抗真菌肽和其使用方法

專利名稱：抗真菌肽和其使用方法
抗真菌肽和其使用方法
背景
CAP37 (Mr 37 kDa的陽離子抗微生物蛋白)最初被鑒定為人嗜中 性粒細胞的不依賴于氧的殺滅機制的組分并且^^皮證明對于包括鼠傷寒 沙門菌(Salmonella typhimurium )、 大腸桿菌(Escherichia coli)和銅 綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa )的革蘭氏陰性生物具有強的殺細 菌活性(Shafer等人，1984; Shafer等人，1986; Spitznagel 1990)。與它對細 菌的作用不同，天然CAP37蛋白質對宿主細胞具有有效的調節作用。 它是單核細胞吞噬系統的細胞如單核細胞(Pereira等人,1990)、小膠質細 胞(Pereira等人，2002)和巨噬細胞(Larnck等人，1991 )的有效調節劑。 它還調節角膜上皮功能(Ruan等人，2002)、內皮功能(Lee等人，2002; Lee 等人，200"和平滑肌細胞功能(Gonzalez等人，20(H)。
CAP37的結構功能分析使得我們可以將它的抗細菌結構域描繪為 對應于天然分子的殘基20到22的區域(Pereira等人，1993)。包含該25 個氨基酸序列(CAP37(20-44)nat)的肽模擬天然分子的抗微生物活性 (Pereira等人，1993)并且將其活性范圍延伸到包括兩種革蘭氏陽性生物 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和糞腸球菌(Enterococcus faecalis)。該肽的殺細菌活性是pH依賴性的，在pH 5.0到5.5之間《尋 到最大活性。用絲氨酸殘基替換26和42位的半胱氨酸殘基 (CAP37(20-44)ser26,42)導致無活性化合物(Pereira等人，1993)。體內實驗表 明CAP37(20-44)nat在內毒素休克的有意識大鼠模型中減弱大腸桿菌脂 多糖(LPS)的致死效應中的功效。
命的全身性感染的疾病表現(Nola等人，2003)。近來，侵入性真菌感染 有了顯著增加，并且念珠菌物種開始大量引起嚴重的醫源性感染(Clark 和Hajjeh, 2002; Hobson 2003, Nola等人，2003; Rapp 2004)。其原因是負 雜的但是可以主要歸因于醫學最近的發展，導致免疫減弱的人的存活增 加和使用內置醫學裝置和導管來治療住院患者(Clark和Hajjeh 2002; Nola等人，2003)。對現有抗真菌藥物抗性的不斷產生抗性進一步使得與 真菌感染相關的臨床和公共健康問題復雜化。需要具有抗真菌活性的新藥物。這就是本發明的目的。 附圖簡述


圖1顯示了四種CAP37肽的殺念珠菌活性。測試了 400 mg/ml (實 心條形)和200 mg/ml (對角線斜紋)的 CAP37(20-44)nat 、 CAP37(20-44)ser26、 CAP37(20-44)ser42和CAP37(20-44) ser26/42對白色念珠 菌A-155、 A-22和A-lll (已知為氟康唑敏感的)和分離物A-5、 A-20 和A-46 (已知為氟康唑抗性的)的活性。如在材料和方法部分中詳述的 測定被殺滅的百分比。數值被表示為來自 一式三份進行的三個獨立實驗 的平均值士標準誤差。
圖2顯示了 CAP37肽對白色念珠菌的菌絲型的活性。測試了 CAP37(20-44)nat、 CAP37(20-44)ser26、 CAP37(20-44)ser42和CAP37(20-44) 鄉26/42對白色念珠菌A畫155、 A-22和A-111、 A-5、 A-20和A-46的活性。 如在材料和方法部分中詳述的那樣測定被殺滅的百分比。數值被表達為 來自 一式三份進行的三個獨立實驗的平均值±標準誤差。
圖3顯示了 CAP37肽對多種念珠菌種的活性。測試了 CAP37(20-44)nat、 CAP37(20-44)ser26、 CAP37(20-44)ser42和CAP37(20-44) ser26/42對高里念珠菌(C. guilliermondii)、近平滑念珠菌(C. pampsilosis)、 假熱帶念珠菌(C. pseudotropicalis )、熱帶念珠菌(C. tropicalis )、白 色念珠菌的血液分離物、都柏林念珠菌(C. dublmiensis)的兩種分離物、 克柔念珠菌(C. glabrata)的三種分離物、光滑念珠菌(C.kmsei)的一 種分離物和釀酒酵母的兩種分離物的殺真菌活性。高里念珠菌(C. guilliermondii)和近平滑念珠菌的肽濃度為100 jig/ml (37.5 pM)，而用 400 pg/ml (150 pM)的肽濃度測定所有其他菌株。數值一皮表示為以一式三 份進行的三到四個獨立實^r的平均值士標準誤差。
圖4顯示了用FUN-1活體染料和共焦顯微鏡檢查測定的CAP37的 殺真菌活性。我們選擇氟康唑敏感性白色念珠菌分離物(圖像A-C)、 假熱帶念珠菌(C. pseudotropicalis )(圖像D-F)、克柔念珠菌(C. glabrata) 分離物(圖像G-I)和釀酒酵母分離物(圖像J-L)進行這些研究。將真 菌分離物與CAP^p04勺nat肽、CAP37(20-44)ser26/42肽和不存在肽的情 況下溫育。被染成紅色的細胞為活的， 一致地染色綠色或者黃綠色的細 胞為死的。顯示了來自三個獨立實驗的代表性數字圖像。發明詳述
本文闡明了基于抗生素蛋白質CAP37的天然序列的肽的抗真菌活
性。所述肽可以用作抗真菌劑，尤其抗念珠菌的抗真菌劑。
常規地認為CAP37是PMN-來源的蛋白質，因為它在這些細胞顆粒 中以組成型方式表達。然而，最近我們已經闡明存在可誘導形式的 CAP37 (Lee等人，2002; Pereim等人，1997; Ruan等人，2003; Gonzalez,等 人，2004;和Pereira等人，2004)。 CAP37可以在炎癥介導的疾病如阿爾 茨海默氏病(Pereira等人，1997)和動脈粥樣硬化(Lee等人，2002)的脈管 系統內襯的內皮細胞中表達。體外研究指出誘導是由于炎癥介質，如腫 瘤壞死因子-a(TNF-a)、白介素-1 (IL-1 )和免疫調節物質，如LPS。 使用金黃色葡萄球菌角膜炎的兔模型進行的體內研究在角膜上皮和邊 緣循環中血管內襯的內皮中非常清楚的應答感染的誘導(Ruan等人, 2002)。此外，我們已經使用傷口修復的體內大鼠模型闡明，在皮膚鱗狀 上皮細胞、毛嚢內襯細胞、皮脂腺的腺泡細胞和血管內襯的內皮細胞中 應答創傷而發生的CAP37表達(Pereira等人，2004)。已經在皮膚(Nizet 等人，2001 ; S0扁en等人，2003; Shirafuji等人，1999; Oren等人，2003)、 胃腸道內襯的粘膜表面(Frohm-Nilsson等人，1999; Fellermann和Stange, 2001)、 口面(Dale 2000; Dale 2001;),呼吸道Hiemstra 2001; Diamond等 人，2000; Huttner和Bevms, 1999)和泌尿生殖道(Frohm-Nilsson等人, 1999; Malm等人，2000)中闡明了上皮抗生素類。這些抗生素蛋白質^L理 想地定位用于作為針對入侵病原體的第一道防線。不管CAP37的表達 是應答念珠菌而發生在宿主粘膜襯細胞，還是CAP37的誘導在具有復 發的念珠菌病的患者中的粘膜和上皮表面受損而提示CAP37在保護宿 主免于真菌感染中的生理學作用在當前都還是未知的。本文報導的研究 首次描述CAP37肽和基于CAP37的天然序列的類似物和衍生物具有有 效的抗真菌活性并且提示該肽比最初提出的具有更廣譜的抗感染活性。
在一系列實驗中，我們使用基于天然CAP37序列的肽，包括 CAP37(20-44)nat和三種肽類似物(CAP37(20-44)ser26、 CAP37(20-44)ser42、 CAP37(20-44)ser26/42)，其中在26和/或42位的半胱氨酸殘基^皮絲氨酸殘 基替代，如表1所示。我們研究了在這兩個位置的替代對多種念珠菌種 的體外殺滅效果。我們的發現表明基于天然序列的肽(0八？37(20- 44)nat) 和僅僅半胱氨酸殘基纟皮替代的兩種類似物(CAP37(20- 44)CAP37(20-44)ser42)對白色念珠菌的顯著活性。兩個半胱氨酸的替代顯著 消除了針對白色念珠菌和所測試的許多念珠菌中的活性。盡管不希望被 理論束縛，但是這些數據提示分子內二硫鍵是重要的，但是環狀化合物 的形成對于抗真菌活性不是必需的，因為兩個半胱氨酸殘基之間的分子 間相互作用(使用兩個單半胱氨酸替代的情況下是可能的)導致保留殺 滅活性的肽。
表I. CAP37肽和衍生物
肽名稱肽序列SEQ ID NO.
