抗凝劑及其用途的制作方法

文檔序號：1124993閱讀：921來源：國知局

專利名稱：抗凝劑及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及血液學領域且尤其涉及止血的分科領域。更具體來說，本發明涉及l)抑制哺乳動物血液凝固的藥劑，以及這些藥劑在治療和預防諸如中風、心肌梗塞以及深部靜脈血栓形成的疾病中的應用；2) 在如下臨床情況下(諸如血栓形成、血栓性栓-了以及不穩定的斑塊等) 能診斷和鑒定活化血小板的探針。
背景技術：
血管損傷后機體控制血流的能力對延續生存至關重要。血液凝固的過程以及受損組織修復后隨后的血凝塊溶解被稱為止血。止血由血管整體性喪失后的一系列按固定順序發生的事件組成。這個過程的起始階段是血管的縮窄，由此限制了損傷部位的血液流動。下一步，血小板經凝血酶活化并聚集在損傷部位，形成一個暫時的、疏松的血小板栓子。纖維蛋白原主要負責刺激血小板的聚集成塊。血小板通過與血管內皮內層破裂后暴露出的膠原結合而聚集成塊。在活化過程中，血小板釋放5'-二磷酸腺苷(ADP)和TXA2(活化更多的血小板)，5-羥色胺，磷脂，脂蛋白以及其他對于凝固級聯反應很重要的蛋白質。除了誘發分泌，活化的血小板還改變其形狀以適應栓子的形成。為確保初步形成的疏松血小板栓子的穩定性，會形成一纖維蛋白網(也稱作血凝塊)并把栓子網住。最后，血凝塊必須被溶解使正常血流在組織修復后再流通。血凝塊的溶解通過纖維蛋白酶的作用而發生。兩條途徑引起纖維蛋白凝塊的形成內源性途徑和外源性途徑。雖然這兩條途徑是通過截然不同的兩種機制啟動的，但它們都會會聚到一條共同的通路通向弓I起凝塊形成。在組織無損傷的情況下對異常血管壁反應而形成的紅色血栓或凝塊是內源性途徑的結果。而對組織損傷反應形成的纖維蛋白凝塊則是外源性途徑的結果。以上兩種途徑均很復雜，且均涉及眾多不同的稱為凝血因子的蛋白質。血小板活化和血管假性血友病因子(von Willebrand factor, vWF)止血如要發生，則血小板必須粘附到暴露的膠原上，釋放其顆粒的內容物，并發生聚集。血小板粘附到內皮細胞表面暴露的膠原是通過血管假性血友病因子(vWF)介導的。vWF的功能是在血小板表面的一個特異糖蛋白(GPIb/IX)和膠原纖維之間搭起一座橋梁。除了在血小板和內皮細胞表面上暴露的膠原之間作為橋梁的作用以外，vWF結合到凝血因子VIII并使其穩定。凝血因子VIII和vWF的結合對于凝血因子vm在血液循環中的正常生存是必需的。vWF是一種復雜的多聚糖蛋白，其產生并存儲在血小板內。vWF 還能被巨核細胞合成，而且還發現vWF與內皮下結締組織有關。血小板的活化最初是由凝血酶與血小板表面特異性受體結合而誘導的，從而啟動信號轉導級聯反應。凝血酶受體偶聯在一個G-蛋白上，而G-蛋白反過來激活磷脂酶C-y(PLC-Y)。PLC-Y水解磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸 (PIP2)，導致肌醇三磷酸(IP3)和甘油二酯(DAG)生成。IP3再誘導細胞內儲庫的Ca^釋放，DAG則激活蛋白激酶C(PKC)。血小板粘附的膠原以及細胞內C的釋放導致磷脂酶A2(PLA2) 活化，然后水解膜磷脂，從而使花生四烯酸釋放。花生四烯酸的釋放引起血栓烷A2(TXA2)的生成增加及其隨后的釋放。這是另一種通過 PLC-Y途徑的血小板活化劑。另一種被胞內(^2+儲庫釋放激活的酶是肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)。活化的MLCK使肌球蛋白輕鏈磷酸化，磷酸化的肌球蛋白輕鏈與肌動蛋白作用，導致血小板形態和運動力發生變化。PKC的眾多效應之一是一個特異的47,000-道爾頓血小板蛋白的磷酸化和活化。該活化蛋白誘導血小板顆粒內容物釋放；其中之一就是 ADP。 ADP進一步刺激血小板增強總的活化級聯反應；其也能改變血小板膜，使纖維蛋白原粘附到血小板表面，引發纖維蛋白原誘導的血小板聚集。血小板的活化對于血小板聚集形成血小板栓是必需的。然而活化血小板表面磷脂在凝血級聯反應活化過程中的作用同樣重要。當血液和暴露的內皮細胞表面接觸以后，內源性凝血機制啟動。外源性途徑和內源性途徑的交匯點在因子X活化為因子Xa。因子Xa 有一種功能是將因子VII進一步活化為VIIa。活性因子Xa也能水解并活化凝血酶原變成凝血酶。然后，凝血酶激活因子XI、 VIII和V，進一步推進級聯反應。最終凝血酶將纖維蛋白原轉化為纖維蛋白，并激活因子XIII成為XIIIa。因子XIIIa(又稱谷氨酰胺轉移酶)交聯纖維蛋白聚合物使血凝塊固化。凝血的內源性途徑需要凝血因子vm、 IX、 X、 XI和XII。也需要激肽釋放酶原和高分子量激肽原的蛋白以及從血小板釋放的鈣離子和磷脂。參與兩種途徑的各要素最終使因子X(無活性)轉化為因子Xa(有活性)。當激肽釋放酶原、高分子量激肽原、因子XI和因子XII接觸到帶負電的表面時就啟動了內源性途徑。這稱為接觸期。膠原暴露于血管表面是接觸期的主要刺激。接觸期各成分的集中導致激肽釋放酶原轉變為激肽釋放酶，激肽釋放酶反過來活化因子XII成為因子XIIa。然后因子XIIa可水解更多的激肽釋放酶原，使之成為激肽釋放酶，建立起一個彼此互相激活的級聯反應。因子XIIa也能將因子XI激活成為因子XIa，并引起緩激肽釋放，緩激肽是一種源自高分子量激肽原的強有力的血管擴張劑。在有012+存在的條件下，因子XIa活化因子IX為因子IXa。因子 IX是含維生素K依賴的Y-羧基谷氨酸殘基(gla)的酶原，其絲氨酸蛋白酶活性在C^+結合到這些gla殘基后被激活。級聯反應的若干絲氨酸蛋白酶(因子II、 VII、 IX和X)都是含gla的酶原。活化的因子IXa在一個內部精氨酸-異亮氨酸鍵處將因子X切斷，由此激活因子Xa。因子Xa的活化需要活化的血小板表面上集中有tenase復合體(Ca2〖和因子Villa、因子IXa和因子X)。血小板對活化的反應之一是將磷脂酰絲氨酸和磷脂酰肌醇提呈至其表面。這些磷脂的暴露使tenase復合體得以形成。因子VIII在這個過程中的作用是以因子VIIIa的形式作為因子IXa和因子X的受體。因子VIIIa被稱為凝血級聯反應的輔因子。因子vn[活化為因子vniia(事實上的受體)在微量凝血酶的存在下即可發生。當凝血酶濃度增加了以后，因子vnia最終被凝血酶裂解和滅活。凝血酶對因子VIII的這種雙向作用限制了 tenase復合體的形成，因而也限制了凝血的級聯反應。如上所述，活化的因子Xa是內源性和外源性凝血級聯反應會聚的地方。在損傷部位處對組織因子(因子m)釋放的反應啟動了外源性途徑。組織因子在因子VIIa催化的因子X活化中是輔因子。含gla殘基的絲氨酸蛋白酶，因子VIIa裂解因子X成為Xa，其方式與內源性途徑的因子IXa活化完全相同。因子VII的活化需要通過凝血酶或因子 Xa的活化。因子Xa活化因子VII的能力在內源性和外源性途徑之間建立了聯系。在兩種途徑之間的另一種聯系是組織因子和因子Vila活化因子IX的能力。但還有一些不明確的地方，似乎在因子VIIa和組織因子之間復合體的形成相信是整個凝血級聯反應中的主要步驟。抑制外源性途徑的主要機制發生在組織因子一因子VlIa—C^+—Xa復合體處。而蛋白質LACI (脂蛋白相關凝血抑制物)可特異地結合這種復合體。LACI也被稱為外源性凝血途徑抑制物(EPI)或者組織因子通路抑制物(TFPI)，過去曾被稱為anticonvertin。 LACI由三個串聯的蛋白酶抑制物結構域組成。結構域1結合因子Xa，結構域2只在因子Xa存在時才結合因子VIIa。凝血酶原轉化為凝血酶外源性和內源性凝血途徑的共同點是因子X活化為因子Xa。因子 Xa活化凝血酶原(因子n)成為凝血酶(因子IIa》凝血酶反過來將纖維蛋白原轉化為纖維蛋白。凝血酶的活化發生在活化的血小板表面，且必須形成凝血酶原酶復合體。此復合物由血小板磷脂、磷脂酰肌醇、磷脂酰絲氨酸、Ca2+、因子Va和因子Xa，以及凝血酶原組成。因子V 在凝血酶原酶復合體形成過程中是輔因子，類似于因子VIII在tenase 復合體形成中的作用。同因子VIII活化一樣，因子V被微量活化成因子Va，并通過凝血酶水平的升高而滅活。因子Va結合到活化血小板表面上的特殊受體上，并與凝血酶原和因子Xa組成復合體。凝血酶原是一種N端區域含有十個gla殘基的單鏈蛋白，分子量為72,000-道爾頓。在凝血酶激酶復合體中，凝血酶原被因子Xa在兩處切斷，產生含有A和B鏈的雙鏈活性凝血酶分子，這兩條鏈通過一個二硫鍵連接在一起。除了在活化纖維蛋白凝塊形成中的作用以外，凝血酶還在凝血過程中起重要的調節作用。凝血酶與存在于內皮細胞表面的血栓調節素結合，形成復合體，該復合體將蛋白C轉化為蛋白Ca。輔因子蛋白S 和蛋白Ca降解因子Va和因子VIIIa，從而限制了這兩種因子在凝血級聯反應的活性。凝血酶還可以結合G-蛋白偶聯蛋白酶激活受體(PAR，具體是 PAR-1、 PAR-3和PAR-4)并使其釋放。這些蛋白的釋放導致眾多信號級聯的激活，反過來又增加了白介素IL(IL-1和IL-6)的釋放、細胞間粘附分子-l(ICAM-l)以及血管細胞粘附分子-l(VCAM-l)的分泌。凝血酶誘導的信號傳遞也能使血小板活化和白細胞粘附增加。凝血酶還能激活凝血酶可活化的纖溶抑制物(TAFI)，從而調節纖維蛋白溶解(纖維塊的降解)。TAFI也被稱為羧基肽酶U(CPU)，其活性能從部分降解的纖維蛋白切除C-端賴氨酸。