Cd19抗體及其用途的制作方法

專利名稱：：Cd19抗體及其用途的制作方法CD19抗體及其用途相關申請的交叉參考本申請要求2005年6月20日提交的美國臨時專利申請No.60/692,531、2005年12月8日提交的美國臨時專利申請No.60/748,956和2006年6月6日提交的美國臨時專利申請No.60/804,083的權利；所有這些申請都全部引入本文作為參考。發明背景CD19是95kDa的膜受體，它在B細胞分化早期表達，并且繼續表達直到B細胞被觸發最終分化(Pezzutto等人(1987).J.Immunol.138:2793;Tedder等人(1994)Immunol.Today15:437)。CD19胞外域含有兩個被較小的潛在二硫鍵連接的結構域分隔開的C2型免疫球蛋白(IG)樣結構域。CD19胞質域在結構上是獨特的，但是在人、小鼠和豚鼠之間高度保守(Fujimoto等人，(1998)SeminImmunol.10:267)。CD19是在B淋巴細胞表面上發現的蛋白質復合物的一部分。該蛋白質復合物包含CD19、CD21(補體受體，2型)、CD81(TAPA-1)和CD225(Leu-13)(Fujimoto,同上)。CD19是B細胞中跨膜信號的一種重要調節劑。細胞表面CD19密度的增加或減少影響B細胞的發育和功能，導致疾病如自身免疫或低丙球蛋白血癥(Fujimoto,同上)。CD19復合物通過交聯兩種在B細胞膜上發現的分離的信號轉導復合物而在體內加強B細胞對抗原的應答。這兩種信號轉導復合物與膜IgM和CD19結合，通過不同的機制激活磷脂酶C(PLC)。CD19和B細胞受體交聯減少了激活PLC所需的IgM分子的數量(Fujimoto,同上；Ghetie,同前)。另夕卜，CD19作為Arc家族激酶擴增的特化的銜接蛋白質起作用(Hasegawa等人(2001)JImmunol167:3190)。已經顯示CD19結合既增強也抑制B細胞激活和增殖，這取決于發生的交聯的量(Tedder，同上)。CD19在90%以上的B細胞淋巴瘤上表達，并且預測其在體外和體內影響淋巴瘤的生長(Ghetie,同上)。已經產生的抗CD19抗體為鼠抗體。使用鼠抗體治療人類受試者的一個缺點是給病人施用后發生人抗小鼠(HAMA)應答。因此，需要更有效地治療和/或預防CD19介導的疾病的改善的治療性抗CD19抗體。發明概述本發明提供與CD19結合并且表現出許多所需特性的分離的單克隆抗體，特別是人單克隆抗體。這些特性包括與人CD19高親和力結合。也提供了使用本發明的抗體和組合物治療多種CD19介導的疾病的方法。在一個方面，本發明涉及一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分或片段，其中該抗體(a)以lxlO-7M或更低的Kd與人CD19結合；且(b)與Raji和DaudiB細胞腫瘤細胞結合。優選地，該抗體為人抗體，但是在替代實施方案中，該抗體也可以是鼠抗體、嵌合抗體或人源化抗體。在一個實施方案中，該抗體以5xlO-SM或更低的Kd與人CD19結合，以2xlO-8M或更低的Kd與人CD19結合，以1x10-8M或更低的Kd與人CD19結合，以5xlO-9M或更低的Kd與人CD19結合，以4xlO-9M或更低的Kd與人CD19結合，以3xlO-9M或更低的Kd與人CD19結合，或以2xlO-9M或更低的Kd與人CD19結合。在另一實施方案中，本發明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其中該抗體與參比抗體交叉竟爭結合CD19,其中該抗體(a)以lxlO-M或更低的Kd與人CD19結合；且(b)與Raji和DaudiB細胞腫瘤細胞結合。在多種實施方案中，所述參比抗體包括(a)包含SEQIDNO:1的氨基酸序列的重鏈可變區；和(b)包含SEQIDNO:8的氨基酸序列的輕鏈可變區；或所述參比抗體包括(a)包含SEQIDNO:l的氨基酸序列的重鏈可變區；和(b)包含SEQIDNO:9的氨基酸序列的輕鏈可變區；或所述參比抗體包括(a)包含SEQIDNO:2的氨基酸序列的重4連可變區；和(b)包含SEQIDNO:10的氨基酸序列的輕鏈可變區；或所述參比抗體包括(a)包含SEQIDNO:3的氨基酸序列的重鏈可變區；和(b)包含SEQIDNO:11的氨基酸序列的輕鏈可變區；或所述參比抗體包括(a)包含SEQIDNO:4的氨基酸序列的重鏈可變區；和(b)包含SEQIDNO:12的氨基酸序列的輕鏈可變區；或所述參比抗體包^l舌(a)包含SEQIDNO:5的氨基酸序列的重鏈可變區；和(b)包含SEQIDNO:13的氨基酸序列的輕鏈可變區；或所述參比抗體包括(a)包含SEQIDNO:6的氨基酸序列的重嗜連可變區；和(b)包含SEQIDNO:14的氨基酸序列的輕鏈可變區；或所述參比抗體包括(a)包含SEQIDNO:7的氨基酸序列的重《連可變區；和(b)包含SEQIDNO:15的氨基酸序列的輕鏈可變區。在另一方面，本發明涉及一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分或片段，其包含產自或源自人VH5-51基因的重鏈可變區，其中該抗體與CD19特異性結合。本發明也提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分或片段，其包含產自或源自人VHl-69基因的重鏈可變區，其中該抗體與CD19特異性結合。本發明還提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分或片段，其包含產自或源自人VKL18基因的輕鏈可變區，其中該抗體與CD19特異性結合。本發明進一步提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分或片段，其包含產自或源自人VKA27基因的輕鏈可變區，其中該抗體與CD19特異性結合。本發明甚至進一步提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分或片段，其包含產自或源自人VKL15基因的輕鏈可變區，其中該抗體與CD19特異性結合。在一個優選實施方案中，本發明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分或片段，其包含(a)人Vh5-51或l-69基因的重鏈可變區；和(b)人VKL18、A27或VKL15的輕鏈可變區；其中該抗體與CD19特異性結合。在另一方面，本發明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分或片革殳，其包括包含CDR1、CDR2和CDR3序列的重鏈可變區；和包含CDR1、CDR2和CDR3序列的輕鏈可變區，其中(a)重鏈可變區CDR3序列包含選自SEQIDNO:30、31、32、33、34、35和36的氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列；(b)輕鏈可變區CDR3序列包含選自SEQIDNO:51、52、53、54、55、56、57和58的氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列；(c)該抗體以lxl(T7M或更低的Kd與人CD19結合；(d)與Raji和DaudiB細胞腫瘤細胞處會z口口o優選地，重鏈可變區CDR2序列包含選自SEQIDNO:23、24、25、26、27、28和29的氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列；且輕鏈可變區CDR2序列包含選自SEQIDNO:44、45、46、47、48、49和50的氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列。優選地，重鏈可變區CDRl序列包含選自SEQIDNO:16、17、18、19、20、21和22的氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列；且輕鏈可變區CDR1序列包含選自SEQIDNO:37、38、39、40、41、42和43的氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列。一種優選的組合包括(a)包含SEQIDNO:16的重鏈可變區CDR1;(b)包含SEQIDNO:23的重鏈可變區CDR2;(c)包含SEQIDNO:30的重鏈可變區CDR3;(d)包含SEQIDNO:(e)包含SEQIDNO:(f)包含SEQIDNO:另一優選組合包括(a)包含SEQIDNO:(b)包含SEQIDNO:(c)包含SEQIDNO:(d)包含SEQIDNO:(e)包含SEQIDNO:(f)包含SEQIDNO:另一優選組合包括(a)包含SEQIDNO:(b)包含SEQIDNO:(c)包含SEQIDNO:(d)包含SEQIDNO:(e)包含SEQIDNO:(f)包含SEQIDNO:另一優選組合包括(a)包含SEQIDNO:(b)包含SEQIDNO:(c)包含SEQIDNO:(d)包含SEQIDNO:(e)包含SEQIDNO:(f)包含SEQIDNO:另一優選組合包括(a)包含SEQIDNO:(b)包含SEQIDNO:(c)包含SEQIDNO:(d)包含SEQIDNO:37的輕鏈可變區CDR1;44的輕鏈可變區CDR2;和51的輕鏈可變區CDR3。16的重鏈可變區CDR123的重鏈可變區CDR230的重鏈可變區CDR337的輕鏈可變區CDR144的輕鏈可變區CDR2:52的輕鏈可變區CDR3￡17的重鏈可變區CDR124的重鏈可變區CDR231的重鏈可變區CDR338的輕《連可變區CDR145的輕鏈可變區CDR253的輕鏈可變區CDR3,18的重鏈可變區CDR125的重鏈可變區CDR232的重鏈可變區CDR339的輕鏈可變區CDR146的輕鏈可變區CDR254的輕《連可變區CDR3,19的重鏈可變區CDR126的重鏈可變區CDR233的重《連可變區CDR340的輕《連可變區CDR1(e)包含SEQIDNO:(f)包含SEQIDNO:另一優選組合包括(a)包含SEQIDNO:(b)包含SEQIDNO:(c)包含SEQIDNO:(d)包含SEQIDNO:(e)包含SEQIDNO:(f)包含SEQIDNO:另一優選組合包括(a)包含SEQIDNO:(b)包含SEQIDNO:(c)包含SEQIDNO:(d)包含SEQIDNO:(e)包含SEQIDNO:(f)包含SEQIDNO:另一優選組合包括(a)包含SEQIDNO:(b)包含SEQIDNO:(c)包含SEQIDNO:(d)包含SEQIDNO:(e)包含SEQIDNO:(f)包含SEQIDNO:47的輕鏈可變區CDR2;55的輕《連可變區CDR3。20的重鏈可變區CDR127的重鏈可變區CDR234的重鏈可變區CDR341的輕《連可變區CDR148的輕《連可變區CDR2:56的輕《連可變區CDR3。21的重鏈可變區CDR128的重鏈可變區CDR235的重鏈可變區CDR342的輕鏈可變區CDR149的輕鏈可變區CDR257的輕鏈可變區CDR3,22的重鏈可變區CDR129的重《連可變區CDR236的重《連可變區CDR343的輕鏈可變區CDR150的輕《連可變區CDR2禾:口和和禾:口58的輕《連可變區CDR3。本發明的其他優選抗體或其抗原結合部分包括(a)包含選自SEQIDNO:1、2、3、4、5、6和7的氨基酸序列的重鏈可變區；和(b)包含選自SEQIDNO:8、9、10、11、12、13、14和15的氨基酸序列的輕鏈可變區；其中該抗體與CD19特異性結合。一種優選的組合包括(a)包含SEQIDNO:l的氨基酸序列的重鏈可變區；和(b)包含SEQIDNO:8的氨基酸序列的輕鏈可變區。另一優選組合包括(a)包含SEQIDNO:l的氨基酸序列的重鏈可變區；和(b)包含SEQIDNO:9的氨基酸序列的輕鏈可變區。另一優選組合包括(a)包含SEQIDNO:2的氨基酸序列的重鏈可變區；和(b)包含SEQIDNO:10的氨基酸序列的輕鏈可變區。另一優選組合包括(a)包含SEQIDNO:3的氨基酸序列的重鏈可變區；和(b)包含SEQIDNO:11的氨基酸序列的輕鏈可變區。另一優選組合包括(a)包含SEQIDNO:4的氨基酸序列的重鏈可變區；和(b)包含SEQIDNO:12的氨基酸序列的輕鏈可變區。另一優選組合包括(a)包含SEQIDNO:5的氨基酸序列的重鏈可變區；和(b)包含SEQIDNO:13的氨基酸序列的輕鏈可變區。另一優選組合包括(a)包含SEQIDNO:6的氨基酸序列的重鏈可變區；和(b)包含SEQIDNO:14的氨基酸序列的輕鏈可變區。另一優選組合包括(a)包含SEQIDNO:7的氨基酸序列的重鏈可變區；和(b)包含SEQIDNO:15的氨基酸序列的輕鏈可變區。在本發明的另一方面，提供了與上述任意抗體竟爭結合CD19的抗體或其抗原結合部分或片段。本發明的抗體可以是，例如，如IgGl或IgG4同種型的全長抗體。或者，這些抗體可以是抗體片段，如Fab、Fab，或Fab'2片,殳，或單鏈抗體。本發明也提供一種免疫偶聯物，其包含與諸如細胞毒素或放射性同位素等治療劑連接的本發明的抗體或其抗原結合部分或片段。本發明也提供一種雙特異性分子，其包含與第二功能部分連接的本發明的抗體或其抗原結合部分或片段，該第二功能部分具有與該抗體或其抗原結合部分不同的結合特異性。物或雙特異性分子和藥學上可接受的載體的組合物。原結合部分或片段的核酸分子，以及包含這些核酸的表達載體，和包含這些表達載體的宿主細月包。本發明的其他特征和優點通過下面的詳述和實施例將是顯而易見的，該詳述和實施例不應理解為限制性的。貫穿本申請中引用的所有參考文獻、Genbank項、專利和公布的專利申請的內容均在此處特別引入作為參考。圖1A顯示21D4和21D4a人單克隆抗體重鏈可變區的核苷酸序列(SEQIDNO:59)和氨基酸序列(SEQIDNO:1)。勾畫出了CDR1(SEQIDNO:16)、CDR2(SEQIDNO:23)和CDR3(SEQIDNO:30)區，并指出了V、D和J的種系來源。圖1B顯示21D4人單克隆抗體輕鏈可變區的核苷酸序列(SEQIDNO:66)和氨基酸序列(SEQIDNO:8)。勾畫出了CDRl(SEQIDNO:37)、CDR2(SEQIDNO:44)和CDR3(SEQIDNO:51)區,并指出了V和J的種系來源。圖1C顯示21D4a人單克隆抗體輕鏈可變區的核苷酸序列(SEQIDNO:67)和氨基酸序列(SEQIDNO:9)。勾畫出了CDRl(SEQIDNO:37)、CDR2(SEQIDNO:44)和CDR3(SEQIDNO:52)區，并指出了V和J的種系來源。圖2A顯示47G4人單克隆抗體重鏈可變區的核苷酸序列(SEQIDNO:60)和氨基酸序列(SEQIDNO:2)。勾畫出了CDRl(SEQIDNO:17)、CDR2(SEQIDNO:24)和CDR3(SEQIDNO:31)區，并指出了V、D和J的種系來源。圖2B顯示47G4人單克隆抗體輕鏈可變區的核苷酸序列(SEQIDNO:68)和氨基酸序列(SEQIDNO:10)。勾畫出了CDRl(SEQIDNO:38)、CDR2(SEQIDNO:45)和CDR3(SEQIDNO:53)區，并指出了V和J的種系來源。圖3A顯示27F3人單克隆抗體重鏈可變區的核苷酸序列(SEQIDNO:61)和氨基酸序列(SEQIDNO:3)。勾畫出了CDR1(SEQIDNO:18)、CDR2(SEQIDNO:25)和CDR3(SEQIDNO:32)區,并指出了V、D和J的種系來源。圖3B顯示27F3人單克隆抗體輕鏈可變區的核苷酸序列(SEQIDNO:69)和氨基酸序列(SEQIDNO:11)。勾畫出了CDR1(SEQIDNO:39)、CDR2(SEQIDNO:46)和CDR3(SEQIDNO:54)區，并指出了V和J的種系來源。圖4A顯示3C10人單克隆抗體重鏈可變區的核苦酸序列(SEQIDNO:62)和氨基酸序列(SEQIDNO:4)。勾畫出了CDR1(SEQIDNO:19)、CDR2(SEQIDNO:26)和CDR3(SEQIDNO:33)區，并指出了V、D和J的種系來源。圖4B顯示3C10人單克隆抗體輕鏈可變區的核普酸序列(SEQIDNO:70)和氨基酸序列(SEQIDNO:12)。勾畫出了CDR1(SEQIDNO:40)、CDR2(SEQIDNO:47)和CDR3(SEQIDNO:55)區，并指出了V和J的種系來源。圖5A顯示5G7人單克隆抗體重鏈可變區的核苷酸序列(SEQIDNO:63)和氨基酸序列(SEQIDNO:5)。勾畫出了CDR1(SEQIDNO:20)、CDR2(SEQIDNO:27)和CDR3(SEQIDNO:34)區,并指出了V、D和J的種系來源。圖5B顯示5G7人單克隆抗體輕鏈可變區的核苷酸序列(SEQIDNO:71)和氨基酸序列(SEQIDNO:13)。勾畫出了CDR1(SEQIDNO:41)、CDR2(SEQIDNO:48)和CDR3(SEQIDNO:56)區,并指出了V和J的種系來源。圖6A顯示13F1人單克隆抗體重鏈可變區的核苷酸序列(SEQIDNO:64)和氨基酸序列(SEQIDNO:6)。勾畫出了CDR1(SEQIDNO:21)、CDR2(SEQIDNO:28)和CDR3(SEQIDN〇35)區，并指出了V、D和J的種系來源。圖6B顯示13F1人單克隆抗體輕鏈可變區的核苷酸序列(SEQIDNO:72)和氨基酸序列(SEQIDNO:14)。勾畫出了CDR1(SEQIDNO:42)、CDR2(SEQIDN0:49)和CDR3(SEQIDNO:57)區,并指出了V和J的種系來源。圖7A顯示46E8人單克隆抗體重鏈可變區的核苷酸序列(SEQIDNO:65)和氨基酸序列(SEQIDNO:7)。勾畫出了CDR1(SEQIDNO:22)、CDR2(SEQIDNO:29)和CDR3(SEQIDNO:36)區,并指出了V、D和J的種系來源。圖7B顯示46E8人單克隆抗體輕鏈可變區的核苷酸序列(SEQIDNO:73)和氨基酸序列(SEQIDNO:15)。勾畫出了CDR1(SEQIDNO:43)、CDR2(SEQIDNO:50)和CDR3(SEQIDNO:58)區,并指出了V和J的種系來源。圖8顯示21D4(SEQIDNO:l)和21D4a(SEQIDNO:1)的重4連可變區氨基酸序列與人種系VH5-51氨基酸序列(SEQIDNO:74)的比對。JH4b種系公開為SEQIDNO:80。圖9顯示47G4的重鏈可變區氨基酸序列(SEQIDNO:2)與人種系VHl-69氨基酸序列(SEQIDNO:75)的比對。JH5b種系公開為SEQIDNO:81。圖10顯示27F3的重鏈可變區氨基酸序列(SEQIDNO:3)與人種系VH5-51氨基酸序列(SEQIDNO:74)的比對。JH6b種系公開為SEQIDNO:82。圖11顯示3C10的重鏈可變區氨基酸序列(SEQIDNO:4)與人種系VHl-69氨基酸序列(SEQIDNO:75)的比對。JH6b種系公開為SEQIDNO:82。圖12顯示5G7的重鏈可變區氨基酸序列(SEQIDNO:5)與人種系VH5-51氨基酸序列(SEQIDNO:74)的比對。JH6b種系公開為SEQIDNO:83。圖13顯示13F1的重鏈可變區氨基酸序列(SEQIDNO:6)與人種系VH5-51氨基酸序列(SEQIDNO:74)的比對。JH6b種系公開為SEQIDNO:82。圖14顯示46E8的重鏈可變區氨基酸序列(SEQIDNO:7)與人種系VH5-51氨基酸序列(SEQIDNO:74)的比對。JH6b種系公開為SEQIDNO:82。圖15顯示21D4的輕鏈可變區氨基酸序列(SEQIDNO:8)與人種系VjcL18氨基酸序列(SEQIDNO:76)的比對。JK2種系公開為SEQIDNO:84。圖16顯示21D4a的輕鏈可變區氨基酸序列(SEQIDNO:9)與人種系VKL18氨基酸序列(SEQIDNO:76)的比對。JK3種系公開為SEQIDNO:85。圖17顯示47G4的輕鏈可變區氨基酸序列(SEQIDNO:IO)與人種系VKA27氨基酸序列(SEQIDNO:77)的比對。JK3種系公開為SEQIDNO:85。圖18顯示27F3的輕鏈可變區氨基酸序列(SEQIDNO:ll)與人種系VKL18氨基酸序列(SEQIDNO:76)的比對。JK2種系公開為SEQIDNO:84。圖19顯示3C10的輕鏈可變區氨基酸序列(SEQIDNO:12)與人種系VjcL15氨基酸序列(SEQIDNO:78)的比對。JK2種系公開為SEQIDNO:84。圖20顯示5G7的輕鏈可變區氨基酸序列(SEQIDNO:13)與人種系VKL18氨基酸序列(SEQIDNO:76)的比對。JK1種系公開為SEQIDNO:86。圖21顯示13F1的輕鏈可變區氨基酸序列(SEQIDNO:14)與人種系VKL18氨基酸序列(SEQIDNO:76)的比對。JK2種系公開為SEQIDNO:87。圖22顯示46E8的輕鏈可變區氨基酸序列(SEQIDNO:15)與人種系VKL18氨基酸序列(SEQIDNO:76)的比對。JK2種系公開為SEQIDNO:87。圖23顯示證明抗人CD19的人單克隆抗體47G4與人CD19特異性結合的實驗結果。圖24顯示證明抗CD19的人單克隆抗體在Raji細胞上竟爭結合的實驗結果。圖25A-D顯示流式細胞實驗結果，該結果證明抗人CD19的人單克隆抗體21D4、21D4a、47G4、3C10、5G7和13F1與B細胞肺瘤細胞系的細胞表面結合。(A)人CD19轉染的CHO細胞上的HuMAb21D4和47G4的流式細胞分析。(B)RajiB肺瘤細胞上的HuMAb47G4的流式細胞分析。(C)RajiB胂瘤細胞上的HuMAb21D4和47G4的流式細胞分析。(D)RajiB腫瘤細胞上的HuMAb21D4、21D4a、3C10、5G7和13F1的流式細胞分析。圖26A-B顯示內化實驗結果，通過3H胸苷釋放試驗，證明抗人CD19的人單克隆抗體21D4和47G4進入CH0-CD19和表達CD19的RajiB腫瘤細胞。(A)HuMAb47G4向CHO-CD19細胞中內化。(B)HuMAb21D4和47G4向RajiB腫瘤細胞中內化。圖27顯示胸苷摻入測定結果，該結果證明抗人CD19的人單克隆抗體殺死RajiB細胞腫瘤細胞。圖28顯示Ramos系統模型中小鼠存活率的Kaplan-Meier圖。圖29顯示Ramos系統模型中小鼠的體重變化。圖30A-B顯示體內小鼠腫瘤模型研究結果，該結果證明用棵抗CD19抗體21D4治療在體內對淋巴瘤具有直接的抑制作用。(A)ARH-77腫瘤，(B)Raji肺瘤。圖31顯示抗體依賴性細胞毒性(ADCC)測定的結果，該結果證明非巖藻糖基化的人單克隆抗CD19抗體以ADCC依賴的方式對人白血病細胞具有提高的細胞毒性。圖32顯示體內小鼠肺瘤模型研究結果，該結果證明毒素偶聯的抗CD19抗體減少了肝瘤體積。圖33顯示Raji腫瘤模型研究中小鼠的體重變化。圖34顯示食蟹猴研究的結果，顯示在巖藻糖基化或非巖藻糖基化抗CD19HuMAb處理后CD20+細胞群體減少。圖35顯示用巖藻糖基化或非巖藻糖基化抗CD19HuMAb處理后個體食蟹猴的結果。圖36A-C顯示胸苷摻入測定的結果，該結果證明單獨的或與毒素偶聯的抗人CD19的人單克隆抗體殺死Raji和SU-DHL-6B細胞腫瘤細胞。發明詳述本發明涉及以高親和力特異性結合CD19的分離的單克隆抗體，特別是人單克隆抗體。在某些實施方案中，本發明的抗體源自特定重鏈和輕鏈種系序列，和/或包含特定結構特征，如包含特定氨基酸序列的CDR區。本發明提供分離的抗體、制備該抗體的方法、含有該抗體的免疫偶聯物和雙特異性分子、和含有本發明的抗體、免疫偶聯物或雙特異性分子的藥物組合物。本發明還涉及使用該抗體的方法，例如用于檢測CD19,以及治療與CD19表達有關的疾病，如表達CD19的B細胞惡性肺瘤。因此，本發明也提供使用本發明的抗-CD19抗體治療B細胞惡性胂瘤的方法，例如治療非何杰金氏淋巴瘤、慢性淋巴細胞性白血病、濾泡性淋巴瘤、B系彌散性大細胞淋巴瘤和多發性骨髓瘤。為了使本發明更容易理解，首先定義了一些術語。其他的定義在發明詳述內容中說明。術語"CD19"是指，例如，人CD19的變體、同種型和物種同源物。因此，本發明的人抗體在某些情況下可與來自人類以外物種的CD19交叉反應。在某些實施方案中，該抗體對于一種或多種人CD19蛋白可能是完全特異性的，并且可能不表現出物種或其他類型的非人交叉反應性。人CD19—個實例的完整氨基酸序列的Genbank登錄號為NM—001770(SEQIDNO:79)。術語"免疫應答"是指例如淋巴細胞、抗原呈遞細胞、吞噬細胞、和補體)的作用，其導致選擇性損傷、破壞或從人體中清除侵入的病原體、被病原體感染的細胞或組織、癌細胞，或(在自身免疫或病理性炎癥的情況下)正常人細胞或組織。"信號轉導途徑"是指在信號從一個細胞的一部分向一個細胞的另一部分傳送中起作用的多種信號轉導分子之間的生化關系。本文使用的短語"細胞表面受體，，包括，例如，能夠接收信號和跨過細胞質膜傳播這種信號的分子和分子復合物。本發明的"細胞表面受體"的一個例子是CD19受體。這里提到的術語"抗體"包括完整抗體及其任何抗原結合片段(即"抗原結合部分")或單鏈。"抗體"是指包含通過二硫鍵互相連接在一起的至少兩條重(H)鏈和兩條輕(L)鏈的糖蛋白，或其抗原結合部分。每條重鏈由重鏈可變區(在此縮寫為VH)和重鏈恒定區組成。重鏈恒定區由三個結枸域Ch、Ch2和Ch3組成。每條輕鏈由輕《連可變區(在此縮寫為VL)和輕鏈恒定區組成。輕鏈恒定區由一個結構域QJ且成。Vh和VL區可進一步再分為高變區，稱為互補決定區(CDR),CDR散布在被稱為構架區(FR)的更加保守的區域中。