CAP37(2044UN"Q-G-R-H-F-S-G-G^A-L-I-H-A-R-F-V-M-T-A-A-S-46"F-Q1
CAP37(2CM4)明畑N-Q-G-R-H-F-S-G-G-A-L-I-H-A-R-F-V善T-A-A-S"C-F-Q2
CAP37(2CM4U2N-Q-G-R-H-F-C"G曙G-A-L-I-H-A-R-F-V-M"T-A-A-S"S-F-Q3
CAP37(2044〉據鵬2N-Q-G-R-H-F-S-G-G-A-L-I-H-A-R-F-V-M-T-A-A"S-S-F-Q4
CAP37(23"42〉加,R-H-F-C"G-G-A-L-I-H-A-R-F-V-M-T-A-A-S-C5
CAP37(2342)m効R-H-F-S-G-G-A-L-I-H-A-R-F-V-M-T-A-A-S-C6
CAP37(23哉w2R-H-F-C-G-G-A-L-l-H-A-R-F-V-M-T-A-A-S-S.7
CAP37(23-42)—R-H-F-S-G-G-A-L-l-H-A-R-F-V-M-T-A-A-S-S8
CAP37(2(M化創N-Q-G-R-H-F-T-G-G-A-L-I-H-A-R-F-V-M-T-A-A-S"C-F"Q9
CAP37《2044WN-Q-G-R-H-F-C-G-G-A-L-I-H-A-R-F-V-M-T-A-A-S-T-F"Q10
CAP37(20-44"2N-Q-G-R-f+F-T-G-G-A-L-卜H-A-R-F-V'M"T-A-A-S"T-F-Q11
CAP37(23,創R-H-F-T-G-G-A-L-I-H-A-R-F-V-M"T-A-A-S-C12
CAP37(2342WR-H-F"C"G-G-A-L-I-H-A-R-F-V-JVI-T-A-A-S-T13
CAP37(23"42),42FW+F-T-G-G-A-L-I-H-A-R-F-V-M-T-A-A-S-T14
CAP37(20-44)nat、 CAP37(20-44)ser26和CAP37(20-44)ser42肽對氟康唑 抗性真菌分離物(A-5， A-20, A-46)的活性是顯著的，得到對兩種分離物 (A-5和A-20)的強的殺滅(<5%存活)并得到對分離物A-46的〉75%的 殺滅(圖2)。這些發現對于最近出現白色念珠菌的氟康唑抗性分離物 和具有新的活性替代作用機理的需要用新的治療劑治療的非念珠菌物 種是尤其合適的(Jabra-Rizk等人，2004; Sullivan等人，2004)。除了 CAP37 肽對白色念珠菌的氟康唑抗性真菌分離物具有活性這一重要發現外，圖 3表明所述肽在37.5 濃度下顯示出對高里念珠菌和近平滑念珠菌的 有效活性。近平滑念珠菌最通常從加強醫療病房中嚴重患者分離，所述患者通常在經歷治療時具有內置插管和裝置(Kuhn等人，2004)。假熱帶 念珠菌(C. pseudotropicalis )和熱帶念珠菌(C. tropicalis )的幾乎100 %的起始接種物都被150 fiM的肽濃度殺滅。熱帶念珠菌正不斷從白血 病、其他瘤形成患者和加強醫療病房的那些患者的血液培養物中分離 (Warn等人，2002)。這些肽中，CAP37(20-44)ser42對都柏林念珠菌比 CAP37(20-44)加t更有效。都柏林念珠菌是新近鑒定的物種，其很少在健 康人中發現，但是傾向于作為主要在HIV感染的個體中口咽感染的病原 體被發現(Sullivan等人，2004)。這些肽對于克柔念珠菌、光滑念珠菌和 釀酒酵母無活性，并且對白色念珠菌的菌絲形式有中等活性。
實現殺真菌活性所需的肽濃度為殺死革蘭氏陰性分離物鼠傷寒沙 門菌、大腸桿菌和銅綠假單胞菌所表現出的活性的大約兩倍(Pereira等 人，1993)。該活性范圍在陽離子抗微生物肽中不是罕見的，所述肽傾向 于對某些細菌種、真菌、寄生蟲和/或病毒具有特異性和功效。除了 CAP37 外，PMN也含有幾種陽離子抗微生物肽，包括防衛素、hCAP18/LL37、 殺細菌通透性增強蛋白(BPI)和乳鐵蛋白(Spitznagel, 1990: Ganz和Weiss， 1997)。防衛素對于白色念珠菌尤其有活性(Selsted等人，1985; Hoover等 人，2003)。表明基于人乳鐵蛋白的氨基末端的第一個陽離子結構域的合 成肽在微摩爾水平具有殺念珠菌活性(Lupetti等人，2000)。也已經表明來 自人血小板的抗微生物肽具有抗微生物活性(Tang等人，2002)。在從血 小板分離的幾種肽中，僅僅"當活化正常T細胞表達和分泌時被調節，， 的蛋白質(RANTES)和血小板因子-4 (PF-4)顯示出殺念珠菌活性。像 CAP37肽一樣，它們的活性是pH依賴性的，在pH5.5時具有最大活性 (Tang等人，2002)。取決于每種肽的分子量，使用的活性肽濃度為150叱 到1.0mg/ml。另一種公知的殺念珠菌分子是唾液富組蛋白(histatm)-5 (Tsai和Bobek 1997; Edgerton等人，2000)。已經表明15 ^tM的唾液富組 蛋白-5濃度殺死80到100%的白色念珠菌芽生孢子(Tsai和Bobek, 1996)。已經表明基于富組蛋白-5的C-末端殺真菌結構域的合成富組蛋 白類似物有效抵抗白色念珠菌(Helmerhorst等人，1997)、光滑念珠菌、 克柔念珠菌和煙曲霉(Aspergillus fumigatus )的氟康哇抗性菌抹 (Helmerhorst等人，1999)。
科學和生物技術團體對天然陽離子肽作為感染治療中新的治療劑 的用途的熱情高漲。常規抗生素的主要缺點是微生物很快產生多種抗性模式。這些陽離子抗微生物肽(包括本文描述的那些)怎樣殺死微生物 的確切機理還不是完全已知。然而，不希望被理論束縛，認為主要的殺 細菌機理是微生物膜通過孔蛋白通道的通透性和自身促進的攝入途徑
而可能不參與共同的抗性機制。Hancock (1997)已經證明陽離子肽甚至 在多達20次傳代后也不誘導對接近最小抑制濃度的抗生素濃度的抗性 突變體。顯然，盡管CAP37肽的作用模式還未確定，不希望被理論束 縛，似乎其作用^t式與基于吡咯的藥物的作用機理不同，因為它同樣好 地殺滅氟康唑抗性和每丈感菌抹。