這將有損于纖溶酶原激活，從而減少纖維蛋白凝塊溶解的速率(即，纖維蛋白溶解》凝血酶水平的控制機體不能控制活性凝血酶的循環水平將導致可怕的后果。凝血酶活性的調節有兩種主要的機制。凝血酶在循環中的主要形式是無活性的凝血酶原，其活化需要上述的凝血級聯中的酶原激活通路。在級聯中的每一步，都有反饋機制調節活性酶和無活性酶之間的平衡。凝血酶的激活也被四種特異性凝血酶抑制物所調節。抗凝血酶III 是最重要的一種，因為它還能抑制因子IXa、 Xa、 XIa和XIIa的活性。抗凝血酶ffl的活性在有肝素存在的條件下通過以下方式得以強化肝素結合到抗凝血酶m上的特異位點，改變了蛋白質的構象，新構象對凝血酶和其的其他底物有更高的親和力。肝素的這種效應是其作為臨床抗凝劑的基礎。抗凝血酶m的天然肝素激活劑以血管內皮細胞表面上的肝素和硫酸肝素而存在。這種特性能控制內源性凝血級聯的激活。盡管如此，凝血酶活性還受到(x2-巨球蛋白、肝素輔因子n和(xi-抗胰蛋白酶的抑制。雖然對凝血酶調節作用較弱，al-抗胰蛋白酶卻是人血清中主要的絲氨酸蛋白酶抑制物，其生理學意義由下面的事實而證明該蛋白在肺氣腫的發生中具有決定性的作用。纖維蛋白原活化為纖維蛋白纖維蛋白原(因子1)由三對多肽鏈組成([A-a][B-(3]M)2。這六條鏈在其近N-端通過二硫鍵共價連接。A-cc和B-卩鏈的A和B部分分別包含纖維蛋白肽A和B。纖維蛋白原的纖維蛋白肽區域含有若干谷氨酸和天冬氨酸殘基，這些殘基對此區賦予了高度的負電荷，且有助于纖維蛋白原在血漿中的溶解度。活化的凝血酶為絲氨酸蛋白酶，該蛋白酶在纖維蛋白肽和該蛋白a、b部分之間的4個精氨酸-甘氨酸鍵處水解纖維蛋白酶原。凝血酶介導的纖維蛋白肽釋放產生了帶有(oc-(3-力2亞單位結構的纖維蛋白單體。這些單體以規律的陣列自發聚集，形成較弱的纖維蛋白凝塊。除了纖維蛋白活化以外，凝血酶將因子xm轉化為因子xnia，后者是高度特異的谷氨酰胺轉移酶，其在谷氨酸中酰胺氮和纖維蛋白單體內賴氨酸的e-氨基之間引入了由共價鍵組成的交聯。纖維蛋白凝塊的溶解纖維蛋白凝塊的降解是纖維蛋白溶酶的功能。纖維蛋白溶酶是一種絲氨酸蛋白酶，其以無活性的酶原(纖溶酶原)形式進行循環。任何游離的循環纖維蛋白溶酶會迅速地被a2-抗纖溶酶抑制。纖溶酶原與纖維蛋白原和纖維蛋白都結合，因此能在凝塊形成時結合在凝塊中。組織纖溶酶原激活物(tPA)以及尿激酶(程度較小)都是將纖溶酶原轉化為纖維蛋白溶酶的絲氨酸蛋白酶。，無活性tPA在損傷后從血管內皮細胞中釋放出來；其結合到纖維蛋白并因此被活化。尿激酶則以尿激酶原的前體形式由上皮細胞內層分泌導管產生。尿激酶的作用是激活可在這些導管中沉積的纖維蛋白凝塊的溶解。活性tPA裂解纖溶酶原為纖溶酶，纖溶酶再消化纖維蛋白，產生可溶性降解產物，該產物既不與纖溶酶結合，也不與纖溶酶原結合。隨著纖溶酶原和纖溶酶的釋放，它們迅速被其各自的抑制物滅活。tPA 活性的抑制源于與特異抑制蛋白的結合。至少有4種獨特的抑制物已經被發現，其中2-纖溶酶原激活物抑制劑1型(PAI-1)和2型的生理學意義是最大的。從上面的敘述可以看出，凝血涉及的生理學機制極其復雜，要理解的是在設計或鑒定能安全地調控凝血過程中的許多相關通路的藥劑是非常困難的。凝血系統的多重級聯反應使其觸發信號得以巨大的放大。以外源性凝血為例，前轉變素(proconvertin)(VII)、 Stuart因子(X)、凝血酶原以及纖維蛋白原在血漿中的濃度分別為<1、 8、 150和 4000 mg/mL。因此，一個很小的信號很快被放大為有效的止血控制。凝血必須嚴格地受到調控，因為任何一個不恰當的血凝塊都可以造成致命的后果。的確，血液凝塊就是中風和心臟病發作的主要原因，這兩種情況是人類死亡的兩種主要因素。所以，凝血的控制是醫學上關心的一個主要問題。若干抑制劑已被開發出來，它們抗凝作用的機制不同。這些抑制劑包括肝素類、香豆素類和1，3-茚滿二酮。肝素是一種粘多糖，分子量6，000 40，000 Da，大多數市售肝素制劑的平均分子量為12,000 15,000。多聚鏈由經內糖苷鍵連接的D-葡糖醛酸和糖醛酸的雙糖重復單位組成。糖醛酸殘基可以是D-葡糖醛酸或L-艾杜糖醛酸。在這些單糖殘基上的少數羥基基團可被硫酸化，形成帶高度負電荷的聚合物。每個糖類殘基平均負電荷為大約2.3。肝素的關鍵結構單位是其獨特的五聚糖序列。這個序列由三個D-葡糖胺和兩個糖醛酸殘基組成。中心的D-葡糖胺殘基包含一個獨特的 3-0-硫酸根部分，其在該序列之外很少見。肝素和抗凝血酶形成高親和力的復合體。抗凝血酶-肝素復合體的形成極大地增強了兩種主要促凝血蛋白酶(因子Xa和凝血酶)的抑制速率。正常情況下抗凝血酶單獨對這兩種酶的緩慢抑制速率( 103-104 M/s)可被肝素提高大約1,000倍。這兩種蛋白酶的活性形式的加速滅活防止了隨后纖維蛋白原到纖維蛋白的轉化，而這對血凝塊的形成至關重要。肝素相對無毒，但使用過量或過敏可引起過度的出血。對于這些過度的出血并發癥可用魚精蛋白作解毒藥。香豆素類及其衍生物是主要的口服抗凝劑。華法令是香豆素的衍生物，在市場上銷售的是R、 S異構體的外消旋混合物。香豆素起效慢，體內在4 12小時的潛伏期后發揮作用，其藥效持續1.5 5天。起效慢的原因可能是需要一段時間來降低藥物前體凝血酶原的血漿水平，而華法令所觀察到的長藥效時間可能是肝臟重新合成凝血酶原至前體藥物的血液水平所需要的滯后期引起的。香豆素類和1,3-茚滿二酮(見前)還有一個缺點是它們和某些藥物會發生相互作用。例如口服抗凝劑的效果會被保泰松和水楊酸鹽增強，卻會被巴比妥酸鹽和維生素K所拮抗。在凝血酶原生物合成中，香豆素類是維生素K的競爭抑制物。凝血級聯反應依賴于一個非常重要的步驟中的凝血酶原到凝血酶的轉化。但這種轉化取決于凝血酶原N-端上的10個g-羧基谷氨酸(GLA) 殘基的存在。多個Gla殘基形成了 012+的結合位點。一般情況下，凝血酶原的10個谷氨酸殘基(Glu)在翻譯后修飾中轉變為Gla殘基。這種翻譯后修飾是由維生素K還原酶和維生素K環氧化物還原酶催化的。維生素K是此轉化反應的輔因子。這樣，維生素K就在還原型和環氧化物型之間循環。由于和維生素K在結構上的相似性，香豆素類被認為能結合酶類，維生素K還原酶和維生素K環氧化物還原酶，而不促使凝血酶原的Glu殘基轉變為Gla。因此，凝血酶原不會和因子 Xa發生作用。在本領域中1,3-茚滿二酮自上世紀四十年代就被認為是抗凝劑。茴茚二酮的起效和持續時間類似于香豆素類。茴茚二酮的主要缺點是其副作用。某些患者對它過敏，出現皮疹、發熱和白細胞減少。盡管總體上能達到一些益處，但目前使用的治療性抗凝劑仍然是發病率和死亡率的主要原因，這是由于抗凝劑的療效有限和更多的是出血并發癥所引起的。為克服這些問題，已經開發了許多新的藥劑。但看起來治療用抗凝劑無法避免其固有的問題，即效果越好，出血并發癥越多。以凝血為耙標的抗凝劑可能代表著能打破上述的致命性的惡性循環。如果把針對凝血特異性抗原表位的抗體和抗凝劑融合起來，則能使抗凝劑富集在血凝塊上而使抗凝劑在血液中的循環濃度保持低水平。成功的血凝塊靶向作用取決于選擇作為靶標的抗原表位豐度和特異性。過去的研究證明纖維蛋白可用于血凝塊靶向。但纖維蛋白或纖維蛋白降解產物可在血中循環，導致抗凝劑在循環中的錯誤靶向。在本領域中更進一步的問題涉及到凝血疾病的診斷。一般公認的是許多凝血性疾病可被預防，或者至少被防止進展至更嚴重的地步。因此，對臨床醫生而言需要有一種診斷早期凝血障礙的指標。這就是本發明要克服或減輕現有技術問題的一個方面，即提供一種有效但又不延長凝血時間的抗凝劑。本發明進一步提供了診斷一種凝血相關障礙的方法和試劑。包括在本說明書中的對文件、法條、材料、論文以及類似物的討論僅是為了理解本發明而提供一些背景知識。并不推薦或代表任意的或所有的這些內容形成現有技術的一部分或是與本發明相關的領域中的公知的一般知識，如同其在本申請的每個權利要求的優先權日之前就存在一樣。發明內容在一個方面，本發明提供了一種抗凝劑，其包括能抑制凝血的第一種組分和能耙向活化血小板的第二種組分，其中當將該藥劑給予受試者時，第二種組分引導第一種組分至活化的血小板上。本申請人已經證明，將抗凝劑靶向到活化的血小板提供了一種能抑制凝血而沒有過多出血危險的手段。在本發明的一種形式中，第二種組分靶向活化的纖維蛋白原/纖維蛋白結合GPIIb/IIIa上的配體誘導結合位點(LIBS)，該位點在血凝塊上很豐富并特異表達，表現為血凝塊特異性靶標。為了進行血凝塊靶向，制造了抗-LIBS單鏈抗體(scFv抗.uBs)。作為第一種組分，使用了一個高效的直接因子Xa(僅a)抑制劑，壁虱抗凝肽(TAP)。在流式細胞儀中證實融合分子scFv抗-ubs-TAP的特異抗體結合，抗-漢a 活性在生色測定中證明。在氯化鐵誘導的小鼠頸動脈血栓形成模型中用多普勒血流測量法以閉塞時間(OT)測定體內抗凝效果。scFv ffi .IJBS-TAP的OT延長與依諾肝素、等摩爾劑量的重組TAP和非耙向的 mut-scFv-TAP相當，即使在后面這些對照不顯示抗凝血效果的低劑量下也能延長OT。與檢測的其它抗凝劑相比，scFv fcUBS-TAP不延長通過斷尾檢測的出血時間。本發明還提供了藥學組合物和治療或預防凝血障礙的方法，所述的方法包括給予需要這種方法的哺乳動物以有效量的如本文所述的化合物的步驟。本發明還包括篩選用作抗凝劑的化合物的診斷方法，以及使用針對活化血小板的探針鑒別血栓形成、血栓性栓子、不穩定斑塊存在的方法。

