專利名稱：：用于治療慢性淋巴細胞性白血病的抗cd52單克隆抗體的重組生產方法用于治療慢性淋巴細胞性白血病的抗CD52單克隆抗體的重組生產方法發明領域本發明涉及用于生產結合CD52的可溶形式單克隆抗體的重組方法。該方法描述從頭合成編碼抗CD52的核酸序列，將已構建的核酸序列轉化到感受態細菌中，以及將該核酸序列亞克隆到哺乳動物表達載體中以表達所需要的蛋白質。本發明公開了包含與目標基因相關的調控元件的DNA構建體。為了允許在合適的哺乳動物宿主細胞中表達，已將目標核酸序列進行了密碼子優化。發明背景抗體是我們免疫系統的一部分。當抗原(例如病菌中的外源蛋白)進入到機體時，機體就會產生天然抗體抵抗它。這些抗體附著并標記抗原從而被我們的免疫系統摧毀。抗體，即免疫球蛋白，包含2條通過二硫鍵連接在一起的重鏈和2條輕鏈，每條輕鏈通過二硫鍵與各自的重鏈相連接。每條重鏈的一端有一可變區(VH)，可變區與若千恒定區(CHl,CH2，CH3)連接。每條輕鏈的一端有一可變區(VL)，另一端有一恒定區(CL),重鏈的輕鏈可變區(VH)和輕鏈恒定區一直與重鏈的笫一恒定區結合。輕鏈和重鏈的恒定區(Fc)不直接參與抗體與抗原的結合。每對輕鏈和重鏈的可變區(Fab)形成抗原結合位點。輕鏈和重鏈各區具有相同的通用結構，并且每個區都包含四個構架區，其序列相對保守、通過三個互補區(CDR)連接在一起。這四個構架區主要采用p-折疊構象，并且CDR形成環，該環與P-折疊結構連接，在某些情況下構成(3-折疊結構部分。CDR通過構架區被緊密靠近約束，并且與來源于其它區的CDR—起影響抗原結合位點的形成。當Kohler和Milstein在1975年報道了來自抗原免疫的小鼠脾細胞與鼠骨髓瘤系的細胞的成功融合(Kohler和Milstein,Nature,1975,256,495-497)時，就向前邁進了一大步。所得雜交細胞，稱為雜交瘤，具有源于脾細胞的抗體產生特性和源于骨髓瘤細胞的持續生長特性。每種雜交瘤都合成和分泌針對原始抗原特定決定簇的單一抗體。為確保培養物中的所有細胞都是相同的，也就是說，確保它們都含有合成獨特抗體種類所必需的遺傳信息，應當將從細胞融合得到的雜交瘤進行克隆或亞克隆。這樣，克隆的雜交瘤就能產生同種抗體即單克隆抗體。細胞系的無限增殖性可確保得到均一、充分表征的抗體的無限供應，用于多種用途，具體地講包括疾病的診斷和免疫治療。令人遺撼的是，所開發的單克隆抗體由于其可能干擾治療或者引起變態反應或免疫復合物過敏反應而無法用于臨床，因此使人抗d、鼠抗體的研發受到嚴重阻礙。為產生足夠量的抗體用于完全臨床用途，最好是使用有效的重組表達系統。因為骨髓瘤細胞是一種專門用于產生和分泌抗體的天然宿主，所以來源于這些骨髓瘤細胞的細胞系一直用于重組抗體的表達。通常，需要基于免疫球蛋白基因調節元件的復合載體設計，但是最終的表達水平據報道變化非常大(Winter等，Nature,1988,332,323-327;Weidle等，Gene,1987,60,205-216;Nakatani等，Bio/Technology,1989，7,805-810;Gillies等，Bio/Technology,1989,7,799-804)。一種可選擇的哺乳動物表達系統由使用中國倉鼠卵巢(CHO)細胞提供。應用這些細胞已能產生數種大量的用于研究和臨床的治療蛋白(Kaufman等，Mol.Cell.Biol,1985,5,1750-1759;Zettlmeissl等，Bio/Technology,1987,5,720-725)。然而，幾乎沒有應用這些細胞表達抗體的實例，并且已才艮道的鼠抗體表達水平一直很低，約為0.01-O.lp/ml(Weidle等，Gene,1987,51,21-29;Feys等，Int.丄Cancer,1988,2,26-27)。事實上，CD52在所有人淋巴細胞和單核細胞中強表達，但不在其它血細胞(包括造血干細胞)中表達，該抗原在Hale等，Blood1983，62,873-882中已有描述。