每個Vh和Vl均由三個CDR和四個FR組成，它們從氨基端向羧基端以如下順序排列FR1,CDR1,FR2，CDR2,FR3,CDR3,FR4。重《連和輕鏈的可變區含有可與抗原相互作用的結合結構域。抗體的恒定區可以介導免疫球蛋白與宿主組織或因子的結合，該宿主組織或因子包括免疫系統的各種細胞(例如效應細胞)和經典補體系統的第一成分(C1q)。本文所用的術語抗體的"抗原結合部分"(或簡稱為"抗體部分")是指保留與抗原(例如CD19)特異性結合的能力的抗體的一個或多個片段。已證明抗體的抗原結合功能可由全長抗體的片段來行使。術語抗體的"抗原結合部分"中所包括的結合片段的例子包括(i)Fab片段，即由Vl、Vh、Cl和CH,結構域組成的單價片段；(ii)F(ab，)2片段，即包含在鉸鏈區處通過二硫鍵連接的兩個Fab片段的雙價片段；(iii)Fab，片段，基本是具有鉸鏈區部分的Fab(參見FUNDAMENTALIMMUNOLOGY,Pauled.，第三版1993);(iv)由VH和Cm結構域組成的Fd片段；(v)由抗體單臂的Vl和VH結構域組成的Fv片段；(vi)由VH結構域組成的dAb片段(Ward等(1989)Nature341:544-546);(vii)分離的互補決定區(CDR)和(viii)納米抗體(nanobody)，即含有單鏈可變域和兩個恒定域的重鏈可變區。此外，盡管Fv片段的兩個結構域Vl和VH由單獨的基因編碼，但是它們可以利用重組方法通過合成連接體連接在一起，該連接體使它們能夠制成一條蛋白質鏈，其中Vl和VH區配對構成單價分子(稱為單鏈Fv(scFv);參見，例如Bird等(1988)Science242:423-426;和Huston等(198S)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883)。這種單鏈抗體也包括在術語抗體的"抗原結合部分"內。這些抗體片段用本領域技術人員公知的常規技術獲得，并用與完整抗體相同的方法對這些片段的實用性進行篩選。本文使用的"分離的抗體"是指基本不含具有不同抗原特異性的其他抗體的抗體(例如，與CD19特異性結合的分離的抗體基本不含與除CD19以外的抗原特異性結合的抗體)。但是，與CD19特異性結合的分離的抗體與諸如來自其他物種的CD19分子等其他抗原可能具有交叉反應性。而且，分離的抗體可基本不含其他細胞材料和/或化學物質。本文使用的術語"單克隆抗體"或"單克隆抗體組合物"是指單一分子組成的抗體分子的制劑。單克隆抗體組合物表現出對特定表位的單一結合特異性和親和性。本文使用的術語"人抗體，，包括具有如下可變區的抗體，在該可變區中，構架區和CDR區都源自人種系免疫球蛋白序列。而且，如果該抗體含有恒定區，則恒定區也源自人種系免疫球蛋白序列。本發明的人抗體可包含并非由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如，通過體外隨機或位點特異性誘變或通過體內體細胞突變引入的突變)。但是，本文使用的術語"人抗體"不包括其中源自另一哺乳動物種如小鼠的種系的CDR序列已被移植到人構架序列上的抗體。術語"人單克隆抗體"是指表現單一結合特異性的抗體，其具有其中構架區和CDR區均源自人種系免疫球蛋白序列的可變區。在一個實施方案中，人單克隆抗體由雜交瘤產生，該雜交瘤包括與無限增殖化細胞融合的B細胞，該B細胞從具有含人重鏈轉基因和輕鏈轉基因的基因組的轉基因非人動物(例如轉基因小鼠)中獲得。本文使用的術語"重組人抗體"包括通過重組方法制備、表達、產生或分離的所有人抗體，例如(a)從對于人免疫球蛋白基因的轉基因或轉染色體動物(例如小鼠)或由其制備的雜交瘤(下文進一步描述)中分離的抗體，(b)從經轉化表達人抗體的宿主細胞如轉染瘤中分離的抗體，(c)從重組組合人抗體文庫中分離的抗體，和(d)通過包括將人免疫球蛋白基因序列剪接為其他DNA序列的任何其他方法制備、表達、產生或分離的抗體。這些重組人抗體具有其中構架區和CDR區均源自人種系免疫球蛋白序列的可變區。但是在某些實施方案中，這些重組人抗體可以經歷體外誘變(或者，當使用人Ig序列的轉基因動物時，經歷體內體細胞誘變)，因此重組抗體的Vh和Vl^區的氨基酸序列盡管是源自人種系VH和VL序列并與之相關的序列，但可能不是在體內天然存在于人抗體種系的所有組成成分(repertoire)中。本文使用的術語"同種型"是指由重鏈恒定區基因編碼的抗體類別(例如IgM或IgGl)。短語"識別抗原的抗體"和"抗原特異性抗體"在此與術語"與抗原特異性結合的抗體"可互換使用。術語"人抗體衍生物"是指人抗體的任何修飾形式，例如抗體和其它試劑或抗體的偶聯物。術語"人源化抗體，，是指其中來源于另外一種哺乳動物種如小鼠的種系的CDR序列已經被移植到人構架序列上的抗體。在人構架序列內也可以進行其它的構架區修飾。術語"嵌合抗體"是指其中可變區序列來源于一個物種而恒定區序列來源于另一個物種的抗體，例如其中可變區序列來源于小鼠抗體而恒定區序列來源于人抗體的抗體。本文使用的術語"與人CD19特異性結合，，的抗體是指以lxl(T7M或更低、更優選5xl0—8M或更低、更優選3xl(T8M或更低、更優選Ixl0—8M或更低、甚至更優選5xl0力M或更低的Kd與人CD19結合的抗體。本文使用的術語"K^。c"或"Ka"是指特定抗體-抗原相互作用的結合速率，而本文使用的術語"Kdis"或"Kd"是指特定抗體-抗原相互作用的解離速率。本文使用的術語"KD"是指解離常數，它是由Kd與Ka的比值獲得的(即Kd/Ka),并且表示為摩爾濃度(M)。抗體的Ko值可能用本領域建立的方法測定。測定抗體KD的一種優選方法是使用表面等離振子共振法，優選使用生物傳感器系統，如81&00^@系統。本文使用的術語IgG抗體的"高親和力"是指抗體對于靶抗原的K。為lxlO〃M或更低、更優選5xlO"M或更低、甚至更優選lxlO'9M或更低、甚至更優選5xlO力M或更低。但是對于其他抗體同種型來說，"高親和力"結合可能不同。例如，對于IgM同種型來說，"高親和力"結合是指抗體具有10—6M或更低、更優選10々M或更低、甚至更優選10』M或更低的KD。本文使用的術語"受試者，，包括任何人或非人類動物。術語"非人類動物，，包括所有脊稚動物，例如哺乳動物和非哺乳動物，如非人靈長類動物、綿羊、狗、貓、馬、牛、雞、兩棲類動物、爬行類動物等。抗-CD19抗體本發明的抗體的特征在于抗體的特定功能特征或特性。例如，這些抗體與人CD19特異性結合。優選地，本發明的抗體以高親和力與CD19結合，例如Ko為lxl(T7M或更低。本發明的抗-CD19抗體優選地表現出以下一種或多種特性(a)以lxlO-7M或更低的Kd與人CD19結合；(b)與Raji和DaudiB細胞腫瘤細胞結合。優選地，該抗體以5xl(T8M或更低的Kd與人CD19結合，以1x10—Sm或更低的Kd與人CD19結合，以5xlO力m或更低的Kd與人CD19結合，以4xlO力M或更低的K。與人CD19結合，以3xl(T9M或更低的Kd與人CD19結合，或以2xlO力M或更低的Kd與人CD19結合，或以lxlO力M或更低的Ko與人CD19結合。評價抗體對CD19的結合能力的標準試驗在本領域中是公知的，包括，例如ELISA、Western印跡分析、RIA和流式細胞分析。合適的試驗在實施例中詳細描述。抗體的結合動力學(例如結合親和力)也可以通過本領域公知的標準試驗(如Scatchard或Biacore⑧系統分析)來評價。為了評價與Raji或DaudiB細胞腫瘤細胞的結合，Raji(ATCC保藏號CCL-86)或Daudi(ATCC保藏號CCL-213)細胞可以從公開來源獲得，如美國典型培養物保藏中心，并且在標準試驗如流式細胞分析中使用。單克隆抗體21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、13F1和46E8本發明優選的抗體是如實施例16、17、18、19、20、21和22所述分離并進行結構表征的人單克隆抗體21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、13F1和46E8。21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、13F1和46E8的VH氨基酸序列分別顯示在SEQIDNO:1、1、2、3、4、5、6和7中。21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、13F1和46E8的VL氨基酸序列分別顯示在SEQIDNO:8、9、10、11、12、13、14和15中。假定這些抗體中的每一個都能夠與CD19結合，則Vh和Vl序列可以"混合并匹配"，從而產生本發明的其他的抗-CD19結合分子。CD19與這些"混合并匹配的，，抗體的結合可以用上文及實施例中所述的結合試驗(例如ELISA)檢測。優選地，當Vh和VL鏈混合并匹配時，來自特定VH/Vi配對的VH序列被替換為結構上相似的VH序列。同樣，優選地，來自特定Vh/Vl配封的VL序列被替換為結構上相似的Vl序列。因此，在一個方面，本發明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其包括(a)包含選自SEQIDNO:1、2、3、4、5、6和7的氨基酸序列的重鏈可變區；和(b)包含選自SEQIDNO:8、9、10、11、12、13、14和15的氨基酸序列的輕鏈可變區；其中該抗體與CD19、優選與人CD19特異性結合。優選的重鏈和輕鏈組合包括(a)包含SEQIDNO:1的氨基酸序列的重鏈可變區；和(b)包含SEQIDNO:8的氨基酸序列的輕鏈可變區；或(a)包含SEQIDNO:1的氨基酸序列的重鏈可變區；和(b)包含SEQIDNO:9的氨基酸序列的輕鏈可變區；或(a)包含SEQIDNO:2的氨基酸序列的重鏈可變區；和(b)包含SEQIDNO:10的氨基酸序列的輕鏈可變區；或(a)包含SEQIDNO:3的氨基酸序列的重鏈可變區；和(b)包含SEQIDNO:11的氨基酸序列的輕鏈可變區；或(a)包含SEQIDNO:4的氨基酸序列的重鏈可變區；和(b)包含SEQIDNO:12的氨基酸序列的輕鏈可變區；或(a)包含SEQIDNO:5的氨基酸序列的重鏈可變區;和(b)包含SEQIDNO:13的氨基酸序列的輕鏈可變區；或(a)包含SEQIDNO:6的氨基酸序列的重鏈可變區；和(b)包含SEQIDNO:14的氨基酸序列的輕鏈可變區；或(a)包含SEQIDNO:7的氨基酸序列的重鏈可變區；和(b)包含SEQIDNO:15的氨基酸序列的輕鏈可變區。在另一方面，本發明提供包含21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、13F1和46E8的重鏈和輕鏈CDR1、CDR2和CDR3或其組合的抗體。21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、13F1和46E8的VHCDR1的氨基酸序列示于SEQIDNO:16、17、18、19、20、21和22中。21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、13F1和46E8的VHCDR2的氨基酸序列示于SEQIDNO:23、24、25、26、27、28和29中。21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、13F1和46E8的VHCDR3的氨基酸序列示于SEQIDNO:30、31、32、33、34、35和36中。21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、13F1和46E8的VKCDR1的氨基酸序列示于SEQIDNO:37、38、39、40、41、42和43中。21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、13F1和46E8的VKCDR2的氨基酸序列示于SEQIDNO:44、45、46、47、48、49和50中。21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、13F1和46E8的VKCDR3的氨基酸序列示于SEQIDNO:51、52、53、54、55、56、57和58中。CDR區用Kabat系統(Kabat，E.A.等人(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第五版，U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIH出版號91-3242)勾畫出。假如這些抗體均能與CD19結合，并且抗原結合特異性主要是由CDR1、2和3區才是供的，則VHCDR1、CDR2和CDR3序列與VKCDR1、CDR2和CDR3序列可以"混合并匹配"(即來自不同抗體的CDR可以混合并匹配，但是每個抗體必須含有VHCDR1、CDR2和CDR3和VkCDR1、CDR2和CDR3)，從而產生本發明的其他的抗-CD19結合分子。CD19與這些"混合并匹配的"抗體的結合可以用上文及實施例中所述的結合試驗(例如ELISA，81&00^@分析)一企測。優選地，當VHCDR序列混合并匹配時，來自特定VH序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列被替換為結構上相似的CDR序列。同樣，當VKCDR序列混合并匹配時，來自特定VK序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列優選地被替換為結構上相似的CDR序列。對于本領域技術人員而言顯而易見的是，通過將一個或多個Vh和/或VlCDR區序列替換為來自此處公開的單克隆抗體21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、13F1和46E8的CDR序列的結構上相似的序列，可以產生新的Vh和Vl序列。因此，在另一個方面，本發明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其包括(a)包含選自SEQIDNO:16、17、18、19、20、21和22的氨基酸序列的重鏈可變區CDR1;(b)包含選自SEQIDNO:23、24、25、26、27、28和29的氨基酸序列的重鏈可變區CDR2;(c)包含選自SEQIDNO:30、31、32、33、34、35和36的氨基酸序列的重鏈可變區CDR3;(d)包含選自SEQIDNO:37、38、39、40、41、42和43的氨基酸序列的輕《連可變區CDR1;(e)包含選自SEQIDNO:44、45、46、47、48、49和50的氨基酸序列的輕鏈可變區CDR2;和(f)包含選自SEQIDNO:51、52、53、54、55、56、57和58的氨基酸序列的輕鏈可變區CDR3;其中該抗體與CD19、優選與人CD19特異性結合。在一個優選實施方案中，該抗體包括(a)包含SEQIDNO:16的重鏈可變區CDR1;(b)包含SEQIDNO:23的重鏈可變區CDR2;(c)包含SEQIDNO:30的重鏈可變區CDR3;(d)包含SEQIDNO:37的輕《連可變區CDR1;(e)包含SEQIDNO:44的輕鏈可變區CDR2;和(f)包含SEQIDNO:51的輕《連可變區CDR3。在另一優選實施方案中，該抗體包括(a)包含SEQIDNO:16的重《連可變區CDR1;(b)包含SEQIDNO:23的重《連可變區CDR2;(c)包含SEQIDNO:30的重鏈可變區CDR3;(d)包含SEQIDNO:37的輕者連可變區CDR1;(e)包含SEQIDNO:44的輕《連可變區CDR2;和(f)包含SEQIDNO:52的輕《連可變區CDR3。在另一優選實施方案中，該抗體包括(a)包含SEQIDNO:17的重鏈可變區CDR1;(b)包含SEQIDNO:24的重鏈可變區CDR2;(c)包含SEQIDNO:31的重《連可變區CDR3;(d)包含SEQIDNO:38的輕鏈可變區CDR1;(e)包含SEQIDNO:45的輕4連可變區CDR2;和(f)包含SEQIDNO:53的輕鏈可變區CDR3在另一優選實施方案中，該抗體包括(a)包含SEQIDNO:18的重鏈可變區CDR1(b)包含SEQIDNO:25的重鏈可變區CDR2(c)包含SEQIDNO:32的重鏈可變區CDR3(d)包含SEQIDNO:39的輕鏈可變區CDR1(e)包含SEQIDNO:46的輕鏈可變區CDR2(f)包含SEQIDNO:54的輕鏈可變區CDR3在另一優選實施方案中，該抗體包:^舌(a)包含SEQIDNO:19的重鏈可變區CDR1(b)包含SEQIDNO:26的重鏈可變區CDR2(c)包含SEQIDNO:33的重《連可變區CDR3(d)包含SEQIDNO:40的輕鏈可變區CDR1(e)包含SEQIDNO:47的輕鏈可變區CDR2(f)包含SEQIDNO:55的輕鏈可變區CDR3(在另一優選實施方案中，該抗體包括(a)包含SEQIDNO:20的重鏈可變區CDR1(b)包含SEQIDNO:27的重鏈可變區CDR2(c)包含SEQIDNO:34的重鏈可變區CDR3(d)包含SEQIDNO:41的輕鏈可變區CDR1(e)包含SEQIDNO:48的輕鏈可變區CDR2(f)包含SEQIDNO:56的輕鏈可變區CDR3(在另一優選實施方案中，該抗體包括(a)包含SEQIDNO:21的重鏈可變區CDR1(b)包含SEQIDNO:28的重鏈可變區CDR2(c)包含SEQIDNO:35的重鏈可變區CDR3:(d)包含SEQIDNO:42的輕鏈可變區CDR1(e)包含SEQIDNO:49的輕鏈可變區CDR2(f)包含SEQIDNO:57的輕鏈可變區CDR3:在另一優選實施方案中，該抗體包括(a)包含SEQIDNO:22的重鏈可變區CDR1;(b)包含SEQIDNO:29的重鏈可變區CDR2;(c)包含SEQIDNO:36的重鏈可變區CDR3;(d)包含SEQIDNO:43的輕鏈可變區CDR1;(e)包含SEQIDNO:50的輕鏈可變區CDR2;和(f)包含SEQIDNO:58的輕鏈可變區CDR3。本領域公知，不依賴于CDR1和/或CDR2域，單獨的CDR3域即可以決定抗體對于同源抗原的結合特異性，并且基于共同的CDR3序列可以預測性地產生具有相同結合特異性的多種抗體。參見，例如，Klimka等人，5〃7/WJ.o/Omcw83(2):252隱260(2000)(描述了僅使用鼠抗-CD30抗體Ki-4的重鏈可變域CDR3產生人源化抗-CD30抗體)；Beiboer等人，Mo/歷o/.296:833-849(2000)(描述了僅使用親本鼠MOC-31抗-EGP-2抗體的重鏈CDR3序列產生重組上皮糖蛋白-2(EGP-2)抗體)；Rader等人，Prac.TV"".爿cac/.t/.S.A95:8910-8915(1998)(描述了使用鼠抗整聯蛋白0^(33抗體LM609的重纟連和輕鏈可變CDR3域的一組人源化抗整聯蛋白otvP3抗體，其中每個成員抗體在CDR3域之外含有不同的序列，并且能夠與親本鼠抗體結合相同的表位，其親和力與親本鼠抗體一樣高或更高)；Barbas等人，J.^w.C/7em.5*oc.116:2161-2162(1994)(公開了CDR3域對抗原結合提供了最重要的貢獻)；Barbas等人，尸rac，TV""./7.Si92:2529-2533(1995)(描述了三種抗人胎盤DNA的Fab(SI-1，SI-40和SI-32)的重鏈CDR3序列向抗破傷風類毒素Fab的重鏈上的移植，由此替換了存在的重鏈CDR3，并且證明單獨的CDR3提供結合特異性)；和Ditzel等人，/mmw"o/.157:739-749(1996)(描述了移植研究，其中僅向單特異性IgG破傷風類毒素結合Fabp313抗體轉移親本多特異性FabLNA3的重鏈CDR3足以保留親本Fab的結合特異性)。上述每一參考文獻都全文引入作為參考。因此，本發明提供了包含一個或多個來自人或非人動物來源的抗體的重鏈和/或輕鏈CDR3域的單克隆抗體，其中該單克隆抗體能夠特異性結合CD19。在某些方面，本發明提供包含一個或多個來自非人抗體如小鼠或大鼠抗體的重鏈和/或輕鏈CDR3域的單克隆抗體，其中該單克隆抗體能夠特異性結合CD19。在某些實施方案中，這些本發明的包含一個或多個來自非人抗體的重鏈和/或輕鏈CDR3域的抗體與相應的親本非人抗體(a)能夠竟爭結合；(b)保留功能特性；(c)結合相同的表位；和/或(d)具有類似的結合親和力。在其他方面，本發明提供包含一個或多個來自人抗體(如從非人動物獲得的人抗體)的重鏈和/或輕鏈CDR3域的單克隆抗體，其中該人抗體能夠特異性結合CD19。在其他方面，本發明提供包含一個或多個來自第一人抗體(如從非人動物獲得的人抗體)的重鏈和/或輕鏈CDR3域的單克隆抗體，其中該第一人抗體能夠特異性結合CD19，并且其中來自該第一人抗體的CD3域代替了缺乏對CD19的結合特異性的人抗體中的CDR3域，從而產生能夠特異性結合CD19的第二人抗體。在某些實施方案中，這些本發明的包含一個或多個來自第一人抗體的重鏈和/或輕鏈CDR3域的抗體與相應的親本第一人抗體(a)能夠竟爭結合；(b)保留功能特性；(c)結合相同的表位；和/或(d)具有類似的結合親和力。具有特定種系序列的抗體在某些實施方案中，本發明的抗體包含來自特定種系重鏈免疫球蛋白基因的重鏈可變區和/或來自特定種系輕鏈免疫球蛋白基因的輕鏈可變區。例如，在一個優選實施方案中，本發明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其包含產自或源自人VH5-51基因的重鏈可變區，其中該抗體與CD19特異性結合。在另一優選實施方案中，本發明提供提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其包含產自或源自人VHl-69基因的重鏈可變區，其中該抗體與CD19特異性結合。在另一優選實施方案中，本發明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其包含產自或源自人VKL18基因的輕鏈可變區，其中該抗體與CD19特異性結合。在另一優選實施方案中，本發明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其包含產自或源自人VKA27基因的輕鏈可變區，其中該抗體與CD19特異性結合。在另一優選實施方案中，本發明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其包含產自或源自人VKL15基因的輕鏈可變區，其中該抗體與CD19特異性結合。在另一優選實施方案中，本發明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其中該抗體(a)包含產自或源自人VH5-51或VHl-69基因(該基因分別編碼SEQIDNO:74和75所示的氨基酸序列)的重鏈可變區；(b)包含產自或源自人VKL18、VkA27或VKL15基因(該基因分別編碼SEQIDNO:76、77和78所示的氨基酸序列)的輕鏈可變區；且(c)與CD19、優選與人CD19特異性結合。分別具有VH5-51和VkL18的Vh和Vk的抗體的例子是21D4、21D4a、27F3、5G7、13F1和46E8。分別具有Vhl-69和VkA27的Vh和Vk的抗體的一個例子是47G4。分別具有Vhl-69和VkL15的Vh和Vk的抗體的一個例子是3C10。在本文中，如果一種人抗體的可變區是從使用人種系免疫球蛋白基因的系統中獲得的，則該人抗體包含"產自"或"源自"特定種系序列的重鏈或輕鏈可變區。這樣的系統包括用目標抗原免疫攜帶人免疫球蛋白基因的轉基因小鼠，或者用目標抗原篩查展示在噬菌體上的人免疫球蛋白基因文庫。"產自，，或"源自，，人種系免疫球蛋白序列的人抗體可以這樣鑒定將該人抗體的氨基酸序列與人種系免疫球蛋白的氨基酸序列進行比較，選擇在序列上最接近于該人抗體序列(即有最高％同一性)的人種系免疫球蛋白序列。"產自，，或"源自，，特定人種系免疫球蛋白序列的人抗體與該種系序列相比可能包含氨基酸差異，例如由于天然發生的體細胞突變或定點突變的有意引入而導致的氨基酸差異。但是，選擇的人抗體在氨基酸序列上與人種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列一般至少90%相同，并且含有當與其他物種的種系免疫球蛋白氨基酸序列(例如鼠種系序列)相比較時確認該人抗體屬于人類抗體的氨基酸殘基。在某些情況下，人抗體在氨基酸序列上與該種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列可以至少95%、或者甚至至少96%、97%、98%或99%相同。一般來說，源自特定人種系序列的人抗體表現與該人種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列有不超過10個氨基酸的差異。在某些情況下，該人抗體可能表現與該種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列有不超過5個、或者甚至不超過4、3、2或1個氨基酸的差異。同源抗體在另一實施方案中，本發明的抗體包含的重鏈和輕鏈可變區含有與此處所述優選抗體的氨基酸序列同源的氨基酸序列，并且其中該抗體保留了本發明抗—CD19抗體的所需功能特性。例如，本發明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其包含重《連可變區和輕鏈可變區，其中(a)重鏈可變區包含與選自SEQIDNO:1、2、3、4、5、6和7的氨基酸序列至少80%同源的氨基酸序列；(b)輕鏈可變區包含與選自SEQIDNO:8、9、10、11、12、13、14和15的氨基酸序列至少80%同源的氨基酸序列；(c)該抗體以lxl(y7]VI或更低的Kd與人CD19結合；(d)與Raji和DaudiB細胞腫瘤細胞結合。