圖1顯示ScFv-K.UBS-TAP:細菌果膠酸裂解酶(pelB)的信號肽序列包括40到105位的核苷酸，重鏈可變區包括106至483位的核苷酸，接頭(YOL抗原決定簇)包括484至510位的核苷酸；輕鏈可變區包括 511至861位的核苷酸；TAP區包括862至1041位的核苷酸，His6-tag 始于1069位止于1086位。圖2顯示pHOG21 -scFv抗-固s -TAP的圖譜。RAMP:氨芐青霉素抗性基因；ColElORI:大腸桿菌復制起始點；fl IG，絲狀基因間區； pe舊果膠酸裂解酶pe舊的引導肽序列；VH/VL:重/輕鏈；TAP:壁虱抗凝肽；His6:6個組氨酸重復。圖3顯示IgG抗-LIBS、 scFv抗-LIBS和scFv抗-LIBS-TAP與活化的人血小板特異性結合，但不與非活化血小板結合的流式細胞計數直方圖。與ADP-活化的血小板的結合用空白的直方圖表示；與非活化血小板的結合用陰影的直方圖表示。與IgG抗體的結合用DTAF交聯的羊抗鼠抗體檢測，與scFv的結合用AlexaFluor488交聯的抗-His-tag 抗體檢測。圖4顯示Ni 2+-純化的scFv抗-LIBS、 scFv抗-LIBS-TAP和非革巴向的mut-scFv-TAP的Western印跡分析。MW:分子量標記(6xHis蛋白梯)，1: scFv抗-LIBS， 2: scFv抗-LIBS-TAP， 3:非耙向的scFv-TAP。圖5顯示rTAP、 scFv抗-LIBS-TAP和非革巴向的mut-scFv-TAP，而不是scFv抗-LIBS對因子Xa活性的抑制作用。因子Xa (500 pM)對生色底物(spectrozyme FXa #222)的裂解在405 nm處檢測。標記條顯示對代表性試驗的三次重復測量的光密度(OD)的平均值和標準差。圖6顯示IgG抗-LIBS、 scFv抗-LIBS禾n scFv抗-LIBS-TAP與活化的鼠血小板特異性結合，但不與非活化血小板結合的流式細胞計數直方圖。與凝血酶活化的血小板的結合用空白的直方圖表示；與非活化血小板的結合用陰影的直方圖表示。與IgG抗體的結合用DTAF交聯的羊抗鼠抗體檢測，與scFv的結合用Alexa Fluor 488交聯的抗 -His-tag抗體檢測。圖7顯示三氯化鐵誘導的頸動脈血栓形成小鼠模型中高、低劑量的scFv抗-LIBS-TAP的抗凝效果。用納米多普勒流量探頭在頸動脈處通過流量測量測定閉塞時間來評價血栓的發生。生理鹽水(0.9% NaCl) 和單鏈抗體scFv抗-LIBS被用作陰性對照。臨床使用的藥物依諾肝素被用作陽性對照。rTAP、 scFv抗-LIBS-TAP和非靶向的mut-scFv-TAP 以較高的等摩爾劑量使用，scFv抗-LIBS-TAP和非靶向的scFv-TAP 以較低的等摩爾劑量使用。給出了每組4只小鼠的均數和標準差(SD)。圖8顯示同依諾肝素、rTAP和非靶向的mut-scFv-TAP相比，靶向血凝塊的抗凝劑scFv抗-LIBS-TAP不引起出血時間延長。通過小鼠斷尾法檢測出血時間。生理鹽水(0.9。/。NaCl)和單鏈抗體scFv抗-LIBS 被用作陰性對照。同scFv抗-LIBS-TAP相比，rTAP和非靶向的 mut-scFv-TAP顯示出血時間明顯延長。給出了每組4只小鼠的均數和標準差(SD)。圖9顯示血栓粘附試驗的概況。固定在纖維蛋白原上的血小板用抗-LIBS珠對比劑經活化的GPIIb/IIIa受體靶向。用P-選擇素抗體和熒光素-親和素對血小板進行共染色以證明對比劑僅對血小板的選擇性結合。圖10左屏粘附試驗的共聚焦顯微鏡圖像。P-選擇素和熒光素親和素染色的血小板顯示為綠色的聚集體，被抗-LIBS珠對比劑的紅色熒光珠圍繞。右屏來自60個共聚焦顯微鏡圖像的Z堆棧的3D重建。圖11顯示人血栓的磁共振像，與縱軸垂直重建的3D FLASH-圖像。暴露于不同濃度抗-LIBS珠對比劑的血栓顯示陰性對照(圍繞血栓的黑圈)，如SPI0珠在T2^中所致的那樣。在珠上無關抗體接觸的血栓不顯示此陰性對照。圖12顯示用鼠抗人P-選擇素和Nova Red(棕色)染色的血小板的免疫組織化學。抗-LIBS珠對比劑顯示為黃色，且僅出現于血栓表面上的血小板聚集體區。圖13顯示纖維蛋白原固定的人血小板用CD62P抗體進行親合素-熒光素染色的免疫熒光。(A)用紅色自熒光LIBS-MPIO對比劑孵育的血小板顯示與呈現綠色親和素-熒光素誘導信號的血小板特異地結合, 而用對照MPIO對比劑孵育的血小板顯示沒有結合(B)。 (C)代表來自用 LIBS-MPIO孵育并用P-選擇素染色的血小板的z-堆桟的3D重建，證明在活化的GPIIb/IIIa受體上靶向LIBS的原理。圖14顯示11.7 T離體MRI， 3D梯度回波序列(TE = 4 ms / TR= 90 ms,視野13 x 13 x 19.5 mm,矩陣大小256 x 256 x 384)，各向同性解析度25 jim3。(A)顯示用LIBS- MPIO灌注的鼠受損股動脈。在LIBS-MPIO 鼠以及對照MPIO鼠(B)中可以觀察到黑色固有血管壁信號，但可觀察到附著在股動脈腔側的信號缺損，其作為LIBS-MPIO鼠中MPIO結合的指征(A，箭頭)。MPIO誘導的MRI信號缺損的定量顯示了 LIBS-MPIO 和對照-MPIO灌注小鼠間的顯著差異(p0.05)。圖15顯示代表性的受損股動脈節段的組織學。(A)顯示用 LIBS-MPIO (箭頭)灌注后多個珠子結合到受損的管壁上，而對照 MPIO灌注后沒有觀察到結合(B)。盡管珠的聚苯乙烯包衣使鐵核心呈現典型的藍染，但組織(A)和(B)是鐵染色的。但是，依靠顯微鏡的焦距可觀察到鐵核的藍色固有信號。(C)用CD61和NovaRed染色的免疫組織化學證實了 LIBS-MPIO對比劑與血小板的結合，(a)代表管壁附著的血小板和(b)直接與血小板結合的MPIO。 (D) LIBS-MPIO和對照 -MPIO灌注小鼠的每個代表性組織學切片上結合的MPIO的量化，顯示了 LIBS靶向對比劑的高度特異性結合(pO.Ol )。圖16顯示了 MRI中每只受損腿的MPIO信號和組織學中每張切片結合的MPIO之間的相關性分析，顯示兩者顯著相關(112=0.72)。圖17顯示采用ImagePro Plus的3D構建器插件制作的LIBS-MPIO 動物股動脈的三維重建圖。(A)顯示股動脈腔表現為綠色管。(B)單獨顯示紅色MPIO信號，和(C)顯示帶有解剖學圖片的合并信息。
具體實施方式
在第一個方面，本發明提供了一種抗凝劑，其包括能抑制凝血的第一種組分和能靶向活化血小板的第二種組分，其中當將該藥劑給予受試者時，第二種組分將第一種組分引向活化的血小板。本申請人發現通過靶向抗凝劑到活化的血小板上增強了抗凝效果并去除了出血并發癥，從而解決了本領域中突出的問題。本申請人發現活化的血小板可以作為有效靶向血凝塊的有效靶標。血小板在動脈系統特別是血栓中非常豐富，像動脈硬化癥引起的血栓癥如在心肌梗塞中。活化血小板對血凝塊是高度特異的，且一般在循環中不能發現。因此，有效靶向血凝塊、豐度和特異性的要求都可滿足。除這些有利特性外，用活化血小板作為耙向血凝塊的抗原表位較纖維蛋白更有優勢，因為血小板激活可能先于纖維蛋白形成。上述抗凝劑可采用任何形式，只要兩種組分能夠完成上述其所需的功能。上述抗凝劑組分可以是任意大小，只要該藥劑能有效地定位在血凝塊部位。但是，該抗凝劑組分優選很小，因為可改善血栓的進入和滲透性。在本發明的優選形式中，第一種組分的分子量大約為7,000 Da 或更少。雖然現有技術公開了一些小的抗凝劑，但那些強力抑制關鍵和重要凝血因子者是優選的。在本發明的一個形式中，第一種組分是來自軟蜱毛白鈍緣蜱(Omithodoros moubata)的肽抗凝劑，它使用抗Xa 因子抑制劑來幫助從其宿主中提取血液。此抗凝劑最初在1990年 (Waxman等人.Science 1990; 248: 2473)被描述并命名為TAP(壁虱抗凝肽)。重組TAP被描述為選擇性Xa因子抑制劑，由于Xa因子在凝血級聯反應中關鍵的、上游的和速率決定性地位，使之具有有效的抗凝作用(Neeper等人.JBiol Chem 19卯；265: 17746)。 TAP自然界中發現的最有力的抗凝劑之一，且其是僅有60個氨基酸的小分子。合適的TAP 序列可以從Genbank數據庫中獲取，登錄號為M60480。第一種組分可作用于外源或內源性凝血途徑的任何成分。在本發明的優選形式中，第一種組分作用在Xa因子酶上。直接抑制漢a已被建議優于間接的、抗凝血酶-m-介導的抑制作用，如肝素所介導的，因為血凝塊結合的僅a和凝血酶原酶相關的僅a看起來顯然能被DCa直接抑制劑更好地抑制。在研究抗血栓形成能力和防止重閉合的對比研究中，TAP已顯示優于間接漢a抑制劑以及凝血酶抑制劑。盡管有這些優勢，但與水蛭素相似，在用于人的治療中，預期有較高的出血率，之前尚未用于開發人用藥物。不希望受理論約束，靶向TAP到形成中的血凝塊上可減少全身性抗凝血作用，從而減少出血并發癥，并由于將抗僅a活性穩定地固定在血凝塊部位而可獲得長期的局部抗凝作用。于是，作為小分子、顯示有直接抑制作用而不需要輔因子且靶向于凝血途徑的早期中心的TAP成為靶向用藥的優選候選者。雖然TAP被用在本發明的一個實施例中，許多其它抗凝劑也是適合的，包括凝血因子的其它抑制劑如水蛭素。此外，對纖維蛋白溶解的靶向也預期有高效的血栓溶解作用而出血并發癥很少。如本文所用的術語"抑制凝血"不僅僅指完全抑制，也包括部分抑制血凝塊的形成。