材泮十和方法 肽合成
如以前所述的(Pereira等人，PNAS 1993)在肽合成儀上通過固相合 成法合成肽。測定肽的純度。通過質鐠法驗證肽的質量。合成的肽斷定 了以前的發現，即基于CAP37的天然氨基酸序列的由殘基20到44的合 成肽(CAP37(20-44)nat)對于許多革蘭氏陰性生物具有有效的殺細菌活性 (Pereira等人，PNAS 1993)。該肽的無活性類似物(其中26和42位的半 胱氨酸殘基被絲氨酸殘基替代(CAP37(20-44)ser26,42) ) (Pereira等人， PNAS 1993)用作無活性對照肽。此外，合成兩種其他的肽類似物。 一種 肽的26位半胱氨酸殘基被絲氨酸替代(CAP37(20-44)ser26)，另 一種的42
位半胱氨酸殘基被絲氨酸替代(CAP37(20-44)ser42)。
真菌分離物和培養條件
用于該研究中的分離物包括白色念珠菌(ATCC 28367)、白色念珠菌 的三種氟康唑敏感型粘膜分離物(稱作A-22、 A-111和A-155)、白色 念珠菌的三種氟康唑抗性粘膜分離物(稱作A-46、 A-5和A-20)，和白 色念珠菌的血液分離物(稱作WDO)。將分離物在-70。C冷凍保存并 在薩布羅右旋糖瓊脂(Sigma, St. Louis, MO)平板上劃線接種并在平板上 在4。C下保持，在培養期間約每IO天在新平板上傳代培養。評估氟康唑 抗性。克柔念珠菌在三種臨床分離物、都柏林念珠菌的兩種臨床分離物、 光滑念珠菌、高里念珠菌、近平滑念珠菌、假熱帶念珠菌和熱帶念珠菌 各一種分離物和釀酒酵母的兩種分離物也用于該研究中并且在薩布羅右旋糖瓊脂平板上在4。C下保持。在具有0.P/。D-葡萄糖(Sigma)的1%植 物蛋白胨培養液(Becton Dickinson, Sparks MD)中33。C過夜培養單個酵 母菌落。
菌絲的誘導
為了誘導菌絲形成，將來自薩布羅右旋糖瓊脂平板的白色念珠菌分 離物A-5、A-20、A-22、 A-46、 A-ll和A-155的單個菌落轉移到具有0.1% 葡萄糖的1%植物蛋白胨培養液并在33。C過夜培養。在具有10%胎牛血 清(Invitrogen, Grand Island, NY)的5ml RPMI-1640 (Cellgro Mediatech Inc Herndon, VA)中37°C下傳代培養過夜培養物的等分試樣(500 jil)90分鐘。 在相差顯微鏡下確定菌絲形成。
體外殺念珠菌測定法
用用于沖洗的無菌的無內毒素水(Baxter, Deerfield, IL)以1 mg/ml濃 度配制所有肽的儲存液。隨后的稀釋都用胰蛋白胨鹽水pH 5.5進行 (Shafer等人，Infect lmmun, 1984)。將在具有0.1%葡萄糖的1%植物蛋白 胨培養液中生長的單個菌落的過夜培養物的等分試樣(IOO iil)在5ml具 有0.1 %葡萄糖的1 %植物蛋白胨培養液中傳代培養并在振動型恒溫水浴 (每分鐘80次振動，Precision, Winchester, VA)中在33°C下溫育90分鐘 以產生對數培養物。如通過相差顯微術測定的，發現在這些條件下的細 胞培養物主要由芽生孢子組成。讀出光密度并將培養液用pH5.5的胰蛋 白胨鹽水(Shafer等人，Infect lmmun， 1984)調節到500芽生孢子lOOjil。 向96孔無菌聚苯乙烯微量滴定板(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) 中的100 pi生物懸浮液加入lOOpl肽(終濃度400 )ig/ml和200 pg/ml) 或100 (il胰蛋白胨鹽水。將后者用作對照。將微量滴定板在37。C溫育4 小時并在薩布羅右旋糖瓊脂板上接種來自每孔的100 ^內含物并在37 。C過夜溫育。計數菌落形成單位(cfu)并將殺真菌活性表達為殺滅百分 數并根據下面的等式計算[(對照cfu -試驗cfu)/對照cfu] x 100 =殺滅的 % 。通過不存在肽的情況下僅在胰蛋白胨鹽水中溫育60分鐘后存在的 菌落數目表示對照cfu。通過計數在含有所述肽的胰蛋白胨鹽水中溫育 后存在的菌落數目來測定試驗cfu。每個實驗點以一式三份進行。殺真菌測定法的方法
還使用FUN-1活/死酵母活力試劑盒(FUN-l Live/Dead Yeast Viability Kit) (Molecular Probes, Eugene, OR)評估酵母活力。使用的方法 是基本上根據銷售商提供的關于使用熒光顯微術的方案。簡言之，完全 如上述制備酵母培養物。在不存在或存在終濃度為400 |Lig/ml的肽 (CAP37(20-44)nat和CAP37(20-44)^6,42)的情況下溫育(37°C3小時)克 柔念珠菌、假熱帶念珠菌、白色念珠菌(氟康唑敏感分離物)和釀酒酵母 (100 ^胰蛋白胨鹽水中5 x 105 cfu)。在溫育期結束時，將樣品轉移到 樣i量離心管中并離心(室溫下10,000 x g 3分鐘)。除去上清液并將沉 淀物重懸浮在25 pi GH溶液(含有10 mM Na-HEPES的2% D -葡萄糖， pH7.2)中，如銷售商提供的技術數據表中所述。從10mM貯存液制備 FUN-1試劑的工作液(100ial 10)iM)并向酵母中加入25iil(終濃度5 jiM) 并在室溫溫育30分鐘。將樣品(10)ul)置于顯微鏡載玻片上并在萊卡TCS NT共焦顯微鏡下使用Ar- 488和Kr-568激光器和63x Plan APO 1.2 NA 水浸沒物鏡觀察染色。掃描圖像并使用激光器TCS軟件分析。
統計學分析
數據以來自以 一式三份進行的三或四個獨立實驗的平均值±標準誤 差給出。
結果
肽的合成