在各種實施方案中，該抗體可以是，例如人抗體、人源化抗體或嵌合抗體。在另外一些實施方案中，Vh和/或VL氨基酸序列可以與上述序列85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同源。具有與上述序列的Vh和Vl區高度(即80%或更高)同源的Vh和Vl區的抗體可以如下獲得誘變(例如定點誘變或PCR介導的誘變)編碼SEQIDNO:59、60、61,62、63、64、65、66、61、68、69、70、71、72或73的核酸分子，然后用此處所述的功能試驗檢測編碼的被改變抗體的保留的功能(即以上(C)到(d)所述的功能)。本文使用的兩個氨基酸序列之間的百分同源性等同于兩個序列之間的百分同一性。考慮為了兩個序列之間進行最佳比對所需要引入的空位的數目和每個空位的長度后，兩個序列之間的百分同一性是這兩個序列共有的相同位點的數目的函數(即％同源性=相同位點的數目/位點的總數X100)。兩個序列之間的序列比較和百分同一性的確定可以如下面的非限制性實施例中所述用凄t學算法實現。兩個氨基酸序列之間的百分同一性可以用已經整合入ALIGN程序(2.0版本)中的E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl.Biosci.，4:11-17(1988))的算法來確定，其使用PAM120權重殘基表，12的空位長度罰分，4的空位罰分。另外，兩個氨基酸序列之間的百分同一性也可以用已經整合入GCG軟件包(可從www.gcg.com獲得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48:444-453(1970))的算法來確定，其使用Blossum62矩陣或PAM250矩陣，16、14、12、10、8、6或4的空位權重，和l、2、3、4、5或6的長度權重。另外，或者可替代地，本發明的蛋白質序列可以進一步作為"查詢序列，，用于檢索公共數據庫，例如鑒定相關序列。這種檢索可以用Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的XBLAST程序(2.0版本)進行。BLAST蛋白質檢索可以用XBLAST程序進行，得分二50,字長=3,以獲得與本發明的抗體分子同源的氨基酸序列。為了獲得用于比較目的的空位比對，可以采用如Altschul等(1997)NucleicAcidsRes.25(17):3389-3402所述的空位BLAST。當采用BLAST和空位BLAST程序時，可以使用各自程序(例如XBLAST和NBLAST)的缺省參數。參見www.ncbi.nlm.nih.gov。具有保守修飾的抗體在某些實施方案中，本發明的抗體包括含CDR1、CDR2和CDR3序列的重鏈可變區和含CDR1、CDR2和CDR3序列的輕鏈可變區，其中這些CDR序列中的一個或多個包含基于本文所述優選抗體(例^口21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、13F1或46E8)的對爭定氨基酸序列或其保守修飾，并且其中該抗體保留本發明抗-CD19抗體的所需功能特性。因此，本發明提供一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其包括含CDR1、CDR2和CDR3序列的重鏈可變區和含CDR1、CDR2和CDR3序列的輕鏈可變區，其中(a)重鏈可變區CDR3序列包含選自SEQIDNO:30、31、32、33、34、35和36的氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列，(b)輕鏈可變區CDR3序列包含選自SEQIDNO:51、52、53、54、55、56、57和58的氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列，(c)該抗體以lxlO-7M或更低的Kd與人CD19結合；(d)與Raji和DaudiB細胞肺瘤細胞結合。在一個優選實施方案中，重鏈可變區CDR2序列包含選自SEQIDNO:23、24、25、26、27、28和29的氨基酸序列和其保守修飾的氨基酸序列；且輕鏈可變區CDR2序列包含選自SEQIDNO:44、45、46、47、48、49和50的氨基酸序列和其保守修飾的氨基酸序列。在另一優選實施方案中，重鏈可變區CDR1序列包含選自SEQIDNO:16、17、18、19、20、21和22的氨基酸序列和其保守修飾的氨基酸序列；且輕鏈可變區CDR1序列包含選自SEQIDNO:37、38、39、40、41、42和43的氨基酸序列和其保守修飾的氨基酸序列。在各種實施方案中，該抗體可以是，例如人抗體、人源化抗體或嵌合抗體。本文使用的術語"保守序列修飾"是指不會顯著影響或改變含該氨基酸序列的抗體的結合特性的氨基酸修飾。這樣的保守修飾包括氨基酸置換、添加和缺失。可以通過本領域公知的標準技術，如定點誘變和PCR介導的誘變，向本發明抗體中引入修飾。保守氨基酸置換是將氨基酸殘基替換為具有相似側鏈的氨基酸殘基。具有相似側鏈的氨基酸殘基的家族在本領域中已經定義。這些家族包括具有堿性側鏈(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側鏈(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電荷極性側鏈(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非極性側鏈(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、(3-分支側鏈(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳族側鏈(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸。因此，本發明抗體的CDR區內的一個或多個氨基酸殘基可以被置換為來自相同側鏈家族的其他氨基酸殘基，并且可以用此處所述的功能試驗檢測改變的抗體保留的功能(即以上(C)至(d)所述的功能)。與本發明的抗-CD19抗體結合相同表位的抗體在另一實施方案中，本發明提供與本發明的任意CD19單克隆抗體結合相同表位的抗體(即能夠與本發明的任意單克隆抗體交叉竟爭結合CD19的抗體)。在優選實施方案中，用于交叉竟爭研究的參比抗體可以是單克隆抗體21D4(具有分別如SEQIDNO:1和8所示的Vh和Vl序列)，或單克隆抗體21D4a(具有分別如SEQIDNO:1和9所示的Vh和Vl序列)，或單克隆抗體47G4(具有分別如SEQIDNO:2和10所示的VH和Vl序列)，或單克隆抗體27F3(具有分別如SEQIDNO:3和11所示的VH和Vl序列)，或單克隆抗體3C10(具有分別如SEQIDNO:4和12所示的VH和VL序列)，或單克隆抗體5G7(具有分別如SEQIDNO:5和13所示的Vh和Vl序歹'J),或單克隆抗體13F1(具有分別如SEQIDNO:6和14所示的VH和VL序列)，或單克隆抗體46E8(具有分別如SEQIDNO:7和15所示的Vh和Vl序歹iJ)。這些交叉竟爭抗體可以根據它們在標準CD19結合測定中與21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、13F1或46E8交叉竟爭的能力來鑒定。例如，可以利用BIAcore⑧分析、ELISA測定或流式細胞分析來證明與.本發明抗體的交叉竟爭。-波測試抗體抑制例如21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、13F1或46E8與人CD19結合的能力證明，該測試抗體可以與21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、13F1或46E8竟爭結合人CD19,因此所結合的人CD19上的表位與21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、13F1或46E8相同。在一個優選實施方案中，所結合的人CD19上的表位與21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、13F1或46E8相同的抗體是人單克隆抗體。這些人單克隆抗體可以如實施例所述制備和分離。工程化抗體和修飾的抗體具有此處所7>開的一種或多種Vh和/或Vl序列的抗體可以用作起始材料來構建一種修飾的抗體，該修飾的抗體相對于與起始抗體相比可以具有改變的特性。可以通過修飾一個或兩個可變區(即VH和/或VJ例如一個或多個CDR區內和/或一個或多個構架區內的一個或多個氨基酸來構建抗體。另外，或者，可以通過修飾恒定區內的殘基來構建抗體，例如改變該抗體的效應功能。在某些實施方案中，可以利用CDR移植來改造抗體的可變區。抗體主要是通過位于六個重鏈和輕鏈互補決定區(CDR)中的氨基酸殘基與靶抗原相互作用。由于這個原因，CDR內的氨基酸序列比CDR外的序列在各個抗體之間更加多樣化。由于CDR序列負責大多數抗體-抗原相互作用，因此通過構建如下的表達載體能夠表達模擬特定天然存在抗體的特性的重組抗體該表達載體包含來自特定天然存在抗體的CDR序列，該CDR序列被移植到來自具有不同特性的不同抗體的構架序列上(參見，例如，Riechmann，L.等(1998)Nature332:323-327;Jones，P.等(1986)Nature321:522-525;Queen，C.等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86:10029-10033;Winter的美國專利5,225,539,和Queen等人的美國專利5,530,101;5,585,089;5,693,762和6,180,370)。因此，另一個實施方案涉及一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其包括含CDR1、CDR2和CDR3序列的重鏈可變區，該CDR1、CDR2和CDR3序列分別包含選自SEQIDNO:16、17、18、19、20、21和22,SEQIDNO:23、24、25、26、27、28和29,和SEQIDNO:30、31、32、33、34、35和36的氨基酸序列，并且包括含CDR1、CDR2和CDR3序列的輕鏈可變區，該CDR1、CDR2和CDR3序列分別包含選自SEQIDNO:37、38、39、40、41、42和43,SEQIDNO:44、45、46、47、48、49和50,和SEQIDNO:51、52、53、54、55、56、57和58的氨基酸序列。因此，這些抗體含有單克隆抗體21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、13F1或46E8的VH和VlCDR序列，但是也可能含有與這些抗體不同的構架序列。這些構架序列可以從包括種系抗體基因序列的公共DNA數據庫或發表的參考文獻中獲得。例如，人重鏈和輕鏈可變區基因的種系DNA序列可以在以下資源中發現"VBase，，人種系序列數據庫(可/人因4爭網上www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase獲4f)，以及Kabat,E.A.等(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第五版,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIH出X反號91-3242;Tomlinson,I.M.等(1992)"TheRepertoireofHumanGermlineVHSequencesRevealsaboutFiftyGroupsofVHSegmentswithDifferentHype匿iableLoops"J.Mol.Biol.227:776-798;和Cox，J.P,L.等(1994)"ADirectoryofHumanGerm-lineVHSegmentsRevealsaStrongBiasintheirUsage"Eur.J.Immunol.24:827-836;其內容均引入本文作為參考。作為另一個例子，用于人重鏈和輕鏈可變區基因的種系DNA序列可以在Genbank數據庫中發現。例如，在HCo7HuMAb小鼠中發現的下列重鏈種系序列可以根據如下Genbank登錄號獲得1-69(NG—0010109,NT_024637和/或BC070333),3-33(NG—0010109和NT一024637)和3-7(NG—0010109和NT—024637)。作為另一個例子，在VKHCol2HuMAb小鼠中發現的以下重鏈種系序列可以根據如下Genbank登錄號獲得1-69(NG_0010109,NT—024637和BC070333),5-51(NG—0010109和NT024637),4-34(NG—0010109和NT—024637)，3-30.3(CAJ556644)和3-23(AJ楊678)。使用本領域^支術人員公知的一種^皮稱為缺口BLAST(Altschul等人(1997)NucleicAcidsResearch25:3389-3402)的序列相似性檢索方法，將抗體蛋白質序列與匯編的蛋白質序列數據庫進行比較。BLAST是一種啟發式算法，其中抗體序列和數據庫序列之間的統計學顯著性比對可能含有所比對的字句的高得分的片段對(HSP)。延伸或修剪不能提高其得分的片段對被稱為命中(hit)。簡要地說，翻譯VBASE來源的核苷酸序列(http:〃vbase.mrc畫cpe.cam.ac.uk/vbasel/list2.php》而寸呆留FR1至FR3構架區之間并且包括該構架區的區域。數據庫數據的平均長度為98個殘基。除去在蛋白質全長上準確匹配的重復序列。使用程序blastp，除關閉的低復雜性過濾器和BLOSUM62置換矩陣以外應用缺省標準參數對蛋白質進行BLAST檢索，對于排名前5位的命中，過濾器產生序列匹配。在所有6個框架內的核苷酸序列都翻譯，在數據庫序列的匹配片段中沒有終止密碼子的框架被認為是潛在命中。然后使用BLAST程序tblastx進行證實，該程序翻譯所有6個框架內的抗體序列，并且比較其翻譯與在所有6個框架內動態翻譯的VBASE核苷酸序列。同一性是抗體序列和蛋白質數據庫之間在序列全長上的完全氨基酸匹配。陽性(同一性+置換匹配)不同，但是氨基酸置換由BLOSUM62置換矩陣指導。如果抗體序列以相同的同一性匹配兩個數據庫序列，則陽性最強的命中被判斷為匹配序列命中。用于本發明抗體的優選構架序列在結構上類似于所選擇的本發明抗體使用的構架序列，例如，類似于本發明優選的單克隆抗體使用的VH5-51構架序列(SEQIDNO:74)和/或VH1-69構架序列(SEQIDNO:75)和/或VKL18構架序列(SEQIDNO:76)和/或VKA27構架序列(SEQIDNO:77)和/或VKL15構架序列(SEQIDNO:78)。VHCDR1、CDR2和CDR3序列和VKCDR1、CDR2和CDR3序列可以被移植到與該構架序列的來源種系免疫球蛋白基因具有相同序列的構架區上，或者CDR序列可以被移植到與該種系序列相比含有一個或多個突變的構架區上。例如，已經發現，在某些情況中，將構架區內的殘基進行突變對于保持或增強抗體的抗原結合能力是有利的(參見，例如，Queen等的美國專利5,530,101;5,585,089;5,693,762和6，180，370)。另一種類型的可變區修飾是突變Vh和/或VkCDR1、CDR2和/或CDR3區內的氨基酸殘基，從而改善目標抗體的一種或多種結合特性(例如親和力)。可以進行定點誘變或PCR介導的誘變，以引入突變，對抗體結合的影響，或者其他目標功能特性，可以用此處所述和實施例中提供的體外或體內試驗來評價。優選引入(如上文所述的)保守修飾。這些突變可以是氨基酸置換、添加或缺失，但是優選置換。而且，一般改變CDR區內的不超過1、2、3、4或5個殘基。因此，在另一個實施方案中，本發明提供分離的抗-CD19單克隆抗體或其抗原結合部分，其包含的重鏈可變區含有(a)VHCDR1區，其包含選自SEQIDNO:16、17、18、19、20、21和22的氨基酸序列，或與SEQIDNO:16、17、18、19、20、21和22相比具有1、2、3、4或5個氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列；(b)VHCDR2區，其包含選自SEQIDNO:23、24、25、26、27、28和29的氨基酸序列，或與SEQIDNO:23、24、25、26、27、28和29相比具有1、2、3、4或5個氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列；(c)VHCDR3區，其包含選自SEQIDNO:30、31、32、33、34、35和36的氨基酸序列，或與SEQIDNO:30、31、32、33、34、35和36相比具有1、2、3、4或5個氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列；(d)VKCDR1區，其包含選自SEQIDNO:37、38、39、40、41、42和43的氨基酸序列，或與SEQIDNO:37、38、39、40、41、42和43相比具有1、2、3、4或5個氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列；(e)VKCDR2區，其包含選自SEQIDNO:44、45、46、47、48、49和50的氨基酸序列，或與SEQIDNO:44、45、46、47、48、49和50相比具有1、2、3、4或5個氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列；和(f)VKCDR3區，其包含選自SEQIDNO:51、52、53、54、55、56、57和58的氨基酸序列，或與SEQIDNO:51、52、53、54、55、56、57和58相比具有1、2、3、4或5個氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列。本發明的工程化抗體包括例如為了改善抗體特性而對其VH和/或VK內的構架殘基進行了修飾的抗體。進行這樣的構架修飾一般是為了降低抗體的免疫原性。例如，一種方法是將一個或多個構架殘基"回復突變"為相應的種系序列。更特別地，經歷體細胞突變的抗體可含有與衍生該抗體的種系序列不同的構架殘基。通過比較抗體構架序列與衍生該抗體的種系序列，可以鑒定這些殘基。例如，下面的表I顯示了抗-PD-1抗體17D8、2D3、4H1、5C4、4A11、7D3和5F4的構架區中不同于重鏈親本種系序列的大量氨基酸改變。為了使構架區序列中的一個或多個氨基酸殘基恢復為其種系構型，可以通過(例如)定點誘變或PCR介導的誘變，將該體細胞突變"回復突變"為種系序列。表1.抗體17D8、2D3、4H1、5C4、4A11、7D3和5F4相對于重鏈種系構型的修飾<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>另一種類型的構架修飾涉及對構架區內、乃至一個或多個CDR區內的一個或多個殘基進行突變，以除去T細胞表位，從而降低該抗體的潛在的免疫原性。該方法也被稱為"脫免疫"，在Carr等人的公布號為20030153043的美國專利中詳細記載。除了在構架區或CDR區內進行的修飾以外，或者作為它的替代方案，也可以將本發明的抗體改造為在Fc區內包括修飾，一般是為了改變該抗體的一種或多種功能特性，如血清半衰期、補體固定、Fc受體結合和/或抗原依賴性細胞毒性。此外，也可以將本發明的抗體化學纟務飾(例如一個或多個化學部分可以連接到該抗體上)，或者修飾改變其糖基化，以改變該抗體的一種或多種功能特性。這些實施方案均在下文詳細描述。Fc區中殘基的編號是Kabat的EU指數的編號。在一個實施方案中，修飾CH1的鉸《連區，使該鉸鏈區中半胱氨酸殘基的數目改變，例如增加或減少。該方法在Bodmer等人的美國專利No.5,677,425號中詳細記載。改變CH1鉸鏈區中半胱氨酸的數目是為了(例如)促進輕鏈和重鏈的裝配，或提高或降低抗體的穩定性。在另一實施方案中，對抗體的Fc鉸鏈區進行突變，以降低該抗體的生物半衰期。更具體地，向Fc-鉸鏈片段的CH2-CH3結構域界面區引入一個或多個氨基酸突變，使得該抗體與葡萄球菌蛋白A(SpA)的結合比天然Fc-鉸鏈結構域與SpA的結合減弱。該方法在Ward等人的美國專利No.6，165，745號中詳細記載。在另一實施方案中，修飾抗體以提高其生物半衰期。可以使用各種方法。例如，如Ward的美國專利No.6,277,375所述，可以引入一個或多個如下突變T252L、T254S、T256F。或者，如Presta等人的美國專利No.5,869,046和6,121,022所述，為了提高生物半衰期，該抗體可以在CH1或CL區內進行改變，使之含有來自IgGFc區CH2結構域的兩個環的補救受體結合表位。在其他一些實施方案中，通過將至少一個氨基酸殘基置換為不同的氨基酸殘基來改變fc區，以改變抗體的效應功能。例如，可以將選自氨基酸殘基234、235、236、237、297、318、320、322的一個或多個氨基酸置換為不同的氨基酸殘基，使得該抗體對效應配體的親和力改變，但是保留親本抗體的抗原結合能力。其親和力被改變的效應配體可以是，例如，Fc受體或補體的Cl成分。該方法在Winter等人的美國專利No.5,624,821和5，648，260中更詳細地描述。在另外一個實施例中，可以將選自氨基酸殘基329、331和322的一個或多個氨基酸置換為不同的氨基酸殘基，使得該抗體的Clq結合改變和/或補體依賴性細胞毒性(CDC)降低或消除。該方法在Idusogie等人的美國專利No.6,194,551中更詳細地描述。在另外一個實施例中，改變氨基酸位點2316、17、18、19、20、21和2239中的一個或多個氨基酸殘基，從而改變該抗體固定補體的能力。該方法在Bodmer等人的PCT公布WO94/29351中進一步描述。在另外一個實施例中，為了提高抗體介導抗體依賴性細胞毒性(ADCC)的能力和/或提高抗體對FcY受體的親和力，通過在下列位點處修飾一個或多個氨基酸來修飾Fc區238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、,438或439。該:方法在Presta的PCT公布WO00/42072中進一步描述。而且，人IgGl上對于FcyRI、FcyRII、FcyRIII和FcRn的結合位點已經作圖，并且已經描述了具有改善的結合的變體(參見，Shields,R丄.等(2001)J.Biol.Chem.276:6591-6604)。位點256、290、298、333、334和339處的特定突變顯示改善了與FcyRIII的結合。另外，下列組合突變體顯示改善了與FcyRIII的結合T256A/S298A,S298A/E333A，S298A/K224A和S298A/E333A/K334A。在另一實施方案中，修飾抗體的糖基化。例如，可以制備無糖基化的抗體(即該抗體缺乏糖基化)。例如，為了提高抗體對抗原的親和力，可以改變糖基化。這樣的碳水化合物修飾可以通過例如改變抗體序列內的一個或多個糖基化位點來實現。例如，可以進行一個或多個氨基酸置換，使一個或多個可變區構架糖基化位點消失，從而消除該位點處的糖基化。這種無糖基化可以提高抗體對抗原的親和力。這種方法在Co等人的美國專利No.5,714,350和6,350,861中更詳細地描述。另外，或者可替代地，可以制備糖基化類型改變的抗體，如巖藻糖基殘基數目減少的低巖藻糖基化抗體，或等分GlcNac結構增多的抗體。已經證明這種改變的糖基化模式提高了抗體的ADCC能力。這種碳水化合物修飾可以通過(例如)在糖基化機制改變的宿主細胞中表達抗體來實現。糖基化機制改變的細胞在本領域中已有描述，能夠用作宿主細胞在其中表達本發明的重組抗體，從而產生糖基化改變的抗體。例如，細胞系Ms704、Ms705和Ms709缺乏巖藻糖基轉移酶基因，FUT8(a(1，6)巖藻糖基轉移酶基因)，因此在Ms704、Ms705和Ms709細胞系中表達的抗體在它們的碳水化合物中缺乏巖藻糖。通過使用兩種替代載體定向破壞CHO/DG44細胞中的FUT8基因，產生Ms704、Ms705和Ms709FUT8^細胞系(參見Yamane等的美國專利申請No.20040110704和Yamane-Ohnuki等.(2004)BiotechnolBioeng87:614-22)。另一個例子是，Hanai等的EP1,176,195描述了具有功能破壞的FUT8基因的細胞系，該基因編碼巖藻糖轉移酶，由于減少或消除了a(l，6)鍵相關的酶，在這種細胞系中表達的抗體表現為低巖藻糖基化。Hanai等也描述了用于向結合抗體Fc區的N-乙酰葡萄糖胺上添加巖藻糖的酶活性低或不具有酶活性的細胞系，例如大鼠骨髓瘤細胞系YB2/0(ATCCCRL1662)。Presta的PCT公布WO03/035835記載了一種變異CHO細胞系，Lecl3細胞，其將巖藻糖連接到Asn(297)-連接的碳水化合物上的能力降低，也導致在該宿主細胞中表達的抗體為低巖藻糖基化(參見，Shields,R,L.等(2001)J.Biol.Chem.277:26733-26740)。