人干擾素α類似物和干擾素τ的低毒長循環的嵌合體的制作方法

專利名稱：：人干擾素α類似物和干擾素τ的低毒長循環的嵌合體的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種聚合物修飾的干擾素a的蛋白類似物，還涉及一種體內去除率較低的低毒人干擾素a類似物，以及使用這些類似物的治療方法。
背景技術：
：干擾素(IFNs)分為兩個不同的組I型干擾素，包括IFNa、IFN(3、IFNt和IFNco(還稱作IFNaII);II型干擾素，表示為IFNy(reviewedbyDeMaeyer,E.,etal.，INTERFERONSANDOTHERREGULATORYCYTOKINES,JohnWileyandSons,NewYork(1988))。人干擾素a(HuIFNa)為I型干擾素，由大約25個已知的不同亞型組成。這些人干擾素a為具有廣譜抗病毒、抗增殖和免疫調節功能的高度多效性細胞因子。特別地，它們能夠抑制多種含有RNA和DNA的病毒的復制；還能夠抑制惡性細胞的生長；并影響多種致癌基因的表達；以及激活天然殺傷細胞。HuIFNa的亞型HuIFNa2已經被用于治療多種病毒性疾病和癌癥。然而，在被施以具有療效所需的劑量時，患者經常產生包括"感冒癥狀"、不適、厭食、中性粒細胞減少癥和肝功能異常在內的副作用。很多患者由于無法忍受這樣的副作用從而放棄了使用干擾素a的治療。人們嘗試提供一種不會引起副作用的干擾素a，結果開發了，例如，混合干擾素(hybridIFNs)、組合干擾素a(consensusIFNa)和長效干擾素(long-actinginterferons),例如聚乙二醇化的干擾素a(pegylatedIFNa)。被聚乙二醇(PEG)修飾的干擾素a的例子包括聚乙二醇化的干擾素a-2b(PEGIntmn②)和a-2a(Pegasys⑧)，其中12kDa的聚乙二醇或40kDa的支鏈聚乙二醇各自分別與干擾素a連接。然而，這些聚乙二醇修飾的干擾素a的安全性與相應的天然蛋白的安全性相似或更差(BukowskiR.M.etal.,Cancer,95(2):389-96(2002);BukowskiR.M.etal.,JournalofClinicalOncology;20(18):3841-3949(2002);Motzer，R丄etal.，J.Clin.Oncol"19(5):1312-9(2001);TongM丄，JournalofInterferonandCytokineResearch,18:81-86(1998);YaoG.B.etal，JournalofGastroenterologyandHepatolog"15:1165-1170(2000);HeathcoteE丄etal，N.Engl.J.Med.，343(23):1673-80(2000);TongMJ.etal.,Hepatology;26(3):747畫54(1997》。最普遍報道的不良反應為惡心、厭食、乏力和發冷，這些癥狀的發生是與劑量相關的。另外，長期治療期間，在PEGIntror^的施用劑量為7.5嗎/kg或更高時，觀察到了包括嚴重的乏力、神經毒性、肝功能異常和骨髓抑制在內的劑量限制性毒性(BukowskiR.M.etal.，Cancer;95(2):389-96(2002))。甚至所有的患者都無法忍受劑量大于9嗎的組合干擾素a，需要對一些患者減少劑量以完善石開究(YaoG.B.etal.，JournalofGastroenterologyandHepatolog.，15:1165-1170(2000))。因此，現有的聚乙二醇化形式的干擾素a和組合干擾素a無法解決干擾素治療中的毒性問題。在該領域中，需要改良的聚合物修飾的干擾素a。
發明內容一方面，提供了一種組合物，該組合物含有與至少一種親水聚合物鏈共價結合的天然人干擾素a的蛋白類似物。在一實施方式中，所述親水聚合物鏈為聚乙二醇。所述聚乙二醇可以為直鏈的或支鏈的。在另一實施方式中，所述蛋白類似物為天然人干擾素a-d的蛋白類似物。在另一實施方式中，所述蛋白類似物為天然人干擾素a-2b的蛋白類似物。在另一實施方式中，所述蛋白類似物的氨基酸序列在位點19、20、22、24和27中的一個或多個位點上與天然人干擾素a-2b的氨基酸序列不同。在一優選實施方式中，所述蛋白類似物具有如SEQIDNO:48所示的序列。另一方面，提供了一種病毒感染的治療方法。該方法包括以能夠有效地治療感染的給藥量對患有病毒感染的患者使用與至少一種親水聚合物鏈共價結合的天然人干擾素a的蛋白類似物進行給藥。在一實施方式中，所述病毒感染選自肝炎病毒感染、人乳頭瘤病毒感染、皰疹病毒感染和人免疫缺陷病毒感染。在一具體實施方式中，所述肝炎病毒感染為丙型肝炎病毒感染或乙型肝炎病毒感染。在一實施方式的方法中，所述蛋白類似物可以通過腸道外進行給藥。在一實施方式中，所述給藥的方式可以為至少每周一次。給藥劑量可以進行調整，但在一實施方式中，所述蛋白類似物的給藥劑量為每周至少200^ig。在一替代性的實施方式中，所述蛋白類似物可以以450或900嗎的給藥劑量來每周給藥一次或每兩周給藥一次。又一方面，提供了一種病毒感染的治療方法。該方法包括對患有病毒感染的患者使用與至少一種親水聚合物鏈共價結合的天然人干擾素a的蛋白類似物進行給藥，該蛋白類似物的給藥頻率使該蛋白類似物的血漿濃度基本上保持穩定，由此所述施藥對肝細胞沒有細胞毒性作用。在又一實施方式中，提供了一種藥物組合物，該組合物含有化學修飾的藥用蛋白；還提供了一種試劑盒，該試劑盒含有所述藥物組合物。在另外一個實施方式中，提供了一種使用在此描述的組合物通過例如抑制腫瘤生長或病毒復制來治療疾病的方法或治療自身免疫性疾病的方法。另一方面，提供了一種增生性病變(proliferativedisorder)的治療方法。該方法包括以能夠有效地治療病變的給藥量對患有增生性病變的患者使用與至少一種親水聚合物鏈共價結合的天然人干擾素a的蛋白類似物進行給藥。圖1顯示了成熟的人IFN(xD、成熟的羊IFNt和8個稱作IFNa-N0至IFNa-N7的IFNa類似物的前27個N-末端氨基酸殘基的比對；圖2為用于制備指定的IFNa類似物IFNa-N0至IFNa-N7的載體的圖表;構建編碼每種類似物的合成基因并將該合成基因插入至pPICZa載體中，得到稱作NLV的表達載體；編碼每種類似物的合成基因是通過將含有預期的核苷酸替換的長度約為150個堿基對的寡核苷酸形成片段按順序結合而得到的。然后將核苷酸片段連接至構建體的Xhol/EcoRI位點，從而在pPICZa載體背景中得到不同的類似物；圖3為示例性的混合干擾素融合蛋白的示意圖；圖4A-4B為柱狀圖，該柱狀圖顯示了通過一定濃度的IFNa2b(IntronA，空白柱，圖4A)、IFNa類似物IFNa2b-N7(帶點的柱，圖4A);或IFNa2b-N7-PEG(40kDa)(帶點的柱，圖4B)、IFNa2a-PEG(40kDa)(Pegasys,空白柱，圖4B)培養的人外周血單核細胞的具體細胞死亡百分數；圖5A-5B顯示了IFNa2b-N7(SEQIDNO:48,帶點的柱)禾卩IFNa2b(IntronA，空白柱)(圖5A);以及PEG(40kDa)-IFNa2b-N7(帶點的柱)和IFNa2a-PEG(40kDa)(Pegasys，空白柱)(圖5B)對原發性人肝細胞的影響，該原發性人肝細胞在檢測代謝活性之前在干擾素存在的情況下培養7天；圖6顯示了以107U/kg的劑量給藥PEG(40kDa)-IFNa2b-N7(正方形)或IFNa2a-PEG(40kDa)(Pegasys氣菱形)之后，鼠的血藥濃度(ng/ml)與給藥后的時間(小時)之間的函數關系；圖7A顯示了裸鼠被植入腎癌細胞并以每周三次的劑量給藥IFNa類似物IFNa2b-N7(SEQIDNO:48)(106和107U/Kg)或IntronA(106和107U/Kg)后，從植入起至第28天中檢測到的腫瘤體積曲線圖下的面積；圖7B顯示了裸鼠被植入腎癌細胞并以每周三次的劑量給藥PEG(40kDa)-IFNa2b-N7(SEQIDNO:48)(106和107U/Kg)或Pegasys(106和107U/Kg)后，從植入起至至28天之間檢測到的腫瘤體積曲線圖下的面積；圖8A顯示了植有人乳腺癌腫瘤移植物的鼠體內腫瘤的體積(mm"與由下列物質治療后的時間(天)之間的函數關系生理鹽水(菱形)、每周107U/kg劑量的PEG(40kDa)-IFN(x2b-N7(正方形)、每兩周107U/kg劑量的PEG(40kDa)-IFNa2b-N7(三角形)和每兩周108U/kg齊U量的PEG(40kDa)-IFNa2b-N7(圓形)；圖8B為柱狀圖，該柱狀圖顯示了裸鼠被植入原發性乳腺癌腫瘤細胞(HCC1954)并以每兩周107禾Q1()Su/kg的劑量，或以每周1(^U/kg的劑量給藥PEG(40kDa)-IFNa2b-N7的從移植后第四天起至第28天之間檢測到的腫瘤體積曲線圖下的面積。序列說明SEQIDNO:l為人干擾素a(HuIFNa)的殘基19-27之間的氨基酸序列。SEQIDNO:2為羊干擾素t(OvIFNt)的殘基19-27之間的氨基酸序列。SEQIDNO:3為人干擾素ad的殘基11-27之間的氨基酸序列。SEQIDNO:4為羊干擾素t的殘基11-27之間的氨基酸序列。SEQIDNO:5為人干擾素ad的殘基6-27之間的氨基酸序列。SEQIDNO:6為羊干擾素t的殘基6-27之間的氨基酸序列。SEQIDNO:7為人干擾素a的殘基1-27之間的氨基酸序列。SEQIDNO:8為羊干擾素的殘基1-27之間的氨基酸序列。