從這些研究合成的肽在表l中表示。CAP37(20-44)nat含有兩個半胱 氨酸殘基，其對應于天然CAP37蛋白質的26和42位，它們在天然 CAP37分子中形成二硫鍵(Pohl等人，FEBS Lett 1990)。因此，通過將兩
個半胱氨酸用絲氨酸殘基(CAP37(20-44)ser26/42)替換或者將26位的單個 半胱氨酸用絲氨酸替換(CAP37(20-44)ser26)或者將42位的單個半胱氨酸 用絲氨酸替換(CAP37(20-44)ser42)，評估這兩個半胱氨酸殘基對肽的活性
的重要性。 一個或兩個半胱氨酸殘基的替換導致該肽不能形成二硫鍵并 且因此干擾可能的環狀結構的形成。不希望被理論束縛，替換任一位置 處的一個半胱氨酸干擾環狀結構的形成但是仍然能夠二聚化。體外殺念珠菌測定法的標準化
將白色念珠菌(ATCC 28367)用于標準號體外殺滅測定法。我們研究 了最佳生長條件(溫度和時間，在25°C下5小時和在33 °C下90分鐘)、 每孔芽生孢子數目(200、 400、 500、 600、 800和1000 cfu)、肽濃度范圍 (750、 500、 400、 200和100昭/ml)以及肽和念珠菌之間發生殺滅的接 觸時間(1、 2和4小時)。數據表明使用在25。C生長5小時或在33°C 生長90分鐘的念珠菌之間沒有顯著性差異。90分鐘溫育在技術上更方 便并且因此被常規地使用。測定每孔cfu的最佳數目為500并且需要念 珠菌和肽之間在37°C 4小時的溫育時間來得到最佳殺滅。用不同濃度 的CAP37(20-44)nat得到劑量依賴性殺滅。然而，在400叱/ml或150 下得到活性和無活性肽之間的最佳區別。
CAP37肽對白色念珠菌的氟康唑敏感性和抗性菌抹的殺真菌活性 肽CAP37(20-44)nat、 CAP37(20-44)ser26和CAP37(20-44)ser42在400 昭/ml下對于氟康唑敏感性臨床分離物A-155、 A-22和A-lll具有強烈 活性，取決于分離物，具有60%到94%之間的殺滅活性范圍(圖l)。 分離物A-l55似乎最敏感，80-94%的生物被殺滅。對于任何給定分離物， 三種肽之間的活性沒有統計學差異。與這三種肽的活性鮮明對比的是兩 個半胱氨酸殘基都被絲氨酸殘基替代的CAP37(20-44)sei26/42沒有活性。
肽CAP37(20-44)nat、CAP37(20-44)ser26和CAP37(20-44)ser42對于氟康
唑抗性分離物A-5和A-20具有高度活性，甚至在較低濃度(200昭/ml 或75 ^M)的肽下得到顯著活性。針對氟康唑抗性分離物A-46的活性需 要較高濃度(400昭/ml)的肽。而被認為無活性的CAP37(20-44)ser26/42肽 對分離物A-5和A-20具有適度活性。
肽CAP37(20畫44)nai、CAP37(20-44)ser26和CAP37(20-44)ser42對氟康唑
抗性物種A-5、 A-20和A-46和氟康唑壽丈感菌才朱A-155的作用是殺真菌 的而不是抑制真菌的，因為在所述肽存在下活菌落數小于起始接種物。
CAP37肽對白色念珠菌的菌絲形式的殺真菌活性 CAP37肽對白色念珠菌的菌絲形式的殺真菌活性 當將它們對芽生孢子的活性比較時，CAP37肽對白色念珠菌的臨床 分離物的菌絲形式的活性較低(圖2)。當比較肽CAP37(20-44)nat、CAP37(20-44)ser26和CAP37(20-44)ser42之間的活性時，似乎用 CAP37(20-44)ser42得到了比其他CAP37肽更大的抗菌形式的活性。
CAP3 7肽對多種念珠菌種的殺真菌活性
CAP37肽的作用取決于所測試念珠菌的不同種而變(圖3)。 CAP37 肽對高里念珠菌和近平滑念珠菌最有效。對于這兩個種，低至100叱/ml (37.5 ^M)的肽濃度是殺真菌的。假熱帶念珠菌對于所有CAP37肽也是 極度敏感的。對于高里念珠菌和近平滑念珠菌，用肽CAP37(20- 44)ser26/42 也得到了一定的活性，盡管顯著小于其他三種CAP37肽。念珠菌的血 液分離物也被CAP37(20-44)nat、 CAP37(20-44)ser26和CAP37(20-44)ser42 殺滅。對所有上面的種的活性都是殺真菌的而不是抑制真菌的。CAP37 肽(CAP37(20-44)nat、 CAP37(20-44)ser26和CAP37(20-44)ser42)有效抗都柏 林念珠菌的兩種分離物和克柔念珠菌的 一種分離物(盡管程度較低)。 CAP37肽對兩種克柔念珠菌分離物、光滑念珠菌和釀酒酵母的兩種分離 物是無效的。
CAP37肽的抗真菌活性是殺真菌的。我們使用共焦顯微術和熒光染 料FUN-1評估細胞活力。我們選擇了氟康唑敏感性白色念珠菌分離物和 對CAP372o-44敏感的，i熱帶念珠菌，和克柔念珠菌和釀酒酵母分離物之 一作為如通過CFU測定法測定不受所述肽影響的真菌實例。使用該技 術，我們觀察到以前使用菌落計數的數據和顯微鏡評估之間良好相關 性。共焦數據的代表圖(圖4)顯示約70-80%的所有白色念珠菌芽生孢 子染成綠色或黃綠色，表明當用CAP37(20-44)nat肽溫育時多數酵母細胞
都是死亡的。另一方面，相對無活性肽(CAP37(20-44)ser26/42)表明僅僅30
。/o的芽生孢子是活的。用肽CAP37(20-44)nat處理假熱帶念珠菌顯示〉95o/Q
的細胞被殺死。用無活性肽(CAP37(20-44)ser26/42)得到類似的結果，證實
了我們用菌落形成單位測定法得到的結果。用克柔念珠菌和釀酒酵母進
行的研究驗證了用菌落形成單位測定法得到的數據；約10- 15%的細胞
中不存在肽的情況下溫育酵母細胞)對活力沒有影響。 實用性
可以用作根據本發明的抗真菌治療劑的肽包括本文描述的肽以及美國專利號6,107,460; 6，514,701;和6,730,659中描述的肽；將它們的說 明書完整地明確引入本文作為參考。
如本文別處的指出的，本發明在優選實施方案中設想將 CAP37(20-44)nat (線性的或者半胱氨酸之間環化的)、CAP37(20-44)ser26.