Umana等人的PCT公布WO99/54342記載了表達糖蛋白修飾的糖基轉移酶(例如(3(l，4)-N-乙酰葡糖氨基轉移酶III(GnTIII))的工程化細胞系，因此該工程化細胞系中表達的抗體表現為等分GlcNac結構增加，導致抗體的ADCC活性提高(參見，Umana等(1999)Nat.Biotech.17:176-180)。此外，抗體的巖藻糖殘基可以用巖藻糖苷酶切下。例如，巖藻糖苷酶a-L-巖藻糖苷酶從抗體上除去巖藻糖殘基(Tarentino,A丄,等.(1975)Biochem.14:5516-23)。本發明涉及的對此處所述抗體的另一種修飾是PEG化。例如，為了提高抗體的生物(例如血清)半衰期，可以將該抗體PEG化。為了PEG化一種抗體，一般在一個或多個PEG基團與抗體或抗體片段連接的條件下，將該抗體或其片段與聚乙二醇(PEG)如PEG的反應性酯或醛衍生物反應。優選地，通過與反應性PEG分子(或類似的反應性水溶性聚合物)的酰化反應或烷基化反應進行PEG化。本文使用的術語"聚乙二醇"包括用來衍生化其他蛋白質的任何PEG形式，如單(Cl-ClO)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-馬來酰亞胺。在某些實施方案中，將要PEG化的抗體是一種無糖基化的抗體。將蛋白質PEG化的方法在本領域中公知，并且可以用于本發明的抗體。參見，例如，Nishimum等人的EP0154316和Ishikawa等人的EP0401384。抗體的物理性質本發明的抗體可以進一步通過抗CD19抗體的各種物理性質進4亍表征。可以利用各種試驗基于這些物理性質檢測和/或區分不同類別的抗體。在某些實施方案中，本發明的抗體可以在輕鏈或重鏈可變區中含有一個或多個糖基化位點。可變區中一個或多個糖基化位點的存在可能由于抗原結合改變而導致抗體的免疫原性提高或者抗體的pK改變(Marshall等人(l972)AnnuRevBiochem41:673-702;GalaFA和MorrisonSL(2004)JImmunol172:5489-94;Wallick等人(1988)JExpMed168:1099-109;SpiroRG(2002)Glycobiology12:43R-56R;Parekh等人(1985)Nature316:452-7;Mimura等人(2000)MolImmunol37:697-706)。已知糖基化在含有N-X-S/T序列的基序處發生。可變區糖基化可以用Glycoblot試驗進行檢測，該試驗切割抗體，產生Fab,然后利用測定高形成的試驗檢測糖基化。或者，可變區糖基化也可以用Dionex光層析法(Dionex-LC)檢測，該方法從Fab上切下糖成為單糖，并且分析各個糖的含量。在某些情況中，優選不含可變區糖基化的抗-CD19抗體。這可以通過選擇在可變區中不含糖基化基序的抗體或者利用本領域公知的標準技術突變糖基化基序內的殘基來實現。在一個優選實施方案中，本發明的抗體不含天冬酰胺異構化位點。脫酰胺或異天冬氨酸作用可以分別在N-G或D-G序列上發生。脫酰胺或異天冬氨酸作用導致產生異天冬氨酸，這通過在側鏈羧基末端而不是在主鏈上產生扭結的結構而降低了抗體的穩定性。異天冬氨酸的產生可以用iso-quant試驗來測定，該試驗利用反相HPLC檢測異天冬氨酸。每種抗體具有獨特的等電點(pl),但是通常抗體落入6至9.5的pH范圍內。IgGl抗體的pl—般落入7-9.5的pH范圍內，IgG4抗體的pI—般落入6-8的pH范圍內。抗體可以具有該范圍之外的pl。盡管這種作用通常未知，但是推測pl落于正常范圍之外的抗體在體內條件下可能具有一定的解折疊和不穩定性。等電點可以用毛細管等電聚焦試驗來測定，該試驗產生pH梯度，并且可以利用激光聚焦來提高精確性(Janini等人(2002)Electrophoresis23:1605-11;Ma等人(2001)Chromatographia53:S75-89;Hunt等人(1998)JChromatogrA800:355-67)。在某些情況中，優選pi值落入正常范圍內的抗CD19抗體。這可以通過選擇pi位于正常范圍內的抗體或者通過利用本領域公知的標準技術突變帶電荷的表面殘基來實現。每種抗體的熔解溫度指示熱穩定性(KrishnamurthyR和ManningMC(2002)CurrPharmBiotechnol3:361-71)。較高的熱穩定性表示在體內有較高的總體抗體穩定性。抗體的熔點可以用諸如差示掃描量熱法(Chen等人(2003)PharmRes20:1952-60;Ghirlando等人(1999)ImmunolLett68:47-52)等技術來測量。TM表示抗體最初解折疊的溫度。T殿表示抗體完全解折疊的溫度。通常，優選地本發明的抗體的TM1大于60°C，優選大于65。C,甚至更優選大于70。C。此外，抗體的熱穩定性也可以利用圓二色性來測量(Murray等人(2002)J.Ch腿atogrSci40:343-9)。在一個優選實施方案中，選擇不快速降解的抗體。抗CD19抗體的石皮裂可以用本領域/>知的毛細管電泳(CE)和MALDI-MS來測定(AlexanderAJ和HughesDE(1995)AnalChem67:3626-32)。在另一個優選實施方案中，選擇具有最小的聚集作用的抗體。聚集可以導致觸發不希望的免疫應答和/或改變的或不利的藥代動力學性質。通常，抗體具有25%或更少的聚集是可以接受的，優選20%或更少，甚至更優選15%或更少，甚至更優選10%或更少，甚至更優選5%或更少。聚集可以用本領域公知的幾種技術來測定，包括大小排阻柱(SEC)高效液相層析(HPLC)和光散射法，用來鑒定單體、二聚體、三聚體或多聚體。4元體工程化方法如上所述，能夠利用具有此處公開的Vh和Vk序列的抗-CD19抗體，通過修飾Vh和/或Vk序列或與之連接的恒定區，產生新的抗-CD19抗體。因此，在本發明的另一方面，利用本發明的抗-CD19抗體(例如21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、13F1或46E8)的結構特征，產生結構上相關的抗-CD19抗體，該結構上相關的抗體保留本發明抗體的至少一種功能特性，如與人CD19結合。如上所述，例如，21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、13F1或46E8的一個或多個CDR區或其突變可以與已知的構架區和/或其他CDR重組組合，從而產生另外的重組工程化的本發明的抗-CD19抗體。其他類型的修飾包括以上部分所述的修飾。用于工程化方法的起始材料是此處提供的一種或多種Vh和/或Vk序列，或其一個或多個CDR區。為了產生工程化抗體，不一定必須實際制備(即表達為蛋白質)具有此處提供的一種或多種Vh和/或Vk序列，或其一個或多個CDR區的抗體。而是用該序列中所含的信息作為起始材料，產生由原始序列衍生的"第二代"序列，然后制備該"第二代"序列，并將其表達為蛋白質。因此，在另一實施方案中，本發明提供一種制備抗-CD19抗體的方法，包括(a)提供(i)重鏈可變區抗體序列，其包含選自SEQIDNO:16、17、18、19、20、21和22的CDR1序列、選自SEQIDNO:23、24、25、26、27、28和29的CDR2序列、和/或選自SEQIDNO:30、31、32、33、34、35和36的CDR3序列；和/或(ii)輕鏈可變區抗體序列，其包含選自SEQIDNO:37、38、39、40、41、42和43的CDR1序列、選自SEQIDNO:44、45、46、47、48、49和50的CDR2序列、和/或選自SEQIDNO:51、52、53、54、55、56、57和58的CDR3序列；(b)改變重鏈可變區抗體序列和/或輕鏈可變區抗體序列內的至少一個氨基酸殘基，從而產生至少一個改變的抗體序列；和(c)將該改變的抗體序列表達為蛋白質。可以利用標準分子生物學技術制備和表達所述改變的抗體序列。優選地，由改變的抗體序列編碼的抗體保留此處所述抗-CD19抗體的一種、一些或全部功能特性，該功能特性包括但不限于(i)以lxlO-7m或更低的Kq與人CD19結合；(ii)與Raji和DaudiB細胞腫瘤細胞結合。改變的抗體的功能特性可以用本領域中使用的和/或此處所述的(如實施例中所述的)標準試驗(例如流式細胞術、結合測定)來評價。在本發明抗體的工程化方法的某些實施方案中，可以沿全部或部分抗-CD19抗體編碼序列隨機或選擇性引入突變，并可以針對結合活性和/或如此處所述的其他功能特性，篩選獲得的修飾的抗-CD19抗體。突變方法在本領域中已經描述。例如，Short的PCT公布WO02/092780記載了利用飽和誘變、合成連接裝配或它們的組合產生和篩選抗體突變的方法。另外，Lazar等人的PCT公布WO03/074679也記載了利用計算篩選方法優化抗體的生理化學性質的方法。編碼抗體的核酸分子本發明的另一方面涉及編碼本發明的抗體的核酸分子。該核酸可以存在于完整細胞、細胞裂解物中，或以部分純化或基本上純的形式存在。當通過包括堿/SDS處理、CsCl顯帶、柱層析、瓊脂糖凝膠電泳在內的標準技術和本領域公知的其他方法與其他細胞成分或其他污染物(例如其他細胞核酸或蛋白質)分離純化時，核酸是"分離的"或"基本上純的"。參見,F.Ausubel等ed.(1987)CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingandWileyInterscience,NewYork。本發明的才亥酉臾可以是例如DNA或RNA,并且可以含有或者可以不含內含子序列。在一個優選實施方案中，該核酸是cDNA分子。本發明的核酸可以利用標準分子生物學技術獲得。對于雜交瘤(例如，由如下文進一步描述的攜帶人免疫球蛋白基因的轉基因小鼠制備的雜交瘤)表達的抗體，編碼由雜交瘤制備的抗體輕鏈和重鏈的cDNA可以用標準PCR擴增或cDNA克隆技術獲得。對于從免疫球蛋白基因文庫中獲得的抗體(例如使用噬菌體展示技術)，可以從文庫中回收編碼該抗體的一種或多種核酸。本發明優選的核酸分子是編碼21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、13F1或46E8單克隆抗體的Vh和Vl序列的核酸分子。編碼21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、13F1和46E8的Vh序列的DNA序列分別在SEQIDNO:59、60、61、62、63、64和65中示出。編碼21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、13F1和46E8的Vl序列的DNA序列分別在SEQIDNO:66、67、68、69、70、71、72和73中示出。一旦獲得編碼Vh和Vl片段的DNA片段，即可通過標準重組DNA技術進一步操作這些DNA片段，例如將可變區基因轉化為全長抗體鏈基因、Fab片段基因或scFv基因。在這些操作中，編碼Vt或Vh的DNA片設與編碼另外一種蛋白質如抗體恒定區或柔性連接體的另一個DNA片段有效連接。如本文使用的術語"有效連接"意思是兩個DNA片段連接在一起，使得這兩個DNA片段編碼的氨基酸序列保持符合閱讀框。通過將編碼VH的DNA與編碼重鏈恒定區(CHI、CH2和CH3)的另外一種DNA分子有效連接，可以將分離的編碼VH區的DNA轉化為全長重鏈基因。人重鏈恒定區基因的序列在本領域中公知(參見，例如，Kabat,E.A.等(1991)SequencesofProteinsofImmunologiclInterest,第五版，U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIH出版號91-3242),包括這些區域的DNA片段可以通過標準PCR擴增獲得。重鏈恒定區可以是IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定區，但是最優選的是IgGl或IgG4恒定區。對于Fab片段重鏈基因，編碼VH的DNA可以與只編碼重鏈CHI恒定區的另外一種DNA分子有效連接。通過將編碼Vl的DNA與編碼輕鏈恒定區CL的另外一種DNA分子有效連接，可以將分離的編碼VL區的DNA轉化為全長輕鏈基因(以及Fab輕鏈基因)。人輕鏈恒定區基因的序列在本領域中公知(參見，例"^口，Kabat,E.A.等(1991)SequencesofProteinsofImmunologiclInterest,第五版，U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIH出版號91-3242),包括這些區域的DNA片段可以通過標準PCR擴增獲得。在優選的實施方案中，輕鏈恒定區可以是K或X恒定區。為了產生scFv基因，將編碼VH和VL的DNA片段與編碼柔性連接體例如編碼氨基酸序列(Gly4-Ser)3的另外一個片段有效連接，使得VH和VL序列可以表達為連續的單鏈蛋白質，其Vl和Vh區通過該柔性連接體連接(參見，例如Bird等(1988)Science242:423-426;Huston等(19S8)Proc.Natl.Acad,Sci.USA85:5879-5883;McCafferty等(1990)Nature348:552-554)。單克隆抗體的產生本發明的單克隆抗體(mAb)能夠通過多種技術制備，包括常規的單克隆抗體方法，例如，Kohler和Milstein(1975)Nature256:495所述的標準體細胞雜交技術。雖然優選體細胞雜交技術，但是原則上，能使用制備單克隆抗體的其他技術，例如B淋巴細胞的病毒或致癌轉化。用于制備雜交瘤的優選的動物系統是鼠系統。用小鼠產生雜交瘤是一種完善建立的程序。免疫程序和分離用于融合的被免疫脾細胞的技術是本領域公知的。融合配偶體(例如鼠骨髓瘤細胞)和融合程序也是公知的。本發明的嵌合或人源化抗體可以基于如上所述獲得的非人單克隆抗體的序列來制備。編碼重鏈和輕鏈免疫球蛋白的DNA可以從目標非(例如人類)免疫球蛋白序列。例如，為了產生嵌合抗體，可以利用本領域公知的方法將鼠可變區連接到人恒定區上(參見，例如，Cabilly等人的美國專利No.4,816,567)。為了產生人源化抗體，可以利用本領域公知的方法將鼠CDR區插入人構架內(參見，例如，Winter的美國專利No.5,225,539,和Queen等人的美國專利No.5,530,101;5,585,089;5,693,762和6,180,370)。在一個優選實施方案中，本發明的抗體是人單克隆抗體。這種抗CD19人單克隆抗體能用攜帶部分人免疫系統而不是小鼠系統的轉基因或轉染色體小鼠產生。這些轉基因和轉染色體小鼠包括在此分別被稱作HuMab小鼠⑧和KM小鼠@的小鼠，并且在此通稱為"人Ig小鼠"。HuMab小鼠⑧(Medarex氣Inc.)包含編碼未重排的人重鏈(p和力和K輕鏈免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因小基因座，和使內源ia和K鏈基因座失活的定向突變(參見，例如，Lonberg等(1994)Nature368(6474):856-859)。因此，該小鼠表現為小鼠IgM或K表達降低，并且響應于免疫，導入的人重鏈和輕鏈轉基因經歷類別轉換和體細胞突變，從而產生高親和力人IgGK單克隆抗體(Lonberg,N.等(1994),同上；綜述Lonberg，N.(1994)HandbookofExperimentalPharmacology113:49-101;Lonberg，N.和Huszar,D.(1995)Intern.Rev.Immunol.Vol.13:65-93，和Harding,F.和Lonberg，N.(1995)Ann,N.Y.Acad.Sd764:536-546)。HuMab小鼠@的制備和使用，以及該小鼠攜帶的基因組修飾，在下面的文獻中詳細描述Taylor，L.等(1992)NucleicAcidsResearch20:6287-6295;Chen,J.等(1993)InternationalImmunology5:647-656;Tuaillon等(1993)Proc.Natl.Acad.SciUSA90:3720-3724;Choi等(1993)NatureGenetics4:117-123;Chen，J.等(1993)EMBOJ.12:821-830;Tuaillon等(l994)J.Immunol.152:2912-2920;Taylor，L.等(1994)Intemationallmm腳logy6:579-591;和Fishwild,D.等(l996)NatureBiotechnology14:845-851，這些文獻的內容全文引入本文作為參考。進一步參見，Lonberg和Kay的美國專利No.5,545,806;5，569，825;5，625，126;5，633,425;5,789,650;5,877,397;5，661，016;5,814,318;5,874,299;和5，770，429;和Surani等人的美國專利No.5,545,807;Lonberg和Kay的PCT公布號WO92/03918，WO93/12227，WO94/25585，WO97/13852,WO98/24884和WO99/45962;和Korman等人的PCT公布號WO01/14424。在另一實施方案中，可以用轉基因和轉染色體上攜帶人免疫球蛋白序列的小鼠，例如攜帶人重鏈轉基因和人輕鏈轉染色體的小鼠，產生本發明的人抗體。這種小鼠在此被稱為"KM小鼠TM，，，在Ishida等人的PCT公布WO02/43478中詳細描述。再者，表達人免疫球蛋白基因的替代轉基因動物系統在本領域中可以獲得，能夠用來產生本發明的抗-CD19抗體。例如，可以使用一種被稱作Xenomouse(Abgenix,Inc.)的替代轉基因系統，這種小鼠在例如Kucherlapati等人的美國專利No.5,939,598;6,075,181;6,114,598;6,150,584和6,162,963中描述。而且，表達人免疫球蛋白基因的替代轉染色體動物系統在本領域中可以獲得，能夠用來產生本發明的抗-CD19抗體。例如，可以使用攜帶人重鏈轉染色體和人輕鏈轉染色體的小鼠，其被稱作"TC小鼠"；這種小鼠在Tomizuka等(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:722-727中描述。另外，本領域中已經描述了攜帶人重鏈和輕鏈轉染色體的牛(Kuroiwa等(2002)NatureBiotechnology20:889-894),其能夠用來產生本發明的抗-CD19抗體。本發明的人單克隆抗體也可以使用用于篩查人免疫球蛋白基因文庫的噬菌體展示方法制備。這種用于分離人抗體的噬菌體展示方法在本領域中已經建立。參見，例如，Ladner等人的美國專利No.5,223,409;5，403,484;和5，571，698;Dower等人的美國專利No.5，427，908和5，580,717;McCafferty等人的美國專利No.5,969,108和6，172，197;和Griffiths等人的美國專利No.5，885,793;6,521,404;6，544，731;6,555,313;6,582,9130，31，32,33,34，35和36,593,081。本發明的人單克隆抗體也可以用SCID小鼠制備，該SCID小鼠中重構了人免疫細胞，因此在免疫時能夠產生人抗體應答。這種小鼠在例如Wilson等人的美國專利No.5,476,996和5,698,767中描述。人Ig小鼠的免疫當使用人Ig小鼠產生本發明的人抗體時，根據Lonberg，N.等(1994)Nature368(6474):856-859;Fishwild，D.等(l996)NatureBiotechnology14:845-851;和PCT/>布WO98/24884和WO01/14424所述，用純化的或富集的CD19抗原和/或重組CD19或表達CD19的細胞或CD19融合蛋白的制劑免疫該小鼠。優選地，第一次輸注時小鼠為6-16周齡。例如，可以使用純化的或重組的CD19抗原的制劑(5-50pg)腹膜內免疫人Ig小鼠。產生抗CD19完全人單克隆抗體的詳細程序在下面的實施例1中描述。應用各種抗原積累的經驗證明，當最初使用弗氏完全佐劑中的抗原腹膜內(IP)免疫，接著隔周用弗氏不完全佐劑中的抗原腹膜內免疫(最多共六次)時，轉基因小鼠產生應答。但是，發現弗氏佐劑之外的佐劑也是有效的。另外，發現在沒有佐劑時，全細胞具有高度免疫原性。在免疫方案進程中用眼眶后取血獲得的血漿樣品監測免疫應答。通過ELISA(如下所述)篩選血漿，用具有足夠抗-CD19人免疫球蛋白效價的小鼠進行融合。用抗原對小鼠進行靜脈內加強免疫，3天后處死并且取出脾臟。預期每次免疫可能需要2-3次融合。每一種抗原一般免疫6-24只小鼠。通常HCo7和HCo12系都使用。另夕卜，HCo7和HCo12轉基因可以雜交，產生具有兩種不同人重鏈轉基因(HCo7/HCo12)的一種小鼠。可替代地或者另外，如實施例1所述，可以使用,小鼠@系。產生人單克隆抗體的雜交瘤的制備為了制備產生本發明的人單克隆抗體的雜交瘤，從被免疫的小鼠中分離脾細胞和/或淋巴結細胞，并且與合適的無限增殖化細胞系(例如小鼠骨髓瘤細胞系)融合。根據抗原特異性抗體的產生篩選得到的雜交瘤。例如，可以使用50%PEG，將來自被免疫小鼠的脾淋巴細胞的單細胞懸液與六分之一數量的P3X63-Ag8.653非分泌小鼠骨髓瘤細胞(ATCC,CRL1580)融合。或者，可以使用CytoPulse大腔室細胞融合電穿孔儀(CytoPulseSciences,Inc.,GlenBurnieMaryland),使用基于電場的電融合法，將來自被免疫小鼠的脾淋巴細胞的單細胞懸浮液融合。將細胞以大約2xl()S的密度接種于平底微量滴定板中，接著在含有20%胎克隆血清，18%"653，，條件培養基，5%Origen(IGEN),4mML-谷氨酰胺，lmM丙酮酸鈉，5mMHEPES,0.055mM2-巰基乙醇，50單位/毫升青霉素，50mg/ml鏈霉素，50mg/ml慶大霉素和lxHAT(Sigma;融合后24小時加入HAT)的選擇性培養基中溫育兩周。大約兩周之后，在用HT替換了HAT的培養基中培養細胞。然后通過ELISA根據人單克隆IgM和IgG抗體篩選各孔。一旦發生廣泛的雜交瘤生長，則通常在10-14天之后觀察培養基。將分泌抗體的雜交瘤再次平板接種，再次篩選，如果對于人IgG仍然是陽性，則可以通過有限稀釋將單克隆抗體至少亞克隆兩次。然后體外培養穩定的亞克隆，以在組織培養基中產生少量抗體用于表征。為了純化人單克隆抗體，選擇的雜交瘤可以在用于單克隆抗體純化的兩升^走轉搖瓶中生長。過濾上清液，濃縮，之后用蛋白A-sepharose(Pharmacia,Piscataway,N丄)進4亍親和層對斤。洗脫下來的IgG通過)疑月交電泳和高效液相色譜法檢查以確保純度。將緩沖溶液換成PBS,用1.43的消光系數根據OD280確定濃度。可將單克隆抗體分成等份并且在-8(TC下保存。產生單克隆抗體的轉染瘤的制備利用(例如)本領域公知的重組DNA技術和基因轉染方法的組合(例如，Morrison,S.(1985)science229:1202),也能在宿主細胞轉染瘤中產生本發明的抗體。例如，為了表達抗體或其抗體片段，可通過標準分子生物學技術(例如，使用表達目標抗體的雜交瘤進行PCR擴增或cDNA克隆)，獲得編碼部分或全長輕鏈和重鏈的DNA,并將該DNA插入到表達載體中，使得基因與轉錄和翻譯控制序列有效連接。在上下文中，術語"有效連接"意思是抗體基因連接到載體中，使得載體中的轉錄和翻譯控制序列發揮它們調節該抗體基因的轉錄和翻譯的預期功能。選擇與所用的表達宿主細胞相匹配的表達載體和表達控制序列。抗體輕鏈基因和抗體重鏈基因可被插入到分開的載體中，或者，更通常地，將兩個基因插入到同一表達載體中。通過標準方法將抗體基因插入到表達載體中(例如，抗體基因片段上的互補限制性位點與載體連接，或者如果不存在限制性位點的活，則平端連接)。通過插入到已經編碼期望的同種型的重鏈恒定區和輕鏈恒定區的表達載體中，使得Vh區段與栽體中的Ch區段有效連接，而VK區段與載體中的CL區段有效連接，可以利用本文描述的抗體的輕鏈和重鏈可變區產生任意抗體同種型的全長抗體基因。另外，或者可替代地，重組表達載體能編碼有利于宿主細胞分泌抗體鏈的信號肽。可將抗體鏈基因克隆到載體中，使得信號肽與該抗體鏈基因的氨基末端符合閱讀框地連接。信號肽可以是免疫球蛋白信號肽或異源信號肽(即，來自非免疫球蛋白的蛋白質的信號肽)。除了抗體鏈基因，本發明的重組表達載體還帶有控制該抗體鏈基因在宿主細胞中表達的調節序列。術語"調節序列"包括啟動子、增強子和控制抗體鏈基因轉錄或翻譯的其他表達控制元件(例如，多腺苷酸化信號)。這沖羊的i周節序歹lH列^口在Goeddel(GeneExpressionTechnology.MethodsinEnzymology185,AcademicPress,SanDiego，CA(1990))中描述。本領域技術人員應當理解，表達載體的設計，包括調節序列的選擇，取決于諸如要轉化的宿主細胞的選擇、期望的蛋白質表達水平等因素。用于哺乳動物宿主細胞表達的優選調節序列包括指導蛋白質在哺乳動物細胞中高水平表達的病毒元件，例如來源于巨細胞病毒(CMV)、猿病毒40(SV40)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP))和多瘤病毒的啟動子和/或增強子。可替代地可以使用非病毒調節序列，例如泛蛋白啟動子或(3-珠蛋白啟動子。另外，調節元件也可由來自諸如SRa啟動子系統等不同來源的序列組成，SRoc啟動子系統含有來自SV40早期啟動子的序列和人l型T細胞白血病病毒的長末端重復序列(Takebe,Y.