不希望受理論約束，我們認為部分抑制是優選的，因為完全抑制可引起不受控制的出血。第二種組分的作用是將第一種組分帶到活化血/」、板的生理學近處u通過具冇與活化血小板結合，或與其關聯的分子結合能力的第二種組分可實現此作用。典型地，通過能與活化血小板表面上的標志物結合的第二種組分來實現此作用。為賦予該藥劑以最可能高的特異性，該標志物應當僅在活化的血小板表面上表達。然而要理解的是這種絕對的需求并非嚴格必要的，且只要第二種組分能主要地靶向活化血小板，那么本發明就能提供本文所公開的這些優勢。在活化的血小板上有大量的標志物，包括活化的GPIIb/IIIa。該標志物可以采取無活性和活性形式，與凝血系統的其他組分相比發現在活化的血小板上一種形式所占的比例比另一種高得多。在血小板表面上表達豐度最高的一種分子是糖蛋白受體(GP)nb/IIIa(CD41/CD61)。該受體屬于整合素的粘附分子家族，也稱為0CubP3。整合素由兩個非共價連接的亞單位組成，其與GPIIb/IIIa配體纖維蛋白原的結合會經歷從低親和力至高親和力受體的構象變化。除了配體結合袋的暴露以外，這種構象變化也誘導了 GPIIb/IIIa上所謂配體誘導結合位點(LIBS)的暴露。這些結合位點對于活化的和/或配體結合的GPIIb/IIIa受體是特異的。GPIIb/IIIa是高度富集的，在每個血小板表面上有大約60 000~80 000個分子。在血小板活化過程中此受體從無活性狀態轉化為活性狀態，其機制是受體的構象改變從而暴露出了新的抗原表位。因此，在本發明的一個形式中，第二種組分能與在GPIIb/nia受體活化過程中形成的新抗原表位結合。專業技術人員要理解的是對于要被物理性連接的第一種和第二種組分并不需要太嚴格。例如，第一種和第二種組分可以是物理分離的，第一種組分包括與第二種組分結合的工具。在這種方案下，第一種組分可首先給予受試者，并運輸到新的血凝塊以結合活化血小板。然后可給予第二種組分并與第一種組分結合。因此，兩種組分是物理分離的直至功能抗凝劑到達了活化血小板的部位。在本發明的一個優選形式中，抗凝劑是單個分子的形式，且典型地是單個蛋白分子。用于將兩個組分包含在單個分子中的常規手段是將兩種組分包括在單鏈抗體分子的框架結構中。這些分子特別適合用于特異性地靶向其可變區的包含體所指定的抗原表位。可變區可如下設計其與被靶向的抗原表位有親和力。單鏈抗體是設計重組治療藥劑的有前途的形式。它們僅由經短接頭分子在單條肽鏈上融合在一起的抗體重鏈和輕鏈的可變區組成。因此，單鏈抗體(scFv)包括含有完整的抗體結合位點的最小片段。由于大小是免疫原性的決定因素，因此期望scFv僅有最小的免疫原性(如果有的話)。單鏈抗體的另一個優勢是第一種和第二種組分的偶聯使兩種組分的生物學功能丟失很少。但要理解的是化學偶聯一般會引起抗體結合功能以及偶聯的效應器分子活性的明顯喪失，可使用分子生物學技術來偶聯scFv而沒有功能性喪失。最后，可在短時間內以很低的成本在細菌中大量的生產scFv，且可通過親和色譜將其高度純化。產生單鏈抗體的手段是本領域技術人員所熟知的，關于該課題的綜述可見 Recombinant Antibodies (Breitling & Duebel, 1999, Publisher: Wiley & sons, ISBN 0471 178470)，該文的內容引入本文作為參考文獻。優選，抗-LIBS單鏈抗體(scFv)的克隆基于表達IgG抗-LIBS 145的雜交瘤細胞系。選擇針對LIBS(配體誘導結合位點)抗原表位的抗體用于抗凝劑對血凝塊的靶向。如以前所證明的，mAb抗-LIBS 145(IgG 抗.UBS)證明在血小板與RGD-肽、阿昔單抗(abdximab)、替羅非班 (tirofiban)和依替巴肽(eptifibatide)孵育后有與GPIIb/IIIa的配體誘導結合(Schwarz等人，JPET 2004, 308: 1002)。而且，IgG抗七iBs證明在纖維蛋白原的存在下與ADP-活化的血小板有強力的結合(圖2)。因此，該抗體提供的靶向傾向性是有很高的豐度和特異性的。表達mAb抗-LIBS 145的雜交瘤細胞用作克隆抗-LIBS單鏈抗體 (scFv)的基礎。制備此雜交瘤細胞系的mRNA，并使用寡聚-dT引物逆轉錄。通過PCR使用復性為保守區的引物在可變區的5'和3'端擴增抗體重鏈和輕鏈的可變區(其細節見本文中其他地方所述的方法)。將PCR 產物克隆進能允許在細菌中高水平表達的pHOG21表達載體中。在轉化TG1大腸桿菌CE. co")后，評價單個克隆的LIBS與GPIIb/nia的典型結合。選擇在流式細胞儀中與初始的IgG抗-LIBS ]45 mAb相比顯示較強結合的一個克隆(圖2)以備進一步使用。對該克隆進行測序，其顯示了單鏈抗體的所有典型特征(圖1)。而且Western印跡分析顯示了正確的大小，為大約32kDa(圖3)。優選，單鏈抗體表達為scFv融合蛋白。基于以前的結果，即顯示可融合TAP而沒有功能喪失(TH)，選擇這種高度有效的因子Xa直接抑制劑來與克隆的單鏈抗體偶聯。根據已發表的序列信息初歩合成 TAP(Genbank數據庫，登錄號M60480),并將其在輕鏈可變區的C端處直接克隆進pHOG21表達載體中(見圖1A、 B)。 pHOG21含有pdB-引導子-序列以經包含體促進純化，含有His(6)-tag用于N產-純化以及檢觀U(圖1A、 B)。純化的scFv抗.uBs-TAP的產量為1L細菌培養物中大約0.4至0.8 mg。表達和純化后，單鏈抗體構建物的大小通過Western 印跡分析來進行評價(圖3)。 scFv抗.uBs單獨的分子量為 32kDa，整個融合蛋白scFv抗-ubs-TAP的分子量為 39 kDa，非靶向的mut-scFv-TAP 的分子量為 42 kDa(圖3)。在本發明的一個高度優選的形式中，單鏈抗體基本上如圖1中所示。專業技術人員要理解的是遺傳代碼的兼并性和將氨基酸替代為其他類似氨基酸的能力意味著可很容易地產生圖1所指定的分子的衍生物和等價物。這些衍生物和等價物包括在本申請的范圍之內。在另一個方面，本發明提供了包括如本文中所述的抗凝劑的藥學組合物。專業技術人員將能夠設計適合用于通過常規方法遞送本文中所述的抗凝劑的組合物。當抗凝劑是蛋白質時，該組合物可簡單地含有等滲濃度的NaCl。可需要加入載體蛋白、穩定劑、緩沖液、非水溶劑、鹽類、防腐劑和類似物。在另一個方面，本發明提供了治療或預防凝血障礙的方法，所述方法包括給予需要這種方法的哺乳動物以有效量的如本文中所述的組合物的步驟。
一般，該組合物將通過靜脈內或動脈內推注或輸注而全身給藥。就用藥量而言，當抗凝劑是蛋白質時，用藥量為大約30mg/kg 至大約300mg/kg。對于任何指定的受試者，或對于任何指定的凝血障礙，將用藥量向上遞增或向下遞減以達到所需的臨床效果是臨床醫生所力所能及的。凝血障礙可以是需要抑制凝血的任何障礙。這些障礙包括與血栓形成相關的所有臨床情況，如冠狀動脈疾病、急性冠狀動脈綜合征包括心肌梗塞、中風、頸動脈或主動脈的動脈粥樣硬化、深部靜脈血栓形成、肺栓塞、和器官的動脈粥樣硬化或血栓形成。本申請人已經評價了優選的雙功能融合分子scFv抗.lbs-TAP。融合分子scFv ffl.UBS-TAP的單鏈抗體部分的功能通過流式細胞儀來評價。 scFv抗七舊s-TAP和scFVffuLIBS證明與纖維蛋白原結合的活化血小板具有相似的結合特性(圖2)。因此，遺傳融合并不會顯著地改變單鏈抗體的結合特性。通過生色測定法來評價融合構建物的因子Xa抑制活性。在 scFv抗-l鵬-TAP、非靶向的mut-scFv-TAP、 scFv ^LIBS和重組TAP的存在下將因子Xa與特異的生色底物孵育(圖4)。與rTAP相比，在融合構建物中TAP活性稍有下降，但還是清楚地存在的(圖4)。因此，抗體結合和因子Xa抑制作用兩種功能仍然保留。為了顯示與傳統的非靶向抗凝劑的應用相比抗凝劑對GPIIb/IIIa 的LIBS抗原表位的靶向作用較佳，選擇了已建立的小鼠血栓形成模型 (Farrehi等人，1998; 97:1002)。但，其首次證明了抗-LIBS抗能能用于靶向纖維蛋白原結合的活化小鼠血小板。本申請人獲取了小鼠血液并通過流式細胞儀評價了初始IgGms、 scFvtt.UBS、和融合構建物scFv 抗-l鵬-TAP與小鼠血小板的結合。與人血小板的結果類似，可見IgG抗丄舊s的特異性結合，但單獨使用scFv抗-l舊s抗體以及其融合蛋白scFv抗-ubs -TAP與纖維蛋白原結合的活化小鼠血小板的結合具有更強的特異性結合(圖5)。因此，建議對小鼠血小板的耙向作用要使用所產生的抗 -LIBS融合構建物。使用三氯化鐵在小鼠的頸動脈中誘發血栓。通過納米流量探頭測量到的血流終止用作血管內閉塞性血栓的指標。氯化鈉溶液和單鏈抗體抗-LIBS用作陰性對照，用作陽性對照的依諾肝素代表目前的臨床標準。依諾肝素的閉塞時間幾乎增加了 1倍(圖8)。等摩爾量的重組TAP、非靶向的mut-scFv-TAP和scFv ffi-UBS -TAP使閉塞時間顯著延長，其效應接近于依諾肝素。使用scFv ffi.UBS-TAP遞送的初始劑量減少至1/10 (0.03 pg/g體重)仍能引起閉塞時間顯著的延長(p=0.002)，而在相同的劑量下非靶向的mut-scFv-TAP不引起閉塞時間的顯著延長。因此，scFv ft.UBS -TAP能顯示很強的抗凝效應，甚至在直接對照組和非靶向 mut-scFv-TAP不產生顯著抗凝作用的劑量下仍顯示很強的抗凝效應。