已先后開發出抗CD52特異性小鼠單克隆抗體YTH66.9和抗CD52特異性大鼠單克隆抗體YTH34.5HL。由于抗球蛋白反應，因此這些抗體在臨床上的應用受到限制。CD52在正常和惡性B淋巴細胞以及正常和惡性T淋巴細胞、NK細胞、單核細胞、巨噬細胞的表面表達，也在男性生殖系統組織中表達。本發明涉及一種方法，該方法中闡明了與CD25結合的抗體可用于治療B細胞慢性淋巴細胞性白血病(B-CLL)。該抗體也可用于治療已經過烷化劑治療的患者和經氟達拉濱治療無效的患者。本發明的抗體是IgGlk，其具有人可變構架區和恒定區，以及源于鼠(大鼠)單克隆抗體的互補性決定區。該抗體的分子量大約為150千道爾頓。本發明通過摻入包含編碼具有抗CD52活性的多肽的核酸序列的重組載體，使得在哺乳動物表達系統中產生抗CD52抗體成為可能。抗CD52抗體將用于治療B細胞慢性淋巴細胞性白血病(簡稱B-CLL)。該抗體也將用于治療已經接受和/或已對其它癌癥化療藥物(例如烷化劑、氟達拉濱)無反應的患者。該抗體還可用于非霍奇金淋巴瘤、某些自身免疫性疾病的治療、腎移植患者。另一方面，抗CD52抗體將用于癌癥病人、特別是淋巴瘤病人的治療，或者用于免疫抑制目的。圖1.編碼抗CD52抗體輕鏈的DNA核苷酸序列的未優化形式和密碼子優化形式的配對序列比對圖。圖2.編碼抗CD52抗體重鏈的DNA核苷酸序列的未優化形式和密碼子優化形式的配對序列比對圖。圖3.抗CD20抗體(利妥昔單抗(Rituximab))和抗CD52抗體(坎帕斯(Campath))的輕鏈恒定區的序列比對圖。圖4.抗CD20抗體(利妥昔單抗(Rituximab))和抗CD52抗體(坎帕斯(Campath))的重鏈恒定區的序列比對圖。圖5.用BglIIBsiWI限制酶切消化pBSKII/ALZ-VLC克隆(第3泳道)和pBSKII/RTX-LC克隆(第1泳道)。第2泳道一lkbDNA梯。圖6.用BglII和EcoRI限制酶切消化pBSKII/ALZ-LC克隆，以鑒定含有插入片段的轉化子。對于所有測試過的克隆，觀察到結果片段與ALZ-LC抗體片段的大小相符。圖7.用BamHI限制酶切消化pBSKII/ALZ-LC克隆，以區別含有ALZ-LC插入片段的克隆和含有RTX-LC插入片段的克隆。圖8.限制酶切消化pBSKII/ALZ-VHC全長克隆，以確定插入片段的存在。圖9.抗CD20抗體重鏈(RTX-HC)克隆與進行了定點誘變的抗CD52抗體重鏈(ALZ-HC)克隆的序列比對圖。CA變為TT用藍色突出顯示。圖10.用于連接反應的經限制酶切消化的和凝膠純化的ALZ-LC和pCAIN。圖11.用BglII和EcoRI限制酶切消化pCAIN/ALZ-LC克隆，以鑒定含有插入片段的轉化子。對于所有測試過的克隆，觀察到結果片段與ALZ-LC抗體片段的大小相符(700bp)。圖12.用于連接反應的經限制酶切消化的和凝膠純化的ALZ-HC和pCAID。圖13.用Bamffl和EcoRI限制酶切消化pCAID/ALZ-HC克隆，以鑒定含有插入片段的轉化子。對于所有測試過的克隆，觀察到結果片段與ALZ-HC抗體片段的大小相符(1420bp)。圖14.通過DNA核苷酸測序證實了pCAID/ALZ-HC的b克隆。測序反應中使用了三種不同的引物(camp246，523和CHC845)。發現整個序列與才莫;〖反序列(C2)匹配。序列表SEQID1.抗CD52抗體輕鏈的核苷酸序列。SEQID2.抗CD52抗體重鏈的核香酸序列。SEQID3.抗CD52抗體肽的氨基酸序列。SEQID4.抗CD52抗體肽的氨基酸序列。SEQID5.抗CD52抗體輕鏈的密碼子優化序列。SEQID6.抗CD52抗體重鏈的密碼子優化序列。發明概述本發明涉及將編碼抗CD52多肽的核酸序列轉化到感受態細菌中，以及將所述核酸序列亞克隆到哺乳動物表達載體中，更優選亞克隆到CHO細胞中，以穩定表達所述單克隆抗體。