等(1988)Mol.Cell.Biol,8:466-472)。除了抗體鏈基因和調節序列以外，本發明的重組表達載體還可以攜帶另外的序列，例如調節載體在宿主細胞中復制的序列(例如，復制起點)和選擇性標記基因。選擇性標記基因有利于篩選載體已經導入其中的宿主細胞(參見，例如，Axel等人的美國專利No.4,399,216,4,634,665和5,179,017)。例如，選擇性標記基因一般給已經導入載體的宿主細胞帶來抗藥性，例如G418、潮霉素或氨曱喋呤抗性。優選的選擇性標記基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(在dhfr-宿主細胞中用于氨曱喋呤選擇/擴增)和neo基因(用于G418選擇)。為了表達輕鏈和重鏈，通過標準技術將編碼重鏈和輕鏈的表達載體轉染到宿主細胞中。術語"轉染"的各種形式包括常用于將外源DNA導入原核或真核宿主細胞中的各種技術，例如，電穿孔、磷酸鈣沉淀、DEAE-葡聚糖轉染等等。雖然在理論上可以在原核或真核宿主細胞中表達本發明的抗體，但是優選在真核細胞中，最優選在哺乳動物宿主細胞中表達該抗體，因為這樣的真核細胞，特別是哺乳動物細胞，比原核細胞更可能組裝和分泌正確折疊并且具有免疫活性的抗體。據纟艮道，原核表達抗體基因無法高產率地產生活性抗體(Boss,M.A.和Wood,C,R.(1985)ImmunologyToday6:12-13)。用于表達本發明的重組抗體的優選哺乳動物宿主細胞包括中國倉鼠卵巢(CHO細胞)(包括Urlaub和Chasin,(1980)Pro"Natl.Acad.Sci.USA77:4216-4220中描述的dhfr-CHO細胞，和DHFR選擇性標記一起使用，例如，如R.J.Kaufman和P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159:601-621所述)、NSO骨髓瘤細胞、COS細胞和SP2細胞。特別地，用于NSO骨髓瘤細胞的另一種優選表達系統是WO87/04462(Wilson)、WO89/01036(Bebbington)和EP338,841(Bebbington)公開的GS基因表達系統。當將編碼抗體基因的重組表達載體導入哺乳動物宿主細胞中時，通過將宿主細胞培養足以使抗體在宿主細胞中表達的時間，或更優選地，培養足以使抗體分泌到宿主細胞生長的培養基中的時間，而產生抗體。可應用標準蛋白質純化方法從培養基中回收抗體。抗體與抗原結合的表征通過(例如)標準ELISA，可以檢測本發明的抗體與CD19的結合。簡要地說，用0.25jug/ml的純化CD19在PBS中的溶液包被微量滴定板，然后用PBS中的5%牛血清白蛋白封閉。向各個孔中加入抗體的稀釋液(例如，來自CD19免疫小鼠的血漿的稀釋液)，并且在37。C下溫育1-2小時。用PBS/Tween洗滌培養板，之后和與堿性磷酸酶偶聯的第二試劑(例如，對于人抗體，為山羊抗人IgGFc特異性多克隆試劑)一起在37。C下溫育1小時。洗滌后，培養板用pNPP底物(lmg/ml)顯色，并且在OD405-650下分析。優選地，用表現出最高效價的小鼠進4亍融合。如上所述的ELISA分析也可以用來篩選表現出與CD19免疫原有陽性反應性的雜交瘤。將與CD19高親合力結合的雜交瘤進行亞克隆，并且進一步表征。從每個雜交瘤中選擇保留母細胞反應性的一個克隆(通過ELISA)，制備5-10小瓶細胞庫，保存在-140。C下，用于抗體純化。為了純化抗-CD19抗體，選擇的雜交瘤在用于單克隆抗體純化的兩升旋轉搖瓶中生長。過濾上清液并且濃縮，然后用蛋白A-sepharose(Pharmacia,Piscataway，NJ)進行親和層析。通過;疑月交電泳和高效液相色譜檢查洗脫的IgG以確保純度。將緩沖溶液換成PBS，并且使用1.43的消光系數根據OD28。確定濃度。將單克隆抗體分成等份并且在-80。C下保存。為了確定選擇的抗-CD19單克隆抗體是否與獨特表位結合，可以使用商售試劑(Pierce,Rockford,IL)將每種抗體生物素化。可以使用如上所述的CD19包被的ELISA板，應用未標記的單克隆抗體和生物素化單克隆抗體進行竟爭研究。可以使用鏈霉抗生物素蛋白-堿性磷酸酶探針檢測生物素化mAb的結合。為了確定被純化的抗體的同種型，可以用對特定同種型抗體具有特異性的試劑進行同種型ELISA。例如，為了確定人單克隆抗體的同種型，在4。C下用lpg/ml抗人免疫球蛋白包被微量滴定板的孔過夜。用1%BSA封閉之后，平板與lpg/ml或更少的測試單克隆抗體或純化的同種型對照物在室溫下反應1-2小時。這些孔然后與人IgGl或人IgM特異性堿性磷酸酶偶聯的探針反應。如上所述使平板顯色并且分析。可以通過Western印跡法進一步檢測抗-CD19人IgG與CD19抗原的反應性。簡要地說，制備CD19并進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳后，將分離的抗原轉移到硝酸纖維素膜上，用10%胎牛血清封閉，并用待檢測的單克隆抗體探查。人IgG的結合可以用抗人IgG石成性磷酸酶才全測，并用BCIP/NBT底物片(SigmaChem.Co.,St.Louis,Mo.)顯色。免疫偶聯物另一方面，本發明涉及與諸如細胞毒素、藥物(例如免疫抑制劑)或放射性毒素等治療性部分偶聯的抗-CD19抗體或其片段。這些偶聯物在此被稱為"免疫偶聯物"。包括一個或多個細胞毒素的免疫偶聯物被稱作"免疫毒素"。細胞毒素或細胞毒劑包括對細胞有害(例如殺傷細胞)的任何試劑。實例包括紫杉醇、細胞松弛素B、短桿菌肽D、溴化乙啶、吐根堿、絲裂霉素、表鬼臼毒吡喃葡糖苷、表鬼臼毒噻吩糖苷、長春新堿、長春堿、秋水仙素、阿霉素、柔紅霉素、二羥基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光輝霉素、放線菌素D、l-脫氫睪酮、糖皮質激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾和嘌呤霉素和它們的類似物或同系物。治療劑還包括，例如抗代謝物(例如，氨甲喋呤、6-巰基嘌呤、6-硫代鳥。票呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、氨烯咪胺(decarbazine))，烷化劑(例如，氮芥、苯丁酸氮芥(thioepachlorambucil)、苯丙氨酸氮芥、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、環磷酰胺、白消安、二溴甘露糖醇、鏈唑霉素、絲裂霉素C和順-二氯二胺合鉑(II)(DDP)順鉑)，氨茴霉素類(例如，柔紅菌素(以前稱為道諾霉素)和阿霉素)，抗生素(例如，放線菌素D(以前稱為放線菌素)、博來霉素、光輝霉素和安曲霉素(AMC)),和抗有絲分裂劑(例如，長春新>減和長春堿)。能與本發明抗體偶聯的治療性細胞毒素的其他優選例子包括倍癌霉素、刺孢霉素、美坦生、auristatin、和它們的衍生物。刺孢霉素抗體偶耳關物的一個例子是可作為商品購得的(Mylotarg;AmericanHomeProducts)。可以利用本領域使用的連接體技術將細胞毒素與本發明的抗體偶聯。已經用于將細胞毒素與抗體偶聯的連接體類型的實例包括但不限于腙、硫醚、酯、二硫化物和含肽的連接體。可以選擇，例如，在溶酶體區室內易被低pH切割或易被蛋白酶切割的連接體，該蛋白酶例如是在腫瘤組織中優先表達的蛋白酶，如組織蛋白酶(例如組織蛋白酶B、C、D)。關于細胞毒素的類型、用于偶聯治療劑與抗體的連接體和方法的進一步討論，參見Saito，G.等(2003)Adv.DrugDeliv.Rev.55:199-215;Trail,P.A.等(2003)Cancer.Immunol.Immunother.52:328-337;Payne,G.(2003)CancerCell3:207-212;Allen,T.M.(2002)Nat.Rev.Cancer2:750-763;Pastan,I.和Kreitman，R.J.(2002)Curr.Opin.Investig.Drugs3:1089-1091;Senter，P.D.和Springer,C丄(2001)Adv.DrugDeliv.Rev.53:247-264。本發明的抗體也可以與放射性同位素偶聯，產生細胞毒性放射性藥物，也被稱作放射性免疫偶聯物。能夠與診斷或治療性使用的抗體偶聯的放射性同位素的例子包括但不限于碘131、銦111、釔9。和镥177。制備放射性免疫偶聯物的方法在本領域中已經建立。放射性免疫偶聯物的例子可以作為商品獲得，包括Zevalin(IDECPharmaceuticals)和Bexxar(CorixaPharmaceuticals),并且能夠利用類似的方法使用本發明的抗體制備放射性免疫偶聯物。本發明的抗體偶聯物可用于修飾特定的生物學反應，且藥物部分不應理解為局限于經典的化學治療劑。例如，藥物部分可以是具有需要的生物活性的蛋白質或多肽。這樣的蛋白質包括，例如具有酶活性的毒素或其活性片段，如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假單胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白質，如腫瘤壞死因子或干擾素-y;或生物學反應調節物，如淋巴因子、白介素-1("IL-l")、白介素-2("IL-2")、白介素-6("IL-6")、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子("GM-CSF")、粒細胞集落刺激因子("G-CSF")或其他生長因子。將這種治療性部分與抗體偶聯的技術是眾所周知的，參見，例如，Amon等人,"MonoclonalAntibodiesForImmunotargetingOfDrugsInCancerTherapy",inMonoclonalAntibodiesAndCancerTherapy,Reisfeid等人(ed.)，pp.243-56(AlanR.Liss，Inc.1985);Hellstrom等人，"AntibodiesForDrugDelivery",inControlledDrugDelivery(2ndEd.),Robinson等人(ed.),pp.623-53(MarcelDekker，Inc.1987);Thorpe,"AntibodyCarriersOfCytotoxicAgentsInCancerTherapy:AReview",inMonoclonalAntibodies'84:BiologicalAndClinicalApplications,Pinchera等人(ed,),pp.475-506(1985);"Analysis,Results,AndFutureProspectiveOfTheTherapeuticUseOfRadiolabeledAntibodyInCancerTherapy",inMonoclonalAntibodiesForCancerDetectionAndTherapy,Baldwin等人(ed.)，pp.303-16(AcademicPress1985)，和Thorpe等人，Immunol.Rev.，62:119-58(1982)。雙特異性分子另一方面，本發明w異性分子。本發明的抗體或其抗原結合部分可以被衍生化或連接到另一個功能性分子上，如另一個肽或蛋白質(例如另一個抗體或受體的配體)上，從而生成可與至少兩個不同結合位點或靶分子結合的雙特異性分子。本發明的抗體實際上可以被衍生化或連接到一個以上的其他功能性分子上，從而生成可與兩個以上不同結合位點和/或靶分子結合的多特異性分子；這樣的多特異性分子也包括在本文使用的術語"雙特異性分子"內。為了產生本發明的雙特異性分子，本發明的抗體可與一個或多個其他結合分子如其他抗體、抗體片段、肽或結合模擬物功能性連接(如通過化學偶聯、基因融合、非共價結合等)，從而得到雙特異性分子。因此，本發明包括雙特異性分子，其具有至少一種對于CD19的第一結合特異性和對于第二種目標表位的第二結合特異性。在本發明一個特定實施方案中，第二種目標表位是Fc受體，如人FcyRI(CD64)或人Fcoc受體(CD89)。因此，本發明包括既能與表達FcyR或FcocR的效應細胞(如單核細胞、巨噬細胞或多形核細胞(PMN))結合，又能與表達CD19的靶細胞結合的雙特異性分子。這些雙特異性分子將表達CD19的細胞導向于效應細胞，并且觸發Fc受體介導的效應細胞活性，如表達CD19的細胞的吞噬作用、抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)、細胞因子釋放、或超氧陰離子的產生。在其中雙特異性分子是多特異性分子的本發明的一個實施方案中，除抗-Fc結合特異性和抗-CD19結合特異性之外，該分子還可包括第三結合特異性。在一個實施方案中，該第三結合特異性是抗增強因子(EF)部分，例如與參與細胞毒性活性的表面蛋白質結合因而增強針對靶細胞的免疫應答的分子。"抗增強因子部分"可以是與諸如抗原或受體等特定分子結合，從而導致結合決定簇對Fc受體或靶細胞抗原的作用增強的抗體、功能性抗體片段或配體。"抗增強因子部分"可與Fc受體或靶細胞抗原結合。可替代地，抗增強因子部分可以與一種實體結合，該實體不同于第一和第二結合特異性所結合的實體。例如，抗增強因子部分可與細胞毒性T細胞結合(如經由CD2、CD3、CD8、CD28、CD4、CD40、ICAM-1或其他免疫細胞，該細胞導致針對靶細胞的免疫應答增強)。在一個實施方案中，本發明的雙特異性分子包含至少一個抗體或其抗體片段作為結合特異性，包括(例如)Fab、Fab，、F(ab，)2、Fv、Fd、dAb或單鏈Fv。該抗體也可以是輕鏈或重鏈二聚體，或任何其最小片段，如Fv或單鏈構建體，如Ladner等人的美國專利No.4，946，778所述，該專利的內容引入本文作為參考。在一個實施方案中，對于FcY受體的結合特異性由單克隆抗體提供，該單克隆抗體的結合不被人免疫球蛋白G(IgG)阻斷。本文使用的術語"IgG受體"是指位于染色體1上的8個Y-鏈基因的任意一個。這些基因編碼總共12個跨膜或可溶性受體同種型，這些同種型分組為3個Fcy受體類別FqRI(CD64)、FcyRII(CD32)和FcyRIII(CD16)。在一個優選實施方案中，Fq受體是人高親和力FcyRI。人FcyRI是72kDa的分子，對單體IgG表現出高親和力(108-l(f]Vr1)。某些優選抗-Fcy單克隆抗體的制備和表征在Fanger等人的PCT申請WO88/00052和美國專利號4,954,617中描述，在此處將其內容整體引入作為參考。這些抗體在與受體的Fey結合位點不同的位點處與FcyRI、FcyRII或FcyRIII的表位結合，因而，其結合基本不被生理學水平的IgG阻斷。可用于本發明中的特定抗-FcyRI抗體為mAb22、mAb32、mAb44、mAb62和mAb197。產生mAb32的雜交瘤可從美國典型培養物保藏中心獲得，ATCC保藏號為HB9469。在另外一些實施方案中，抗-Fcy受體抗體是單克隆抗體22的人源化形式(H22)。H22抗體的產生和表征在Graziano，R.F.等人(1995)J.Immunol155(10):4996-5002和Tempest等人的PCT公布WO94/10332中描述。產生H22抗體的細胞系以HA022CL1的名稱保藏在美國典型培養物保藏中心，保藏號為CRL11177。在另外一些優選實施方案中，對Fc受體的結合特異性由可與人IgA受體如Fc-oc受體(FcaRI(CD89))結合的抗體提供，該抗體的結合優選地不被人免疫球蛋白A(IgA)阻斷。術語"IgA受體"包括位于染色體19上的一個a-基因的基因產物(FcaRI)。已知該基因編碼幾個55-110kDa的可變剪接跨膜同種型。FcocRI(CD89)在單核細胞/巨噬細胞、嗜酸性和嗜中性粒細胞上組成型表達，但不在非效應細胞群體上組成型表達。FcaRI對IgAl和IgA2兩者均具有中等親和力(約5xl07M")，在暴露于諸如G-CSF或GM-CSF的細胞因子后該親和力增加(Morton,H.C.等(1996)CriticalReviewsinImmunology16:423-440)。已描述了4種FcaRI-特異性單克隆抗體，它們:帔確定為A3、A59、A62和A77,它們在IgA配體結合域之外與FcccRI結合(Monteiro，R.C.等(1992)J.Immunol.148:1764)。FcaRI和FcyRI是用于本發明的雙特異性分子的優選觸發受體，因為它們(l)主要表達于諸如單核細胞、PMN、巨噬細胞和樹突細胞的免疫效應細胞上；(2)高水平表達(如每個細胞表達5，000-100，000個)；(3)是細胞毒性(如ADCC、吞噬作用)的介質；(4)介導導向于它們的抗原(包括自身抗原)的增強的抗原呈遞。優選人單克隆抗體，可以在本發明的雙特異性分子中使用的其他抗體包括鼠、嵌合和人源化單克隆抗體。可通過應用本領i或中^^知的方法偶聯組成的結合特異性，如抗-FcR和抗-CD19結合特異性，制備本發明的雙特異性分子。例如，雙特異性分子的每一種結合特異性可單獨生成，然后彼此偶聯。當結合特異性是蛋白質或肽時，可以使用多種偶聯劑或交聯劑進行共價偶聯。交聯劑的例子包括蛋白A、碳二亞胺、N-琥珀酰亞氨基-S-乙酰-硫代乙酸鹽(SATA)、5，5，-二硫代二(2-硝基苯曱酸)(DTNB)、鄰亞苯基雙馬來酰亞胺(oPDM)、N-琥珀酰亞氨基-3-(2-吡咬二硫代)丙酸鹽(SPDP)和磺基琥珀酰亞氨基4-(N-馬來酰亞氨基甲基)環己基-l-羧酸鹽(sulfo-SMCC)(參見，例如，Karpovsky等(19S4)J.Exp.Med.160:1686;Liu，MA等(1985)Proc.Natl.Acad,Sci.USA82:8648)。其他方法包括Paulus(1985)BehringIns.Mitt.No.78,118-132);Brennan等(1985)Science229:81-83和Glennie等(1987)J.Immunol.139:2367-2375所描述的方法。優選的偶聯劑為SATA和sulfo-SMCC，兩者均可從PierceChemicalCo.(Rockford，IL)獲得。當結合特異性是抗體時，它們可通過兩個重鏈的C-末端鉸鏈區的巰基鍵合而偶聯。在一個特別優選的實施方案中，對鉸鏈區進行修飾以使其在偶聯前含有奇數個，優選1個巰基殘基。可替代地，兩種結合特異性可在同一載體中編碼，并在相同的宿主細胞中表達和裝配。當雙特異性分子是mAbxmAb、mAbxFab、FabxF(ab，)2或配體xFab融合蛋白時，該方法是特別有用的。本發明的雙特異性分子可以是包含一個單鏈抗體和一個結合決定簇的單鏈分子，或包含兩個結合決定簇的單鏈雙特異性分子。雙特異性分子可以包含至少兩個單鏈分子。制備雙特異性分子的方法例如在美國專利5,260,203、5,455,030、4,881,175、5,132,405、5，091，513、5,476,786、5,013,653、5,258,498和5,482,858中描述，均引入本文作為參考。雙特異性分子與其特異性靶標的結合可通過例如酶聯免疫吸附測定(ELISA)、放射免疫測定(RIA)、FACS分析、生物測定(如生長抑制)或Western印跡分析來證實。這些試驗中的每一個通常通過應用對目標復合物具有特異性的標記試劑(如抗體)來檢測特定目標蛋白質-抗體復合物的存在。例如，可以利用識別和特異性結合抗體-FcR復合物的酶聯抗體或抗體片段來檢測FcR-抗體復合物。或者，這些復合物可利用多種其他免疫分析中的任一種來檢測。例如，可對抗體進行放射性標記并且在放射免疫測定(R1A)中4吏用(參見，例如，Weintraub，B.，PrinciplesofRadioimmunoassays,SeventhTrainingCourseonRadioligandAssayTechniques,TheEndocrineSociety,1986年3月，引入本文作為參考)。可以通過諸如使用y計數器或閃爍計數器的手段或者通過放射自顯影方法沖企測放射性同位素。藥物組合物另一方面，本發明提供一種組合物，例如藥物組合物，其含有與藥學上可接受的載體配制在一起的一種或組合的本發明的單克隆抗體或其抗原結合部分。這樣的組合物可以包含一種或組合的(例如兩種或多種不同的)本發明的抗體或免疫偶聯物或雙特異性分子。例如，本發明的藥物組合物可以含有結合靶抗原上的不同表位或具有互補活性的抗體組合(或免疫偶聯物或雙特異性分子)。本發明的藥物組合物也可以在聯合治療中施用，即與其他藥劑聯用。例如，聯合治療可包括本發明的抗-CD19抗體聯合至少一種其他的抗炎劑或免疫抑制劑。可在聯合治療中使用的治療劑的例子在下面本發明抗體的應用一節中更詳細地描述。本文使用的"藥學上可接受的載體，，包括生理學相容的任何和所有的溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。優選地，該載體適合于靜脈內、肌內、皮下、腸胃外、脊柱或表皮施用(如通過注射或輸注)。根據施用途徑，可將活性化合物即抗體、免疫偶聯物或雙特異性分子包裹于一種材料中，以保護該化合物免受可使該化合物失活的酸和其他天然條件的作用。本發明的藥物組合物可包含一種或多種藥學上可接受的鹽。"藥持了親代化合物的所需生物活性而不引起任何不期望的毒理學作用的鹽(參見如Berge，S.M.等(1977)J.Pharm.Sci.66:1-19)。這樣的鹽的例子包括酸加成鹽和堿加成鹽。酸加成鹽包括那些由諸如鹽酸、硝酸、磷酸、石充酸、氪溴酸、氬》典酸、亞磷酸等無毒性無機酸衍生的鹽，以及由諸如脂族單羧酸和二羧酸、苯基取代的鏈烷酸、羥基鏈烷酸、芳族酸、脂族和芳族磺酸等無毒性有機酸衍生的鹽。堿加成鹽包括那些由諸如鈉、鉀、鎂、釣等;成土金屬衍生的鹽，以及由諸如N,N，-二節基乙二胺、N-曱基葡糖胺、氯普魯卡因、膽堿、二乙醇胺、乙二胺、普魯卡因等無毒性有機胺衍生的鹽。本發明的藥物組合物也可含有藥學上可接受的抗氧化劑。藥學上可接受的抗氧化劑的例子包括(l)水溶性抗氧化劑，如抗壞血酸、鹽酸半胱氨酸、；琉酸氫鈉、焦亞^5危酸鈉，亞好u酸鈉等；(2)油溶性抗氧化劑，如棕櫚酸抗壞血酸酯、丁羥茴醚(BHA)、丁羥甲苯(BHT)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、ot-生育酚等；和(3)金屬螯合劑，如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。可用于本發明藥物組合物中的適當的水性或非水性載體的例子包括水，乙醇，多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)，及其適當的混合物，植物油如橄欖油，和注射用有才幾酯如油酸乙酯。例如通過應用包被材料如卵磷脂，在分散液的情況下通過維持所需的顆粒大小，以及通過應用表面活性劑，能夠維持適當的流動性。這些組合物還可含有佐劑，如防腐劑、潤濕劑、乳化劑和分散劑。可以通過上述的滅菌程序或通過包含諸如對羥基苯曱酸酯、氯代丁醇、苯酚山梨酸等各種抗細菌劑和抗真菌劑確保防止存在微生物。也可能需要在組合物中包含等滲劑，例如，糖、氯化鈉等。另外，通過包含延遲吸收劑，例如單硬脂酸鋁和明膠，可實現注射型藥物延長的吸收。藥學上可接受的載體包括無菌水溶液或分散液和用于臨時制備無菌注射液或分散液的粉末劑。這些用于藥學活性物質的介質和試劑的使用是本領域公知的。除了任何與活性化合物不相容的常規介質或試劑范圍外，包括其在本發明的藥物組合物中的應用。還可以向組合物中摻入補充的活性化合物。治療性組合物一般必須是無菌的并且在制備和貯存條件下穩定的。可以將組合物配制成溶液、微乳狀液、脂質體或其他適合高藥物濃度的有序結構。載體可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液態聚乙二醇等)及其合適的混合物的溶劑或分散劑。例如，通過使用包衣，例如卵磷脂，在分散液的情況下通過保持所需的顆粒大小，以及通過使用表面活性劑，可以保持適當的流動性。在很多情況下，組合物中優選包含等滲劑，例如，糖、多元醇例如甘露糖醇、山梨糖醇或氧化鈉。通過在組合物中加入延遲吸收劑，例如單硬脂酸鹽和明膠，可實現注射型藥物延長的吸收。通過將活性化合物以需要的量混入合適的溶劑中，并且根據需要加入以上列舉的成分中的一種或其組合，接著無菌微過濾，可制備無菌注射液。通常，通過將活性化合物摻入到含有基本分散介質和上面所列其他所需成分的無菌載體中制備分散劑。對于用于制備無菌注射液的無菌粉末劑，優選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥(凍干)，由其預先無菌過濾的溶液得到活性成分加任何額外所需成分的粉末。可以與載體材料組合制備單一劑量形式的活性成分的量根據所治療的受試者和特定給藥方式而不同。可以與載體材料組合制備單一劑量形式的活性成分的量一般是產生治療效果的組合物的量。通常，以100%計，這個量的范圍是大約0.01%至大約99%的活性成分，優選大約0.1%至大約70%,最優選大約1%至大約30%的活性成分，與藥學上可接受的載體相組合。調節劑量方案，以提供最佳的期望的反應(例如，治療反應)。例如，可以施用單一大丸劑，可以隨時間施用幾次分開的劑量，或者根據治療狀況的緊急情況所需，可以按比例減小或增加劑量。特別有利的是將腸胃外組合物配制成容易給藥并且劑量均勻的劑量單位形式。此處使用的劑量單位形式是指適合作為單位劑量用于所治療的受試者的物理不連續單位；每個單位含有預定量的活性化合物，經計算該預定量的活性化合物與需要的藥物載體組合產生所需的治療效果。對本發明劑量單位形式的具體說明限定于且直接依賴于(a)活性化合物的獨特特性和要達到的特定治療效果，和(b)本領域中固有的對于配制這種用于治療個體敏感性的活性化合物的限制。