耙向活化血小板抗凝作用的主要優勢是減少出血并發癥。通過標準化地手術切斷小鼠尾部來測定出血時間。如所期望的那樣，鹽水和 scFVffi-UBS不引起出血時間延長，而依諾肝素，且尤其是重組TAP產生了相當長的延長。在0.3 )ig/gBW的劑量下，非靶向mut-scFv-TAP 和scFv抗.jJBS-TAP都證明有很強的抗凝效應(圖6)，僅非耙向的mut scFv-TAP使出血時間顯著延長(pO.OOl，圖7)。靶向血凝塊的scFvfiUJBS -TAP根本不引起出血時間的延長。較低劑量的scFv K-L1BS -TAP證明在小鼠的頸動脈處有明顯的抗凝效應，也不引起出血時間延長。因此，通過新產生的TAP與抗-LIBS單鏈抗體的融合體能達到高效的抗凝效應而不延長出血時間。要理解的是，盡管避免出血時間的延長是本發明的一個優勢，但在一些實施方案中如本文所述的抗凝劑會增加出血時間。在另一個方面，本發明提供了如本文所述的抗凝劑在制備用于預防或治療凝血障礙的藥物中的應用。在另一個方面，本發明提供了一種篩選用于將抗凝劑靶向血凝塊的化合物的方法，所述方法包括以下的歩驟提供候選化合物，將該化合物與活化血小板和血凝塊的至少一種其他成分接觸，評價該化合物是否與活化血小板結合，并評價該化合物是否與血凝塊的至少一種其他成分結合，其中如果與血凝塊的至少一種其他成分相比，該化合物與活化血小板具有較高的親和力，則該化合物是可用的。因此，基于本申請人的發現(即活化血小板是抗凝治療的有益靶標) 根據本發明的上下文有可能鑒定用作第二種組分的化合物。專業技術人員對于用于測定一種分子與另一種分子結合的大量方法是很熟悉的，這些方法包括免疫吸附法、色譜法、質子表面共振法和類似方法。在另一個方面，本發明提供了通過如本文中所述的篩選方法鑒定的化合物。本發明的另一個方面提供了對受試者的凝血障礙診斷或預后的方法，該方法包括檢測受試者血管中的活化血小板。就本申請人所知，現有技術沒有公開活化血小板用于診斷或預后。活化血小板的檢測將為臨床醫生提供以能用于大量醫學應用中的相關標志物。一個應用是將在破裂的冠狀動脈斑或易于發生破裂的那些斑塊上發現的活化血小板成像。這種方法能對心肌梗塞綜合征進行早期非侵入性診斷，使隨后預防性地將支架植入至相關的病變部位成為可能。這具有特殊的臨床意義，因為冠狀動脈造影術(如現有技術中所述) 僅能提供關于血管腔的信息，但不能提供關于血管壁本身形態學的信息。因此，使用冠狀動脈造影術不能檢測到可能已經破裂的或有破裂傾向的斑塊。考慮到活化血小板能用作診斷標志物，本發明也提供了用于檢測血管異常的探針，其包括(a)能靶向活化血小板的結合組分和Cb)標記物。專業技術人員要理解的是在本發明上下文中使用的探針一般是以含水組合物提供的，并在診斷方法之前或期間被注射入受試者的動脈或靜脈中。然后該探針通過血液被運輸至機體內的目標部位，如果有活化血小板存在的話則與其結合。然后通過合適的手段如MRI檢測結合的探針。結合組分可以是能夠與活化血小板表面上的標志物結合。合適的標志物的一個非限制性實例是活化的GPIIb/IIIa受體分子。也可考慮其他的標志物如PAC-1和CD62-P。在本發明的一種形式中，結合組分和標記物在單鏈抗體分子的框架結構內。探針和使用本文中所述的探針的方法可用來檢測活化血小板的任何積聚，例如在肺栓塞或周圍血管栓塞中，或在周圍或腦動脈中破裂的粥樣硬化斑上。這些病變能在疾病過程中的早期被檢測到和選擇性地進行治療。專業技術人員要理解的是本文中所述的探針和方法可用于鑒定對凝血障礙有易感性的個體，而不需要證明凝血障礙的臨床上可識別的指征或癥狀。在上述方法的一個優選形式中，用于檢測活化血小板的歩驟的探針是如本文中所述的單鏈抗體。優選該單鏈抗體與如本文中所述的抗 -LIBS抗體相同或相似。要理解的是對于診斷目的，單鏈抗體不需要包括抗凝組分。實際上，專業技術人員要理解的是有可能使用單鏈抗體的片段，只要該片段包括用于與活化血小板結合的位點。不希望受限于理論，在本申請中單鏈抗體的緊湊尺寸(compact dimension)具有特殊的優勢。建議抗體能夠穿透血栓表面進入存在大量活化血小板的區域中。這樣就能更有效地檢測到結合的抗體，從而獲得更高的成像靈敏度。抗體探針也可附著在有活化血小板沉積的血管表面上。上述方法可用來診斷和鑒定血栓(例如，深部靜脈血栓形成)、血栓性栓子(例如，肺栓塞)和活化血小板的沉積(例如，在不穩定粥樣硬化斑的部位:i。早期檢測將是非常有益的，能進行血凝塊溶解劑的給藥和/ 或抗凝治療和/或介入操作。專業技術人員要理解的是用于診斷和預后方法的探針可通過本領域任何已知的方法進行標記。根據微粒的官能性不同，對于此目的可使用不同的策略。一種方式是在羧基官能化的SPIO和單鏈抗體的游離氨基之間建立肽鍵。可用于這種化學交聯方法的各種市售偶聯劑和試劑盒對于專業技術人員來說是很熟悉的。另一種方式將是使用抗體的組氨酸-標記與市售的鈷官能化1 pmSPIO-珠結合，從而通過組氨酸與鈷的結合獲得了單鏈抗體/珠復合體。簡言之，采取這種方式，單鏈抗體和SPIO-珠在室溫下孵育10分鐘，此后通過磁鐵分離懸液并沖洗數次。通過采用相同的方案將無關單鏈抗體與SPIO交聯產生合適的對照。專業技術人員將要理解的是在X-線成像法中使用的任何標記物都可加入至探針中。作為上述方法的一個非限制性實例，順磁性標記物可與靶向活化血小板的探針偶聯。在給予探針的過程中，順磁性標記物將定位在血凝塊、栓子或不穩定粥樣硬化斑的部位，然后可通過磁共振成像技術來顯影。可選的是，上述探針可被放射標記(例如，用锝-99m、銣-82、鉈 201、 F-18、鎵-67或銦-111標記)，使用Y照相機來顯影活化的血小板。也可考慮使用所述的抗體采用計算機體層掃描術和超聲法來標記活化的血小板(例如，微泡的靶向作用)。本申請人在此公開了探針在體內情況下的應用，該探針能耙向活化的血小板，并能使用MRI來對對比結合進行定量。在本發明的一種形式中，使用了僅能識別GPIIb/nia的活性構象的單鏈抗體，該抗體與微米尺寸的順磁性氧化鐵微粒偶聯。微米尺寸的微粒比本領域中通常使用的氧化鐵納米微粒大幾個數量級，其能進入血管內結構。就本申請人所知，本文第一次描述了使用單鏈抗體來對活化血小板進行功能性成像。為了證明靶向活化血小板的標記探針在體內情況下的應用，使用了小鼠股骨金屬絲損傷模型(Roque, M.等人，Mouse model of femoralmolecules on the luminal surface and recruitment of neutrophils. Arterioscler Thromb Vase Biol, 2000. 20(2): p.335-42)，損傷后24小時獲取血小板單層。小鼠股骨金屬絲損傷后細胞事件的時間過程得到了很好地描述，且如圖15C中所證明，同樣顯示了在24小時后在裸露的內皮上沉積的匯合血小板。這被用作使用針對活化GPIIb/nia受體上配體誘導結合位點的單鏈抗體靶向活化血小板的基礎。該抗體賦予了功能特異性，因為其結合取決于纖維蛋白原或其類似物的存在。這些特性使該抗體被作為MPIO的配體以介導血小板血栓的成像。使用11.7 T MRI和丁2*-加權MRI，在有很強的珠結合的區域檢測到了信號缺損 (signal void)。組織學確認的MPIO與血管壁的結合量與由MPIO在T2*-加權MRI中產生的信號衰減程度顯著相關。這種MRI法對于直徑僅有 200 (im的小血管成像具有足夠的解析度。MPIO-誘導的信號缺損的敏感性足以能檢測到甚至延伸至由動脈血管壁在丁2*-加權MRI中產生的陰性內對比的信號缺損。以前的靶向對比劑方法包括富含整合素交聯釓的全氟碳納米微粒、氧化鐵的肽交聯納米微粒和用釓標記的纖維蛋白特異性環肽。但，能被遞送的對比劑的數量和因此能達到的對比效應的強度相當有限，尤其是對于低豐度的耙標。本申請人已經發現MPIO攜帶了很高有效負荷的對比劑，其不容易被分散，在MRI上很明顯，并建議使用MPIO來用于分子成像。這種方法的通用性能夠對血管受體進行一般的血管內成像，甚至用于不同的受體構象。散在的抗原表位可被MPIO有效地靶向，盡管如本文中所證明的那樣，其大小與配體本身相當，同時很高的鐵有效負荷能根據MPIO-大小檢測甚至單個珠子，并因此能檢測單個受體。而且，本文中所述的噬菌體展示法對散在或功能性抗原表位提供了構建選擇性配體的可能性，因此能夠更深入地了解各種疾病中的病理生理學過程。其他的重要問題是單鏈抗體最低限度的免疫原性，因為它們僅由可變區組成，且其大小能促進其接觸隱秘的抗原表位。要理解的是本文中所述的探針可用于通過檢測血管中的活化血小板而對受試者的血管異常成像的方法中。在上述方法的一種形式中，檢測包括使用如本文中所述的探針。可考慮的是，可使用在標準心導管實驗室中可見的X-線和CT裝置來探測該探針。建議64-層CT或128-層CT適合于本文中所述的成像法。也建議通過使用導管導入上述探針而將該探針用于近紅外光譜成像(熱敏成像)的情況。可檢測的異常情況包括破裂的粥樣硬化斑或易于破裂的粥樣硬化斑、血栓、栓子和活化血小板的積聚。本發明將參照下面的非限制性實施例來進行進一歩地描述。實施例實施例1:產生單鏈抗體scFv M^和融合構建物scFv s，-TAP 過去的文獻已經描述了表達針對GPIIb/IIIa上LIBS抗原表位的單克隆抗體的雜交瘤細胞系的產生及其功能特征(Schwarz等人，JPET 2004; 308: 1002)。