SEQIDNO:9為成熟人干擾素a(IFNa-d;GenBankAccessionNo.J00210,PIDg386796)的氨基酸序列。SEQIDNO:10為干擾素a類似物IFNad-NO的氨基酸序列。SEQIDNO:ll為干擾素a類似物IFNad-N0的殘基1-27之間的氮基酸序列。SEQIDNO:12為干擾素a類似物IFNad-Nl的氨基酸序列。SEQIDNO:13為干擾素a類似物IFNad-Nl的殘基1-27之間的氨基酸序列。SEQIDNO:14為干擾素a類似物IFNad-N2的氨基酸序列。SEQIDNO:15為干擾素a類似物IFNad-N2的殘基1-27之間的氨基酸序列。SEQIDNO:16為干擾素a類似物IFNad-N3的氨基酸序列。SEQIDNO:17為干擾素a類似物IFNad-N3的殘基1-27之間的氨基酸序列。SEQIDNO:18為干擾素a類似物IFNad-N4的氨基酸序列。SEQIDNO:19為干擾素a類似物IFNad-N4的殘基1-27之間的氨基酸序列。SEQIDNO:20為干擾素a類似物IFNad-N5的氨基酸序列。SEQIDNO:21為干擾素a類似物IFNad-N5的殘基1-27之間的氨基酸序列。SEQIDNO:22為干擾素a類似物IFNad-N6的氨基酸序列。SEQIDNO:23為干擾素a類似物IFNad-N6的殘基1-27之間的氨基酸序列。SEQIDNO:24為干擾素a類似物IFNad-N7的氨基酸序列。SEQIDNO:25為干擾素a類似物IFNad-N7的殘基1-27之間的氨基酸序列。SEQIDNO:26為成熟羊干擾素t(OvIFNt)(oTP-1;GenBankAccessionNo.Y00287;PIDgl358)的氨基酸序列。SEQIDNO:27為編碼類似物IFNad-NO的合成基因的核苷酸序列。SEQIDNO:28為接頭1的核苷酸序列。SEQIDNO:29為接頭2的核苷酸序列。SEQIDNO:30為Nl類似物的殘基1-27之間的核苷酸序列，正義鏈(forwardstrand)。SEQIDNO:31為片段N1的核苷酸序列，反義鏈(reversestrand)。SEQIDNO:32為片段N2的核苷酸序列，正義鏈。SEQIDNO:33為片段N2的核苷酸序列，反義鏈。SEQIDNO:34為片段N3的核苷酸序列，正義鏈。SEQIDNO:35為片段N3的核苷酸序列，反義鏈。SEQIDNO:36為片段N4的核苷酸序列，正義鏈。SEQIDNO:37為片段N4的核苷酸序列，反義鏈。SEQIDNO:38為片段N5的核苷酸序列，正義鏈。SEQIDNO:39為片段N5的核苷酸序列，反義鏈。SEQIDNO:40為片段N6的核苷酸序列，正義鏈。SEQIDNO:41為片段N6的核苷酸序列，反義鏈。SEQIDNO:42為片段N7的核苷酸序列，正義鏈。SEQIDNO:43為片段N7的核苷酸序列，反義鏈。SEQIDNO:44與SEQIDNO:26的第5和6位的氨基酸殘基被修飾的成熟羊干擾素t的氨基酸相對應。SEQIDNO:45與SEQIDNO:26所示的羊干擾素T的前37個氨基酸殘基相對應。SEQIDNO:46與SEQIDNO:44所示的修飾的羊干擾素t的前37個氨基酸殘基相對應。SEQIDNO:47為包括來自干擾素t的C-末端區域和來自另一個干擾素的區域的混合干擾素蛋白的序列。SEQIDNO:48與在此稱作IFNa2b-N7類似物的干擾素a類似物的氨基酸序列相對應，其中，IFNa2b的N-末端區域的19、20、22、24、27位氨基酸被羊干擾素t的相應殘基所取代。SEQIDNO:49為人干擾素a2b的氨基酸序列。具體實施方式I、定義干擾素a是指分離的干擾素a蛋白家族的任何成員，例如，具有SEQIDNO:9所示氨基酸序列的IFNaD，具有SEQIDNO:49所示氨基酸序列的腿a2b。簡寫為IFNt或interferon-^的干擾素t是指任何與已知IFNt的氨基酸序列具有高于70%、優選高于80%、更優選高于90%的氨基酸同源性的分離的干擾素蛋白家族的成員(例如，Ott，etal.，J.InterferonRes"11:357(1991);Helmer,etal.,J.Reprod.Fert.,79:83(1987);Imakawa，etal.，Mol.Endocrinol,3:127(1989);Whaley，etal"J.Biol.Chem.，269:10846(1994);Bazer，etal,WO94/10313(1994))。干擾素t已經在多種反芻動物中進行了鑒定，所述反芻動物包括但不限于牛(5ov/"e取，Z/e/menS.D.,/7義'S3(79S7人/maA:awa，AT"Mo/.￡"<aocWwo/""9:532(7卵柳、羊(OWwe平)、麋牛(OW/zos5p.)、長頸鹿(G7ra加Ge"5awA^4cce肌'ow肌W050)、馬(五《"wsca&a〃tw)、斑馬(&w附6w/r/^〃/,(7ew5"wA:v4cce肌'owwo.M7005ft27)、河馬(/f一o;o/譜wj5/.)、大象(丄o;cocfo"tos/.)、駱鴕(丄/a附"g/ama)、山羊(Capra印"G^"5""Aj函細磨.超57諷葡573",葡473W,招573",超57332,」735733/,爿"57330'^K5573M,」"5732&爿K557327)和鹿(Cen^aes/.)。這些物種中，許多物種的干擾素t的核苷酸序列在公共數據庫和/或文獻中都有報道(例如，參見，Ao6^1s'兄MW"/">//"&z/era"C"oA:/"eA".，/S:S05羊干擾素t(OvIFN"是指具有如SEQIDNO:26所示的氨基酸序列的蛋白，還指具有不顯著地影響蛋白活性的氨基酸替換和改變(如中性氨基酸替換)的蛋白，如SEQIDNO:44所示的干枕素t蛋白。更普遍地說，羊干擾素t蛋白是指與SEQIDNO:26所示的序列具有大約80%、更優選90%的序列同源性的蛋白。例如，通過嚴格的氨基酸比對或使用多種商用程序中的一種來確定序列的同源性。"成熟蛋白"是指移除其前導序列后的干擾素蛋白。例如，成熟的干擾素t蛋白序列起始于干擾素t氨基酸全序列的殘基Cys24，相當于成熟蛋白序列的Cysl。當多核苷酸序列或片段具有與能夠分離出該多核苷酸序列或片段的序列或片段相同的核苷酸序列時，該多核苷酸序列或片段可以分離自另一個多核苷酸序列或片段。例如，如果插入物的多核苷酸序列與選擇的人類基因的多核苷酸序列相同，那么細菌質粒含有分離自所選擇的人類基因的插入物。同樣，當多肽序列或片段具有與能夠分離出該多肽序列或片段的序列或片段相同的氨基酸序列時，該多肽序列或片段可以分離自另一個多肽序列或片段。對于兩個氨基酸序列，百分率(％)同源性是指當對序列進行最佳比對并且沒有由于缺失而被罰分時，兩個氨基酸序列的殘基同源性的百分率。換句話說，如果需要在第一條序列中插入缺失從而與第二條序列進行最佳比對時，所述同源百分率僅僅通過與相應的氨基酸殘基配對的殘基進行計算(即，計算并不考慮第二條序列中位于第一條序列缺失位置的殘基)。最佳比對是指給出最高同源百分率分數的比對。相對較短的多肽的比對可以目測進行，或者可以使用"GENEWORKS"程序進行比對。選擇性地，可以使用敏感度(ktup)為1的局部比對程序LALIGN、缺省參數和缺省點突變模型(defaultPAM)進行比對。"保守取代"是指一種類型的氨基酸被同一類型的氨基酸所取代，所述類型由普通生理化學氨基酸側鏈特性以及自然界中發現的同源蛋白中較高的取代頻率所決定(由標準的頻率變換打分矩陣(Dayhofffrequencyexchangematrix)所決定)。氨基酸側鏈分為六種類型，包括I型(Cys)、II型(Ser、Thr、Pro、Ala、Gly)、III型(Asn、Asp、Gln、Glu)、IV型(His、Arg、Lys)、V型(Ile、Leu、Val、Met)和VI型(Phe、Tyr、Trp)。例如，Asp對另一種III型殘基如Asn、Gln或Glu的取代為保守取代。"非保守取代"是指一種類型的氨基酸被另一種類型的氨基酸所取代，例如，II型殘基Ala被III型殘基如Asp、Asn、Glu或Gin所取代。"類似物"是指通過如下方式得到的與分離的天然蛋白序列相關的多肽:對天然蛋白的N-末端和/或C-末端進行一個或多個氨基酸的缺失或插入；在天然多肽的一個或多個位點進行一個或多個氨基酸的缺失或插入；或者，在天然多肽的一個或多個位點進行一個或多個氨基酸的取代。例如，該類似物可以通過遺傳多態性或人工處理得到。所述人工處理的方法為本領域技術人員所公知。"融合"蛋白是指通過將第一個蛋白的至少一個鄰近(contiguous)部分連接至第二個不同的蛋白的至少一個鄰近部分而構建的蛋白。將融合蛋白類似物假定為天然蛋白，其中所述融合蛋白具有兩種不同干擾素的嵌合體序列。因此，在融合蛋白類似物中，在含有嵌合體的一個或兩個鄰近部分，一個或多個氨基酸殘基可以被替換、刪除或插入至該構成部分的天然序列中。術語"蛋白"和"多肽"可以互換使用，是指氨基酸聚合體而并不特指具有特定長度的氨基酸聚合體。例如，該術語還包括多肽的表達后的修飾，例如糖基化、乙酰化和磷酸化等。"共軛化合物"是指包括連接或結合有第二化合物的第一化合物的化合物。"增生性病變"是指特征在于快速產生新細胞的病變或疾病，包括但不限于腫瘤或癌癥。II、低毒、長循環人干擾素(X類似物一方面，提供了通過共價鍵與至少一種親水聚合物鏈結合的天然人干擾素a蛋白類似物。可以使用多種人干擾素ct蛋白類似物，在此部分將描述各種例子。