對于抗體的給藥而言，劑量范圍為約0.0001至100mg/kg,更通常為0.01至5mg/kg受者體重。例如，劑量可以是0.3mg/kg體重、1mg/kg體重、3mg/kg體重、5mg/kg體重或10mg/kg體重,或在1-10mg/kg范圍內。一個治療方案的例子需要每周給藥一次、每兩周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每3月一次、或每3-6月一次。本發明的抗-CD19抗體的優選劑量方案包括經靜脈內給予1mg/kg體重或3mg/kg體重，該抗體使用如下劑量方案之一給藥(i)每4周一次，共6次，然后每3個月一次；(ii)每3周一次；(iii)3mg/kg體重一次，然后每3周1mg/kg體重。在一些方法中，同時施用具有不同結合特異性的兩種或多種單克隆抗體，在該情況中，每種抗體的給藥劑量落在所述范圍內。抗體通常在有必要時多次給藥。單次給藥之間的間隔可以是，例如，每周、每月、每三個月或每年。間隔也可以是不定期的，例如通過測定患者中抗靶抗原的抗體的血液水平來確定。在一些方法中，調節劑量以達到約l-1000ng/ml的血漿抗體濃度，在一些方法中為約25-300|Lig/ml。可替代地，抗體也可以作為持續釋放制劑來給藥，在此情況中需要頻率較低的給藥。劑量和頻率根據抗體在患者中的半衰期而不同。通常，人抗體表現出最長的半衰期，之后是人源化抗體、嵌合抗體和非人類抗體。給藥劑量和頻率根據處理是預防性的還是治療性的而不同。在預防性應用中，在長時間內以較不頻繁的間隔給予相對較低的劑量。有些患者在余生中持續接受處理。在治療性應用中，有時需要以較短的間隔給予較高的劑量，直到疾病的進展減輕或停止，優選直到患者表現為疾病癥狀部分或完全改善。之后，可以以預防性方案給患者給藥。本發明藥物組合物中活性成分的實際劑量水平可能改變，以獲得可有效實現對特定患者、組合物和給藥方式的所需治療反應，而對患者無毒性的活性成分的量。選擇的劑量水平取決于多種藥物代謝動力學因素，包括應用的本發明特定組合物或其酯、鹽或酰胺的活性，給藥途徑，給藥時間，應用的特定化合物的排泄速率，治療的持續時間，與應用的特定組合物聯合應用的其他藥物、化合物和/或材料，接受治療的患者的年齡、性別、體重、狀況、總體健康情況和病史，以及醫學領域中公,口的類似因素。本發明的抗-CDl9抗體的"治療有效劑量"優選地導致疾病癥狀的嚴重性降低，疾病無癥狀期的頻率和持續時間增加，或者防止因疾病痛苦而引起的損傷或失能。例如，對于CD19+腫瘤的治療，相對于未接受治療的受試者，"治療有效劑量"優選地將細胞生長或腫瘤生長抑制至少約20%,更優選至少約40%,更優選至少約60%,更優選至少約80%。化合物抑制腫瘤生長的能力可以在預測對人類肺瘤的療效的動物才莫型系統中評價。或者，也可以通過檢查化合物抑制細胞生長的能力來評價該組合物的這種性能，這種抑制可以通過本領域技術人員公知的試驗在體外測定。治療有效量的治療性化合物能夠減小腫瘤大小，或者以其他方式緩解受試者的癥狀。本領域4支術人員可以才艮據如下因素確定這種量，如受試者的大小、受試者癥狀的嚴重性和選擇的特定組合物或給藥途徑。本發明的組合物可以利用本領域公知的一種或多種方法通過一種或多種給藥途徑給藥。本領域技術人員應當理解，給藥途徑和/或方式根據期望的結果而不同。本發明抗體的優選給藥途徑包括靜脈內、肌肉內、皮內、腹膜內、皮下、脊柱或其他腸胃外給藥途徑，例如注射或輸注。本文使用的短語"腸胃外給藥"是指除腸和局部給藥以外的給藥模式，通常是注射，包括但不限于靜脈內、肌內、動脈內、鞘內、嚢內、眶內、心內、皮內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、嚢下、蛛網膜下、脊柱內、硬膜外和胸骨內注射和輸注。可替代地，本發明的抗體也可以通過非腸胃外途徑給藥，如局部、表皮或粘膜途徑給藥，例如，鼻內、經口、陰道、直腸、舌下或局部。活性化合物可以與保護化合物不被快速釋放的載體一起制備，例如控釋制劑，包括植入物、透皮貼劑和微膠嚢遞送系統。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐類、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。制備這樣的制劑的很多方法受專利保護或者通常為本領域技術人員所公知。參見，例如，SustainedandcontrolledReleaseDrugDeliverySystems,J.R.Robinson,ed.，MarcelDekker,Inc.，NewYork,1978。治療性組合物可應用本領域公知的醫療裝置給藥。例如，在一個優選實施方案中，本發明的治療組合物可用無針皮下注射裝置給藥，如在美國專利No.5，399，163;5,383,851;5，312,335;5,064,413;4,941,880;4,790,824;或4,596,556中公開的裝置。可用于本發明的^^知的植入物和;漠塊的例子包括美國專利No.4，487，603,該專利公開了用于以受控速率分散藥物的可植入微量輸注泵；美國專利No.4,486,194,該專利公開了用于通過皮膚給藥的治療裝置；美國專利No.4,447,233,該專利7>開了用于以-晴確的輸注速率遞送藥物的醫用輸注泵；美國專利No.4,447,224,該專利公開了用于連續遞送藥物的變流可植入輸注裝置；美國專利No.4,439,196,該專利公開了具有多腔區室的滲透藥物遞送系統和美國專利No.4，475，196,該專利公開了一種滲透藥物遞送系統。這些專利引入本文作為參考。本領域技術人員公知許多其他這樣的植入物、遞送系統和模塊。在某些實施方案中，本發明的人單克隆抗體可配制為確保在體內的正確分布。例如，血-腦屏障(BBB)阻止了許多高度親水性的化合物。為了確保本發明的治療性化合物能夠跨過BBB(如果需要時)，可將它們配制在如脂質體中。至于制備脂質體的方法，參見，例如，美國專利4,522,811;5,374,548;和5,399,331。脂質體包含可被選擇性地轉運入特定細胞或器官內的一個或多個部分，從而增強定向藥物遞送(參見，例如，V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29:685)。定向部分的例子包括葉酸或生物素(參見，例如，Low等人的美國專利5,416,016);甘露糖苷(Umezawa等(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153:1038);抗體(P,G.Bloeman等(1995)FEBSLett.357:140;M.Owais等(1995)Antimicrob.AgentsChemother.39:180);表面活性劑蛋白A受體(Briscoe等(1995)Am.J.Physiol.1233:134);pl20(Schreier等(1994)J.Biol.Chem.269:9090);也參見K.Keinanen;M丄.Laukkanen(1994)FEBSLett.346:123;JJ.Killion;I丄Fidler(1994)Immimomethods4:273。應用禾口方法本發明的抗體(特別是人抗體)、抗體組合物和方法，具有與診斷和治療CD19介導的疾病有關的許多體外和體內診斷和治療應用。例如，這些分子可以施用于在體外或離體培養的細胞，或者(例如)在體內施用于人類受試者，從而治療、預防或診斷多種疾病。本文使用的術語"受試者，，包括人和非人動物。非人動物包括所有脊推動物，例如哺乳動物和非哺乳動物，例如非人靈長類動物、綿羊、狗、貓、牛、馬、雞、兩棲類動物和爬行類動物。優選的受試者包括患有CD19活性介導的疾病的人類患者。這些方法特別適合治療患有與異常CD19表達相關的疾病的人類患者。當抗CD19抗體與另一種藥物一起給藥時，這兩種藥物可以相繼或同時給藥。假如本發明的抗體與CD19特異性結合，則本發明的抗體可以用來特異性檢測細胞表面上的CD19表達，而且能夠用來通過免疫親和純化方法純化CD19。此外，假定CD19在各種腫瘤細胞上表達，則本發明的人抗體、抗體組合物和方法能夠用來治療患有致腫瘤疾病的受試者，例如以存在表達CD19的腫瘤細胞為特征的疾病，包括，例如，非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、急性淋巴細胞性白血病(ALL)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、伯基特淋巴瘤、間變性大細胞淋巴瘤(ALCL)、多發性骨髓瘤、皮膚T細胞淋巴瘤、結節性小卵裂細胞淋巴瘤、淋巴細胞性淋巴瘤、外周T細胞淋巴瘤、倫納特淋巴瘤、免疫母細胞性淋巴結瘤、T細胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、成人T細胞白血病(T-ALL)、中心母細胞/中心細胞性(cb/cc)濾泡性淋巴瘤、B系彌漫性大細胞淋巴瘤、血管免疫母細胞性淋巴結病(AILD)-樣T細胞淋巴瘤、HIV相關體腔淋巴瘤、胚胎性癌、未分化鼻咽癌(例如施明克瘤)、卡斯爾曼病、卡波西肉瘤、多發性骨髓瘤、沃爾登斯特倫巨球蛋白血癥和其他B細胞淋巴瘤。另外，CD19的過量表達可以導致B細胞耐受的喪失和自身免疫性疾病的產生(Tedder等人.(2005)CurrDirAutoimmun8:55)。這種自身免疫作用已經通過類風濕性關節炎患者的發炎關節中CD19+B細月包的積累而見到(He等人.(2001)JRheumatol28:2168)。這樣，本發明的人抗體、抗體組合物和方法可以用來治療自身免疫病(例如以存在表達CD19的B細"包為特4正的疾病，包4舌例如類風濕性關節炎)的患者。在一個實施方案中，本發明的抗體(例如人單克隆抗體、多特異性和雙特異性分子和組合物)可以用于檢測CD19的水平或在其膜表面上含有CD19的細胞的水平，然后可將該水平與特定疾病癥狀相關聯。此外，也可以利用這些抗體抑制或阻斷CD19的功能，然后可以將其與特定疾病癥狀的預防或緩解相關聯，因此提示CD19是該疾病的介質。這可以如下實現，例如，在抗體與CD19之間能夠形成復合物的條件下，使樣品和對照樣品接觸抗-CD19抗體。檢測并比較樣品和對照中抗體與CD19之間形成的任何復合物。在另一實施方案中，可以在開始時檢測本發明的抗體(例如人抗體、多特異性和雙特異性分子和組合物)與體外治療或診斷應用相關的結合活性。例如，能夠用以下實施例中所述的流式細胞分析來檢測本發明的組合物。本發明的抗體(例如人抗體、多特異性和雙特異性分子、免疫偶聯物和組合物)在CD19相關疾病的治療和診斷中具有額外的應用。例如，人單克隆抗體、多特異性或雙特異性分子和免疫偶聯物可以用來在體內或體外引發一種或多種下列生物活性抑制表達CD19的細胞的生長和/或將其殺死；介導表達CD19的細胞在人效應細胞存在下的吞噬作用，或者阻斷CD19配體與CD19的結合。在一個特定實施方案中，本發明的抗體(例如人抗體、多特異性和雙特異性分子和組合物)在體內用于治療、預防或診斷多種CD19相關疾病。CD19相關疾病的例子尤其包括自身免疫病、類風濕性關節炎、癌癥、非何杰金氏淋巴瘤、急性淋巴細胞性白血病(ALL)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、伯基特淋巴瘤、間變性大細胞淋巴瘤(ALCL)、多發性骨髓瘤、皮膚T細胞淋巴瘤、結節性小卵裂細胞淋巴瘤、淋巴細胞性淋巴瘤、夕卜周T細胞淋巴瘤、倫納特淋巴瘤、免疫母細胞性淋巴結瘤、T細胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、成人T細胞白血病(T-ALL)、中心母細胞/中心細胞性(cb/cc)濾泡性淋巴瘤、B系彌漫性大細胞淋巴瘤、血管免疫母細胞性淋巴結病(AILD)-樣T細胞淋巴瘤、HIV相關體腔淋巴瘤、胚胎性癌、未分化鼻咽癌(例如施明克瘤)、卡斯爾曼病、卡波西肉瘤、多發性骨髓瘤、沃爾登斯特倫巨球蛋白血癥和其他B細胞淋巴瘤。在體內和體外施用本發明的抗體組合物(例如人單克隆抗體、多特異性和雙特異性分子和免疫偶聯物)的適當途徑在本領域中公知，可以由本領域才支術人員選擇。例如，抗體組合物可以通過注射(例如靜脈內或皮下)給藥。使用的分子的適宜劑量將取決于受試者的年齡和體重以及抗體組合物的濃度和/或制劑。如前所述，本發明的人抗-CD19抗體可以與諸如細胞毒劑、放射性毒劑或免疫抑制劑等一種或多種其他治療劑共同給藥。抗體可以與該治療劑連接(作為免疫復合物)，或者可以與該治療劑分開給藥。對于后者(分開給藥)，抗體可以在治療劑之前、之后或同時給藥，或者可以與其他已知治療如抗癌治療例如》文射治療共同應用。這些治療劑包括，抗腫瘤劑，如多柔比星(阿霉素)、順柏、硫酸博來霉素、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、環磷酰胺、羥基脲，它們本身僅在對患者具有毒性或亞毒性的水平時有效。順鉑以100mg/劑的劑量靜脈內給藥，每4周1次，阿霉素以60-75mg/ml的劑量靜脈內給藥，每21天1次。本發明的人抗-CD19抗體或其抗原結合片段與化療劑的共同給藥提供了兩種抗癌劑，它們通過對人肺瘤細胞產生細胞毒性作用的不同的機制起作用。這種共同給藥能夠解決由于發展耐藥性或腫瘤細胞抗原性改變(這將使它們對抗體沒有反應性)引起的問題。耙特異性效應細胞，例如與本發明的組合物(例如人抗體、多特異性和雙特異性分子)有關的效應細胞，也可以用作治療劑。用于耙向的效應細胞可以是人白細胞，如巨噬細胞、嗜中性粒細胞或單核細胞。其他細胞包括嗜酸性細胞、自然殺傷細胞和其他帶有IgG或IgA受體的細胞。需要時，效應細胞可以從所治療的受試者中獲得。靶特異性效應細胞可以作為在生理學可4妾受的溶液中的細胞懸浮液給藥。施用的細胞數可以是108-109個的數量級，但是根據治療目的而不同。通常，該量足以獲得在靶細胞處如表達CD19的腫瘤細胞處的集中，以及通過例如吞噬作用實現對細胞的殺傷。給藥途徑也可以不同。應用靶特異性效應細胞的治療可以與其他清除靶細胞的纟支術一起進行。例如，使用本發明的組合物(例如人抗體、多特異性和雙特異性分子)和/或具有這些組合物的效應細胞的抗腫瘤治療可以與化學治療一起使用。另夕卜，可以應用聯合免疫治療將兩種不同的細胞毒性效應群體導向至腫瘤細胞排斥。例如，與抗-Fc-yRI或抗-CD3連接的抗-CD19抗體可以與IgG-或IgA-受體特異性結合劑一起使用。本發明的雙特異性和多特異性分子也可以用來調節效應細胞上的FcyR或FcyR水平，例如通過對細胞表面上的受體加帽以及將其清除。抗-Fc受體的混合物也可以用于該目的。具有補體結合位點(如來自IgGl、-2或-3或IgM的補體結合部分)的本發明的組合物(例如人抗體、多特異性和雙特異性分子和免疫偶聯物)，也可以在補體的存在下使用。在一個實施方案中，用本發明的結合劑和適宜的效應細胞離體處理含有靶細胞的細胞群體能夠通過加入補體或含有補體的血清來實現。補體蛋白的結合能夠改善用本發明的結合劑包被的耙細胞的吞噬作用。在另一實施方案中，用本發明的組合物(例如人抗體、多特異性和雙特異性分子)包被的靶細胞也能夠被補體裂解。在另一實施方案中，本發明的組合物不激活補體。本發明的組合物(例如人抗體、多特異性和雙特異性分子和免疫偶聯物)也可以與補體一起施用。在某些實施方案中，本發明提供了含有人抗體、多特異性或雙特異性分子和血清或補體的組合物。當補體與人抗體、多特異性或雙特異性分子緊密接近時，這些組合物可能是有利的。另外，本發明的人抗體、多特異性或雙特異性分子和補體或血清也可以分開施用。本發明的范圍內還包括藥盒，該藥盒包括本發明的抗體組合物(例如人抗體、多特異性或雙特異性分子，或免疫偶聯物)和使用說明。該藥盒可以進一步包括一種或多種另外的試劑，如免疫抑制劑、細胞毒劑或放射性毒劑，或一種或多種另外的本發明的人抗體(例如，具有補充活性的人抗體，它所結合的CD19抗原上的表位與第一人抗體不同)。因此，可以給用本發明的抗體組合物治療的患者(在本發明的人抗體給藥之前、同時或之后)另外施用另一種治療劑，如細胞毒劑或放射性毒劑，該治療劑可以增強或增加人抗體的治療效果。在另外一些實施方案中，可以另外用調節(例如增強或抑制)FcY或Fcy受體的表達或活性的藥物治療受試者，例如用細胞因子治療受試者。在用多特異性分子治療過程中施用的優選細胞因子包括粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、干擾素-y(IFN-y)和腫瘤壞死因子(TNF)。本發明的組合物(例如人抗體、多特異性和雙特異性分子)也可以用來耙向表達FcyR或CD19的細胞，例如標記這些細胞。對于這種應用，可以將結合劑與能夠被檢測到的分子連接。因此，本發明才是供離體或在體外定位表達Fc受體如FcyR或CD19的細胞的方法。可才企測標記物可以是，例如放射性同位素、焚光化合物、酶或酶輔因子。在一個特定實施方案中，本發明提供檢測樣品中CD19抗原的存在，或測定CD19抗原量的方法，包括在抗體或其部分與CD19之間能夠形成復合物的條件下使樣品和對照樣品接觸可與CD19特異性結合的人單克隆抗體或其抗原結合部分。然后檢測復合物的形成，其中樣品與對照樣品之間復合物形成的差異指示樣品中CD19抗原的存在。在另外一些實施方案中，本發明提供通過對受試者施用上述人抗體而治療受試者的CD19介導的疾病的方法，該疾病例如是自身免疫病、類風濕性關節炎、癌癥、非何杰金氏淋巴瘤、急性淋巴細胞性白血病(ALL)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、伯基特淋巴瘤、間變性大細胞淋巴瘤(ALCL)、皮膚T細胞淋巴瘤、結節性小卵裂細月包淋巴瘤、'淋巴細胞性淋巴瘤、夕卜周T細胞淋巴瘤、4侖納特淋巴瘤、免疫母細胞性淋巴結瘤、T細胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、成人T細胞白血病(T-ALL)、中心母細胞/中心細胞性(cb/cc)濾泡性淋巴瘤、B系彌漫性大細胞淋巴瘤、血管免疫母細胞性淋巴結病(AILD)-樣T細胞淋巴瘤、HIV相關體腔淋巴瘤、胚胎性癌、未分化鼻咽癌(例如施明克瘤)、卡斯爾曼病、卡波西肉瘤、多發性骨髓瘤、沃爾登斯特倫巨球蛋白血癥和其他B細胞'淋巴瘤。這些抗體及其衍生物用來抑制CD19誘導的與某些疾病有關的活性，如增殖和分化。通過將抗體與CD19接觸(例如通過對受試者施用抗體)，CD19誘導這些活性的能力得到抑制，因此相關疾病得到治療。抗體組合物可以單獨給藥或者與諸如細胞毒劑或放射性毒劑的另一種治療劑一起給藥，該另一種治療劑與抗體組合物聯合或協同作用，以治療或預防CD19介導的疾病。在另一實施方案中，通過將化合物與抗體連接，可以利用本發明的免疫偶聯物將該化合物(例如治療劑、標記物、細胞毒素、放射毒素、免疫抑制劑等)靶向至具有CD19細胞表面受體的細胞。例如，抗CD19抗體可以與美國專利No.6,81,354和6,548,530、美國專利公開Nos.20030050331、20030064984、20030073852和20040087497所述或WO03/022806公開的任一種毒素化合物偶聯。因此，本發明也提供用于離體或在體內定位表達CD19的細胞(例如應用可檢測標記物，如放射性同位素、焚光化合物、酶或酶輔因子)的方法。可替代地，免疫偶聯物通過將細胞毒素或放射毒素靶向至CD19，也可以殺傷具有CD19細胞表面受體的細胞。本發明進一步通過下面的實施例進行闡述，不應將這些實施例理解為進一步的限制。全部附圖和在本申請中引用的全部參考文獻、專利和公開專利申請的內容均引入本文作為參考。實施例實施例1:抗CD19人單克隆抗體的制備抗原用B細胞肺瘤細胞系Raji(ATCC保藏號CCL-86)和Daudi(ATCC保藏號CCL-213)作為免疫用抗原。轉基因轉染色體KM-小鼠⑧用表達人抗體基因的轉基因轉染色體KM系小鼠制備抗CD19的完全人單克隆抗體。在這種小鼠系中，已經如Chen等(1993)EMBOJ.12:811-820所述將內源小鼠K輕鏈基因純合地破壞，并且已經如PCT公布WO01/09187的實施例1對于HuMab小鼠所述將內源小鼠重鏈基因純合地破壞。該小鼠攜帶人K輕鏈轉基因KCo5,如Fishwild等(1996)NatureBiotechnology14:845-851所述。該小鼠也攜帶人重鏈轉染色體SC20,如PCT公布WO02/43478所述。KM-小鼠⑧的免疫為了產生抗CD19的完全人單克隆抗體，用Raji或DaudiB細胞腫瘤細胞系免疫KM-小鼠⑧群體。一般性免疫方案在Lonberg,N.等(1994)Nature368(6474):856-859;Fishwild,D.等(1996)NatureBiotechnology14:845-851和PCT公開WO98/24884中描述。在第一次輸注抗原時小鼠為6-16周齡。利用細胞制劑腹膜內(IP)免疫小鼠(KM-小鼠):轉基因小鼠用在完全弗氏佐劑或Ribi佐劑中的抗原腹膜內免疫兩次，然后用在不完全弗氏佐劑或Ribi佐劑中的抗原IP免疫3-21天(最多可達總共11次免疫)。通過眼眶后采血監測免疫應答。通過ELISA對血漿進行篩選(如下文所述)，用具有足夠的抗-CD19人免疫球蛋白效價的小鼠進行融合。用抗原經靜脈內對小鼠進行加強免疫，3天后處死并取出脾臟。產生抗-CD19抗體的KM-小鼠⑧的選擇為了選擇產生可與CD19結合的抗體的KM-小鼠，如最初Fishwild，D.等人(1996)(同上)所述，通過改良的ELISA檢測來自被免疫小鼠的血清。簡要地說，用在PBS中濃度為l-2嗎/ml的純化重組CD19融合蛋白以50^d/孔的量包被微量滴定板，4。C下溫育過夜，然后用PBS中的5%BSA以200pl/孔封閉。將來自CD19免疫的小鼠的血漿稀釋液加入各孔中，在室溫下溫育1-2小時。用PBS/Tween洗滌培養板，然后與堿性磷酸酶偶聯的山羊抗人K輕鏈多克隆抗體在室溫下溫育1小時。洗滌后，培養板用pNPP底物顯色，并用分光光度計在OD415-650處分析。用顯示最高抗-CD19抗體效價的小鼠進行融合。如下文所述進行融合，通過ELISA4全測雜交瘤上清液的抗-CD19活性。產生抗CD19人單克隆抗體的雜交瘤的產生根據標準程序使用PEG或者使用CytoPulse大腔室細胞融合電穿孔儀(CytoPulseSciences,Inc.,GlenBurnie,MD)使用基于電場的電融合法將從KM-小鼠@中分離的小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞系融合。然后根據抗原特異性抗體的產生篩選獲得的雜交瘤。使用50%PEG(Sigma)將來自被免疫小鼠的脾淋巴細胞單細胞懸液與1/4數量的SP2/0非分泌型小鼠骨髓瘤細胞(ATCCCRL1581)融合。將細胞以約lxl0V孔的密度接種于平底微量滴定板上，然后在選擇性培養基中溫育約兩周，該培養基含有10%胎牛血清、10%P388D1(ATCC，CRLTIB-63)條件培養基、在DMEM(Mediatech,CRL10013,含有高濃度葡萄糖、L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉)中的3-5%origen(IGEN),力口5mMHEPES、0.055mM2-巰基乙醇、50mg/ml慶大霉素和lxHAT(Sigma，CRLP-7185)。1-2周后，將細胞在用HT替代了其中的HAT的培養基中培養。然后通過ELISA(如上所述)根據人抗CD19單克隆IgG抗體篩選各個孔。一旦發生廣泛的雜交瘤生長，則通常在10-14天后監測培養基。將分泌抗體的雜交瘤再次平板接種，再次篩選，并且如果對于人IgG仍然是陽性，則通過有限稀釋將抗CD19單克隆抗體亞克隆至少兩次。然后在體外培養穩定的亞克隆，以在組織培養基中產生少量的抗體用于進一步表征。選擇雜交瘤克隆21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、13F1和46E8進一步分析。實施例2:人單克隆抗體21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、13F1和46E8的結構表4正利用標準PCR技術從21D4雜交瘤中獲得編碼21D4和21D4a的單克隆抗體的重^^連和輕《連可變區的cDNA序列，并利用標準DNA測序技術進行測序。注意到21D4雜交瘤產生重鏈與兩條輕鏈(SEQIDNOs:8和9)之一配對的抗體。兩種抗體(即分別具有SEQIDNOs:1和8的Vh和Vl序列的21D4,和分別具有SEQIDNOs:1和9的Vh和Vl序列的21D4a)與CD19結合。編碼47G4、27F3、3C10、5G7、13F1和46E8單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區的cDNA序列分別利用標準PCR技術從21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、13F1和46E8雜交瘤獲得，并且利用標準DNA測序技術測序。21D4的重鏈可變區的核苷酸和氨基酸序列分別顯示于圖1A和SEQIDNO:59和1中。21D4的輕鏈可變區的核苷酸和氨基酸序列分別顯示于圖1B和SEQIDNO:66和8中。21D4重鏈免疫球蛋白序列與已知人種系免疫球蛋白重鏈序列的比較證明，21D4重鏈應用了來自人種系VH5-51的Vh區段、來自人種系3-10的D區段和來自人種系JH4b的JH區段。21D4Vh序列與種系VH5-51序列的比對顯示在圖8中。利用KabatCDR區測定系統對21D4Vh序歹'j的進一步分析勾畫出了重鏈CDR1、CDR2和CDR3區，分別如圖1A和8以及SEQIDNO:16、23和30所示。