CAP37(20-44)ser4jP CAP37(20-44)ser26/42用作抗真菌治療。本發明還包括
類似于肽CAP37(20-44)nat, CAP37(20-44)ser26 、 CAP37(20-44)ser42和
CAP37(20-44)ser26/42的肽的用途，只是其中N-末端三個氨基酸和C-末端
兩個氨基酸是被截短的(CAP37(23-42:u (線性的或者半胱氨酸之間環化 的)、CAP37(23-42)ser26、 CAP37(23-42)ser42和CAP37(23-42)ser26/42)。備選 地，這些絲氨酸替代的肽的每一種可以備選用蘇氨酸替代(即，SEQID NO. 9-14)。此外，本文使用的CAP37肽或肽衍生物可以包含至少一個 下面的替代苯丙氨酸被酪氨酸替代；甘氨酸被丙氨酸替代；纈氨酸被 丙氨酸、亮氨酸或異亮氨酸替代；丙氨酸被亮氨酸、異亮氨酸或纈氨酸 替代；亮氨酸被丙氨酸、異亮氨酸或纈氨酸替代；異亮氨酸被纈氨酸、 亮氨酸或丙氨酸替代；絲氨酸被組氨酸、精氨酸或賴氨酸替代；蘇氨酸 被絲氨酸替代。
如本文別處指出的，所述肽4汙生物可以是如上述》多飾的 CAP37(20-44)肽或CAP37(23-42)的衍生物。在一個備選的實施方案中， 使用的肽可以包含CAP37(120-146),即SEQ ID NO: 16。備選地，完整 CAP37蛋白質可以用于本發明的抗真菌治療中。
本發明設想治療患者、受試者或哺乳動物中真菌感染或者預防性預 防患者、受試者或哺乳動物中真菌感染的方法，其包括對該患者、受試 者或哺乳動物施用治療有效量的本文所述的肽。
此外，本文i史想的用作抗真菌治療的肽可以包含具有20、 21、 22、 23、 24或25個殘基并且包含序列(SEQIDNO: 15)的肽
R-H-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-H-Xi 1-R-X13-X14-M-X16-X17-X〗8-X19-X20
其中X3和乂13是苯丙氨酸、酪氨酸、精氨酸、賴氨酸或組氨酸； X4選自半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、精氨酸、賴氨酸或組氨酸；X5和 X6選自甘氨酸、丙氨酸、精氨酸、賴氨酸或組氨酸；X7、 X仏和Xw選
自丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、精氨酸、賴氨酸或組氨酸。x9、
Xn和X"選自丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸；X^是絲氨酸或蘇 氨酸；X。選自絲氨酸、蘇氨酸、組氨酸、精氨酸和賴氨酸；X2o選自半胱氨酸、絲氨酸和蘇氨酸；R是精氨酸；H是組氨酸；M是甲硫氨酸，并且其 中該肽可以在N-末端包含一個、兩個或三個額外殘基并且在肽的C末 端包含一個或兩個額外的殘基并且其中在一個實施方案中，例如，X3-X7 可以是精氨酸并且X！廣X14可以是賴氨酸。
SEQ ID NO: 1-16中的4壬一個可以單獨或組合用作肽的"混合物"，此 外，當肽綴合到聚合物如聚乙二醇時，SEQ ID NO: l-16的多種肽可以 連接到相同的聚乙二醇分子。此外，可以將本發明的任一種肽二聚化， 例如，以形成同型二聚體或異二聚體，如CAP37(20-44)nat 二聚體、 CAP37(20-44)ser26二聚體、CAP37(20-44)ser42二聚體或CAP37(20-44)set26 -CAP37(20-44)ser42 二聚體。對于分子內環化，在兩個半胱氨酸之間形成 二硫鍵。肽的二聚化和巰基之間的分子內環化是本領域公知的并且認為 其詳細解釋不是本文所必要的。然而，這些方法的一個實例在Thermo Electron Corp. 2005的技術報告TI-PEP05- 0405中說明，將其完整包括 在本文中作為參考。二聚體可以通過"分子間氧化，，連接，例如，連接 在26位cys上的巰基將連接到來自具有cys 26的另 一肽的SH基團，得 到同型二聚體。類似地，可以將cys42上的SH基團與來自另一肽的cys 42上的SH基團環化，得到cys42同型二聚體。在第三個備選方案中， cys 42和cys 26之間的巰基可以連4妻而得到雜二聚體。顯示本領域環化 和二聚化現狀的其他參考文獻包括J. Davies, J. Peptide Sci. 9:471- 501 (2003); P. Li和P. Roller. Can. Top. In Med. Chem. 2:325-341 (2002);和 M. Hornef，等人Nat Immunol. 5(8):836-843(2004),將它們都完整的明確 引入本文作為參考。
本發明還包含DNA分子，其具有編碼如本文所列或所述的任一氨 基酸序列中定義的氨基酸序列的肽，尤其在26或42位具有被取代的半 胱氨酸殘基的核苷酸序列。
本發明設想使用本文所述的肽和/或其有效亞基治療進行中的真菌 感染和預防性治療具有發生此類感染風險的個體。
合成或重組產生的用于本發明中的肽當與可藥用載體組合時可以 用作治療組合物。這種組合物除了含有所述肽和載體、稀釋劑、填充劑、 鹽、緩沖劑、穩定劑、增溶劑之外，還含有本領域公知的其他物質。所 述制劑的合適的載體、運載體和其他組分例如在Remingtons'Pharmaceutical Sciences, (Mack Publishing Co., 1980或最新X反本)中描述。 術語"可藥用的"是指無毒物質，其不干擾活性成分的生物活性的有效 性。載體的特征將取決于施用途徑。
本發明的藥物組合物可以為脂質體的形式，其中分離的肽除了與其 他可藥用載體組合外，還與兩親性試劑如脂類組合，所述兩親性試劑以 聚集體的形式存在，如膠束、不溶性單層、液晶、或者水溶液中的片層。 脂質體制劑的合適的脂類包括但不限于，甘油一酯、甘油二酯、硫肝脂、 溶血卵磷脂、磷脂、皂苷、膽汁酸等等。此類脂質體制劑的制備在本領 域:忮術水平之內，如美國專利號4,235,871、美國專利號4，501 ,728、美 國專利號4,837,028和美國專利號4,737,323中公開，將它們都明確地完 整引入本文作為參考。
本發明化合物的治療有效量指有效控制、減輕或者抑制真菌感染的 量。術語"控制，，意在指所有過程，其中可以有感染進展的減慢、中斷、 阻止或停止，并且不必要指出感染癥狀的完全消除。
術語"治療有效量"還意在定義導致真菌感染特征性的任何參數或 臨床癥狀的改善的量。實際劑量將隨著患者的總體狀況、癥狀的嚴重性 和計數指示而變。
如本文使用的術語"受試者"或"患者"是指溫血動物，尤其哺乳 動物，其受到真菌感染的侵襲。可以理解豚鼠、狗、貓、大鼠、小鼠、 馬、山羊、牛、綿羊、動物園動物、家畜、靈長類動物和人是該術語意 義范圍內的動物的實例。