在以下部分、部分III中，將對使這些天然人干擾素a類似物與親水聚合物共價結合的方法進行描述。A、干擾素a類似物蛋白在第一個示例性實施方式中，提供了一種天然人干擾素a蛋白的類似物，其中，該類似物的與天然干擾素a的殘基序列1-27相對應的氨基酸序列在位點19、20、22、24和27存在區別，前提是相對于位點22的氨基酸殘基為Ser、Thr、As、Gln或Gly不會使該類似物的序列不同于相對應的天然干擾素a。例如，在培養過程中分析人單核細胞或肝細胞時，與天然干擾素a相比，這種類似物的毒性較低。圖1顯示了成熟的人干擾素aD(GenBankAccessn.J00210,PIDg386796;SEQIDNO:9)和成熟的羊干擾素<SEQIDNO:26)的前27個N-末端氨基酸殘基，其中粗體顯示不一致的殘基。包括源自羊干擾素T的特定氨基酸替換的人干擾素aD類似物可以通過如美國專利No.6,204,022所描述的方法制得，該專利的全文在此一并引入作為參考。圖1還顯示了稱作IFNa-N0至IFNa-N7(SEQIDNO:11、13、15、17、19、21、23、25)的幾種人干擾素aD類似物的氨基酸殘基1-27。N-末端部分的氨基酸殘基1-27對應于如圖1所示的類似物片段并且蛋白剩余部分(氨基酸殘基28-166)對應于IFNaD的人干擾素a類似物蛋白在此表示為SEQIDNOs:10、12、14、16、18、20、22和24。這些干擾素a類似物在此均可預期使用，其中優選包括IFNa-N7類似物片段的蛋白類似物。使用如圖2所示的載體，這些類似物的制備在實施例1中進行了簡要的描述。更加詳細的制備方法在美國專利No.6,204,022中進行了描述。在美國專利No.6，204，022中還描述了這些類似物的體外細胞毒性檢測，表明氨基酸殘基位點19、20、22、24和27與降低成熟干擾素aD的細胞毒性有關。位點19、20、22、24和27中的一個或多個位點的氨基酸替換降低了細胞毒性，并保留了成熟的天然干擾素a的預期治療性能。在實施例IB中描述了另一種干擾素a類似物蛋白，其中，人干擾素a2b(SEQIDNO:49，AccessionNo.AAP20099)的氨基酸殘基位點19、20、22、24和27被修飾，從而在這些位點中含有相應的羊干擾素t殘基。該人干擾素a2b類似物蛋白在此定義為SEQIDNO:48。特別地，人干擾素a2b的以下氨基酸殘基進行了如下修飾A19—D，Q2Q—R，R22—N，I24—L和F27—H。更普遍的是，預期了基于各種干擾素a亞型的干擾素a類似物。所述天然干擾素a蛋白可以被修飾為包括一種或多種的以下替換以得到干擾素a類似物成熟人干擾素a的19位氨基酸可以被成熟羊干擾素t的19位Asp或者同類殘基Asn、Gin或Glu所替換；成熟人干擾素a的20位氨基酸可以被成熟羊干擾素t的20位Arg或者同類殘基His或Lys所替換;成熟人干擾素a的22位氨基酸可以被成熟羊干擾素t的22位Asn或者同類殘基Asp、Gin或Glu所替換；成熟人干擾素a的24位氨基酸可以被成熟羊干擾素t的24位Leu或者同類殘基Val或Met所替換；成熟人干擾素a的27位氨基酸可以被成熟羊干擾素T的27位His或者同類殘基Arg或Lys所替換。這種替換能夠有效的降低人干擾素a蛋白的毒性而并不顯著改變預期的治療性能。包括一些額外的示例性人干擾素a類似物蛋白的改變位點的其它示例性序列包括在此定義的序列SEQIDNO:2、SEQIDNO:4和SEQIDNO:6。最優選的實施方式為包括選自19-27位點中的一個或多個位點具有殘基替換的人干擾素a類似物。在另一實施方式中，提供了一種干擾素a類似物，其中，一種或多種氨基酸殘基(i)位于如圖1所示的殘基19-27的區域；(ii)殘基與成熟干擾素t(優選為成熟羊干擾素t)不同，該殘基被成熟干擾素t的殘基所替換。例如，其中成熟人干擾素a(SEQIDNO:l，SEQIDNO:49)的19-27位氨基酸被成熟羊干擾素t(SEQIDNO:2)的19-27位氨基酸所取代的類似物蛋白導致成熟的人干擾素a的位點19、20、22、24和27發生改變，而剩余的成熟人干擾素a序列保持不變。這些例子相對應的類似物在此被稱作IFNad-N7(SEQIDNO:24)和IFNa2b陽N7(SEQIDNO:48)。在另一實施方式中，所述人干擾素a類似物蛋白包括被人干擾素a位點19、20、22和27上的一個或多個氨基酸取代的非保守氨基酸殘基。所述取代包括但不限于III型氨基酸(特別是Asp)取代位點19的氨基酸；IV型氨基酸(特別是Arg)取代位點20的氨基酸；III型氨基酸(特別是Asn)取代位點22的氨基酸；IV型氨基酸(特別是His)取代位點27的氨基酸。在另一實施方式中，所述取代可以包括V型氨基酸(特別是Leu)取代位點24的氮基酸。示例性類似物包括成熟人干擾素a位點19-27之間的殘基序列被SEQIDNO:2所定義的9-mer所替換的取代。特別地，成熟人干擾素a位點19-27之間的殘基序列為SEQIDNO:l。所述SEQIDNO:2所定義的9-mer對應于成熟羊干擾素t的19-27位殘基，包括與人干擾素a位點19、20、22、24和27不同的殘基。在另一實施方式中，類似物包括成熟人干擾素a位點11-27之間的殘基序列被SEQIDNO:4所定義的17-mer所替換的取代。特別地，成熟人干擾素a位點11-27之間的殘基序列為SEQIDNO:3。所述SEQIDNO:4所定義的17-mer對應于成熟羊干擾素t的11-27位殘基，包括與人干擾素a位點ll、13、14、16、19、20、22、24和27不同的殘基。在另一實施方式中，類似物包括成熟人干擾素a位點6-27之間的殘基序列被SEQIDNO:6所定義的22-mer所替換的取代。特別地，成熟人干擾素a位點6-27之間的殘基序列為SEQIDNO:5。所述SEQIDNO:6所定義的22-mer對應于成熟羊干擾素t的6-27位殘基，包括與人干擾素a位點6、7、8、11、13、14、16、19、20、22、24和27不同的殘基。應當理解為，雖然所描述的低毒人干擾素a類似物為成熟蛋白，即它們起始于干擾素全序列的24位Cys殘基(相對于成熟蛋白的1位Cys);但是包括前導序列即起始于初始甲硫氨酸的干擾素a類似物也是適合的。所述人干擾素a類似物中的前導序列可以來自人干擾素a、羊干擾素t或其它I型干擾素。如上文所描述的，與天然的人干擾素T相比，這些人干擾素a類似物的毒性降低，并且在大多情況下可以具有與天然的人干擾素a相同的生物活性。B、干擾素a類似物蛋白融合或混合蛋白在另一實施方式中，被親水聚合物化學修飾的干擾素a蛋白為融合蛋白，該融合蛋白包括干擾素a蛋白和干擾素t蛋白。如即將進行描述的，干擾素a如IFNaD或IFNa2b的N-末端或-末端可以被源自IFNt的具有任意長度的氨基酸殘基鄰近片斷所修飾。將對幾種示例性實施方式進行詳細的描述，但是應當理解這些實施方式只是示例性的例子，對本領域技術人員而言，其它融合或混合蛋白也明顯可用。在此所用的術語融合或混合是指將第一蛋白的片段連接至第二蛋白的片段的意思。這些融合或混合蛋白落入更通用的術語干擾素a類似物蛋白的定義之內。設計了包括第一片段和第二片段的融合蛋白，該第一片段含有干擾素t蛋白的N-末端氨基酸序列，第二片段含有非干擾素t的I型干擾素多肽的C-末端氨基酸序列。這兩個片段連接于成熟干擾素多肽的約8位和37位殘基之間的部分。在另一普通實施方式中，這兩個片段連接于與成熟干擾素多肽的約8位和28位殘基之間相對應的部分。在另一普通實施方式中，這兩個片段連接于與成熟干擾素多肽的約8位和22位殘基之間相對應的部分。在另一普通實施方式中，這兩個片段連接于與成熟干擾素多肽的約8位和16位殘基之間相對應的部分。如在此一并引入作為參考的美國專利No.5，939，286所描述的，干擾素t的N-末端區域與干擾素t的毒性降低有關，因此，在融合或混合蛋白中使用干擾素t的N-末端區域引起了人們的極大關注。參考附圖3，由嵌合體核苷酸分子編碼的混合干擾素融合蛋白或多肽40具有N-末端42和C-末端44。所述融合蛋白由第一片段46(N-末端)和第二片段48(C-末端)構成。所述N-末端片段包括由嵌合體核苷酸分子的5'端片段編碼的干擾素t多肽的N-末端氨基酸序列。所述C-末端片段包括非干擾素t的I型干擾素多肽的C-末端氨基酸序列、和由嵌合體核苷酸分子的3'端片段編碼的干擾素t多肽的氨基酸序列。這兩個片段連接或拼接于與成熟干擾素多肽的8位和37位氨基酸殘基之間的部分相對應的作為連接區域的連接點50。值得注意的是，成熟的干擾素t多肽一般以半胱氨酸起始于全序列(包括前導序列并起始于甲硫氨酸)的第24位氨基酸。所述連接區域一般包括在干擾素t(SEQIDNO:45和SEQIDNO:46)多肽的N-末端的37個氨基酸中。幾種干擾素t、干擾素a和干擾素p克隆的成熟氨基酸序列在1-37位氨基酸之間的比對表明這些序列中最高程度的趨異性發生在接近于N-末端的位置。特別地，序列間最高程度的趨異性位于l-16位氨基酸之間，中等程度的趨異性位于17-28位氨基酸之間。不同的I型干擾素的29-37位氨基酸之間的區域相對保守。結合本領域技術人員所公知的功能分析方法(如抗病毒、抗增殖和細胞毒性分析)，可以通過使用與干擾素<1-37)的長鏈或短鏈區域相對應的多肽或編碼該多肽的DNA序列來鑒定最佳連接，即上游序列(朝N-末端或5'端)與干擾素t相對應并且下游序列(朝C-末端或3'端)與另一個干擾素如干擾素a或干擾素p相對應的氨基酸殘基位點。例如，含有干擾素T的1-28位氨基酸和源自非干擾素T的I型干擾素的剩余氨基酸的混合或嵌合體干擾素預期具有與干擾素T相關的低毒特性和與I型干擾素相關的正常生物活性。