本發明的一個方面，提供編碼抗CD52分子重鏈和輕鏈的核酸序列。本發明的另一個方面，提供由所述核酸序列編碼的相應氨基酸序列。本發明的一個具體方面，涉及從頭合成抗CD52分子重鏈和輕鏈的可變區。還公開了構建攜帶目標核酸序列的載體構建體，將所述載體構建體轉化到感受態細菌中，以及將所述抗CD52鏈亞克隆到哺乳動物表達載體中。發明詳述下文概述的方法適用于生產具有生物活性的可溶性重組抗CD52抗體。實施例1從頭合成的抗CD52抗體cDNA將包括以下組件Kozak共有序列(GCCACC)3,后接起始密碼子(ATG)。三個"保護"核苷酸，位于cDNA的5'端和3，端。合適的限制酶切位點，位于cDNA的5，端和3，端，以克隆到表達載體中。編碼抗CD52抗體輕鏈的核苷酸序列如SEQID1所示。編碼抗CD52抗體重鏈的核苷酸序列如SEQID2所示。為確保重組蛋白在哺乳動物細胞系(例如CHOKl和HEK293)中的最佳表達，抗CD52抗體重鏈編碼DNA序列的密碼子，已在密碼子優化過程中:f皮改變。相應的密碼子優化序列如SEQID4和SEQID5所示。實施例2表達系統的選擇設計表達重組抗CD52抗體的哺乳動物表達載體，可基于一種市售載體(例如/7cDA^或p/^E"S，分別得自Invitrogen或BDBiosciences公司)，修飾后包括下列特征具有多克隆位點以插入編碼抗CD52抗體輕鏈和重鏈的cDNA以及天然信號肽。將抗CD52抗體輕鏈和重鏈克隆到兩個獨立的、帶有不同選擇標記的質粒DNA載體中。設計的載體也可為所述輕鏈和重鏈兩者都提供獨立的(雙順反子)IRES介導的選擇標記共表達。設計的表達載體也可為抗CD52抗體輕鏈和重鏈兩者以及天然信號肽都提供獨立的(雙順反子)IRES介導的共表達。實施例3抗CD52抗體可變區的從頭合成抗CD52抗體的輕鏈可變區和重鏈可變區交由美國Epoch實驗室從頭合成。抗CD52抗體鏈沒有合成恒定區；而是從抗CD20抗體鏈中切下k和IgGl恒定區，并將其與抗CD52抗體可變區連接，從而產生全長纟元體鏈。抗CD52抗體的k恒定區與抗CD20抗體的k恒定區有100%同源性，^旦兩者的重鏈恒定區仍相差2個核苷酸。這兩個核苷酸的變化導致第240位的纈氨酸變為丙氨酸。實施例4全長抗CD52抗體重鏈和輕鏈的構建將從頭合成的可變區克隆到包含全長抗CD20抗體重鏈和輕鏈的pBSK載體中。抗CD20抗體的可變區與抗CD52抗體的可變區交換后產生全長抗CD52抗體片段。作為克隆到pBSKII中的片段得到抗CD52抗體的可變區，所得到的構建體稱為pBSKII/ALZ-VLC。將該DNA轉化到大腸桿菌DH10b中，再接種到含有氨千青霉素的LB瓊脂平板上。將平板上的一個菌落接種到液體培養基中，進行DNA小量制備。通過測序證實了這兩個可變區的序列。全長抗CD52抗體K輕鏈的構建pBSKII/ALZ-VLC和pBSKII/RTX-LC(表達抗CD20抗體輕鏈的構建體)克隆用限制性內切酶BglII和BsiWI消化(圖5)。對來自前者的394bp大小的插入片段和來自后者的載體+K恒定區進行凝膠純化。載體和插入片段連接后產生全長抗CD52抗體K輕鏈。將熱激過的感受態細胞DHIO轉化獲得的菌落接種到含有氨千青霉素的LB培養基中，這樣就完成了DNA小量制備。通過限制酶切消化鑒定克隆中存在的全長抗CD52抗體輕鏈(圖6)。還通過測序證實了由限制酶切消化得到的陽性克隆。pBSKII/ALZ-LC克隆也用限制性內切酶BamHI消化，以區別含有ALZ-LC插入片段的克隆和含有RTX-LC的克隆。實質上這是因為用pBSKII/RTX-LC作為載體主鏈，而且RTX-LC和ALZ-LC大小是一樣的。兩條輕鏈的限制性內切酶譜是不同的。當pBSKII/ALZ-LC克隆用BamHI消化時，將僅使pBSKII/RTX-LC克隆線性化，產生700bp的結果片段(圖7)。第6、9和13號克隆是RTX-HC克隆。