簡言之，用RGD肽類純化和洗脫的GPIIb/IIIa用作生產雜交瘤的免疫原。用活化的血小板以及用RGD肽類飽和的固化GPIIb/IIIa篩選克隆。這些克隆之一，單克隆抗體(mAb)克隆145證明與ADP-活化的血小板以及用RGD肽類(GRGDSP， BIOMOL Research Laboratories, Plymouth Meeting, PA)、依替巴月太(eptifibatide) (Integrilin , Essex Pharma， Muenchen， Germany)、替羅非班(tirofiban) (Aggrastat , MSD, Whitehouse Station, NJ)和阿昔單抗(abciximab) (ReoPro , Eli Lilly & Co, Indianapolis, IN)預孵育的血小板的結合增加。雜交瘤培養在 RPMI、 10%胎牛血清、lmM丙酮酸鈉、IOjiM巰基乙醇、100單位/ml 青霉素、100g/ml鏈霉素(均購自Gibco)和1 x HAT添加齊!j(H0262， Sigma)。使用ImmunoPure IgG Protein G purification (Pierce, Rockford, IL, USA)通過親和純化雜交瘤上清液制備IgG K.UBS mAb。對于單鏈抗體克隆，使用mRNA純化柱(oligo-dT)和M-MuLV (均貝勾自Amersham-Pharmacia, Freiburg, Germany)制備雜交瘤的cDNA。使用/y^聚合酶(Strategene, La Jolla, CA, USA)通過聚合酶鏈式反應 (PCR)完成抗體可變區的擴增。使用下面的基于來自重鏈(VH)和輕鏈(VO 可變區的保守序列的引物(Welschof等人，J Immunol Methods 1995; 179: 203): VH正義5-CCG GCC ATG GCG CAG GTG CAG CTG CAG CAG-3'， VH反義5'-CC AGG GGC CAG TGG ATA GAC AAG CTT GGG TGT CGT TTT -3'， VL,正義5'- AA TTT TCA GAA GCA CGC GTAGATATCG/TTGA/CTG/CACCCAAT/ACTCC， VL反義5'-GAA GAT GGA TCC AGC GGC CGC AGC ATC AGC -3'。對VH亍吏用限希U性位點Nco I和Hind III，對于VL使用限制性位點MIu I和Not I將PCR 構建物克隆進pHOG21載體系統中(Kipriyanov等人，J Immunol Methods. 1997; 200: 69, Schwarz等人，FASEB J 2004: 18: 1704)。生成的單鏈抗體命名為scFv抗-ljbs。以前已經克隆了 TAP(Hagemeyer等人， Thromb Haemost. 2004; 92: 47)并被轉移到已經使用限制性位點Not I 和Xbal包含了 scFv抗—應的pHOG21中，從而形成了 scFv K-LIBS-TAP (圖1A)。生成了非靶向的mut-scFv-TAP作為沒有scFv部分的結合功能的對照，其含有單鏈抗體，原來與GPIIb/IIIa結合，但其重鏈CDR3 (互補決定區，complexity determining region)發生突變(RND突變為 AND),因此其結合活性喪失。所有構建物都進行測序(圖IB)。實施例2: seFv構建物在大腸桿菌中的表達和純化大腸桿菌(TGl)細胞用上述的pHOG21質粒轉化，來自劃線瓊脂平板的單個集落在37°C下生長在500mL瓶中的含有100pg/mL氨芐青霉素和100 mM葡萄糖的LB培養基中。培養物在200 rpm下振搖大約 4-6小時直至達到 0.8的OD (600nm)。細菌在4°C下以5000 rpm離心 10 min成團，用含有100|ig/ml氨芐青霉素和0.4 M蔗糖的LB培養基重新懸浮。加入IPTG至0.25 mM的終濃度以誘導scFv產生，并在室溫下(22-24。C)在200 rpm下孵育16-20小時。對于來自全細胞提取物的可溶性蛋白質的純化，通過在4°C下以5000 rpm離心10 min收獲細菌。團狀的細菌重新懸浮在5 mL IX BugBuster (Novagen, Madison, USA) 溶液/g細菌團中，并在室溫下孵育15 min并輕輕震蕩。在4°C下以15 000 rpm另外離心20 min后，將含有可溶性蛋白質的上清液保持在冰上，力卩入1:50稀釋的蛋白酶抑制劑(complete Roche， Basel, Switzerland)。含有可溶性蛋白提取物的上清液與500 Ni2+-Agarose (QIAGEN, Hilden, Germany)混合，并在4°C下孵育1小時，并以150 rpm 持續震蕩。現在結合了 His(6)-tag蛋白的Ni2+-Agarose沉降30 min，然后用緩沖液(50 mM NaH2P04、 300 mM NaCl、 20 mM咪唑、pH 8)沖洗。該沖洗步驟重復兩次。最后，在高濃度咪唑(250 mM)下洗脫scFv融合蛋白，并通過梯度SDS-PAGE分析，在還原條件下進行Western印跡。將蛋白轉禾多至 Immobilon P membrane (Millipore Corporation, Bedford, USA)上用于免疫印跡。在用含有0.2 % Tween20 (PBS-Tween) 和1% BSA的磷酸鹽緩沖鹽水對膜封閉過夜后，加入HRP-標記的抗 -扭3(6)-抗體(110(^6, Mannheim, Germany)(稀釋度1:500)，并在室溫下孵育2小時。該膜用PBS-Tween緩沖液沖洗數次，然后加入SuperSignal 化學發光底物(Pierce, Rockford, USA)在ChemiDoc XRS (BioRad, Regents Park, NSW, Australia)上對過氧化物酶活性進行顯色。使用 6xHis protein ladder (QIAGEN)用作大小標志物和His(6)-tag陽性對照。實施例3: scFv抗-LIBS- TAP的體外功能特性血液制品使用21號蝶式針頭從健康志愿者通過靜脈穿刺采集人血，并用枸櫞酸抗凝。通過在室溫下在塑料管中在離心機(GS-6R centrifuge,Beckmann Coulter, Gladesville, NSW， Australia)中以lOOxg離心10 min 獲得富含血小板的血漿。使用27號針頭從C57BL/6小鼠通過心內穿刺采集小鼠血液，并用未分餾的肝素(20 U/mL)抗凝。50 |J的體積用1 mL改良Tyrode氏緩沖液(150 mM NaCl、 2.5 mM KCl、 1.2 mM NaHC03、 2 mM MgCl2、 2 mM CaCl2、 0.1 %BSA、 0.1 %葡萄糖)重新懸浮，并以1300 xg離心5 min。棄去上清液，沉淀團用1 mL改良Tyrode氏緩沖液重新懸浮。流式細胞術含枸櫞酸的人全血以1/50在改良Tyrode氏緩沖液中稀釋，或加入 20 ADP活化或不活化，然后與10嗎/mL IgGffi—LIBS、 scFv抗-L鵬禾口 scFv ffi-IJBS-TAP預孵育10 min。通過針對scFv的Histidin(6)-tag的二抗 (Penta His Alexa Fluor 488 Conjugat , QIAGEN)檢測ScFv。通過DTAF-交聯的羊抗鼠igG + IgM (H + L) (Jackson Immuno Research, West Grove, PA， USA)檢測IgG抗丄鵬。小鼠血小板通過力卩入0.1 U/mL凝血酶(Enzyme Research Laboratories, South Bend， IN, USA)被活化或不活化，然后與10 pg/mL IgG杭丄舊s、 scFv抗-ubs禾卩scFv杭-libs-TAP孵育10min。如上所述進行熒光檢測。在用CellFIX⑧(BectonDickinson)固定后，在FACSCalibur 流式細胞儀(Becton Dickinson, San Jose, CA， USA)上對標本進行測定。實施例4:抗-因子Xa活性測定通過顯色底物spectrozyme fXa #222 (American Diagnostica Inc., Greenwich, Connecticut, USA)的降解測定僅a的抑制。探針在改良 Tyrode氏緩沖液(150mMNaCl、 2.5mMKCl、 12mMNaHC03、 2 mM MgCl2、 2mMCaCl2、 pH7.4)中透析，并進行調整得到終體積為165 ^ 的100 nM scFv K-LIBS、 scFv ffi-LIBS-TAP和非靶向的mut-scFv-TAP或游離的重組TAP。在加入10 pi 0.1 %人白蛋白后，探針與10 500 pM fXa (Haemochrom, Enzyme Research Laboratories)，昆合，,，與j乍為陽個生X寸照的單獨使用的漢a進行比較。在室溫下孵育10 min后，加入15 顯色底物溶液(5mM)，將各板在室溫下孵育15分鐘。