21D4輕鏈免疫球蛋白序列與已知人種系免疫球蛋白輕鏈序列的比較證明，21D4輕鏈應用了來自人種系VKL18的Vl區段和來自人種系JK2的Jk區段。21D4Vi序列與種系VKL18序列的比對顯示于圖15中。利用KabatCDR區測定系統對21D4V^序列的進一步分析勾畫出了輕鏈CDR1、CDR2和CDR3區，分別如圖1B和15以及SEQIDNO:37、44和51所示。21D4a的重鏈可變區的核苷酸和氨基酸序列分別顯示于圖1A和SEQIDNO:59和1中。21D4a的輕鏈可變區的核苷酸和氨基酸序列分別顯示于圖1C和SEQIDNO:67和9中。21D4a重鏈免疫球蛋白序列與已知人種系免疫球蛋白重鏈序列的比較證明，21D4a重鏈應用了來自人種系VH5-51的Vh區段、來自人種系3-10的D區段和來自人種系JH4b的JH區段。21D4aVH序列與種系VH5-51序列的比對顯示于圖8中。利用KabatCDR區測定系統對21D4aVH序列的進一步分析勾畫出了重鏈CDRl、CDR2和CDR3區，分別如圖1A和8以及SEQIDNO:16、23和30所示。21D4a輕鏈免疫球蛋白序列與已知人種系免疫球蛋白輕鏈序列的比較證明，21D4a輕鏈應用了來自人種系VKL18的Vl區段和來自人種系JK3的JK區段。21D4aV^序列與種系VKL18序列的比對顯示于圖16中。利用KabatCDR區測定系統對21D4aV^序列的進一步分析勾畫出了輕鏈CDR1、CDR2和CDR3區，分別如圖1C和16以及SEQIDNO:37、44和52所示。47G4的重鏈可變區的核苷酸和氨基酸序列分別顯示于圖2A和SEQIDNO:60和2中。47G4的輕鏈可變區的核苷酸和氨基酸序列分別顯示于圖2B和SEQIDNO:68和10中。47G4重鏈免疫球蛋白序列與已知人種系免疫球蛋白重鏈序列的比較證明，47G4重鏈應用了來自人種系VH1-69的VH區段、來自人種系1-69的D區段和來自人種系JH5b的JH區段。47G4Vh序列與種系VHl-69序列的比對顯示于圖9中。利用KabatCDR區測定系統對47G4Vh序列的進一步分析勾畫出了重鏈CDR1、CDR2和CDR3區，分別如圖2A和9以及SEQIDNO:17、24和31所示。47G4輕鏈免疫球蛋白序列與已知人種系免疫球蛋白輕鏈序列的比較證明，47G4輕鏈應用了來自人種系VKA27的VL區段和來自人種系JK3的JK區段。47G4Vl序列與神系VKA27序列的比對顯示于圖17中。利用KabatCDR區測定系統對47G4VL序列的進一步分析勾畫出了輕鏈CDR1、CDR2和CDR3區，分別如圖2B和17以及SEQIDNO:38、45和53所示。27F3的重鏈可變區的核苷酸和氨基酸序列分別顯示于圖3A和SEQIDNO:61和3中。27F3的輕鏈可變區的核苷酸和氨基酸序列分別顯示于圖3B和SEQIDNO:69和11中。27F3重鏈免疫球蛋白序列與已知人種系免疫球蛋白重鏈序列的比較證明，27F3重鏈應用了來自人種系VH5-51的VH區段、來自人種系6-19的D區段和來自人種系JH6b的JH區段。27F3Vh序列與種系VH5-51序列的比對顯示于圖10中。利用KabatCDR區測定系統對27F3Vh序列的進一步分析勾畫出了重鏈CDR1、CDR2和CDR3區，分別如圖3A和10以及SEQIDNO:18、25和32所示。27F3輕鏈免疫球蛋白序列與已知人種系免疫球蛋白輕鏈序列的比較證明，27F3輕鏈應用了來自人種系VKL18的Vl區段和來自人種系JK2的JK區段。27F3V^序列與種系VKL18序列的比對顯示于圖18中。利用KabatCDR區測定系統對27F3VL序列的進一步分析勾畫出了輕鏈CDR1、CDR2和CDR3區，分別如圖3B和18以及SEQIDNO:39、46和54所示。3C10的重鏈可變區的核苷酸和氨基酸序列分別顯示于圖4A和SEQIDNO:62和4中。3C10的輕鏈可變區的核苷酸和氨基酸序列分別顯示于圖4B和SEQIDNO:70和12中。3C10重鏈免疫球蛋白序列與已知人種系免疫球蛋白重鏈序列的比較證明，3C10重鏈應用了來自人種系VH1-69的VH區段、來自人種系l-26的D區段和來自人種系JH6b的Jh區段。3C10Vh序列與種系VHl-69序列的比對顯示于圖11中。利用KabatCDR區測定系統對3C10Vh序歹'j的進一步分析勾畫出了重鏈CDR1、CDR2和CDR3區，分別如圖4A和11以及SEQIDNO:19、26和33所示。3C10輕鏈免疫球蛋白序列與已知人種系免疫球蛋白輕鏈序列的比較證明，3C10輕鏈應用了來自人種系VKL15的Vl區段和來自人種系JK2的JK區段。3C10Vi序列與種系VKL15序列的比對顯示于圖19中。利用KabatCDR區測定系統對3C10V^序列的進一步分析勾畫出了輕鏈CDR1、CDR2和CDR3區，分別如圖4B和19以及SEQIDNO:40、47和55所示。5G7的重鏈可變區的核苷酸和氨基酸序列分別顯示于圖5A和SEQIDNO:63和5中。5G7的輕鏈可變區的核苷酸和氨基酸序列分別顯示于圖5B和SEQIDNO:71和13中。5G7重鏈免疫球蛋白序列與已知人種系免疫球蛋白重鏈序列的比較證明，5G7重鏈應用了來自人種系VH5-51的Vh區段、來自人種系3-10的D區段和來自人種系JH6b的JH區段。5G7Vh序列與種系VH5-51序列的比對顯示于圖12中。利用KabatCDR區測定系統對5G7VH序列的進一步分析勾畫出了重鏈CDR1、CDR2和CDR3區，分別如圖5A和12以及SEQIDNO:20、27和34所示。5G7輕鏈免疫球蛋白序列與已知人種系免疫球蛋白輕鏈序列的比較證明，5G7輕鏈應用了來自人種系VKL18的Vl區段和來自人種系JK1的Jk區段。5G7V^序列與種系VKL18序列的比對顯示于圖20中。利用KabatCDR區測定系統對5G7vl序列的進一步分析勾畫出了輕鏈CDR1、CDR2和CDR3區，分別如圖5B和20以及SEQIDNO:41、48和56所示。13F1的重鏈可變區的核苷酸和氨基酸序列分別顯示于圖6A和SEQIDNO:64和6中。13F1的輕鏈可變區的核苷酸和氨基酸序列分別顯示于圖6B和SEQIDNO:72和14中。13F1重鏈免疫球蛋白序列與已知人種系免疫球蛋白重鏈序列的比較證明，13F1重鏈應用了來自人種系VH5-51的VH區段、來自人種系6-19的D區段和來自人種系JH6b的Jh區段。13F1Vh序列與種系VH5-51序列的比對顯示于圖13中。利用KabatCDR區測定系統對13F1vh序列的進一步分析勾畫出了重鏈CDR1、CDR2和CDR3區，分別如圖6A和13以及SEQIDNO:21、28和35所示。13F1輕鏈免疫球蛋白序列與已知人種系免疫球蛋白輕鏈序列的比較證明，13F1輕鏈應用了來自人種系VKL18的VL區段和來自人種系JK2的JK區段。13F1V^序列與種系VKL18序列的比對顯示于圖21中。利用KabatCDR區測定系統對13F1vl序列的進一步分析勾畫出了輕鏈CDR1、CDR2和CDR3區，分別如圖6B和21以及SEQIDNO:42、49和57所示。46E8的重鏈可變區的核苷酸和氨基酸序列分別顯示于圖7A和SEQIDNO:65和7中。46E8的輕鏈可變區的核苷酸和氨基酸序列分別顯示于圖7B和SEQIDNO:73和15中。46E8重鏈免疫球蛋白序列與已知人種系免疫球蛋白重鏈序列的比較證明，46E8重鏈應用了來自人種系VH5-51的VH區段、來自人種系6-19的D區^:和來自人種系JH6b的JH區段。46E8Vh序列與種系VH5-51序列的比對顯示于圖14中。利用KabatCDR區測定系統對46E8Vh序歹'J的進一步分析勾畫出了重鏈CDR1、CDR2和CDR3區，分別如圖7A和14以及SEQIDNO:22、29和36所示。46E8輕鏈免疫球蛋白序列與已知人種系免疫球蛋白輕鏈序列的比較證明，46E8輕鏈應用了來自人種系VKL18的Vl區段和來自人種系JK2的Jk區^:。46E8V^序列與種系VKL18序列的比對顯示于圖22中。利用KabatCDR區測定系統對46E8VL序列的進一步分析勾畫出了輕鏈CDR1、CDR2和CDR3區，分別如圖7B和22以及SEQIDNO:43、50和58所示。實施例3:抗-CD19人單克隆抗體的結合特異性和結合動力學的表征在該實施例中，通過ELISA分析檢測了抗-CD19抗體21D4和47G4的結合親和力。通過ELISA測定的結合特異性微量滴定板用50|ul在PBS中的1.0|ag/ml純化的全長CD19-Fc融合蛋白包被，然后用150pl在PBS中的1%牛血清白蛋白封閉。使培養板溫育30分鐘至1小時，洗滌三次。向各個孔中加入HuMab抗CD19抗體47G4的稀釋液，并且在37。C下溫育1小時。用已知的鼠抗CD19抗體作為陽性對照。用PBS/Tween洗滌培養板，之后跟與辣才艮過氧化物酶偶聯的山羊抗人IgGK特異性第二試劑一起在37。C下溫育1小時。洗滌后，培養板用ABTS底物(1.46mMol/L)顯色，并且在OD490nm下分析。結果顯示在圖23中。CD19HuMab47G4與人CD19肽特異性結合。抗CD19抗體的表位作圖利用流式細胞術確定抗CD19HuMab的表位分組。抗CD19人單克隆抗體21D4、21D4a、3C10、5G7、5G7-N19K、5G7畫N19Q和13F1的表位結合如下評價溫育RajiB腫瘤細胞與0.3pg/ml生物化的21D4或21D4a抗CD19人單克隆抗體，洗滌，然后添加冷抗CD19人單克隆抗體。同種型對照抗體用作陰性對照。結合用FITC標記的抗人IgGAb檢測。流式細胞分析用FACScan流式細胞法(BectonDickinson,SanJose,CA)進行。結果顯示在圖24中。經分析數據，抗CD19抗體21D4、21D4a、3C10、5G7和13F1的竟爭相同的表位區。實施例4:CD19抗體與B細胞來源的腫瘤細胞系的結合通過流式細胞分析評價CD19HuMab與B細胞肺瘤系Raji和Daudi或與CHO-CD19轉染的細胞系的結合。用含有編碼CD19跨膜形式的全長cDNA的表達質粒轉染CHO細胞。Raji、Daudi和CD19-CHO細胞系與下列CD19HuMab之一溫育21D4、21D4a、47G4、5G7、5G7-N19K、5G7-N19Q、3C10或13F1。用已知的鼠抗CD19抗體作為陽性對照。洗滌細胞，通過藻紅蛋白標記的抗人或抗小鼠第二抗體檢測，并且通過流式細胞術分析。與CHO-CD19細胞系、DaudiB細胞系、RajiB細胞系和對RajiB細胞系的擴大結合組的結合結果分別顯示在圖25A、25B、25C和25D中。人抗CD19單克隆抗體21D4和47G4與CHO-CD19細胞系結合。人抗CD19單克隆抗體21D4、21D4a、47G4、5G7、5G7-N19K、5G7-N19Q、3C10和13F1與RajiB細胞系結合。抗CD19HuMab抗體21D4、21D4a、3C10、5G7、5G7畫N19K、5G7-N19Q和13F1的計算的ECs。值分別為0.1413、0.1293、0.2399、0.1878、0.2240、0.2167和0.2659。也顯示47G4結合DaudiB肺瘤細胞系。所有結果都顯示為通過染色的幾何平均熒光強度(GMFI)所測量的。這些數據顯示CD19蛋白在B細胞來源的腫瘤細胞系表面表達，并且抗CD19HuMab抗體21D4、21D4a、47G4、5G7、5G7-N19K、5G7-N19Q、3C10和13F1與細胞表面上表達的CD19結合。實施例5:抗-CDI9人抗體21D4和47G4與RajiB腫瘤細胞的Scatchard結合分析Raji細胞從ATCC獲得(保藏號CCL-86),并且在含有10%胎牛血清(FBS)的RPMI中生長。細胞用含有10%FBS的RPMI在4。C下洗滌2次，用含有10%胎牛血清的RPMI培養基(結合緩沖液，含有24mMTrispH7.2，137mMNaCl，2.7mNKC1,2mM葡萄糖，lmMCaCl2，lmMMgCl2,0.1%BSA)將細胞調節為4xl07細胞/ml。Millipore板(MAFBNOB)用溶于水中的1%脫脂奶粉包被，4。C貯存過夜。用結合緩沖液洗板，向Millipore96孔玻璃纖維濾板的對照孔(非特異性結合NSB)中加入25|nl未標記的抗體(1000倍過量)。向最大結合對照孔中只加入25(il緩沖液(總結合)。加入在結合緩沖液中的25)^1不同濃度的"5l-抗-CD19抗體21D4或47G4和25^1Raji細胞(4xl0細胞/ml)。培養板在4。C搖床上以200RPM溫育2小時。在溫育結束時用0.2ml冷結合緩沖液(24mMTrispH7.2,500mMNaCl，2.7mNKC1，2mM葡萄糖，lmMCaCl2,lmMMgCl2,0.1%BSA)洗Millipore板3次。取出濾板，在y計數儀中計數。使用Prism軟件(SanDiego，CA)用單位點結合參數進行平衡結合的評價。利用上述Scatchard結合試驗，該抗體對Raji細胞的Ko分別為，21D4約為2.14nM,47G4約為12.02nM。實施例6:抗CD19單克隆抗體的內化利用Hum-Zap內化試驗檢測抗CDl9HuMAb內化到表達CD19的RajiB腫瘤細胞或CD19轉染的人CHO細胞內的能力。Hum-Zap檢測第一人抗體通過第二抗體的結合的內化，該第二抗體對偶聯到毒素皂草素上的人IgG具有親和力。CHO-CD19或RajiB腫瘤細胞系以l.OxlO4細胞/孔接種到100|il孔中過夜或者次日兩小時。抗CD19抗體21D4或47G4以30nM的起始濃度添加到孔中，并且以1:3的連續稀釋倍數向下滴定。用非CD19特異性的人同種型對照抗體作為陰性對照。Hum-Zap(AdvancedTargetingSystems,IT-22畫25)以11nM的濃度加入，并且將板溫育48小時。然后將板用1.0pCi311-胸苷脈沖18-24小時，收獲，并且用TopCount閃爍計數儀(PackardInstruments)讀數。CHO-CD19和B肺瘤細^^的內化結果分別顯示在圖26A和26B中。只有HuMAb47G4在CHO-CD19細胞上檢測。抗CD19抗體47G4在CHO-CD19細胞上顯示抗體濃度依賴性的3H-胸苷摻入減少。21D4和47G4HuMAb在RajiB肺瘤細胞上都顯示抗體濃度依賴性的311-胸苷摻入減少。該數據證實抗CD19抗體21D4和47G4內化到表達CD19的CHO-CD19轉染細胞和B腫瘤細胞內。實施例7:毒素偶聯的抗CD19抗體的細胞殺傷的評價在該實施例中，通過胸苷摻入試驗檢測了與毒素偶聯的抗CD19單克隆抗體殺傷CD19+細胞系的能力。抗CD19單克隆抗體通過連接體如肽基、腙或二硫鍵連接體與毒素偶聯。CD19+表達Raji細胞系以2.5x104細胞/孔接種3小時。向孔中添加起始濃度為30nM的抗CD19抗體-毒素偶聯物，并且以1:3的連續稀釋倍數向下滴定。用非CD19特異性的同種型對照抗體作為陰性對照。10倍過量的冷抗體21D4a或同種型對照抗體用于竟爭結合。使板溫育69小時。然后將板用1.0pC"H-胸苷脈沖24小時，收獲，并且用TopCount閃爍計l丈4義(PackardInstruments,Meriden,CT)讀數。結果與EC50值一起顯示在圖27中。該數據證實抗CD19抗體21D4殺死RajiB細胞腫瘤細胞。實施例8:應用抗CD19抗體對體內B細胞腫瘤的治療在該實施例中，植入癌性B細胞肺瘤的SCID小鼠用棵抗CD19抗體或毒素偶聯的抗CD19抗體在體內處理，以4全查這些抗體對肺瘤生長的體內效果。毒素偶聯的抗CD19抗體如上所述制備。缺乏功能性B和T淋巴細胞的重度聯合免疫缺陷(SCID)小鼠用于研究B細胞惡性肺瘤。靜脈內注射來自RamosB肺瘤細胞系的細胞。小鼠用19.6mg/kg毒素偶聯的抗CD19抗體或30mg/kg棵抗CD19抗體處理。用同種型對照抗體或配制緩沖液作為陰性對照。動物通過腹膜內注射大約200jul含有抗體或載體的PBS而給藥。抗體-毒素偶聯物作為單一劑量在第7天注射，而棵抗體作為單一劑量預防模型在第1天注射，或者作為治療模型在第7、14、21天注射。每日監測小鼠的后腿麻痹，共約6周。使用電子卡尺從三個維度上測量腫瘤(高度x寬度x長度)，并計算腫瘤體積。當后腿麻痹時，對小鼠行安樂死。通過Kaplan-Meier分析證實(圖28),在用毒素偶聯的抗CDl9抗體、預防性施用的棵抗CD19抗體、或作為治療方案施用的抗CD19抗體治療后，平均存活時間延長。所顯示的平均存活時間的最大延長在使用棵抗CD19抗體進行預防性治療時達到。也測量了體重的變化，并且將其計算為體重變化百分比。該數據顯示在圖29中。在30天期間，使用一種毒素-偶聯的抗體使體重具有凈增長變化，使用抗體和毒素(非偶聯物)導致體重的凈降低變化。利用預防性棵抗CD19抗體或抗CD19抗體治療方案，體重具有凈增長變化。實施例9:使用棵抗CD19抗體治療體內腫瘤異種移植模型植入淋巴瘤的小鼠用棵抗CD19抗體體內治療，以檢查抗體對腫瘤生長的體內效果。ARH-77(人B淋巴母細胞白血病；ATCC保藏號CRL-1621)和Raji(人B淋巴細胞伯基特淋巴瘤；ATCC保藏號CCL-86)細胞在體外用標準實施方案程序增殖。6-8周齡的雄性CB17.SCID小鼠(Taconic,Hudson,NY)每只小鼠在右脅下皮下才直入在0.2mlPBS/Matrigel(l:l)中的5xl06ARH-77或Raji細胞。對小鼠稱重，在植入后每周兩次使用電子卡尺測量肺瘤的三個維度。肺瘤體重計算為高度x寬度x長度/2。帶有平均為80mn^的ARH-77肺瘤或平均為170mm、々Raji腫瘤的小鼠隨機分入治療組。在第0天，給小鼠腹膜內施用PBS載體、同型對照抗體或棵抗-CD19HuMAb2H5。當腫瘤達到肺瘤終點(2000mm3)時對小鼠行安樂死。結果顯示在圖30A(ARH-77腫瘤)和30B(Raji胂瘤)中。棵抗-CD19抗體21D4延長了達到腫瘤終點體積(2000mm3)的平均時間，并且減慢了腫瘤生長的進展。因此，單獨用抗-CD19抗體治療對肺瘤生長具有直接的體內抑制作用。實施例10:非巖藻一唐基化HuMAb的產生已經證實具有減少的巖藻糖基殘基的抗體提高了抗體的ADCC能力。在該實施例中，生產了缺乏巖藻糖基殘基的抗-CD19HuMAb21D4。缺乏巖藻糖基轉移酶基因FUT8(Biowa,Inc.,Princeton,NJ)的CHO細月包系Ms704-PF用表達抗體21D4的重鏈和輕鏈的載體電穿孔。通過在含有6mML-谷氨酰胺和500pg/mlG418(Invitrogen,Carlsbad,CA)的Ex-Cell325-PFCHO培養基(JRHBiosciences,Lenexa，KS)中生長而選擇耐藥性克隆。通過標準ELISA試驗針對IgG的表達來篩選克隆。通過CE-LIF對MAb的寡糖表征來源于CHO巖藻糖基化細胞系的抗CD19抗體衍生的N連接的寡糖和Ms704-PF衍生的抗CD19單克隆抗體樣品的對比分析通過毛細管電泳激光誘導的熒光(cLIF)來進行(Chen和Evangelista(1998)Electrophoresis15:1892)。通過樣品與12.5mUPNGaseF(Prozyme)在40。C下溫育過夜，從IgG樣品(lOOjiig)上釋放純化的抗體的N-連接的寡糖。在使用的條件下，從在CHO巖藻糖基化和非巖藻糖基化細胞中表達的HuMAb21D4的Fc部分上釋放N-連接的聚糖。經乙醇沉淀除去MAb蛋白后，含有聚糖的上清液通過真空離心干燥，并且在溫和還原胺化條件下重懸浮在19mM8-氨基芘-l，3，6-三磺酸酯(APTS)(Beckman)中，其中脫唾液酸化和巖藻糖殘基的丟失最小化(在THF(Sigma)中15%乙酸和1M氰硼氬化鈉)。聚糖標記反應在40。C下繼續過夜，隨后用水將樣品稀釋25倍。將APTS標記的聚糖加到在P/ACEMDQCE系統(Beckman)上具有激光誘發的熒光的毛細管電泳中，其具有反極性，使用50|Lim內徑和50cm有效長度的N-CHO包^皮的毛細管(Beckman)。壓力(8秒)注射樣品，并且使用碳水化合物分離凝膠緩沖液(Beckman)在2(TC和25kV下分離20分鐘。應用具有3mW氬離子激光的激光誘發的熒光檢測系統(Beckman)在488nm的激發波長和520nm的發射波長下監測分離(Ma和Nashabeh(1999)Anal.Chem,71:5185)。在從巖藻糖基化細胞系獲得的抗體和從Ms704-PF細胞系獲得的抗體之間觀察到寡糖譜的差異，這與Ms704-PF衍生的抗CD19抗體中不存在巖藻糖殘基一致。使用HPAE-PAD通過HPLC的單糖分析使用2NTFA(用于估計中性糖)或6NHC1(用于估計氨基糖)在100。C下對IgG樣品(200pg)進行酸解4小時。通過在室溫下真空離心將樣品干燥，并用200|li1水重建，之后進行HPAE-PAD分析(Dionex)。單糖用具有前置柱氨基捕獲器(AminoTrap)和硼酸鹽捕獲器的CarboPacPA104x250mm柱(Dionex)分離。步驟按照DionexTechnicalNote53進行。利用單糖標準(Dionex)測定單糖峰的身份和相對豐度。也用標準毛細管等電聚焦試劑盒試驗(BeckmanCoulter)檢測了非巖藻糖基化抗CD1921D4抗體。該試驗觀察到，巖藻糖基化^D4的pi值為pH8.45,巖藻糖基化21D4a的pi值為8.44和8.21,非巖藻糖基化21D4抗體的pi值為8.52和8.30。實施例11:抗CD19抗體的ADCC活性的評價在該實施例中，在焚光細胞毒性試驗中檢測了巖藻糖基化和非巖藻糖基化抗CD19單克隆抗體在效應細胞存在下通過抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)殺傷CD19+細胞的能力。非巖藻糖基化人抗CD19單克隆抗體21D4如上所述制備。人效應細胞如下所述從全血中制備。通過標準Ficoll-paque分離法從肝素化的全血中純化人外周血單核細胞。將該細胞重懸浮在含有10%FBS(培養基)和200U/ml人IL-2的RPMI1640培養基中，并在37°C下溫育過夜。次日，收集細胞，用培養基洗一次，并以2xl07細胞/ml的濃度重懸浮。在補充2.5mM丙磺舒(probenecid)(試驗基質)的培養基中耙CD19+細胞與BATDA試劑(PerkinElmer，Wellesley，MA)以每1x106靶細胞2.5^1BATDA的比例37。C溫育20分鐘。用含有20mMHEPES和2,5mM丙磺舒的PBS洗滌靶細胞4次，離心，使得在測定基質中的終濃度為1x1()S細胞/ml。如下所述，利用Delfia焚光發射分析檢測CD19+細胞系ARH-77(人B淋巴母細胞白血病；ATCC保藏號CRL-1621)對巖藻糖基化和非巖藻糖基化人抗CD19單克隆抗體21D4的抗體特異性ADCC。耙細胞系ARH-77(100pl標記的靶細胞)與50(al效應細胞和50pl21D4或非巖藻糖基化21D4抗體一起溫育。在整個實驗過程中均使用1:50的革巴效比。使用人IgGl同種型對照作為陰性對照。在以2100rpm離心和37。C溫育1小時后，收集上清液，再次快速離心，將20|il上清液轉移到平底板上，向其中加入180(ilEu溶液(PerkinElmer，Wellesley,MA)，在FusionAlphaTRF讀板機(PerkinElmer)上讀數。裂解百分比如下計算(樣品釋放-自發釋放x100)/(最大釋放-自發釋放)，其中自發釋放是只含靶細胞的孔的熒光，最大釋放是含有靶細胞并且用3%Lysol處理的孔的熒光。對于ARH-77細胞系的細胞毒性％特異性裂解顯示在圖31中。CD19+表達細胞系ARH-77顯示與HuMAb抗-CD19抗體21D4有關的抗體介導的細胞毒性，以及與非巖藻糖基化形式的抗-CD19抗體21D4相關的特異性裂解百分比的提高。該數據證實非巖藻糖基化HuMAb抗-CD19抗體顯示對CD19+表達細胞的特異性細胞毒性增加。實施例12:通過差示掃描量熱法測定的抗-CD19單克隆抗體的熱穩定性使用熔解溫度的量熱分析比較了抗-CD19單克隆抗體的熱穩定性。熔解溫度的量熱測量tm在與自動采樣器組合的VP-毛細管DSC差示掃描量熱儀平臺(MicroCalLLC,Northampton,MA,USA)上進行。樣品細胞體積為0.144mL。糖基化和脫糖基化形式的抗體的變性數據通過將濃度為2.3|uM的該樣品以l。C/min的速度從30。C加熱到95°C來進行。蛋白質樣品存在于pH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)中。在參比細胞中使用相同的緩沖液，來通過比較獲得摩爾熱容。使用軟件Originv7.0將觀察到的熱解曲線對基線進行修正，并且基于2狀態模型分析標準化的數據。數據顯示在表2中。表2.抗-CD19抗體的熱穩定性測量克隆熱穩定性Tml(°C)21D468.721D4a69.75G768.55G7IgG467.413F1IgG468.446E866.447G467.2實施例13:糖基化位點的評價通過序列分析發現HuMAb抗CD19抗體5G7在可變區具有N-X-S/T糖基化基序。N-連接的序列位點(N-X-S/T)的存在是必需的，但是不足以向MAb上添加碳水化合物。也就是說，可能具有由于蛋白質折疊和溶劑可及性而實際上沒有添加碳水化合物的N-X-S/T序列。5G7可變區中糖基化位點的確證通過LC-MS和Western分析進行。液相色譜-質譜(LC-MS)是測定蛋白質如抗體的質量的標準方法。在分析前，通過將樣品與12.5mUPNGaseF(Prozyme)在40°C下溫育過夜，將抗CD19HuMAb5G7和13F1的N-連接的寡糖從IgG樣品(100pg)上釋放下來。在使用的條件下，N-連接的聚糖從HuMAb的Fc部分上釋放下來。