全長抗CD52抗體IgGl重鏈的構建攜帶抗CD52抗體重鏈可變區的構建體pBSKII/ALZ-VHC克隆和攜帶抗CD20抗體重鏈的構建體pBSKII/RTX-HC克隆用限制性內切酶HindIII和Nhel消化。對來自前者的426bp大小的插入片段和來自后者的載體+IgGl恒定區進行凝膠純化。載體和插入片段連接后產生全長抗CD52抗體IgGl重鏈。將熱激過的感受態細胞DH10轉化獲得的菌落接種到含有氨芐青霉素的LB培養基中，這樣就完成了DNA小量制備。通過限制酶切消化鑒定克隆中存在的全長抗CD52抗體重鏈(圖8)。還通過測序證實了由限制酶切消化得到的陽性克隆。pBSKII/ALZ-HC克隆的定點誘變抗CD52抗體重鏈片段的恒定區與抗CD20抗體重鏈片段的恒定區有2個核苷酸不相同。在序列確證后，將含有抗CDS2抗體的可變區及與之拼接的抗CD20抗體重鏈恒定區的克隆進行定點誘變。材料與方法酶和試劑Pfu高保真性Taq聚合酶(Stratagene)Dpnl限制性內切酶(Stratagene)DNA模板pBSKII/ALZ-HC-克隆(a)引物所有要合成的寡核苷酸都交給SIGMA公司合成。所合成的寡核苷酸由Sigma公司用HPLC純化兩次，然后轉給Avesthagen公司。PCR反應中所使用的寡核苷酸見下表。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>突變鏈合成反應(熱循環)下列成分/試劑按以下指定順序加入到滅菌的0.2mlPCR管中。所有PCR反應的終體積都是50|Lil。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>QuickChange定點誘變方法的循環參數步驟1(1個循環)95°C/30秒步驟295。C/30秒步驟355。C/30秒步驟468。C/7分鐘步驟5轉到步驟2并重復步驟2-4共16次。擴增產物的D/wI消化將1iLilD/^I(10U/^il)加入到擴增反應的反應混合物中。將所得混合物輕輕地充分混勻，離心，37。C保溫l小時。感受態細胞DH10b的轉化按生產商(Stratagene)推薦的方法進行轉化。用4plPCR反應產物進行轉化。結果將已進行過定點誘變的抗CD20抗體重鏈(RTX-HC)克隆與抗CD52抗體重鏈(ALZ-HC)克隆進行序列比對。CA轉變為TT用藍色突出顯示。將已進行過定點誘變的抗CD20抗體重鏈(RTX-HC)克隆與抗CD52抗體重鏈(ALZ-HC)克隆進行序列比對。結果見圖9。抗CD52抗體鏈亞克隆到哺乳動物表達載體中全長抗CD52抗體重鏈抗體輕鏈和重鏈分別克隆或亞克隆到哺乳動物表達載體pCAIN和pCAID中。pBSKII/ALZ-LC克隆和pCAIN載體用BglII和EcoRI消化，所得構建體稱為pCAIN/ALZ-LC。將來自前者的插入片段(700bp)和來自后者的載體主鏈進行凝膠純化和連接(圖10)。將連接混合物轉化到熱激過的感受態細胞DH10b中，再接種到含有氨芐青霉素作為選擇抗生素的LB瓊脂平板上。挑取少量轉化子并進行DNA小量制備。通過限制酶切消化鑒定克隆(圖11)。pBSKII/ALZ-HC-SDM克隆(I.4)和pCAID載體用BamHI和EcoRI消化。所得構建體稱為pCAID/ALZ-HC。將來自前者的插入片段(1429bp)和來自后者的載體主鏈進行凝膠純化和連接(圖12)。將連接混合物轉化到熱激過的感受態細胞DH10b,再接種到含有氨千青霉素作為選捧抗生素的LB瓊脂平板上。挑取少量轉化子并進行DNA小量制備。通過限制酶切消化鑒定克隆(圖13)。DNA測序和分析分別克隆到哺乳動物表達載體pCAID和pCAIN中的最終克隆ALZ-HC和ALZ-LC經測序，其序列正確性得到證實。參見序列分析的比對圖。通過DNA核苷酸測序，pCAID/ALZ-HC的b克隆獲得證實。測序反應中使用了三種不同的引物(camp246、523和CHC845)。