例如，IFNt/IFN(x融合混合干擾素可以降低IFNa的毒性但是不會影響IFNoc的抗病毒特性。可以選擇作為干擾素融合蛋白的前8-37個氨基酸的示例性序列包括與INFT的以下鄰近片段相對應的序列:1-8，1-9，1-10，1-11，1-12，1-13，1-14，1-15，1-16，1-18，l-i9，i-20，1-21，i-22，1-23，1-24，1-25，1-26，1-27，1-28，1-29，1-30，1-31，1-32，1-33，1-34，1-35，1-36和1-37。可以理解的是，這些鄰近的片段能夠被如保守氨基酸的替換所修飾，這也在此處考慮的融合蛋白的范圍之內。所述剩余序列(即，由嵌合體核苷酸分子的3'端片段編碼的"第二"C-末端片段的氨基酸序列)可以選自任何合適的非干擾素t的I型干擾素多肽，例如，干擾素a(例如，a-l或a-2)、干擾素(3、干擾素Q)、混合干擾素或組合干擾素(consensusinterferon)。非干擾素t的I型干擾素的序列為本領域技術人員所公知。組合干擾素的示例性序列為本領域技術人員所公知(美國專利No.4，897，47D。示例性的干擾素a的序列如歐洲專利No.88622、美國專利No.4，820，638、美國專利No.4，780，530和美國專利No.4,748,233所示。另外的干擾素a和卩的序列如Fish，E.N.，J.InterferonRes.12:257-266(1992)中所示。合適的序列還可以通過GenBank或其它公共序列存儲系統得到。3'端或C-末端片段起始的非干擾素t的I型干擾素的氨基酸殘基位點的檢測可以通過親本序列的最佳比對并進行連接來實現，從而使得到的嵌合體干擾素分子的序列與以下序列完全對齊(i)干擾素t親本序列的5'端或N-末端片段；禾叩i)非干擾素T的I型干擾素親本序列的3'端或C-末端片段。當然，所述親本序列就是指衍生出5'端或N-末端片段和3'端或C-末端片段的干擾素序列。一般地，3'端或C-末端片段起始的非干擾素t的I型干擾素t的殘基位點為隨著5'端或N-末端干擾素t片段的最后一位氨基酸殘基的位點。例如，在前10個氨基酸具有SEQIDNO:26所示的前10個氨基酸的序列的混合干擾素融合蛋白中，剩余的氨基酸可以具有成熟干擾素a(例如，Fish，Id所描述的IFN-aCom)除去其前IO個氨基酸后的序列。另一個例子為前28個氨基酸具有SEQIDNO:44所示的前28個氨基酸的序列，剩余的氨基酸具有天然的成熟干擾素如IFNaD(SEQIDN0:9)的序列。應當理解為，雖然所描述的干擾素融合蛋白為"成熟"蛋白，即它們起始于干擾素全序列的第24位殘基，但本發明還包括含有前導序列即起始于初始甲硫氨酸的融合蛋白和編碼該融合蛋白的嵌合體核苷酸分子。干擾素融合蛋白中的前導序列可以來自干擾素t或非干擾素t的I型干擾素。另外，應當理解為，第一和第二片段的序列均可以為"共有"序列。換句話說，5'片段的序列可以不與天然的干擾素t相對應，而與通過將對齊的序列和多種不同的干擾素t進行對比而得到的共有序列相對應。同樣，3'片段的序列可以不與天然的非干擾素t的I型干擾素相對應，而與通過將對齊的序列和多種不同的非干擾素t的I型干擾素進行對比而得到的共有序列相對應。選擇性地，每個片段的序列均可以與"內部一致(internally-consistent)"序列相對應，即，與其中各個位點含有在IFNt(N-末端片段)或非IFNt的I型IFN(C-末端片段)的至少一個自然生成的亞型的該位點上發現的殘基的序列相對應，而最終的序列既不與任何自然生成的亞型相對應也不與任何共有序列相對應。例如，如果長度為3個氨基酸的兩個亞型具有序列"CRS"和"CKG"，那么內部一致序列為"CRG"。此外，應當理解為，預期得到了復合嵌合體，例如含有一個以上的源自IFNt的不連續區域和/或一個以上的源自另一種適合干擾素的區域的嵌合體。例如，這種嵌合體出現在含有第二片段(C-末端)的非干擾素t的I型干擾素本身為混合干擾素的情況中，例如，由干擾素a和干擾素P形成的混合干擾素(美國專利No.4758428)，由干擾素a-l和a-2形成的混合干擾素(美國專利No.4892743)，或由干擾素a和co形成的混合干擾素(美國專利No.4917887)。嵌合體核酸分子可以合成得到或通過標準的分子生物學手冊和操作得到。通過使用標準的重組方法(例如，在DNA序列中設計限制位點，該限制位點不改變翻譯的氨基酸序列；消化質粒；將相關片段克隆到選擇的表達載體中)，將編碼親本多肽(由該兩個多肽的片段衍生出形成混合蛋白的兩個片段)的DNA序列在表達載體中彼此靠近地克隆。在另一個實施方式中，設想將包括源自干擾素t的C-末端區域和源自另一種干擾素的區域的混合干擾素蛋白用作通過親水聚合物修飾的蛋白。如在此一并引入作為參考的公開號為2003/0130486的美國專利申請所描述的，這種混合蛋白具有干擾素t的C-末端區域和源自非干擾素t的I型干擾素多肽(例如，IFN-(3和多種亞型的IFN-a)的N-末端部分。一個示例性的蛋白在此被定義為SEQIDNO:47。這種蛋白可以通過嵌合體核苷酸分子編碼得到或通過天然化學連接(nativechemicalligation)得到，該蛋白具有包括IFN-aD的位點1-163的氨基酸的N-末端和包括IFN-t的位點163-172的氨基酸的C-末端。所述N-末端片段包括可以由嵌合體核苷酸分子的5'端片段編碼的非i干擾素多肽的N-末端氨基酸序列。所述C-末端片段包括可以由嵌合體核苷酸分子的3'端片段編碼的干擾素t多肽的C-末端氨基酸序列。結合功能分析如抗病毒或細胞毒性分析，可以通過常規的方法使用與干擾素t(163-172)內部的或延伸出的長鏈或短鏈區域相對應的多肽或編碼該多肽的DNA序列，來鑒定其中上游序列與非t干擾素相對應并且下游序列與干擾素t相對應的最佳連接或氨基酸殘基位點。含有人干擾素-aD的1-166位氨基酸和干擾素t的后10個c-末端氨基酸的混合或嵌合體干擾素具有與干擾素t相關的較低的毒性以及與干擾素(x相關的生物活性或通常歸因于干擾素a的生物活性。例如，IFN-a/IFN-t混合干擾素降低了IFN-a的毒性，但并不影響甚至提高了IFN-a的抗病毒特性。優選的融合蛋白是其中N-末端片段的序列源自人干擾素-aD以及C-末端片段源自羊干擾素-t的蛋白。III.通過親水聚合物進行修飾的方法此部分描述了通過親水聚合物化合物來修飾上述蛋白的多種合成反應的路線。簡單地說，此部分所述的術語"干擾素a類似物蛋白"或"類似物蛋白"是指上述部分II中所描述的各種干擾素(x類似物蛋白，例如，具有確定的特殊殘基替換的干擾素a類似物，和具有替換其它蛋白的特定殘基或與其它蛋白結合的一種蛋白的鄰近片段或框的示例性融合蛋白或混合蛋白。在此描述的類似物蛋白可以通過將類似物蛋白與合成的或天然生成的聚合物、寡聚物、小分子或功能基團連接而進行修飾，從而生成非自然生成的結合物。各組分的結合可以通過如靜電結合力或范德華力在內的非共價鍵結合，但各組分之間優選通過共價鍵進行結合。如本領域技術人員所公知，由于共價鍵的結合力，共價鍵結合的優點在于更容易操作以及可以在各種化學環境使用而不被分解。用一種或多種分子對蛋白進行的共價修飾通常被稱為"共軛"，結合產物被稱為"修飾蛋白"。對類似物蛋白的修飾可以在該類似物蛋白的一個或多個官能團上進行。多個官能團暴露在干擾素a類似物蛋白的外部，并且這些基團能夠通過已知的方法容易地被功能化或轉化成可以被功能化的基團。修飾的數量和性質取決于該類似物蛋白的特殊性質和結構以及共軛產物的預期作用類型。另外，如果期望得到基本同源的產物，除了選擇位于共軛位點上類似物蛋白的官能團以外，修飾位點的選擇也是有益的，它將在很大程度上決定所用化學反應的類型。選擇性共軛的兩個相對便利的位點為類似物蛋白的N-末端和C-末端。在這兩個位點中，N-末端通常為更便利的選擇性修飾位點，因為在反應條件容易控制的情況下，含有羧酸的氨基酸側鏈具有與C-末端羧基相同的化學反應性；在N-末端氨基為活化狀態的情況下，賴氨酸殘基的氨基并不反應。存在的其它官能團(如半胱氨酸的巰基、或蘇氨酸的羥基)還提供了用于結合反應的位點。通過蛋白氨基酸序列的信息并輔助以顯示蛋白三維結構的晶體結構，能夠確定蛋白表面能夠用于結合的位點。關于在此描述的干擾素ct類似物蛋白，Radhakrishnan等公開了干擾素t的晶體結構并與干擾素a的結構進行了對比(J.Mol.Biol.,286:151-162(1999))。天然蛋白的晶體結構可以用于指導干擾素a類似物蛋白的位點特殊修飾。在制備修飾的干擾素a類似物蛋白的過程中，使用親水聚合物是特別有益的。親水聚合物能夠維持共軛化合物在水性體系如血液和漿液中的水溶性，且適用于治療應用。適合與類似物蛋白發生共軛結合的聚合物分子包括聚乙二醇(PEG)和普通的衍生物，例如，單甲氧基聚乙二醇(mPEG)、聚氧化乙烯(polyethyleneoxide，PEO)、聚乙烯醇、聚丙二醇、聚胺酸、聚乙烯吡咯垸酮、葡聚糖、多糖、纖維素以及纖維素衍生物(如羧甲基纖維素或羧乙基纖維素)、淀粉以及淀粉衍生物。優選的分子為聚乙二醇，因為它除了在分子量范圍內有效以外，在化學活化的和保護的形式中也是有效的。聚乙二醇被多次用于蛋白的共軛化合物，包括干擾素蛋白。公開文獻包括在此一并引入作為參考的美國專利No.5711944和美國專利No.5281698。干擾素-P共軛化合物公開于在此一并引入作為參考的美國專利No.6800735和美國專利No.6531122中。所述聚合物的分子量預期為100-500000道爾頓。