用于本文所述的治療中的化合物的治療有效量可以由作為本領域 技術人員的主治診斷醫生通過使用常規技術和通過在類似環境下得到 的觀察結果容易地確定。在測定治療有效劑量時，主治診斷醫生考慮多 種因素，包括但不限于哺乳動物種類、其大小、年齡、 一般健康、有關 的特定真菌疾病或狀況、真菌疾病或病癥的涉及程度或嚴重性、個體受 試者的應答、施用的具體化合物、施用方式、施用的制劑的生物利用率 特征、所選的劑量方案、相伴藥物治療的使用和其他相關情況。
本發明化合物的治療有效量也指有效控制或減輕真菌感染的化合 物的量。
本發明組合物的治療有效量將一般含有足夠的活性成分(即肽)以 遞送約0.1昭/kg到約100 mg/kg (活性成分的重量/患者的體重)。優選地，組合物將遞送至少0.5 pg/kg到50 mg/kg,更優選至少1 pg/kg到10 mg/kg。
本發明方法的實施包括對受試者以任何合適的全身或局部制劑，以 有效遞送上面列出劑量的量遞送治療有效量的肽。肽的基本上抑制真菌 感染的有效的、特別優選的劑量是1昭/kg到1 mg/kg肽。劑量可以一次 施用，或者(例如)每天施用一次到五次或者每周一次或兩次，或者通 過經脈滴注連續施用，這取決于所希望的治療效果。
如本文使用的，術語"治療有效量"是指治療組合物或方法的每種 活性組分的總量，其足夠顯示出有意義的患者益處，即減輕真菌感染。 當應用于單獨施用的個別活性成分時，該術語僅僅指該成分。當應用于 組合時，該術語是指導致治療效果的多種活性成分的組合量，不管它們 是組合順序還是同時施用。
在實踐本發明的治療方法或用途時，將肽組合物的治療有效量施用 于具有真菌疾病狀態的哺乳動物。可以根據本發明的方法單獨或與其他 療法組合施用肽。
用于治療組合物中或實施本發明方法中的肽的施用可以以多種常 規方法進行，包括經口、通過吸入(例如，用于竇真菌感染)、經直腸， 或者通過皮膚、皮下、腹膜內、陰道或靜脈內注射。可以配制口服制劑 使得肽在被釋放之前穿過一部分消化系統，例如，它可以在到達小腸或 結腸時才纟皮釋》文。
當經口施用治療有效量的肽時，肽將為片劑、膠嚢劑、粉劑、溶液 劑或酏劑的形式。當以片劑形式施用時，本發明的藥物組合物可以額外 含有固態載體，如明膠或輔劑。片劑、膠嚢劑和粉劑優選含有約5到95 %肽。當以液體形式施用時，可以加入液態載體，如水、石油、動物或 才直物來源的油，如花生油、礦物油、大豆油、或者芝麻油，或合成油。 藥物組合物的液體形式可以還含有生理鹽水溶液、葡萄糖或其他糖溶 液，或者二醇，如乙二醇、35丙二醇或者聚乙二醇。當以液體形式施用 時，藥物組合物優選含有4姿重量計約0.005到95%的肽。例如，可以經 口施用100-1000 mg活性成分，每天一到兩次。
對于經口施用，可以將化合物配制成固體或液體制劑，如膠嚢劑、 丸劑、片劑、錠劑、熔化物、粉劑、混懸劑、或者乳劑。固體單位劑型 可以是普通明膠型膠嚢劑，其含有例如，表面活性劑、潤滑劑和惰性填充劑，如乳糖、蔗糖和玉米淀粉或者它們可以是緩釋制劑。
在另 一實施方案中，本發明的化合物可以用常規片劑基質如乳糖、 蔗糖和玉米淀粉與黏合劑如阿拉伯樹膠、玉米淀粉或者明膠、崩解劑如 馬鈴薯淀粉或者藻酸和乳化劑如硬脂酸或硬脂酸鎂相組合來壓片。通過 將活性成分溶解在水性或者非水性可藥用溶劑中制備液體制劑，所述溶 劑還可以含有如本領域中已知的懸浮劑、增甜劑、調味劑和防腐劑。
對于腸胃外施用，可以將化合物溶解在生理學上可接受的藥物載體 中并作為溶液或者懸浮液施用。合適的藥物載體的實例是水、鹽水、葡
萄糖溶液、果糖溶液、乙醇，或者動物、植物或合成來源的油。藥物載 體還可以含有本領域中已知的防腐劑和緩沖劑。
當通過靜脈內、皮膚或皮下注射施用治療有效量的肽時，肽通常為 無致熱原的、腸胃外可接受的水溶液或混懸液。此類腸胃外可接受的具 有應當的pH、等滲性、穩定性等等的肽溶液在本領域技術之內。用于 皮內、皮膚或者皮下注射的優選藥物組合物除了含有肽之外，還應該含 有等滲載體，如氯化鈉注射液、林才各注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖和
氯化鈉注射液、乳酸林格注射檸檬酸鹽緩沖液(pH 5.5)，或者本領域
已知的其他載體。本發明的藥物組合物還可以含有穩定劑、防腐劑、緩 沖劑、抗氧化劑，或者本領域技術人員已知的其他添加劑。
如上面指出的，組合物還可以包含合適的載體。對于局部使用，可 以加入任一種常規賦形劑以將活性成分配制成洗劑、軟膏劑、粉劑、霜 劑、噴霧劑或者氣霧劑。對于手術植入，可以將活性成分與任一種公知 的生物可降解的和生物蝕解的載體，如聚乳酸和膠原制劑組合。此類材 料可以為固體植入物、縫線、海綿、傷口敷劑等等的形式。在任一情況
下，對于材術十的局部《吏用，活性成分通常以約1:1000到1:20,000的重量 比存在于載體或賦形劑中，但是不限于該范圍內的比例。用于局部使用 的纟且合物的制備一皮i羊述在Remington's Pharmaceutical Sciences,最近片反 本(Mack Publishing)中。
在優選治療方法中，以靜脈內灌注以1 mg活性成分/kg - 4mg/kg體 重的范圍每天一次提供肽組合物。
如所指出的，本領域技術人員可以確定優選的量和施用方式。制備
染、感染階段和其他相關情況，使用本領域已知的，例如在Remington'sPharmaceutical Sciences,最新片反本，Mack Publishing Co中描述的酉己制4支 術容易地選3奪施用形式和方式。
利用本領域已知的技術可以生產藥物組合物。通常，將治療有效量 的肽與可藥用載體混合。
本發明還包括通過應用足夠治療感染的肽量，如0.5 - 10%來治療局 部真菌感染的方法。局部藥療法可以采用任一種標準形式，如糊劑、凝 膠劑、霜劑和軟膏劑。通過簡單地制備待施用化合物的溶液，優選使用 已知促進經皮吸收的溶劑，如乙醇或者二甲基亞砜(DMSO),用或不 用其他賦形劑來制備溶液，完成局部應用。優選地，將使用貯庫制劑和 多孔膜形式或者固體基質形式的貼劑完成局部施用。
本發明中藥物組合物的肽量將取決于被治療的狀況的性質和嚴重 性和患者已經經歷的先前治療的性質。最后，主治醫生將決定治療每個 個體患者所用的肽量。最初，主治醫生將優選施用低劑量的肽，并觀察
患者的反應。將施用較大劑量的肽直到為該患者得到最佳的治療效果， 并且在此時劑量不進一步增加。不希望被具體劑量限制，預期用于實施 本發明方法的多種藥物組合物應該含有約0. lmg到約1000mg肽/kg體重/劑。
使用本發明的藥物組合物的靜脈內療法的持續實踐將取決于被治 療的疾病和狀況的嚴重性和每名患者的潛在的特應性反應。預期肽的每 次應用的持續時間將在1到2小時范圍內并且通過連續靜脈內施用被每 12或24小時給藥一次。最后，主治醫生將決定使用本發明的藥物組合 物的靜脈內治療的適當的持續時間。
如果主治醫生要求，那么也可以以本領域普通技術人員已知的方式 提供其他抗生素、靜脈內液體、心血管和呼吸支持體。
可以一皮本文所述的肽組合物治療的真菌疾病包括但不限于念珠 菌、釀酒酵母、引起組織胞漿菌病的夾膜組織胞漿菌(Histoplasma capsulatum)和其他組織胞漿菌種、煙曲霉和引起曲霉菌病的其他物種 (多數發生在肺中)，和新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)(有時在 肺中被發現，但是多數在中樞神經系統中被發現)，其引起被稱作隱球菌 病的疾病。
