—種提供根據上述權利要求中任一項所述的負載抗原的免疫原性載體復合物的方法，該方法包括如下步驟-提供免疫原性載體；-提供雙功能多肽，所述雙功能多肽包含融合于抗原結合域(ABD)的肽聚糖結合域(PBD)，以允許所述多肽附著于所述免疫原性載體；以及-使所述免疫原性載體與所述多肽接觸；-使所述多肽與目標抗原接觸。9.根據權利要求8所述的方法，其中所述提供免疫原性載體包括自革蘭氏陽性菌制備無活力的球狀肽聚糖顆粒。10.根據權利要求8或9所述的方法，其中，提供所述雙功能多肽包括自隨機肽或抗體文庫篩選抗原結合域，其優選使用噬菌體展示技術。11.根據權利要求8-10中任一項所述的方法，其包括通過重組表達編碼所述多肽的核酸構建體而在宿主細胞中產生所述雙功能多肽。12.根據權利要求11所述的方法，其中所述宿主細胞在培養基中分泌所述多肽。13.—種藥物組合物，其包含根據權利要求1-7中任一項所述的負載抗原的免疫原性載體復合物。14.一種免疫原性組合物，其包含根據權利要求1-7中任一項所述的負載抗原的免疫原性載體復合物。15.抗原結合性免疫原性載體復合物用于將目標抗原遞送至對象的免疫系統的用途，所述復合物包含至少一種附著于免疫原性載體的雙功能多肽，所述多肽包含肽聚糖結合域(PBD)，所述多肽通過該肽聚糖結合域附著于所述載體，該肽聚糖結合域(PBD)融合于能夠結合所述目標抗原的抗原結合域(ABD)，其中所述PBD包含選自由如下(i)、(ii)和(iii)組成的組的氨基酸序列(i)LysM域，(ii)以乳酸乳球菌細胞壁水解酶AcmAC末端中的LysM域(所述域在此還稱為AcmALysM域)在氨基酸序列數據庫中進行同源性檢索所檢索到的氨基酸序列，以及(iii)與AcmALysM域顯示至少70°/。的序列相同性的序列，條件是所述PBD能夠將物質附著于革蘭氏陽性微生物的細胞壁。16.根據權利要求15所述的用途，其中所述向免疫系統的遞送包括向粘膜位點的遞送，例如鼻內或口、陰道或直腸遞送。17.根據權利要求15或16所述的用途，其中所述復合物負載有所述目標抗原。全文摘要本發明涉及免疫學和疫苗遞送領域。更具體而言，本發明涉及具有內在免疫調節性質的細菌疫苗遞送技術，其可以使任何目標抗原不經過預先的抗原修飾而固定。本發明提供一種負載抗原的免疫原性載體復合物，其包含至少一種附著于免疫原性載體的雙功能多肽，所述雙功能多肽包含融合于抗原結合域(ABD)的肽聚糖結合域(PBD)，所述多肽通過該肽聚糖結合域附著于所述載體，所述抗原結合域結合至少一種目標抗原。本發明還提供一種包含本發明的負載抗原的免疫原性載體復合物的藥物組合物(例如疫苗)。文檔編號A61P35/00GK101268095SQ200680034459公開日2008年9月17日申請日期2006年7月20日優先權日2005年7月20日發明者C·J·利恩霍茨,M·L·范羅斯馬倫,T·伯斯馬申請人:應用超微系統股份有限公司