所述聚合物的分子量更優選為1000-50000道爾頓。所用的分子量除了表示蛋白活性位點對共軛的聚合物的空間阻隔的敏感度以外，還可以表示每個共軛化合物的聚合物的官能數，以及共軛化合物預期的流體力學半徑。多分散性也是在選擇用于共軛化合物的聚合物時的一個考慮因素。較窄的多分散性表明聚合物的大小及分子量相對較為接近。使用較窄的多分散性將產生更加均一且同源的共軛產物。考慮使用直鏈的或支鏈的聚合物。支鏈的聚合物的優點在于使共軛化合物具有更好的空間體積以及尺寸，同時需要更少量的蛋白共軛位點。還應考慮選擇性位點的共軛反應。一個示例性位點為蛋白的N-末端修飾。在此一并引入作為參考的美國專利No.5985265中提供了一種在垸基化還原條件下使用聚乙二醇的共軛反應。在該方法中，每個蛋白均偶聯有一個聚合物。另外，還可以考慮使用支鏈的聚乙二醇化合物或其它親水聚合物。各種共軛化學方法均可以用于將聚乙二醇或聚乙二醇類衍生物偶聯至蛋白。以下方法為示例性的并且不以任何方式進行限制。也可以使用其它的方法，例如，Zalipsky,S等教導的方法(BiotechnologyandAppliedBiochemistry,15:100-114(1992))以及在美國專利No.5,985,265中公開的將聚乙二醇分子通過烷基化還原至蛋白N-末端的方法。在美國專利No.6638500中，通過使用鄰位吡啶基二硫化物作為活化劑，利用硫醇選擇性反應制得共軛化合物，在該共軛化合物中，聚合物連接至蛋白的半光氨酸部分。在另一個例子美國專利No.5362852中，通過將2-羥乙胺部分氧化從而產生醛基，隨后，該醛基基團與肼反應生成共軛化合物，從而在蛋白中原位生成官能團。其它的制備活化的聚乙二醇和聚乙二醇類衍生物的方法以及制備具有用于與該衍生物反應的官能團的蛋白的方法為本領域技術人員所公知，并且可以用于在此描述的干擾素a類似物蛋白的修飾。這些其它方法包括在此一并引入作為參考的以下專利中所提及的方法US2005/0014240和2004/0062746，WO2004/060300和WO2004/060299，和美國專利No.6,783,965。在此，研究所指的干擾素a類似物蛋白涉及干擾素a2b類似物(SEQIDNO:48)，該類似物被支鏈的聚(乙烯醇)通過如實施例1C中所描述的方法進行了修飾。該聚乙二醇-干擾素a2b-N7類似物蛋白具有如實施例2-7中所描述的體外和體內特征。IV.使用方法在此描述的修飾的干擾素a蛋白類似物可以用于治療由干擾素a或干擾素T治療后的各種情況的應答。這包括但不限制于選自由病毒感染、以細胞增生為特征的疾病、炎癥和自身免疫疾病所組成的組中的癥狀。在一優選實施方式中，所述修飾的干擾素a類似物蛋白被用于治療病毒感染，例如包括甲型肝炎、乙型肝炎和丙型肝炎在內的肝炎感染。在另一優選實施方式中，所述修飾的干擾素a類似物蛋白被用于進一步治療包括人乳頭瘤病毒、皰疹病毒和人免疫缺陷病毒在內的病毒感染。描述的實施例8和9研究了通過聚乙二醇修飾的干擾素a類似物蛋白，即PEG(40kDa)-IFNa2b-N7，來治療患有病毒感染的病人。在一優選實施方式中，所述聚合物修飾的干擾素(x類似物蛋白被用于治療人類患者的丙型肝炎病毒(HCV)感染。導致肝衰竭和肝細胞癌變危險增加的肝硬化是丙型肝炎病毒感染的重要病狀。慢性丙型肝炎到肝硬化的進程中的前兆性因素包括高水平的病毒血癥、男性、感染時年齡超過40歲、同時感染有HIV1和HBV、酒精攝入量高、和涉及的病毒的基因型。丙型肝炎病毒分為具有多個亞型的6個基因型中，在一實施方式中，嘗試使用聚合物修飾的干擾素a類似物蛋白來治療由于基因型2或基因型3引起的感染。因此，可以考慮使用對患有丙型肝炎的患者給藥聚合物修飾的干擾素a類似物蛋白來治療病毒感染或減少肝衰竭的進程的治療方法。在另一實施方式中，給藥聚合修飾的干擾素a類似物蛋白，從而持續地暴露于該類似物蛋白，以進行持續的病毒應答并根除丙型肝炎。如定義為在治療的前12-24周內病毒載量至少降低2-log的早期病毒應答被鑒定為應答的良好預測因子。在給藥的前12周內，通過顯示出肝酶的降低或丙型肝炎病毒載量至少降低2-bg，對聚合物修飾的干擾素a類似物蛋白的治療產生應答的丙型肝炎感染患者可以被確定為對治療產生應答的人群。例如，在治療起始后約2周內被證實降低量大于1.39loglO的病毒血癥應答的丙型肝炎患者對治療具有應答性。還可以考慮將聚合物修飾的干擾素a類似物蛋白用于治療細胞增殖疾病，例如，實體瘤。在另一個實施方式中，聚合物修飾的干擾素a類似物蛋白用于治療自身免疫癥狀，例如，多發性硬化癥、牛皮癬、眼色素層炎和口腔干燥-風濕性關節炎綜合癥等。所述聚合物修飾的干擾素a類似物蛋白可以根據已知的藥用組合物的制備方法進行配制。在先已描述了含有干擾素或干擾素類化合物的制劑(例如，Martin,E.W.，In:DISPENSINGOFMEDICATION:APRACTICALMANUALONTHEFORMULATIONANDDISPENSINGOFPHARMACEUTICALPRODUCTS(Hoover,J.E.,Ed.)，8thedition,MackPublishingCo.,Easton,PA.，(1976))。通常情況下，為了方便有效地給藥該組合物，該組合物將被制成制劑從而使有效量的修飾的干擾素a類似物與合適的載體相結合。這些治療中所用的組合物還可以為多種形式，但優選為適用于腸道外給藥的形式，例如，可注射的或可注入的溶液。適用于腸道外給藥的藥用組合物包括含有合適的緩沖液并選擇性地含有藥學上可接受的賦形劑、載體、漲度劑(tonicityagent)、防腐劑和表面活性劑的聚合物修飾的干擾素a類似物蛋白的制劑，其中，所述緩沖液的例子包括Tris-HCl、醋酸鹽或磷酸鹽如磷酸氫二鈉/磷酸二氫鈉緩沖液，所述藥學上可接受的賦形劑的例子包括蔗糖，所述載體的例子包括人類重組血漿白蛋白，所述漲度劑的例子包括氯化鈉，所述防腐劑的例子包括水楊乙汞(thimerosol)、甲酚或苯甲醇，所述表面活性劑的例子包括滅菌注射用水中的吐溫或聚山梨酸酯(polysorabates)。所述聚合物修飾的干擾素a類似物蛋白可以在冷凍條件下以冷凍粉末的形式儲存，然后再復原以供使用。選擇性地，含有所述聚合物修飾的干擾素(x蛋白類似物的水溶液可以儲存在預裝填的、多劑量注射器中，例如，用于傳輸藥品如胰島素的注射器。典型的適用的注射器包括由連接至筆型注射器(如諾和諾德公司的NovoletNovoPen)的預填裝管以及允許使用者自己注射的預填裝的筆型注射器所組成的系統。其它注射器系統包括由含有稀釋劑和位于單獨間隔內的冷干的聚合物修飾的干擾素ot蛋白類似物粉末組成的筆型注射器。所述修飾的蛋白的適宜劑量可以基于已知的成熟干擾素a的治療劑量，由熟練的藥劑師來決定。由于在此描述的干擾素a類似物具有較低的細胞毒性，因此可以考慮使用比成熟干擾素a的施用劑量更高的劑量。在一實施方式中，所述聚合物修飾的干擾素a類似物蛋白的腸道外劑量比目前認可的聚乙二醇化的干擾素(如PEGIntron⑧和Pegasys⑧)的推薦人體劑量至少高2倍，優選高3倍，更優選高5倍。例如，在治療丙型肝炎的過程中，聚乙二醇修飾的干擾素a的當前給藥劑量為每周180pg，而在此描述的聚合物修飾的干擾素a類似物蛋白的給藥劑量為每周360pg或540pg，優選為每周720嗎或更高。在一優選實施方式中，聚合物修飾的干擾素a類似物蛋白的給藥劑量為每周900|ig或每兩周900|ig，以更有效地使病人產生持續的病毒應答，并且具有比當前治療中認可的聚乙二醇修飾的干擾素a蛋白更低的毒性以及更好的耐受性。可以理解的是，較大的劑量的給藥頻率可以低于較小的劑量。在另一實施方式中，給藥劑量至少為每周約200)Lig或450ng、或者為每兩周約200嗎或450|ig。在一實施方式中，以能夠有效地獲得穩定狀態的該蛋白類似物的血漿濃度的劑量和頻率，對病人給藥聚合物修飾的干擾素a類似物蛋白。在這個實施方式中，該穩定狀態的血漿濃度對肝細胞不具有實際上的細胞毒性效應，例如，這種情況已經被體外研究所證實，通過使用選擇的濃度的聚合物修飾的干擾素Ol類似物蛋白對肝細胞進行選擇的階段的培養，通過評價肝細胞的代謝作為判斷毒性的指標，相似的研究在實施例5中進行了描述。當然，應該理解的是，在此描述的組合物可以與其它療法結合使用。例如，在治療慢性肝炎病毒感染中，所述聚合物修飾的干擾素a類似物蛋白可以與合成的核苷利巴韋林(syntheticnucleosideRibavirin)結合給藥。其它結合方式為本領域技術人員所公知。以下實施例實質上僅為說明的目的，而并不是以任何方式進行限制。實施例1干擾素a類似物和聚乙二醇化的干擾素a-N7的合成A、基于天然的人干擾素(xD的干擾素a蛋白類似物的制備在畢赤酵母(尸/c/n'"/^Mto^)中，通過用優化的密碼子首先回譯(backtranslate)包括位于前27個N-末端位點范圍內的15個干擾素t氨基酸替換的人干擾素a的氨基酸序列，構建編碼被命名為HuIFNa-NLV的人干擾素a蛋白類似物的合成基因。剪輯該核苷酸序列，使其含有得到位于構建體長度上的5個限制性酶切位點。該合成基因序列被分成4個核苷酸片段。通過寡核苷酸的順序連接而構建得到長度約150個堿基對的各個片段。將片段按照序列順序克隆到G2細菌載體中(OperonTechnologies,Alameda,CA)，得到編碼HuIFNa-N0(見圖l)的基因。然后，從細菌載體上切出該合成基因，并將該合成基因連接到用于在在畢赤酵母中表達的pPICZ-a載體(Invitrogen,SanDiegoCA)的Xhol/Notl位點上。構建的表達載體稱為pNLV，如圖2所示。