對于克隆5G7，我們觀察到兩個高豐度的質量；一個(49,855Da)對應于經PNGaseF消化在保守的N-連接位點(N297)處除去恒定區中的糖后預測的質量，第二個質量(52,093Da)符合在第二個位點處添加碳水化合物的情況。我們發現PNGaseF消化未除去Fab-區聚糖；因此，該數據支持克隆5G7的可變區中存在碳水化合物。對于克隆13F1，觀察的質量與未連接碳水化合物的蛋白質序列的預測質量相一致。為了證實上述結果，我們使用碳水化合物特異性染色方法對克隆5G7和13F1的Fab片萃殳進4亍了WesternBlot試-瞼。通過向含1mM半胱氨酸的25pglgG樣品中添加1，25ng活化的木瓜蛋白酶產生Fab和Fc片段。樣品在4(TC下溫育4小時，用30mM碘乙酰胺終止反應。通過4-20%Tris-甘氨酸SDS-PAGE隨后通過電轉印到PVDF膜上分析樣品。印跡的碳水化合物特異性染色用GelCode糖蛋白染色試劑盒(Pierce)按照廠商推薦的方案進行。結果在5G7抗體中檢測到Fab糖基化，而在13F1抗體中沒有。這些結果表明5G7抗體在Fab區中糖基化。如上所述，抗CD19單克隆抗體5G7含有具有糖基化位點的可變區。由于可變區中的糖基化位點可能由于抗原結合改變而導致抗體的免疫原性提高或pK值改變，因此突變可變區N-X-S/T糖基化基序以減少糖基化可能是有利的。使用標準分子生物學方法，修飾5G7抗體序列，以將開始于位點19的N-I-S序列改變為K國I鄰G7-N19K)或Q-I-S(5G7畫N19Q)。實施例14:通過熒光光譜法測定的抗CD19單克隆抗體的穩定性通過熒光光譜法測量化學變性的中點來比^^抗CD19單克隆抗體的穩定性。化學變性的焚光測量在具有Micromax讀板器的SPEXFluorolog3.22(SPEX，Edison，NJ)上進行。對在PBS緩沖液中以16種不同濃度的鹽酸胍平衡24小時的抗體樣品進行測量。測量在黑色、小體積、非結合的表面384孔板(Corning,Acton,MA)中進行，并且在12|iL的孔體積中需要2|uM抗體。在280nm處激發熒光，發射光i普在300-400nm之間測量。掃描速度為每nm1秒，裂縫設置為5nm帶通。用PBS作為緩沖液空白，從數據中自動減除。數據顯示在表3中。表3.抗CD19抗體的焚光穩定性<table>tableseeoriginaldocumentpage94</column></row><table>實施例15:使用抗CD19抗體治療體內B細胞Raji腫瘤在該實施例中，用棵抗CD19抗體或毒素偶聯的抗CD19抗體在體內治療植入癌性B細胞腫瘤的SCID小鼠，以4企查該抗體對腫瘤生長的體內效果。毒素偶聯的抗CD19抗體如上所述制備。利用缺乏功能性B和T淋巴細胞的重度聯合免疫缺陷(SCID)小鼠研究B細胞惡性腫瘤。皮下注射來自RajiB腫瘤細胞系的細胞。小鼠用30mg/kg抗體或0.3^M/kg(毒素)抗體-毒素偶聯物治療。用同種型對照抗體或配制緩沖液作為陰性對照。給動物腹膜內注射大約200pl含有抗體或載體的PBS進行給藥。抗體作為單劑量(SD)在第0天注射，或者作為重復劑量(RD)在第0、7、14天注射。每天使用電子卡尺監測小鼠的腫瘤生長；測量腫瘤的三個維度(高度x寬度x長度/2)，計算肺瘤體積。當肺瘤達到肺瘤終點(2000mm3)或顯示大于20%的體重減輕時對小鼠行安樂死。結果顯示在圖32中。在每種情況中，抗CD19抗體都比陰性對照顯示更小的肺瘤體積，毒素偶聯抗體比棵抗體治療顯示更小的肺瘤體積。也測量了體重的變化，并將其計算為體重變化百分比。結果顯示在圖33中。結果表明使用毒素偶聯抗體得到體重的凈降低變化，使用載體或棵抗體得到體重的凈增長。實施例16:食蟹猴中的B細胞研究在該實施例中，給食蟹猴靜脈內注射親本抗CD19抗體或非巖藻糖基化(nf)的抗CD19抗體。給藥后測量絕對白細胞計數和白細胞亞群，并與給藥前的值進行比較。采自食蟹猴的血樣用親本抗CD19抗體或非巖藻糖基化的抗CD19抗體染色，并且使用標準方法進行FACS分析。來自研究中包括的所有猴的B細胞用親本和非巖藻糖基化的抗CD19抗體都染色為陽性。每組包括兩只;維性和兩只雌性猴。在第-7天和給藥前采集血樣。通過隱靜脈進行慢大丸劑靜脈注射，給動物施用lmg/kg親本或非巖藻糖基化的抗CD19抗體。給藥后24、48、72小時和第7、14、21、28天采集血樣。采集血樣進行PK測定、血液學和流式細胞分析。在每一時間點，監測血液的下列細胞表面抗原CD2+/CD20+(所有淋巴細胞)，CD20+(B-淋巴細胞)，CD3+(T-淋巴細胞),CD3+/CD4+(T-輔助淋巴細胞)，CD3+/CD8+(T-細胞毒性淋巴細胞)，CD3-/CD16+(NK纟田月包)，CD3-/CD14+(單核細胞)。圖34顯示了與第-7天和給藥前的平均值相比CD20陽性細胞數的變化。親本抗CD19抗體在24小時后誘導CD20陽性B細胞數減少55%,非巖藻糖基化的抗體產生更強的抑制，B細胞數下降大約90%。在非巖藻糖基化抗CD19組中，B細胞計數在治療后第2、3、7天保持在該水平上，而親本抗體開始恢復到基線。圖35顯示每只個體猴的CD20陽性細胞相對于基線的％變化。與親本抗CD19抗體相比，用非巖藻糖基化抗CD19抗體處理的所有4只猴都顯示更顯著的CD20陽性細胞百分數下降。這些數據結合起來表明非巖藻糖基化抗CD19抗體在排除循環B細胞方面比親本抗體更有效。實施例17:抗CD19抗體的免疫組化研究為了評價HuMab抗-CD19的組織結合分布，在一組正常的(非腫瘤)人組織中檢查了FITC偶聯的21D4(21D4-FITC,F:P=4)和非巖藻糖基化的21D4(nf21D4)(nf21D4-FITC,F:P=3),這些組織包括脾、扁桃腺、小腸、小腦、大腦、心臟、肝臟、肺和腎(l-2個樣品/每個組織)，以及B細胞肺瘤，包括慢性淋巴細胞性白血病、濾泡性、淋巴瘤、邊緣區淋巴瘤、外套細胞'淋巴瘤、B系彌散性大細月包淋巴瘤(1-2個樣品/每個肺瘤)。非巖藻糖基化21D4抗體如上所述制備。用FITC偶聯的Hu-IgG,(Hu-IgG廣FITC)作為同種型對照抗體。驟凍的并且OCT包埋的正常和淋巴瘤組織購自CooperativeHumanTissueNetwork(Philadelphia,PA)或NationalDiseaseResearchInstitute(Philadelphia,PA)。5(am的冷凍切片用丙酮在室溫下固定10分鐘，在使用前貯存于-80°C。使用EnVision+System(Dako.Carpinteria，CA)按照我們的常規方案進行間接過氧化物酶免疫染色。簡要來說，將切片用PBS(Sigma，St.Louis,MO)洗滌兩次，然后與DakoEnVision+System提供的過氧化物酶封閉液溫育10分鐘。用PBS洗滌兩次后，將切片與補充1%人丫球蛋白和1mg/ml熱聚集的人IgG的Dako蛋白封閉液溫育20分鐘，以封閉非特異性結合位點。然后，向切片上加第一抗體(21D4-FITC和nf21D4-FITC,0.4或2嗎/ml)或同種型對照(Hu-IgGl-FITC，0.4或2|ug/ml),并溫育1小時。用PBS洗滌三次后，將切片與小鼠抗FITC抗體(20嗎/ml)—起溫育30分鐘。用PBS另外洗滌三次后，切片與DakoEnVision+System提供的過氧化物酶偶聯的抗小鼠IgG聚合物一起溫育30分鐘。最后，如上所述洗滌切片，并與DakoEnVision+System提供的DAB底物-發色團溶液反應6分鐘。然后用去離子水洗滌切片，按照常規組織學程序用Mayer蘇木精(Dako)復染，脫水，清潔，并蓋上玻片Permount(FischerScientific,FairLawn,NJ)。在淋巴樣或富含淋巴樣組織(脾、扁桃腺和小腸)和淋巴瘤組織中觀察21D4-FITC和nf21D4-FITC的特異性染色。在脾和扁桃腺中，強特異性染色主要分布在B細胞區，即脾的淋巴結、扁桃腺的外套層和生發中心。在小腸中，強特異性染色主要位于派伊爾淋巴集結或集合淋巴結中，在粘膜固有層中的擴散淋巴細胞中有弱至'J強的染色。強染色也表現在濾泡性淋巴瘤和邊緣區淋巴瘤的腫瘤細胞中，在慢性淋巴細胞性白血病、B系彌散性大細胞淋巴瘤和外套細胞淋巴瘤中有中到強的染色。在正常的小腸、小腦、大腦、心臟、肝臟、肺和腎組織中，除了在肺和腎組織中的局灶性淋巴細胞或集合中有一些染色之外，用21D4-FITC或nf21D4-FITC染色時沒有觀察到明顯的染色。另外，這些組織在可達lOpg/ml的較高濃度下染色。類似地，與同種型對照抗體相比沒有觀察到特異性染色。21D4-FITC和nf21D4-FITC的比4交在所有組織中顯示類似的染色沖莫式。特異性染色在0.4ng/ml時飽和或接近飽和。然而，21D4-FITC的染色強度比nf21D4-FITC大約強0.5-1級。這可能部分是由于21D4-FITC的較高的F:P比(4相對于3)。實施例18:抗CD19抗體的細胞殺傷的評價在該實施例中，利用胸苷摻入試驗檢測了單獨的或與毒素偶聯的抗CD19單克隆抗體殺傷CD19+細胞系的能力。抗CD19單克隆抗體通過連接體如肽基、腙或二硫鍵連接體與毒素偶聯。CD19+表達Raji或SU-DHL-6細胞系以lx104細胞/孔接種。向孔中添加起始濃度為30nM的單獨的抗CD19抗體或抗CD19抗體-毒素偶聯物，并且以1:3的連續稀釋倍數向下滴定，共8個稀釋度。用非CD19特異性的同種型對照抗體作為陰性對照。使板溫育69小時。然后將板用0.5fiCi3H-胸苷脈沖24小時，收獲，并且用TopCount閃爍計數儀(PackardInstruments,Meriden，CT)讀數。結果與EC50值一起顯示在圖36中。圖36A顯示棵抗體對于Raji細胞的結果。圖36B顯示棵抗體對于SU-DHL-6細胞的結果。圖36C顯示毒素偶聯的抗CD19抗體對于SU-DHL-6細胞的結果。該數據證實抗CD19抗體21D4結合并殺死RajiB細胞胂瘤細胞，并且對SU-DHL-6細胞具有意外的高水平的細胞殺傷。實施例19:B細胞排除研究為了確定抗CD19抗體是否能夠排除B細胞，建立了全血B細胞排除試驗。人全血購自AllCellsInc.(Berkeley,CA)，并且在同一天在室溫下運輸。2ml全血在存在或不存在l-30mg/ml的指定抗體或作為未處理組的PBS的條件下溫育。血-抗體混合物在37。C和5。/。C02下溫育過夜。在實驗當天，通過溫育10分鐘然后離心，用RBS裂解緩沖液以1:10的比例裂解血液兩次。在第二次離心后，細胞沉淀物用FACS緩沖液(PBS+4丐和鎂，含有2%FBS和20。/o維爾烯)洗滌一次，然后使用標準流式細胞分析方案，用作為T細胞標記物的抗CD3抗體(BectonDickinson目錄號#555332)和作為B細胞標記物的抗CD22抗體(BectonDickinson目錄號#340708)進行FACS染色。細胞在冰上溫育20分鐘，之后最終洗滌，并且重懸浮在5mg/ml在FACS緩沖液中的碘化丙錠(Sigma目錄號#P4864)溶液中。使用BectonDickinson的FASCalibur系統和CeliQuest軟件通過流式細胞分析收集數據，并且使用FiowJo軟件利用淋巴細胞大小門控(gating)進行分析。通過測定非處理組中的％陽性B細胞減去抗體處理組中的％陽性B細胞除以非處理組中的％陽性B細胞乘以100來計算變化百分比。結果顯示在表4中。來自健康獻血者的血液在溫育過夜(無抗體)后保留了8.7%的B細胞。與未處理的、無抗體組相比，全血與30mg/ml陽性對照Rituxan溫育導致B細胞數排除46%。非巖藻糖基化(nf)抗CD19抗體處理組對B細胞排除具有顯著的影響，抑制B細胞約40%。親本抗體對B細胞數具有中度的影響。表4.全血的B-細胞排除<table>tableseeoriginaldocumentpage99</column></row><table>序列表概述<table>tableseeoriginaldocumentpage99</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage100</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage101</column></row><table>權利要求1.一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分或片段，其中該抗體(a)以1×10-7M或更低的KD與人CD19結合；且(b)與Raji和DaudiB細胞腫瘤細胞結合。2.權利要求1的抗體，其為人抗體。3.權利要求1的抗體，其為嵌合抗體或人源化抗體。4.權利要求2的抗體，其為IgGl或IgG4同種型的全長抗體。5.權利要求2的抗體，其為抗體片段或單鏈抗體。6.權利要求2的抗體，其中所述抗體是非巖藻糖基化的。7.權利要求2的抗體，其中所述抗體以5xl(T8M或更低的KD與人CD19結合。8.權利要求2的抗體，其中所述抗體以5xl(T9M或更低的KD與人CD19結合。9.權利要求2的抗體，其中所述抗體具有高于65。C的熱穩定性溫度。10.權利要求2的抗體，其中人CD19包括具有如SEQIDNO:79[Genbank登錄號NM一001770]所示氨基酸序列的多肽。11.一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分或片段，其中該抗體與參比抗體交叉竟爭結合CD19,其中該抗體(a)以lxl(r7M或更低的Kd與人CD19結合；且(b)與Raji和DaudiB細胞腫瘤細胞結合。12.權利要求ll的抗體，其中所述參比抗體包括(a)包含SEQIDNO:1的氨基酸序列的重鏈可變區；和(b)包含SEQIDNO:8的氨基酸序列的輕鏈可變區。13.權利要求11的抗體，其中所述參比抗體包括(a)包含SEQIDNO:1的氨基酸序列的重鏈可變區；和(b)包含SEQIDNO:9的氨基酸序列的輕鏈可變區。14.權利要求ll的抗體，其中所述參比抗體包括(a)包含SEQIDNO:2的氨基酸序列的重鏈可變區；和(b)包含SEQIDNO:10的氨基酸序列的輕鏈可變區。15.權利要求ll的抗體，其中所述參比抗體包括(a)包含SEQIDNO:3的氨基酸序列的重鏈可變區；和(b)包含SEQIDNO:11的氨基酸序列的輕鏈可變區。16.一又利要求ll的抗體，其中所述參比抗體包括(a)包含SEQIDNO:4的氨基酸序列的重鏈可變區；和(b)包含SEQIDNO:12的氨基酸序列的輕鏈可變區。17.權利要求ll的抗體，其中所述參比抗體包括(a)包含SEQIDNO:5的氨基酸序列的重鏈可變區；和(b)包含SEQIDNO:13的氨基酸序列的輕鏈可變區。18.權利要求ll的抗體，其中所述參比抗體包括(a)包含SEQIDNO:6的氨基酸序列的重鏈可變區；和(b)包含SEQIDNO:14的氨基酸序列的輕鏈可變區。19.權利要求ll的抗體，其中所述參比抗體包括(a)包含SEQIDNO:7的氨基酸序列的重鏈可變區；和(b)包含SEQIDNO:15的氨基酸序列的輕鏈可變區。20.—種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分或片段，其包括產自或源自人VH5-51基因或人VHl-69基因的重鏈可變區，其中該抗體與CD19特異性結合。21.—種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分或片段，其包括產自或源自人VkL18基因、VkA27基因或人VKL15基因的輕鏈可變區，其中該抗體與CD19特異性結合。22.權利要求21的分離的單克隆抗體或其抗原結合部分或片段，其還包括產自或源自人VH5-51基因或人VH1-69基因的重鏈可變區。23.權利要求1的抗體，其包括(a)包含SEQIDNO:16的重鏈可變區CDR1;(b)包含SEQIDNO:23的重鏈可變區CDR2;(c)包含SEQIDNO:30的重鏈可變區CDR3;(d)包含SEQIDNO:37的輕鏈可變區CDR1;(e)包含SEQIDNO:44的輕鏈可變區CDR2;和(f)包含SEQIDNO:51的輕鏈可變區CDR3。24.權利要求1的抗體，其包括(a)包含SEQIDNO:16的重鏈可變區CDR1;(b)包含SEQIDNO:23的重鏈可變區CDR2;(c)包含SEQIDNO:30的重鏈可變區CDR3;(d)包含SEQIDNO:37的輕鏈可變區CDR1;(e)包含SEQIDNO:44的輕鏈可變區CDR2;和(f)包含SEQIDNO:52的輕鏈可變區CDR3。25.權利要求1的抗體，其包括(a)包含SEQIDNO:17的重《連可變區CDR1;(b)包含SEQIDNO:24的重鏈可變區CDR2;(c)包含SEQIDNO:31的重鏈可變區CDR3;(d)包含SEQIDNO:38的輕鏈可變區CDR1;(e)包含SEQIDNO:45的輕鏈可變區CDR2;和(f)包含SEQIDNO:53的輕鏈可變區CDR3。26.權利要求1的抗體，其包括(a)包含SEQIDNO:18的重鏈可變區CDR1;(b)包含SEQIDNO:25的重鏈可變區CDR2;(c)包含SEQIDNO:32的重鏈可變區CDR3;(d)包含SEQIDNO:39的輕鏈可變區CDR1;(e)包含SEQIDNO:46的輕鏈可變區CDR2;和(f)包含SEQIDNO:54的輕4連可變區CDR3。27.權利要求1的抗體，其包括(a)包含SEQIDNO:19的重4連可變區CDR1;(b)包含SEQIDNO:26的重鏈可變區CDR2;(c)包含SEQIDNO:33的重鏈可變區CDR3;(d)包含SEQIDNO:40的輕鏈可變區CDR1;(e)包含SEQIDNO:47的輕鏈可變區CDR2;和(f)包含SEQIDNO:55的輕鏈可變區CDR3。28.權利要求1的抗體，其包括(a)包含SEQIDNO:20的重鏈可變區CDR1;(b)包含SEQIDNO:27的重鏈可變區CDR2;(c)包含SEQIDNO:34的重鏈可變區CDR3;(d)包含SEQIDNO:41的輕鏈可變區CDR1;(e)包含SEQIDNO:48的輕鏈可變區CDR2;和(f)包含SEQIDNO:56的輕鏈可變區CDR3。29.^l利要求1的抗體，其包括(a)包含SEQIDNO:21的重鏈可變區CDR1;(b)包含SEQIDNO:28的重4連可變區CDR2;(c)包含SEQIDNO:35的重鏈可變區CDR3;(d)包含SEQIDNO:42的輕鏈可變區CDR1;(e)包含SEQIDNO:49的輕鏈可變區CDR2;和(f)包含SEQIDNO:57的輕鏈可變區CDR3。30.權利要求1的抗體，其包括(a)包含SEQIDNO:22的重鏈可變區CDR1;(b)包含SEQIDNO:29的重鏈可變區CDR2;(c)包含SEQIDNO:36的重鏈可變區CDR3;(d)包含SEQIDNO:43的輕《連可變區CDR1;(e)包含SEQIDNO:50的輕鏈可變區CDR2;和(f)包含SEQIDNO:58的輕鏈可變區CDR3。31.—種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分或其片段，其包括:包含CDR1、CDR2和CDR3序列的重鏈可變區；和包含CDR1、CDR2和CDR3序列的輕鏈可變區；其中(a)重鏈可變區CDR3序列包含選自SEQIDNO:30、31、32、33、34、35和36的氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列；(b)輕鏈可變區CDR3序列包含選自SEQIDNO:51、52、53、54、55、56、57和58的氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列；(c)該抗體以lxlO;M或更低的Kd與人CD19結合；且(d)與Raji和DaudiB細胞腫瘤細胞結合。32.權利要求31的抗體，其中重鏈可變區CDR2序列包含選自SEQIDNO:23、24、25、26、27、28和29的氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列；且輕鏈可變區CDR2序列包含選自SEQIDNO:44、45、46、47、48、49和50的氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列。33.權利要求32的抗體，其中重鏈可變區CDR1序列包含選自SEQIDNO:16、17、18、19、20、21和22的氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列；且輕鏈可變區CDR1序列包含選自SEQIDNO:37、38、39、40、41、42和43的氨基酸序列及其保守修飾的氨基酸序列。34.斥又利要求31的抗體，其為人抗體。35.權利要求31的抗體，其為人源化或嵌合抗體。36.—種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分或片段，其包括(a)包含選自SEQIDNO:1、2、3、4、5、6和7的氨基酸序列的重鏈可變區；和(b)包含選自SEQIDNO:8、9、10、11、12、13、M和15的氨基酸序列的輕鏈可變區；其中該抗體與CD19特異性結合。37.—種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分或片段，其包括(a)包含SEQIDNO:1的氨基酸序列的重鏈可變區；和(b)包含SEQIDNO:8的氨基酸序列的輕鏈可變區。38.—種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分或片段，其包括(a)包含SEQIDNO:1的氨基酸序列的重鏈可變區；和(b)包含SEQIDNO:9的氨基酸序列的輕鏈可變區。39.—種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分或片段，其包括:(a)包含SEQIDNO:2的氨基酸序列的重鏈可變區；和(b)包含SEQIDNO:10的氨基酸序列的輕鏈可變區。40.—種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分或片段，其包括(a)包含SEQIDNO:3的氨基酸序列的重鏈可變區；和(b)包含SEQIDNO:11的氨基酸序列的輕鏈可變區。41.一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分或片段，其包括(a)包含SEQIDNO:4的氨基酸序列的重鏈可變區；和(b)包含SEQIDNO:12的氨基酸序列的輕鏈可變區。42.—種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分或片段，其包括(a)包含SEQIDNO:5的氨基酸序列的重鏈可變區；和(b)包含SEQIDNO:l3的氨基酸序列的輕鏈可變區。43.—種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分或片段，其包括(a)包含SEQIDNO:6的氨基酸序列的重鏈可變區；和(b)包含SEQIDNO:14的氨基酸序列的輕鏈可變區。44.一種分離的單克隆抗體或其抗原結合部分或片段，其包括(a)包含SEQIDNO:7的氨基酸序列的重鏈可變區；和(b)包含SEQIDNO:l5的氨基酸序列的輕鏈可變區。45.—種組合物，其含有權利要求1的抗體或其抗原結合部分或片段，和藥學上可接受的載體。46.—種免疫偶聯物，其包含與治療劑連接的權利要求1的抗體或其抗原結合部分或片段。47.—種組合物，其含有權利要求46的免疫偶聯物和藥學上可接受的載體。48.權利要求46的免疫偶聯物，其中所述治療劑是細胞毒素。49.一種組合物，其含有權利要求48的免疫偶聯物和藥學上可接受的載體。50.權利要求46的免疫偶聯物，其中所述治療劑是放射性同位素。51.—種組合物，其含有權利要求50的免疫偶聯物和藥學上可接受的載體。52.—種分離的核酸分子，其編碼權利要求1的抗體或其抗原結合部分。53.—種表達載體，其包含權利要求52的核酸分子。54.—種宿主細胞，其包含權利要求53的表達載體。55.—種制備抗-CD19抗體的方法，包括在權利要求54的宿主細胞中表達該抗體，并且從所述宿主細胞中分離該抗體。56.—種抑制表達CD19的腫瘤細胞生長的方法，包括使該細胞與有效抑制腫瘤細胞生長的量的權利要求1的抗體或其抗原結合部分或片段相接觸。57.權利要求56的方法，其中所述腫瘤細胞是B細胞惡性腫瘤。58.權利要求57的方法，其中所述B細胞惡性腫瘤是非何杰金氏-淋巴瘤。59.權利要求57的方法，其中所述B細胞惡性腫瘤是外套細胞淋巴瘤。60.—種消耗受試者中B細胞的方法，包括給該受試者施用有效消耗受試者中B細胞的量的抗CD19抗體。61.權利要求60的方法，其中所述抗CD19抗體是權利要求1-44任一項的抗體。62.權利要求1-44中任一項的抗CD19抗體，其用于消耗受試者中B細胞的治療性用途。63.權利要求1-44中任一項的抗CD19抗體在制備消耗受試者中的B細^^的藥物中的用途。全文摘要本發明提供以高親和力特異性結合CD19的分離的單克隆抗體，特別是人單克隆抗體。還提供了編碼這種抗體的核酸分子，用于表達該CD19抗體的表達載體、宿主細胞和方法。還提供了包含該CD19抗體的免疫偶聯物、雙特異性分子和藥物組合物。還公開了檢測CD19的方法，以及治療包括非何杰金氏淋巴瘤在內的各種B細胞惡性腫瘤的方法。文檔編號A61P35/00GK101233156SQ200680028184公開日2008年7月30日申請日期2006年6月20日優先權日2005年6月20日發明者A·F·貝爾,C·拉奧-奈克,C·潘,D·B·帕斯莫爾,D·J·金,J·M·卡達雷利,S·陳,T·U·蒂·多,杰劉,黃海春申請人:米德列斯公司