最后，加入50pl終止溶液終止反應，在ELISA讀數儀(Victor3⑧，Perkin Elmer， Melbourne, Australia)上在405腿測量吸收度。實施例5:在小鼠模型中抗凝血功效和防止出血的體外功能評價本研究使用體重為22-38 g的C57BL/6小鼠(Charles River Laboratories, Wilmington, MA, USA)。實驗室動物的管理和使用遵循國家指導原則，并經Freiburg大學和Baker心臟研究所的動物管理和道德委員會(institutional animal care and ethics committee)矛比7佳。使用吹氣禾幾用異氟烷麻醉小鼠幾秒鐘，并腹腔內注射氯胺酮(Ketanes^ 100 mg/kg BW)禾卩甲苯噻嗪(Rompun⑧5 mg/kg BW)，并置于解剖顯微鏡下。在沒有任何反射后，在右頸總動脈區的上部直接做皮膚切口。鈍性剝離筋膜，暴露一段右頸總動脈。然后在動脈上放置納米多普勒流量探頭(nano doppler flow probe) (Model 0.5 VB, Transonic Systems, Ithaca， NY, USA)，通過流量計(model T106， Transonic Systems, Ithaca， NY, USA)測量頸動脈血流量。通過在右頸動脈下使用一片用三氯化鐵(10%溶液) (Sigma, St. Louis, MO， USA)飽和的濾紙(l x 2 mm) (Gel Blot Paper, GB003, Schleicher and Schuell, Keene， NH， USA)， 3分鐘后去除而誘發血栓形成。當流量降低至0.0士0.2mL/min(與系統的精度相對應，由生產廠商規定)時，考慮發生了血栓性閉塞。在三氯化鐵處理前1分鐘，通過尾靜脈向小鼠輸注鹽水(陰性對照) (0.9%氯化鈉)100 (il、以1 mg/kg BW用鹽水稀釋至100 pi體積的的依諾肝素(陽性對照)(Clexane Sanofi Aventis， Paris, France)和各種劑量的純化重組scFv抗-ubs-TAP、scFv抗丄鵬、非靶向的mut-scFv-TAP和rTAP。所使用的scFv和rTAP的所有劑量溶解至100 ^的體積。為了保證所有藥物都輸注至小鼠體內，入口處用iooy鹽水沖洗。小鼠出血時間如前面Xinkang所述進行測定。麻醉的小鼠置于解剖顯微鏡下。離鼠尾尖端大約1-2 mm處(大約1 mm直徑)用一次性手術刀將其切斷。以秒記錄尾部第一次停止出血超過30秒的時間。統計學分析對于指定數目(N)的小鼠，數據表示為均數士標準差。通過方差分析(ANOVA，然后進行Newmann-Keuls-檢驗)進行統計學比較，p < 0.05時認為差異是顯著的。實施例6:使用標記的單鏈抗體用于診斷性影像學如實施例1中所述的單鏈抗體抗-LIBS與超順磁性氧化鐵微粒 (SPIO)混合，它們被官能化能與包括His-tag (Dynabeads TALON ; Dynal Biotech)的蛋白相互作用。也可使用將抗體與順磁性珠偶聯的其他方法(例如，化學偶聯)。通過粘附測定證明對比劑與活化血小板(其是血栓和栓子的主要和基本成分)的結合。在本測定中使用的血小板的活化的監測是通過熒光顯微鏡證明血小板表面上P-選擇素表達的上調以及熒光檢測細胞內Ca2+水平的增加。該測定包括將血小板在37°C 下孵育30分鐘而將活化的血小板固定在覆蓋纖維蛋白原的蓋玻片上。沖洗蓋玻片后，纖維蛋白原-血小板基質與對比劑接觸30分鐘。為了排除非特異性的結合，并證明對比劑僅與血小板結合，使用P-選擇素抗體和熒光素-親和素的二次染色來對血小板進行共染色(圖9)。使用共聚焦顯微鏡，通過同時出現的P-選擇素染色的血小板的綠色熒光來證明顯示紅色自熒光的對比劑與血小板的結合。來自共聚焦顯微鏡使用z-堆棧的3D-重建顯示在圖10中。而且，為了評價體外成像法的合適性，進行磁共振實驗來顯示單鏈抗體與活化血小板在血栓表面上的結合。對于這些實驗，通過向富含人血小板的血漿中加入肌動蛋白、二磷酸腺苷和氯化鈣，并將混合物在37°C下孵育15-30分鐘人工生成人血栓。血栓與不同濃度的對比劑接觸，并在37。C下另外孵育30分鐘。最后，血栓在PBS緩沖液中沖洗兩次，并用4%多聚甲醛固定。固定4小時后，血栓包埋入24孔培養板的孔中，被釓-針刺狀(gadolinium-spiked)2。/。瓊脂糖所包繞。在 3德斯拉的臨床掃描儀上進行核磁共振成像(MRI)，采用標準腕部線圈。運行3D FLASH序歹U， TE/TR為9.3ms/700ms，解析度為130 x 130 x 200 (im，垂直于血凝塊的縱軸對圖像進行一整夜的重建。陰性對比劑與 LIBS耙向抗體以劑量依賴的方式孵育(如由T2*-加權MRI中SPIO所產生)觀察為血栓周圍的黑環(圖11)。而且，使用與抗P-選擇素抗體進行免疫組織化學并用NovaRed在石蠟包埋切片中染色證實珠子的結合圖4顯示了血小板的聚集體(褐色)，珠子(黃色)結合到有血小板的區域。這些結果表明設計的對比劑成功地在體外與活化血小板結合，其可通過MRI以臨床上相關的場強檢測到。實施例7:使用標記的單鏈抗體用于小鼠模型中的診斷成像單鏈抗體生成和交聯至1 Jim氧化鐵微粒GPIIb/IIIa上的LIBS抗原表位是活化血小板的豐富的和高度特異的靶標。mAb抗-LIBS 145僅其活性構象能與GPIIb/IIIa結合，且證明其與ADP-活化的血小板在纖維蛋白原的存在下有很強的結合 (Schwarz JPET 2004)。表達mAb抗-LIBS 145的雜交瘤細胞用作克隆抗-LIBS單鏈抗體(scFv)的基礎。制備該雜交瘤細胞系的mRNA并使用寡聚-dT引物進行逆轉錄。通過PCR使用復性為保守區的引物在可變區的5'和3'端擴增抗體重鏈和輕鏈的可變區。將PCR產物克隆進 pHOG21載體中。在轉化TG1大腸桿菌后，在流式細胞儀中使用活化血小板評價單個克隆的LIBS與GPIIb/IIIa的典型結合。最后在500 mL 瓶中在37°C下在含有100 (ig/mL氨芐青霉素和100 mM葡萄糖的LB 培養基中產生最佳結合的SCFVUBS。培養物以200 rpm振搖大約4-6 小時直至達到 0.8的OD (600nm)。細菌在4°C下以5000 rpm離心10 min成團，用含有lOOpg/ml氨芐青霉素和0.4 M蔗糖的LB培養基重新懸浮。加入IPTG至0.25 mM的終濃度以誘導scFv產生，并在室溫下(22-24。C)在200 rpm下孵育16-20小時。通過在4°C下以5000 rpm 離心10 min收獲細菌，團狀的細菌重新懸浮在5 mL IX BugBuster (Novagen)溶液/g細菌團中，并在室溫下孵育15 min并輕輕震蕩。在4°C 下以15 000 rpm另外離心20 min后，將含有可溶性蛋白質的上清液保持在冰上，加入1:50稀釋的蛋白酶抑制劑(complete②Roche)。上清液與500 jiL Ni2+-Agarose (Qiagen)混合，并在4°C下孵育1小時，并以150 rpm持續震蕩。現在結合了 His(6)-tag蛋白的N產-Agarose沉降30 min，然后用緩沖液(50 mM NaH2P04、 300 mM NaCl、 20 mM咪唑、pH 8) 沖洗。該沖洗步驟重復兩次。最后，在高濃度咪唑(250mM)下洗脫scFv 融合蛋白并透析。在流式細胞儀中評價scFv制劑的功能性。自熒光鈷-官能化的MPIO (1 pm)與LIBS單鏈抗體的組氨酸-標記根據生產廠商(Dynal Biotech, Oslo, Norway)的方法進行交聯。簡言之，沖洗后，1 mg珠與LIBS抗體在室溫下(RT)孵育10min以結合大約IO嗎組氨酸-標記抗體。然后包含懸液的試管置于磁鐵上直至珠子移動至試管一側，并棄去上清液。使用含有50mMNaP(pH8)、 300mMNaCl和 0.01 %Tween-20的結合和沖洗緩沖液重復沖洗四次。LIBS-MPIO與活化血小板的結合進行粘附試驗來證明LIBS-MIPO與活化血小板的結合。來自未使用藥物的健康志愿者的血液用枸櫞酸抗凝并以1000rpm離心10min。得到的富含血小板的血漿用PBS(1:10)稀釋，并將100 ^加入至覆蓋纖維蛋白原的蓋玻片上，該蓋玻片已用20pg/ml纖維蛋白原在38°C預孵育1小時并用1 % BSA在室溫下封閉1小時。在38°C孵育30 min 后，蓋玻片用PBS沖洗，并在連續旋轉條件下或與0.5嗎LIBS-MPIO (LIBS-MPIO)或與等量的交聯的無關單鏈抗體對照(對照-MPIO)在 38。C下另外孵育30 min。然后用PBS沖洗蓋玻片兩次，并用10%羊血清(Vector, Burlingame, CA/USA)在室溫下封閉1小時。為了證明對比劑的特異性結合，使用單克隆鼠抗人CD62抗體(1:100, R&D Systems, Abingdon, LJK)，以生物素化的羊抗鼠IgG(Vector， Burlingame, CA/USA) 作為二抗對血小板進行P-選擇素共染色。最后，加入1:200稀釋的熒光素親和素D (Vector, Burlingame, CA/USA)，在室溫下孵育1小時。使用CellFix (BD Biosciences, Heidelberg, Germany)固定蓋玻片并通過共聚焦顯微鏡進行評價。小鼠在平均年齡為10±0.8周的雄性C57BL/6小鼠(Jackson Laboratories, UK)進行金屬絲損傷。