可以用額外的藥學方法控制肽的作用持續時間。通過使用聚合物綴 合、復合或者吸收本文的肽可以實現增加的半壽期和控釋制劑。通過選擇合適的大分子和大分子的合適濃度以及摻入方法以便控釋，可以實現 受控的遞送和/或增加的半壽期，所述大分子為例如，多糖、聚酯、聚氨 基酸、均聚物聚乙烯吡咯烷酮、乙烯乙酸乙烯基酯、甲基纖維素或者羧 曱基纖維素和丙烯酰胺類如N-(2-羥丙基)曱基丙烯酰胺。
用于控制控釋制劑的作用持續時間和半壽期的另 一 可能的方法是 將肽分子或其功能衍生物摻入到聚合物材料顆粒中，如聚酯、聚酰胺、 聚氨基酸、水凝膠、聚(乳酸)、乙烯乙酸乙烯基酯共聚物、例如聚乙 二醇和聚(1-天冬酰胺)的共聚物膠束。
通過使用本領域已知的方法將本文所述的肽綴合到其他分子，如聚 合物以形成藥物-聚合物綴合物，可以延長所述肽的半壽期。例如，用 被稱作"聚乙二醇化"的方法可以將肽(例如共價)結合到本領域已知 的惰性聚合物分子，如聚乙二醇(聚乙二醇)的分子上。因此，聚乙二醇
減:、肽分子的潛在抗原性。聚乙二醇化還可以增強肽^溶解度從而提高 它們的治療效果。使用的聚乙二醇可以是線性或支鏈的。
聚乙二醇分子可以被官能團修飾，如Hams等人，"聚乙二醇ylation, A Novel Process for Modifying Phararmacokinetics", Clin Pharmacokinet 2001 :40(7); 539-551中所示，并且肽的氨基末端殘基的氨基或者內部半 胱氨酸殘基或其中具有連接基團的其他氨基酸(如精氨酸、賴氨酸、組 氨酸、絲氨酸、蘇氨酸或甲硫氨酸)可以連接到聚乙二醇分子，其中聚乙 二醇分子可以攜帶一個或多個一種或多種類型的肽，或者肽可以攜帶一 個以上的聚乙二醇分子。
"聚乙二醇化的肽"是指本發明的肽，其具有共價結合到該肽的氨 基酸殘基或連接基團的聚乙二醇(聚乙二醇)部分。聚乙二醇分子還可 以通過例如包含1到10個氨基酸的接頭連接到肽。
"聚乙二醇"是指聚(亞烷基)二醇化合物或其衍生物，使用或不 適用偶聯劑或者用偶聯或活化部分(例如，用巰基、三氯曱磺酸基、三 氟乙基磺酸基、氮丙啶、環氧乙烷或者優選用馬來酰亞胺部分)衍生。 化合物如馬來酰亞胺單甲氧基聚乙二醇是本發明的示例性或活化的聚 乙二醇化合物。其他聚(亞烷基)二醇化合物，如聚丙二醇可以用于本 發明。其他合適的聚合物綴合物包括，但不限于，非多肽聚合物、下面 類型的帶電或中性聚合物例如,葡聚糖、多聚乙酰神經氨酸或其他基于糖類的聚合物、生物素衍生物和樹狀聚合物。術語聚乙二醇還意在包括 聚環氧烷類型的其他聚合物。
聚乙二醇可以被連接到肽的任一 N-末端氨基酸和/或可以被連接到 N-末端氨基酸的下游氨基酸，如賴氨酸、組氨酸、色氨酸、天冬氨酸、 谷氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、甲硫氨酸和半胱氨酸或者本領域技術人員已 知的其他此類氨基酸。例如，通過將聚乙二醇連接到肽的半胱氨酸殘基
上的SH基團產生半胱氨酸-聚乙二醇化的肽。
化學修飾的肽含有至少一個聚乙二醇部分，優選至少兩個聚乙二醇 部分，至多到連接到肽而不去除其活性的最大數目的聚乙二醇部分，例 如，聚乙二醇部分連接到優選在該肽的N-末端部分或其附近的氨基酸殘基。
連接到蛋白質的聚乙二醇部分的分子量優選為約200到30,000 MW。優選地，聚乙二醇部分將為約1 ,000到8,000 MW，更優選為約 3,250到5,000 MW,最優選為約5,000 MW。
目可以取決于^希望的肽的穩定性(;卩，血清半i期)在鄉寬范圍內^變動。 使用例如(但不限于)美國專利號4,179,337; 5,382,657; 5,972,885; 6,177,087; 6,165,509; 5,766,897;和6,217,869中所示技術,可以將預期 用于本文的肽分子連接到聚乙二醇分子；將所述專利各自的說明書和附 圖完整地明確引入本文作為參考。
備選地，可以將肽捕獲在微嚢、膠體藥物遞送系統(例如，脂質體、 白蛋白微球體、微乳劑、納米顆粒和毫超微嚢劑)中，所述微嚢為例如 通過凝聚技術或者通過界面聚合法制備(例如，分別為羥基甲基纖維素 或明膠微嚢和聚(異丁酸曱酯)微嚢)。此類技術被公開于Remington's Pharmaceutical Sciences的最新版本中。
美國專利號4,789,734描述了在脂質體中包嚢在生物化學品中的方 法并且從而將其在明確引入本文作為參考。大體上，將材料溶解在水溶 液中，加入合適的磷脂和脂類以及表面活性劑(如果需要)，并將材料 透析或超聲處理(如果必要)。已知方法的綜述見G. Gregonadis,第14 章."Liposomes", Drug Carriers in Biology and Medicine, pp. 287-341 (Academic Press, 1979)。聚合物或蛋白質形成的樣i球體是本領域技術人 員已知的，并且可以凈皮定制用于穿過胃腸道直接浸入血流中。備選地，可以將試劑摻入并將微球體或者微球體復合物植入用于在幾天到幾個
月的時間內緩慢釋放。見例如，美國專利號4，卯6,474; 4,925,673;和 3,625,214，將它們引入本文作為參考。
當組合物將被用作可注射物質時，可以將其配制到常規的可注射載 體中。合適的載體包括生物相容的和和可藥用的磷酸鹽緩沖鹽溶液，其 優選是等滲的。
為了重構根據本發明的凍干產物，可以使用無菌稀釋劑，其可以含 有公認被用于近似生理條件和/或政府規定所要求的物質。在這方面，無 菌稀釋劑可以含有緩沖劑以得到生理上可接受的pH,如氯化鈉、鹽水、 磷酸緩沖鹽水和/或其他生理學上可接受的和/或安全使用的物質。通常， 用于人體中,爭脈內注射的物質應該符合食品和藥物管理局(Food and Drug Admmistration)的規定，其是本領域技術人員可得到的。
藥物組合物也可以是含有與上面關于凍干產物重構所述的相同物 質的水溶液。
化合物還可以作為可藥用酸或i咸加成鹽施用，所述鹽通過與無才幾酸 如氫氯酸、氫溴酸、高氯酸、硝酸、硫氰酸、硫酸和磷酸，和有機酸如 甲酸、乙酸、丙酸、羥基乙酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、 馬來酸和富馬酸反應形成，或者通過與無機堿如氫氧^f匕鈉、氫氧化銨、 氫氧化鉀和有機堿如單-、二-、三烷基和芳基胺和取代的乙醇胺反應 形成。
如上述，可以將本發明的化合物被摻入到可以用于治療目的的藥物 組合物中。然而，術語"藥物制劑"在本文中以更廣義包括含有根據本 發明的肽組合物的制劑，其不^5l用于治療目的而且用于如本領域已知的 試劑或診斷目的，或者用于組織培養。意在用于治療用途的藥物制劑應 該含有"可藥用的"或者"治療有效量，，的肽，即預防性或治療性健康 措施必需的量。如果藥物制劑將被用作試劑或診斷，那么它應該含有試 劑或診斷量的肽。
考慮到本文提供的教導，本文列出的所有測定方法都在本領域普通 技術人員能力范圍之內。