編碼如圖1所示定義為HuIFNa-Nl、HuIFNa-N2、HuIFNa-N3、HuIFNa-N6和HuIFNcx-N7的類似物的合成基因可以通過順序連接寡核苷酸而構建得到。使用XbaI和BstEII對上述構建的pNLV進行消化，將退火的寡核苷酸接頭l(SEQIDNO:28)和接頭2(SEQIDNO:29)連接至這些位點，得到構建的中間載體。在此步驟中，去除了與HuIFNa-NO的N-末端片段相對應的核苷酸序列。通過順序連接寡核苷酸得到編碼IFNa-Nl、IFNa-N2、、IFNa-N3、IFNa-N6禾口、IFNa-N7的N-末端序列突變的核苷酸序列。使用Xhol和EcoRI對構建的中間載體進行消化，然后將核苷酸片段連接到中間構建體的XhoI/EcoRI位點，以在pPICZ-a載體中得到類似物HuIFNa-Nl、HuIFNa-N2、HuIFNa-N3、HuIFNa-N6和HuIFNa-N7。在SEQIDNO:30-43中給出了每個片段的正義鏈和反義鏈的核苷酸序列。為了表達重組的干擾素類似物，通過載體上的Xhol和Notl限制性內切酶位點，將各基因的編碼序列插入到pPICZ-a表達載體(Invitrogen，SanDiego，CA)上。pPICZ-a表達載體提供了便于重組干擾素表達和純化的多種條件。例如，該載體包括具有甲醇調節的醇氧化酶(AOX)啟動子的表達框(expressioncassette)。在甲醇生長的酵母細胞中，大約5%的polyA+RNA來自醇氧化酶l基因。另外，該載體還含有指引蛋白分泌到培養基中的源自釀酒酵母"flcc/7flramyc"cweWs/ae)a因子前序多肽的分泌信號序列。該載體還禾U用Shble基因(5^e/toa〃ote/c/2"s/n'm/wtom^ble基因)編碼的Zeocin抗生素來選擇重組細菌和酵母細胞。將編碼HuIFNa類似物的重組質粒電穿孔至大規模培養的X-33野生型畢赤酵母中。根據Invitrogen公司提供的程序對重組酵母克隆進行生長培養和誘導。收集上清液并使用0.8/0.2mm孔徑的acrodisc過濾器(GelmanSciences,AnnArbor，MI)對上清液進行過濾。濃縮所述上清液并用10mM的Tris、150mM的NaCl更換緩沖液，隨后使用CentriconPlus-20(MilliporeCorporation,Bedford,MA)將上清液濃縮至終體積2ml，然后在4。C溫度下裝載在HiPrepSephacryl26/60S-100高分辨率尺寸排除柱上(Pharmacia,Peapack，NewJersey)。大多數的HuIFNa類似物蛋白位于部分3。B、基于HuIFNa2b的類似物的制備使用類似的方法生成用于生成基于天然的人IFNa2b蛋白、HuIFNa2b的類似物的基因和表達載體。簡要地說，在畢赤酵母中，通過用優化的密碼子首先回譯包括位于殘基位點19、20、22、24和27的預期的干擾素a氨基酸替換的人干擾素a2b的氨基酸序列，構建編碼類似物rHuIFNa2b的基因，命名為NLVga2b。通過寡核苷酸的順序連接生成長度約150個堿基對的4個核苷酸片段。將片段按照序列順序克隆到G2細菌載體中(OperonTechnologies,Alameda，CA)，得到基因NLVga2b。利用與其它人干擾素a類似物相同的方法(實施例1A)表達并純化該基因。IFNa2b類似物在此是指IFNa2b-N7的序列，被定義為SEQIDNO:47。C、用聚(乙烯醇)對類似物進行修飾通過類似物和mPEG2-丁醛(NektarTherapeutics,SanCarlos,CA)之間的還原性氨基化作用，將如實施例IB所描述的方法制備的被定義為IFNa2b-N7(SEQIDNO:48)的類似物與40kDa的支鏈甲氧基聚乙二醇部分在N-末端半胱氨酸進行共軛連接。實施例2聚乙二醇化的IFNa2b-N7的體外抗病毒活性使用基于馬丁達比牛腎(MadinDarbybovinekidney,MDBK)細胞株和水泡性口膜炎病毒(VSV)作為攻擊病毒的分析方法，對IFNa2b-N7(SEQIDNO:48)和聚乙二醇(40kDa)-IFNa2b-N7(如實施例1C描述的方法制備的聚乙二醇修飾的SEQIDNO:48)的抗病毒活性(單位/毫升)進行檢測，并與0^-0121)(1他011八@)和商品名為Pegasys⑧的聚乙二醇化的IFNa2a產品的抗病毒活性進行比較。通過檢測該干擾素對MDBK細胞株抗VSV病毒的保護作用來評價干擾素的抗病毒性能。將稀釋的干擾素加入到鋪滿的MDBK單層細胞中，在96孔平板上培養，在加入攻擊病毒之前溫育18小時。在分析中，使用重組的人干擾素aA(BiosourceInternational,Camarillo，CA)作為標準的干擾素對照。分析稀釋后的各種干擾素樣品，得到50%的MDBK細胞受到保護而不被VSV病毒感染時的數值。通過下式計算保護百分率-(平均數(A45。-63Q檢測孔)一平均數(八45().63()病毒對照孔))X100平均數(A45Q-63()未處理的細胞對照孔)其中，A45o.63()為450-630nm處的吸光值。一個抗病毒單位定義為50%的保護。產物效價單位表示為單位/毫克(U/mg)。結果如表l所示。IFNa2b(IntronA)和IFNa2a-N7被證明具有相似的抗病毒性能，比活性約為109U/mg。從商品名為Pegasy^的聚乙二醇化的干擾素a產品和PEG(40kDa)-IFN-a2b-N7可以看出，在干擾素分子中添加40kDa的聚乙二醇部分，導致體外抗病毒比活性降低10倍。因此，MDBK/VSV抗病毒分析證明了PEG(40kDa)-IFN-a2b-N7的抗病毒活性與聚乙二醇化的干擾素a產品Pegasys⑧相當。業已證明，聚乙二醇化的干擾素產品的體外抗病毒活性比非聚乙二醇化的干擾素的抗病毒活性低。表1在由水泡性口膜炎病毒(VSV)攻擊的MadinDarby牛腎(MDBK)細胞株中，干擾素的抗病毒比活性的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>實施例3聚乙二醇化的IFNa2b-N7的體外抗增殖活性將根據實施例1C所描述的方法制備的PEG(40kDa)-IFNa2b-N7的體外抗增殖活性與商品名為Pegasy^的聚乙二醇化的IFNa產品的抗增殖活性進行比較。對代表主要腫瘤類型的7種人類腫瘤細胞株進行培養，并用干擾素進行處理。通過四唑鹽WST-1的減少來檢測細胞增殖的程度。將用干擾素處理后的WST-1的減少程度與未處理的對照細胞進行比較。結果如表2所示。PEG(40kDa)-IFNa2b-N7和Pegasys⑧在7種檢測細胞株中的抗增殖活性相似。表2干擾素在人類腫瘤細胞株中的抗增殖活性的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>a對代表性腫瘤細胞株施以lpg/ml量的干擾素，得到了相對于未處理的對照細胞的細胞株增殖平均百分數。未處理對照=100%，各種條件下的n二3;誤差為平均值的標準誤差(SEM)。實施例4聚乙二醇化的IFNa2b-N7的體外毒性通過檢測人類外周血單核細胞中的細胞調亡水平，進行IFNcx2b(Intron-A)、IFNa2b-N7(SEQIDNO:48)、PEG修飾的IFNa2b-N7和商品名為Pegasy^的聚乙二醇化的IFNa干擾素產品的毒性評價。人類外周血單核細胞分離自17個志愿者供體的血沉棕黃層。IFNa2b-N7(SEQIDNO:48)和Intron-A⑧的干擾素檢測濃度為0.01-lng/ml，PEG(40kDa)-IFNa2b-N7和Pegasy^的干擾素檢測濃度為0.025-9pg/ml。將人類外周血單核細胞在擾素的處理下以每孔1.5乂106個細胞的濃度于24孔板中進行培養。在培養的第12天，使用膜聯蛋白V和碘化吡啶對細胞進行染色，然后通過流式細胞計數法進行細胞調亡分析。通過誘導人類外周血單核細胞中的細胞調亡來檢測IFNa2b-N7(SEQIDNO:48)、PEG(40kDa)-IFNa2b-N7、Intron-A⑧和Pegasys⑧的毒性的相對水平，并與未處理對照進行對比，表示為比細胞死亡平均百分數(meanpercentspecificcelldeath)<=在人類外周血單核細胞中，通過干擾素濃度為每毫升培養基0.01-l.Opg的IFNa2b-N7(SEQIDNO:48)和lntronA⑧誘導的比細胞死亡平均百分數如圖4所示。結果說明，與11^011八@不同，在濃度為等于或低于0.025pg/ml時，IFNa2b-N7(SEQIDNO:48)對人類外周血單核細胞不具有明顯的毒性作用；而lntronA⑧在最低檢測濃度0.01jug/ml時，誘導40%的細胞調亡。濃度為0.025昭/ml的IFNa2b-N7(SEQIDNO:48)處理的人類外周血單核細胞培養中，未檢測到毒性；而濃度為0.025]iig/ml的IntronA⑧處理的培養中，檢測到細胞死亡的平均百分率為53%(p<0.001,T-檢驗)。在最高檢測濃度為lpg/ml時與IntronA⑧相比，IFNa2b-N7(SEQIDNO:48)的毒性顯著降低，比細胞死亡平均百分數為53%:71%(p=0.015，T-檢驗)。然而，對病人通過皮下或肌肉注射推薦劑量的IntronA后，IntronA的最大血漿濃度為約0.1-1.0ng/ml。在高于IntronA的推薦劑量500倍時，IFNa2b-N7(SEQIDNO:48)的毒性仍然低于IntronA在推薦劑量時的毒性。