發現整個序列與坤莫板序列(C2)匹配。6.抗CD52抗體的純化抗CD52抗體是一種人源化抗體，可分泌到細胞上清液中。按照管理機構對于過量表達所需重組蛋白的指導方針，后續確定無污染的細胞培養系統，可利用一系列步驟對抗CD52抗體蛋白進行純化，包括透析-過濾和柱色譜法(包括親和色譜法)。回收洗脫后的抗體以使體內活性最大化。乙抗CD52抗體體外活性和體內活性的測定:抗CD52抗體ELISA測定。補體介導的B細胞淋巴細胞性白血病細胞(Karpas422細胞)溶胞作用。抗CD52抗體體內功效研究已基于當前數據，在那些先前已用烷化劑治療和用氟達拉比濱治療無效的B細胞慢性淋巴細胞性白血病(B-CLL)患者中進行。純化方法的最優化根據以上提及的受推薦的功能/結合測定，后續確定可重現的生物活性，將努力使所用純化方法最佳化。純化策略將針對產品的工藝過程經濟學、上市速度、規3莫性、重復性和最高純度，以及功能穩定性和結構整體性為主要目的。為實現這一目的，將探索由過濾(常規過濾和切向流過濾)和色譜兩者組合的方法。所述方法的合格要求和接受標準研究將實施3批。因此，本發明在純化過程中擬定以下的步驟a.初步澄清，用COHC/A1HC/O.45p深度濾器；b.濃縮，用PelliconXLBiomax濾器，臨界值為50千道爾頓，基于切向流過濾；c.色譜步驟I:親和色譜，用ProsepVAUltra(對基于血清(2%胎牛血清[FCS])的上清液)/ProsepVA(對無血清培養物上清液)；d.色譜步驟II:強陽離子交換劑，例如SPS印harose;e.色譜步驟III:基于流通的強陰離子交換劑，例如CellufineQ(—種基于纖維素的介質)，用于去除宿主細胞蛋白和核酸；f.去除病毒，用大小排阻過濾和用硫酸Cellufine瀝濾A蛋白；g.過濾除菌；h.去除內毒素，用Remtox或CellufineET色譜；h.配制。權利要求1.一種制備有體內生物活性的抗CD52單克隆抗體的方法，該方法包括以下步驟■從頭合成抗CD52單克隆抗體輕鏈和重鏈的步驟；■構建全長抗CD52抗體κ輕鏈的步驟；■構建全長抗CD52抗體IgG1重鏈的步驟；■構建包含編碼抗CD52分子輕多肽鏈和重多肽鏈的核酸序列的載體的步驟；■將抗CD52抗體鏈亞克隆到在哺乳動物表達載體中以生產生物活性抗體分子的步驟。2.權利要求1的方法，其中編碼抗CD52抗體輕鏈的核苷酸序列如SEQID1所示。3.權利要求1的方法，其中編碼抗CD52抗體重鏈的核苷酸序列如SEQID2所示。4.權利要求1的方法，其中抗CD52抗體輕鏈的氨基酸序列如SEQID3所示。5.權利要求1的方法，其中抗CD52抗體重鏈的氨基酸序列如SEQID4所示。6.權利要求1的方法，其中將包含編碼抗CD52重鏈的核酸片段的載體進行定點誘變。7.權利要求1的方法，其中全長抗CD52重鏈和輕鏈已分別亞克隆到哺乳動物載體pCAIN和pCAID中。8.—種制備有體內生物活性的抗CD52單克隆抗體的方法，該方法包括以下步驟用附圖所示的載體構建體轉化宿主細胞，從所述宿主細胞或其生長的培養基中分離出所述產品。9.一種藥物組合物，該組合物包含治療有效量的抗CD52抗體以及藥學上可接受的稀釋劑、輔劑或載體，其中所述抗體是從培養物生長的哺乳動物細胞中純化出來的。全文摘要本發明涉及用于生產結合CD52的可溶形式單克隆抗體的重組方法。該方法描述從頭合成編碼抗CD52的核酸序列，將已構建的核酸序列轉化到感受態細菌中，以及將該核酸序列亞克隆到哺乳動物表達載體中以表達所需要的蛋白質。本發明公開了包含與目標基因相關的調控元件的DNA構建體。為了允許在合適的哺乳動物宿主細胞中表達，已將目標核酸序列進行了密碼子優化。文檔編號A61K39/395GK101238150SQ200680026667公開日2008年8月6日申請日期2006年5月24日優先權日2005年5月24日發明者V·莫拉瓦拉帕特爾申請人:阿維斯塔金格蘭技術有限公司