盡管本文關于某些實施方案描述了本發明，從而可以更完全地理解 和明白本發明的方面，但是本發明不意在局限于這些具體實施方案。相 反，預期所有備選方案、修飾和等同方案都包括在如本文定義的本發明的范圍內。從而，包括優選實施方案的上述實施例將用于闡明本發明的 實踐，應該理解這些細節僅僅是作為舉例和為了闡明性討論本發明的優 選實施方案而說明，并且是為了提供被認為最有用并且容易理解本發明 的步驟以及原理和 一 既念方面的描述而提供。可以對本文所述的多種組合 物的配制或者本文所述的步驟或方法步驟的順序進行改變而不背離本 文所述的^l青神和范圍。
將本文引用的所有參考文獻、文章和專利申請都明確完整地引入本 文作為參考。
引用的參考文獻
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權利要求
1.治療或抑制受試者中真菌感染的方法，其包括施用治療有效量的具有20-25個氨基酸并且包含SEQ ID NO15或SEQ ID NO5的肽或SEQ ID NO5的肽衍生物，其中在該肽衍生物中至少一個半胱氨酸殘基被絲氨酸或蘇氨酸殘基替代。
2. 權利要求1的方法，其中所述肽衍生物包含SEQ ID NO: 5，其 N-末端第一個半胱氨酸殘基被絲氨酸或蘇氨酸殘基替代。
3. 4又利要求1的方法，其中所述肽書于生物包含SEQ ID NO: 5,其 C-末端第一個半胱氨酸殘基被絲氨酸或蘇氨酸殘基替代。
4. 權利要求1 -3中任一項的方法，其中SEQ ID NO: 5的肽書l"生物 還包含至少一個替代，所述替代包括苯丙氨酸一皮酪氨酸^齊代； 甘氨酸被丙氨酸替代； 纈氨酸被丙氨酸、亮氨酸或異亮氨酸替代； 丙氨酸被亮氨酸、異亮氨酸或纈氨酸替代； 亮氨酸被丙氨酸、異亮氨酸或纈氨酸替代； 異亮氨酸被纈氨酸、亮氨酸或丙氨酸替代； 絲氨酸被組氨酸、精氨酸或賴氨酸替代；和 蘇氨酸被絲氨酸替代。
5. 權利要求1-4中任一項的方法，其中被治療或抑制的真菌感染 w^^-不閨、eip^曰呀；、5且5r、/j已^fL閨、w母汴口 l諒j來閨引趕。
6. 權利要求1-5中任一項的方法，其中所述受試者是哺乳動物。
7. 權利要求1-6中任一項的方法，其中所述肽在該肽的N末端上 具有1到3個額外的氨基酸并且在該肽的C-末端上具有1到2個額外的 氨基酸。
8. 權利要求1 - 7中任一項的方法，其中所述肽包含序列(SEQ ID NO: 15):'R-H-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-H-Xl l-R-Xi3-Xi4-M-Xl6-Xn-Xl8-Xi9-X20其巾X3是phe、 tyr、 arg、 lys或his;X4是cys、 ser、 thr、 arg、 lys或his;X5是gly、 ala、 arg、 lys或his;X6是gly、 ala、 arg、 lys或his;X8-X9、 Xn和Xis是ala、 leu、 ile或val;X7、 Xu和Xw是ala、 leu、 ile、 val、 arg、 lys或his;X13是phe或tyr;X!6是ser或thr;X19是ser、 thr、 his、 arg或lys;X20是ser、 cys或thr(T> 曰R疋arg; H是his;以及 M是met。
9. 權利要求8的方法，其中X4是cys并且X2。是ser或thr。
10. 權利要求8的方法，其中X2o是cys并且X4是ser或thr。
11. 權利要求1 - IO任一項的方法，其中所述肽被聚乙二醇化。
12. 權利要求11的方法，其中所述肽被通過包含1到15個氨基酸 的接頭分子共價聚乙二醇化到聚乙二醇分子上。
13. 肽用于制備用于治療或抑制受試者中真菌感染的藥物的用途， 其中所述肽具有20 - 25個氨基酸并且包含SEQ ID NO: 15或SEQ ID NO: 5的肽或SEQ ID NO: 5的肽冬亍生物，其中在該肽書f生物中至少一個半月先 氨酸殘基被絲氨酸或蘇氨酸殘基替代。
14. 權利要求13的藥物的肽，其中所述SEQ ID NO: 5的肽書f生物 的N-末端第一個半胱氨酸殘基被絲氨酸或蘇氨酸殘基替代。
15. 權利要求13的藥物的肽，其中所述SEQ ID NO: 5的肽書f生物 的C-末端第一個半胱氨酸殘基被絲氨酸或蘇氨酸殘基替代。
16. 權利要求13 - 15中任一項的藥物的肽，其中SEQ ID NO: 5的 肽衍生物還包含至少一個替代，所述替代包含苯丙氨酸被酪氨酸替代；甘氨酸被丙氨酸替代；纈氨酸被丙氨酸、亮氨酸或異亮氨酸替代；丙氨酸被亮氨酸、異亮氨酸或纈氨酸替代；亮氨酸被丙氨酸、異亮氨酸或纈氨酸替代；異亮氨酸被纈氨酸、亮氨酸或丙氨酸替代；絲氨酸被組氨酸、精氨酸或賴氨酸替代；和蘇氨酸被絲氨酸替代。
17. 權利要求13- 16中任一項的藥物的肽，其中被治療或抑制的真 菌感染由念珠菌、釀酒酵母、組織胞漿菌、曲霉和隱球菌引起。
18. 權利要求13-17中任一項的藥物的肽，其中所述受試者是哺乳 動物。
19. 權利要求13 - 18中任一項的藥物的肽，其中所述肽在該肽的N 末端上具有1到3個額外的氨基酸并且在該肽的C-末端上具有1到2個 額外的氨基酸。
20. 權利要求13-19中任一項的藥物的肽，其中所述肽包含序列 (SEQ ID NO: 15):R-H-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-H-Xll-R-Xi3-Xi4-M-Xl6-Xi7-Xl8-Xi9-X20其中X3是phe、 tyr、 arg、 lys或his;X4是cys、 ser、 thr、 arg、 lys或his;X5是gly、 ala、 arg、 lys或his;X6是gly、 ala、 arg、 lys或his;Xg-X9、 X丄7和Xw是ala、 leu、 ile或val;X7、 Xu和Xi4是ala、 leu、 ile、 val、 arg、 lys或his;X13是phe或tyr;Xi6是ser或thr(Xi9是ser、 thr、 his、 arg或lys;X20是ser、 cys或thr;R是arg;H是his;M是met。
21. 權利要求20的藥物的肽，其中X4是cys并且X2o是ser或thr。
22. 權利要求20的藥物的肽，其中X2o是cys并且乂4是ser或thr。
23. 權利要求13-22中任一項的藥物的肽，其中所述肽被聚乙二醇化。
24. 權利要求23的藥物的肽，其中所述肽被通過包含1到15個氨 基酸的接頭分子共價聚乙二醇化到聚乙二醇分子上。
全文摘要
本文公開了通過用CAP37和其衍生物治療真菌感染的方法，所述衍生物包括在其中的兩個半胱氨酸殘基的至少一個處具有絲氨酸或蘇氨酸替代的肽類似物。還設想該肽的氨基酸殘基的其他替代。
文檔編號A61K38/00GK101300022SQ200680034294
公開日2008年11月5日 申請日期2006年7月31日 優先權日2005年8月1日
發明者H·安妮·佩雷拉, 保羅·菲德爾 申請人:俄克拉荷馬州大學評議會;路易斯安那州大學及農業和機械學院管理委員會