如圖4B所示，與IFNa2b-N7(SEQIDNO:48)比IntronA⑧的毒性低相一致，通過誘導細胞調亡檢測，證實了PEG修飾的IFNa2b-N7(SEQIDNO:48)的毒性比Pegasys⑧的毒性低。濃度為lpg/ml的PEG(40kDa)-IFNa2b-N7與對照相比，比細胞死亡平均百分數約為0;而濃度為lpg/ml的Pegasy^的與對照相比，比細胞死亡平均百分數為30%(p<0.001,T-檢驗)。在施以推薦劑量以后，Pegasys⑧的最大血漿濃度為約0.025pg/ml。當PEG(40kDa)-IFNa2b-N7的血漿濃度升至高于通過施以推薦劑量(180pg/劑量)的Pegasy^而得到的血漿濃度的10倍時，仍然未顯示出毒性。該研究的數據說明，通過誘導細胞調亡檢測，與商購的類似干擾素如IntronA和Pegasys⑧相比，PEG(40kDa)-IFNa2b-N7介導的毒性大幅度地降低。由于Pegasys②和，PEG(40kDa)-IFNa2b-N7均具有連接在天然干擾素分子上的40kDa的PEG部分，毒性特性的差異源自PEG(40kDa)-IFNct2b-N7分子中5個氨基酸的改變。數據說明了PEG(40kDa)-IFNa2b-N7的劑量比Pegasys^的推薦劑量高5倍。實施例5人類肝細胞中聚乙二醇化的IFNa2b-N7的體外毒性肝毒性是干擾素在治療丙型肝炎和癌癥治療中副作用的另一種潛在治療限制。病人的IFNa肝毒性與劑量水平有關，可以通過轉氨酶升高來進行檢測。業已進行了研究來評價肝細胞中IFNa和IFNa類似物的毒性。在基質膠96孔平板中培養原發性人類肝細胞，并用0.0001-1pg/ml的IFNa2b-N7(SEQIDNO:48)或lntronA②進行處理、以及0.010-10ng/ml的PEG(40kDa)-IFNa2b-N7或Pegasys⑧的肝細胞培養基進行處理。在培養的第7天，通過四唑鹽WST-1的減少作為干擾素介導的肝細胞毒性的標記來檢測細胞代謝的相對程度，并與未處理的對照細胞進行比較。結果如圖5A-5B所示。用IFNa2b-N7處理的原發性人類肝細胞在培養基濃度低于0.01pg/ml培養的第7天，未顯示出對細胞代謝的副作用。這與培養基濃度為0.01pg/ml的IntronA介導的肝細胞代謝降低相反(p=0.02，T-檢驗)。在干擾素濃度為0.1pg/ml和lpg/ml時，IFNa2b-N7處理的肝細胞的代謝分別降低了7.3%(+/-2.1SEM)和10.9%(+/-1.8SEM)。這與濃度為0.1嗎/1111的1他011八@對肝細胞具有明顯的副作用不同，IntronA使肝細胞代謝降低了18.3%(+/-2.71SEM)。在濃度為0.1pg/ml和lpg/ml時，IntronA的副作用比IFNcx2b畫N7的副作用高2倍(p=0.05,T-檢驗)。關于圖5B，在使用PEG(40kDa)-IFNa2b-N7和Pegasys處理原發性人肝細胞時，在濃度升至lpg/ml時并未顯示出毒副作用。值得注意的是，濃度為0.01pg/ml和l|ig/ml的干擾素以及濃度升至10pg/ml的PEG(40kDa)-IFNa2b-N7同等地介導對肝細胞的保護作用，在第7天與對照相比具有更高的代謝數值。然而，通過肝細胞代謝的降低，從2.5pg/ml(p<0.05，T-檢驗)和5ng/ml(p<0.002，T-檢驗)的40%至7.5pg/ml(p<1.3x10-5,T-檢驗)禾口10pg/ml(p<1x10—4,T-檢驗)的50%，清楚地顯示出高于lpg/ml的Pegasy^具有顯著的毒性。因此，研究結果清楚地顯示出，在原發性人類肝細胞中，與lntmnA⑧和Pegasys⑧相比，IFNa2b-N7和PEG(40kDa)-IFNa2b-N7均具有顯著降低毒性的性質。IntnmA在比IFNa2b-N7的水平低10倍時仍對肝細胞具有副作用(0.01|ig/ml:0.1pg/ml)，而任何檢測濃度的PEG(40kDa)-IFNa2b-N7均未顯示出對肝細胞的副作用。相反，Pegasy^在濃度等于和高于2.5pg/ml時對肝細胞具有明顯的毒性。實施例6聚乙二醇化的IFNa2b-N7的體內藥物動力學將如實施例1C所描述的方法制備的PEG(40kDa)-IFNa2b-N7以107U/Kg的單一劑量對小鼠進行皮下給藥后，檢測血漿內消減性質。在劑量為107U/Kg時，將PEG(40kDa)-IFNa2b-N7的血漿內消減曲線與聚乙二醇化的IFNaa產品Pegasy產的血漿內消減曲線進行對比，從而檢測吸收和消除的差異。另外，在每周多次或每兩周多次注射后，結束PEG(40kDa)-IFNa2b-N7的血漿濃度研究。使用無菌PBS將PEG(40kDa)-IFNa2b-N7和Pegasys⑧稀釋至合適的濃度，并在給藥的當天制得。對實驗動物進行稱重，并使用異氟烷進行輕微麻醉，然后對檢測動物施以107U/Kg劑量的s.c。每個時間點的每個檢測動物組的兩個小鼠，通過預設時間的二氧化碳窒息進行安樂死處理。在上述操作后短時間內采集心內血。將血液樣品以10,000的轉速離心3分鐘，然后收集血清。將血清樣品于-8(TC下進行儲存，直至進行分析。通過微軟Excel的線性曲線擬合程序(MicrosoftExcel，sLinearCurvingFittingProgram)對不同時期的消除率進行評估。每個線性調整曲線(linercurvefit)的斜率用于評價消除率(ng/mL/h)。使用BenderMedsystems公司的人干擾素aELISA試劑盒(CAT弁BMS216)對血清樣品進行分析。修改該方法以分析聚乙二醇化的干擾素。結果如表6所示。給藥后1小時(約10.26ng/mL)就可以檢測到PEG(40kDa)-IFNa2b-N7的準確的血清水平(方形)。最大血清濃度(約1000.00ng/mL)出現第24小時，此后干擾素濃度逐漸降低。評價的第24-72小時期間的消除率為約13.83ng/mL/hr，第72小時的血清濃度降低至約339.38ng/mL(約為血清濃度最大值的33.84%)。在t=72-216小時期間，消除率降低至2.27ng/mL/hr，在第168小時(第7天)時，血清濃度為79.98ng/mL(約為濃度最大值的7.97%)。在第264小時(第11天，約8ng/ml)和第384小時(第14天，約lng/ml,未顯示數據)仍能檢測到PEG(40kDa)-IFNa2b-N7的血清水平。在107U/Kg的PEG(40kDa)誦IFNa2b-N7的血清消除性質與107U/Kg的Pegasys(菱形，圖5)相似時，Pegasys⑧不能維持遠高于其推薦劑量所能達到的最大血清濃度的血清濃度，由于其毒性，推薦劑量比人等效劑量107U/Kg低5倍。實施例6聚乙二醇化的IFNa2b-N7的體內抗增殖活性使用用于人腎細胞癌的裸鼠異種移植模型來評價IFNa2b-N7(SEQIDNO:48)和PEG(40kDa)-IFNa2b-N7的抗癌效果(抗增殖)。在相同的研究條件下，將該抗癌效果與通過磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)或兩種商購IFNa產品IntronA和Pegasy^處理的移植模型的抗癌效果進行比較。在雌性裸鼠的右側腹部以5X106個細胞/200微升s.c的濃度移植腎癌細胞株(ACHN)。該腎癌細胞株(ATCCCRL-1611)分離自惡性腎腺癌。在異種移植當天開始進行處理。每周對小鼠施以PBS(10mL/kg)、PEG(40kDa)-IFNa2b-N7或Pegasys(106或l()7u/kg)—次。另外一批小鼠，每周對小鼠施以PBS(10mL/kg)、IFNa2b陽N7(SEQIDNO:48)或IntronA(106或l(^U/kg)三次。用數字測徑儀檢測腫瘤。每周對腫瘤進行2次檢測，以確定腫瘤體積和腫瘤的橢圓面積。異種移植后28天，殺死小鼠。記錄腫瘤體積和面積的正常變化以用于標準化數據以及降低極端數據偏差。用曲線下面200680030200.5說明書第35/38頁積(AUC)來比較處理效果。用變量分析(ANOVA)來確定處理作用的統計學顯著性(pS0.05)。變量分析后進行T-測試用兩樣品的假定方差不齊性(AssumingUnequalVariance)比較PBS處理的檢測動物的顯著性(p^O.05)。結果如表7A-7B所示。在移植后7天，所有組的平均腫瘤體積和面積分別為約200mm3和30mm2。在移植7天后，對腫瘤生長的藥效變的明顯。劑量為107U/kg的IFNa2b畫N7(SEQIDNO:48)、PEG(40kDa)-IFNa2b-N7和Pegasys顯著地抑制了腫瘤的生長。劑量為106U/kg的PEG(40kDa)-IFNa2b-N7和？6§&373@顯示出中等程度的抑制腫瘤生長的作用，但不具有統計顯著性。在移植后11-21天期間，每周三次通過IntronA⑧處理的動物顯示出一定水平的對腫瘤生長的抑制。然而，IntronA⑧處理21天的小鼠證明處理效果降低，與研究結尾階段通過PBS處理的動物的腫瘤體積和面積沒有顯著的區別，如圖7A所示。107U/kg的小鼠劑量轉換為840pg/dose的人體等效劑量，該人體等效劑量為Pegasys的人體推薦劑量(180pg/dose)的約5倍。由于毒性，Pegasys不能夠以如此高的濃度進行給藥；然而，這樣劑量的聚乙二醇化的IFNa2b-N7并不受到副作用的處理限制。實施例7聚乙二醇化的IFNa2b-N7的體內效力通過對用于人乳腺癌的裸鼠異種移植模型的抗腫瘤效力來檢測PEG(40kDa)-IFNa2b-N7的效力。在此模型中，還比較了PEG(40kDa)-IFNa2b-N7的每周和每兩周的給藥間隔。在雌性裸鼠的右側腹部以5X106個細胞/200微升SC的濃度，移植乳腺導管癌細胞株(HCC1954)。HCC1954細胞株(ATCCCRL-2338)分離自無淋巴結轉移的初始階段的浸潤性導管癌。在異種移植后4天開始處理。對檢測動物施以的PBS(10mL/kg)、107U/kg(每周或每兩周)的PEG(40kDa)-IFNa2b-N7，每兩周108U/kg的PEG(40kDa)-IFNa2b-N7。通過數字測徑儀檢測腫瘤。每周對腫瘤進行2次檢測，以確定腫瘤體積。腫瘤體積的幾何平均數用于標準化數據以及降低極端數據偏差。用微軟Excel的線性回歸曲線擬合程序來確定每條腫瘤生長曲線的線性生長率(斜率)。通過梯形法確定曲線下面積(AUC)，記錄正常轉換數據用于統計分析并比較處理效果。研究結束時(異種移植后28天)，對檢測動物實施安樂死。用變量分析(ANOVA)來確定處理作用的統計學顯著性(pS0.05)。變量分析后進行T-測試用兩樣品的假定方差不齊性(AssumingUnequalVariance)比較PBS處理的檢測動物的顯著性(p^O.05)結果如圖8A-8B所示。在異種移植后7天的首次檢測中觀察腫瘤體積的藥物處理效果。PBS(菱形，圖8A)、每周107U/kg的PEG(40kDa)-IFNa2b-N7、每兩周1()7u/kg的PEG(40kDa)-IFNa2b-N7(三角形)、以及每兩周108U/kg的PEG(40kDa)-IFNa2b-N7(圓形)處理的首次檢測的平均腫瘤體積分別為約144±15.00、122±14.00、103±7.33和110±15,41mm3。在使用PEG(40kDa)-IFNa2b-N7的所有劑量組和劑量間隔的研究中均觀察到具有顯著的腫瘤生長抑制作用。正如各個腫瘤生長曲線的斜率所確定的那樣，在處理0-18天期間內，每周107U/kg的PEG(40kDa)-IFNa2b-N7、每兩周107U/kg的PEG(40kDa)-IFNa2b-N7以及每兩周108U/kg的PEG(40kDa)-IFNa2b-N7處理的腫瘤生長率(分別為5.27、3.614和3.614毫米V天)稍微比PBS對照組(8.63毫米3/天)的緩慢。然而，在處理18-28天期間內，處理的檢測動物的腫瘤生長率與PBS處理相比顯著降低(每周107U/kg的PEG(40kDa)-IFNa2b-N7:7.3毫米3/天；每兩周107U/kg的PEG(40kDa)-IFNa2b-N7:12.67毫米3/天；每兩周108U/kg的PEG(40kDa)-麗a2b-N7:7.91毫米V天；和PBS:39.64毫米V天)。使用每周107U/kg的PEG(40kDa)-IFNa2b-N7;每兩周107U/kg的PEG(40kDa)-IFNa2b-N7;以及每兩周108U/kg的PEG(40kDa)-IFNa2b-N7處理的檢測動物的AUC分析表明與PBS處理相比在腫瘤生長上具有統計學上的顯著作用(分別為，38.85、47.07和61.27%的抑制率)。實施例8聚乙二醇化的IFNot2b-N7的體內病毒感染治療敘利亞金倉鼠(Syriangoldenhamster)對腦炎心肌炎病毒(EMCV)和單純皰疹病毒(HSV)感染非常敏感。因此，選擇EMCV和HSV對倉鼠進行攻擊研究，從而證明IFNas的體內抗病毒作用。敘利亞金倉鼠(雌性；鼠齡6-8周；重65-75g;CharlesRiverBreedingLaboratories)被注射有lx103PFU和3xl03PFU的EMCV(300pl)。在注射EMCV6小時之前，每個倉鼠注射如下劑量的IFNa2b-N7、PEG(40kDa)-IFNa2b-N7、rHulIFNa2b或PEG-HulIFNa2b:104U、105U、10611和10711;注射PBS作為對照。五個檢測組中，每個檢測組有5只倉鼠。在另一組檢測動物中，敘利亞金倉鼠(雌性；重65-75g;CharlesRiverBreedingLaboratories)接受300jul的HSV-2病毒接種，該病毒接種含有104TCID5Q/ml，將導致平均存活期為5天。在感染6或10小時后，施以單次劑量為105、106和1()7單位的IFNa2b-N7、PEG(40kDa)-IFNa2b-N7、rHuIFNa2b或PEG-HuIFNa2b。注射PBS作為對照。五個檢測組中，每個檢測組有10只倉鼠。通過每日的記錄確定感染后的倉鼠的存活時間。通過log-rankchi-square方法評價各個處理組之間存活時間差異的顯著性。通過PEG(40kDa)-IFNa2b-N7處理的檢測動物的存活時間比其它檢測動實施例9聚乙二醇化的IFNa-N7體內治療丙型肝炎將24名診斷為丙型肝炎的患者分為4個治療組。使用90pg的PEG(40kDa)-IFNa2b-N7治療組1中的患者；使用180pg的PEG(40kDa)-IFNa2b-N7治療組2中的患者；使用450嗎的PEG(40kDa)-IFNa2b-N7治療組3中的患者；使用90嗎的PEG(40kDa)-IFNa2b-N7治療組4中的患者。患者每周接受上述劑量，共4周。在檢測期間和處理后4周期間內，采集血樣并檢測作為治療丙型肝炎感染的生物標記的丙氨酸轉移酶。上面已經討論了多個示例性方面和實施方式，本領域技術人員能夠認同它的修改、替換、補充以及組合。應當理解為，在本發明的實質精神和范圍內，所附權利要求以及后續的權利要求應理解為包括所有的修改、替換、補充以及組合。權利要求1.一種組合物，該組合物含有與至少一種親水聚合物鏈共價結合的天然人干擾素α的蛋白類似物。2、根據權利要求1所述的組合物，其中，所述親水聚合物鏈為聚乙二醇。3、根據權利要求1所述的組合物，其中，所述蛋白類似物為天然人干擾素-a-d的蛋白類似物。4、根據權利要求3所述的組合物，其中，所述蛋白類似物的氨基酸序列在位點19、20、22、24和27中的一個或多個位點上與天然人干擾素-a-d的氨基酸序列不同。5、根據權利要求1所述的組合物，其中，所述蛋白類似物為天然人干擾素-a-2b的蛋白類似物。6、根據權利要求5所述的組合物，其中，所述親水聚合物鏈為聚乙二醇。7、根據權利要求6所述的組合物，其中，所述聚乙二醇為支鏈聚乙二醇。8、根據權利要求5所述的組合物，其中，所述蛋白類似物的氨基酸序列在位點19、20、22、24和27中的一個或多個位點上與天然人干擾素-a-2b的氨基酸序列不同。9、根據權利要求8所述的組合物，其中，所述蛋白類似物具有如SEQIDNO:48所示的序列。10、根據權利要求8所述的組合物，其中，所述親水聚合物鏈為聚乙二醇。11、根據權利要求IO所述的組合物，其中，所述聚乙二醇為支鏈聚乙二醇。12、一種治療病毒感染的方法，該方法包括以能夠有效地治療感染的給藥量，對患有病毒感染的患者使用與至少一種親水聚合物鏈共價結合的天然人干擾素a的蛋白類似物進行給藥。13、根據權利要求12所述的方法，其中，所述病毒感染選自由肝炎病毒感染、人乳頭瘤病毒感染、皰疹病毒感染和人免疫缺陷病毒感染所組成的組中。14、根據權利要求13所述的方法，其中，所述肝炎病毒感染為丙型肝炎病毒感染。15、根據權利要求13所述的方法，其中，所述肝炎病毒感染為乙型肝炎病毒感染。16、根據權利要求12所述的方法，其中，所述給藥包括腸道外給藥。17、根據權利要求12所述的方法，其中，所述給藥包括將所述蛋白類似物至少每周給藥一次。18、根據權利要求12所述的方法，其中，所述給藥包括每周至少給藥約200嗎的所述蛋白類似物。19、根據權利要求12所述的方法，其中，所述給藥包括使用天然人干擾素-ot-d的蛋白類似物進行給藥。20、根據權利要求12所述的方法，其中，所述給藥包括使用天然人干擾素-a-2b的蛋白類似物進行給藥。21、根據權利要求20所述的方法，其中，所述給藥包括使用具有如SEQIDNO:48所示序列的蛋白類似物進行給藥。22、根據權利要求12所述的方法，其中，所述給藥包括使用與聚乙二醇共價結合的蛋白類似物進行給藥。23、根據權利要求22所述的方法，其中，所述給藥包括使用與支鏈聚乙二醇共價結合的蛋白類似物進行給藥。24、一種治療增生性病變的方法，該方法包括以能夠有效地治療該病變的給藥量，對患有增生性病變的患者使用與至少一種親水聚合物鏈共價結合的天然人干擾素a的蛋白類似物進行給藥。25、根據權利要求24所述的方法，其中，所述增生性病變為腫瘤或癌癥。26、根據權利要求24所述的方法，其中，所述給藥包括腸道外給藥。27、根據權利要求24所述的方法，其中，所述給藥包括使用天然人干擾素-a-2b的蛋白類似物進行給藥。28、根據權利要求24所述的方法，其中，所述給藥包括使用與聚乙二醇共價結合的蛋白類似物進行給藥。29、根據權利要求28所述的方法，其中，所述給藥包括使用與支鏈聚乙二醇共價結合的蛋白類似物進行給藥。全文摘要公開了一種通過與至少一種親水聚合物部分如聚乙二醇鏈進行化學連接而修飾的干擾素α(IFNα)類似物蛋白。在一實施方式中，干擾素α類似物蛋白具有與天然干擾素α不同的氨基酸序列，其中，不同在于包括由大約1-27個殘基組成的N-末端區域的一個或多個氨基酸被選自與成熟干擾素τ(IFNτ)蛋白的氨基酸殘基相對應的一個或多個氨基酸替換。還公開了通過使用聚合物修飾的IFNα類似物蛋白治療病毒疾病或其它疾病的方法。文檔編號A61P31/12GK101257925SQ200680030200公開日2008年9月3日申請日期2006年6月20日優先權日2005年6月20日發明者L·H·維拉里特,劉治平申請人:派普根公司