小鼠隨意飲水和進食標準飼料。所有操作步驟均遵循1986年的英國(科學實驗)動物法(UK Home Office Animals (Scientific Procedures) Act 1986》股骨金屬絲損傷、珠子灌注和標本制備如以前的記載(Roque, M.等人，Mouse model of femoral artery denudation injury associated with the rapid accumulation of adhesion molecules on the luminal surface and recruitment of neutrophils. Arterioscler Thromb Vase Biol， 2000. 20(2): p.335-42)，使用芬太尼 (Hypnorm) (25 mg/kg, Bayer, Germany)禾口環巴比妥(Hypnova1)(25 mg/kg, Bayer， Germany)的組合皮下給藥施以全身麻醉，進行單側股骨金屬絲損傷。在手術顯微鏡下做腹股溝切口。暴露股動脈，使用30G注射套管(BD, Erembodegem, Belgium)從遠端至上腹部分支做動脈切開。插入一根0.010"導絲(Boston Scientific, Natick, USA)，推進至主動脈杈處并將其拉回。去除金屬絲后，結扎動脈切開部位，使用縫合絲線閉合皮膚。24小時后，小鼠通過吸入異氟烷進行終末麻醉。采用胸廓切開術開胸，暴露心臟，并切開右心房。經左心室尖插入30G針頭并用10ml PBS對動物進行灌注以排除血液。用5 mL含有LIBS-MPIO或對照 -MPIO(每種含1.5x10s珠子/ml)的PBS繼續灌注。30分鐘后，在生理學壓力下用10 mL PBS然后用5 ml含有2mM加多利道(gadotehdiol) (Prohance, Bracco, UK)的4%多聚甲醛(PFA)再次對小鼠進行灌注。去掉皮膚，切除有損傷區域的腿，置于4% PFA/2mM加多利道中24小時，然后包埋在含有2%高級別低熔點的瓊脂糖(Cambrex， Rockland， ME/USA)的玻璃MR試管中。離體(Ex vivo)MRI"(吏用 13 mm H 鳥籠身寸步員線圈(birdcage radiofrequency coil) (RAPID Biomedical, Wiirzburg, Germany)以11.7T進行離體MRI 。在自動過夜操作中使用3D梯度回波序列(TE = 4 ms / TR= 90 ms，視野13 x 13xl9.5mm，矩陣大小256 x 256 x 384，兩次平均，每個序列的顯像時間 7 h)。脫機進行數據重建，最終的各向同性解析度為25 pm3。股動脈損傷中MPIO結合的組織學和定量在MRI后，標本在10%甲酸中脫鈣過夜，通過梯度乙醇溶液和 Neo-clear (VMR, UK)脫水，石蠟包埋和連續切片(8 厚)。根據生產廠商的方法對標本進行鐵染色(Accustain, Sigma, Germany)。對與損傷血管壁結合的交聯MPIO的數量進行定量，并使用光學顯微鏡對來自每只動物損傷血管部位的20-25張切片進行平均。為了用免疫組織化學顯示血小板，將去石蠟和再水化的切片在1%H202中飽和20min，加入至慢沸的檸檬酸鹽緩沖液中，并在高壓鍋內煮沸4 min進行抗原修復。標本在PBS Tween沖洗，與蛋白質封閉溶液(DakoCytomation, Hamburg, Germany)孵育4小時，并在4°C下與大鼠抗小鼠CD61抗體(1:8000, InterCell Technologies, FI/USA)孵育過夜。用PBS沖洗后，加入生物素化羊抗倉鼠IgG (1:200， Vector, Burlingame, CA/USA)二抗。載玻片用PBS沖洗，并使用VectastainRTU Elite ABC-試劑和Vector NovaRed (均來自Vector, Burlingame, CA/USA)進行過氧化物酶反應。最后，切片脫水，用Permount (Biomeda, Foster City, CA/USA)封片，在光學顯微鏡上評價珠子與血小板的結合。通過離體MRI檢測股動脈中的MPIO結合設盲進行MPIO結合的定量。抗體-交聯的MPIO結合定義為在22 個連續的層中股動脈的腔面上清晰的環狀信號缺損。在多塊切片.卜rh 現的MPIO僅計數一次。使用ImagePro Plus的3D構建器插件對分段圖像進行三維重建以顯示在股動脈上MPIO結合的分布情況。統計學方法數據表示為均數i標準差。使用f-檢驗比較參數數據。統計學顯著性指定為P0.05。結果LIBS-MPIO能檢測血小板上活化的糖蛋白Ilb/IIIa受體在圖13中，用抗P-選擇素受體標記的人血小板血栓的熒光呈現亮綠色。在血小板血栓上重疊的是紅色區域，對應于LIBS-MPIO (A屏) 的自熒光。MPIO被限制在血小板血栓中，沒有非特異性的背景滯留。相反，在B屏中，對照-MPIO與無關單鏈抗體完全沒有交聯結合。在共聚焦顯微鏡中的3D z-堆棧重建顯示了 LIBS-MPIO與P-選擇素染色的血小板(綠色)的結合(紅色)，著重顯示了其相對大小和空間關系。通過離體MRI檢測到的LIBS-MPIO與粘附于血管壁的血小板的結合在13只小鼠中進行單側股動脈金屬絲損傷試驗，沒有發生并發癥。 7只小鼠經左心室灌注以LIBS-MPIO， 6只灌注對照-MPIO。因為在 MPIO定量過程中兩名觀察者對一只對照動物的觀察結果有顯著的差異，因此將該動物從定量分析中排除。損傷動脈段的離體丁2*-加權MRI也證明在動脈壁內有固有的低信號區(圖14B)。與此不同的是在血管腔內但靠近血管壁處出現了環狀的信號缺損。在用LIBS-MPIO注射的所有小鼠的金屬絲損傷動脈中都觀察到了這種特征(圖14A)。在定量分析中，在LIBS-MPIO注射的動物中，表明有MPIO積累的低信號的管腔面積明顯高亍對照-MPIO灌注的動物(23.72比6.2; P<0.01，圖14C)。在組織學中證實MPIO的結合(圖15)，在LIBS-MPIO注射的動物中MPIO-結合明顯較高(每張切片9.98比0.5個珠子，PO.01;圖15D)。通過免疫組織化學證實了 MPIO和血小板與動脈壁的粘附是共存的。在圖15C中，證明了 MPIO的存在與血小板標志物CD61的免疫染色陽性是有關聯的。組織學中對珠子定量的分析與離體MRI定量的比較表明兩者有很強相關性(112=0.7219， PO.001;圖17)。因此，通過MRI測定的MPIO 信號強度直接反映了與損傷血管壁結合的MPIO的數量。最后，要理解的是在不背離如本文所概括的本發明的精神的前提下，可做出各種其他的修改和/或變化。
權利要求
1.一種抗凝劑，其包括能抑制凝血的第一種組分和能靶向活化血小板的第二種組分，其中在對受試者給予所述抗凝劑時，第二種組分將第一種組分引向活化的血小板。
2. 根據權利要求1所述的抗凝劑，其中所述的第二種組分能與活化血小板表面上的標志物結合。
3. 根據權利要求2所述的抗凝劑，其中所述的標志物僅在或主要在活化血小板的表面上表達。
4. 根據權利要求2或3所述的抗凝劑，其中所述的標志物是配體誘導結合位點(LIBS)。
5. 根據權利要求2至4任意一項所述的抗凝劑，其中所述的標志物是GPIIb/IIIa。
6. 根據權利要求2至5任意一項所述的抗凝劑，其中所述的標志物是GPIIb/IIIa的活化形式。
7. 根據權利要求2至6任意一項所述的抗凝劑，其中在每個血小板的表面上發現有大約60000至80000的標志物分子。
8. 根據權利要求1至7任意一項所述的抗凝劑，其中所述的第二種組分能與GP Hb/IIIa受體活化過程中形成的新抗原表位結合。
9. 根據權利要求1至8任意一項所述的抗凝劑，其中當給予受試者時基本上不增加出血時間，或引起受試者的出血并發癥。
10. 根據權利要求9所述的抗凝劑，其中出血時間通過手術切斷小鼠尾部來確定。
11. 根據權利要求1至10任意一項所述的抗凝劑，其中當給予受試者時延長了受試者的閉塞時間。
12. 根據權利要求11所述的抗凝劑，其中使用小鼠血栓模型來確定閉塞時間。
13. 根據權利要求11或12所述的抗凝劑，其中當給予受試者時，與陰性對照的給藥相比閉塞時間為至少大約兩倍。
14. 根據權利要求11至13任意一項所述的抗凝劑，其中閉塞時間的延長類似于或超過依諾肝素的效果。
15. 根據權利要求1至14任意一項所述的抗凝劑，其中所述的第一種組分具有很低的分子量，這樣第一種組分能夠有效地集中在活化血小板的部位處。
16. 根據權利要求15所述的抗凝劑，其中所述的第一種組分的分子量為大約7,000道爾頓或更小。
17. 根據權利要求1至16任意一項所述的抗凝劑，其中所述的第一種組分是肽抗凝劑。
18. 根據權利要求17所述的抗凝劑，其中所述的肽抗凝劑由大約 60個或更少的氨基酸殘基組成。
19. 根據權利要求17或18所述的抗凝劑，其中所述的肽抗凝劑來源于蜱。
20. 根據權利要求19所述的抗凝劑，其中所述的蜱是毛白鈍緣蜱。
21. 根據權利要求1至20任意一項所述的抗凝劑，其中所述的第一種組分作用于酶Xa因子。
22. 根據權利要求21所述的抗凝劑，其中所述的第一種組分在缺少輔因子時直接抑制Xa因子。
23. 根據權利要求1至22任意一項所述的抗凝劑，其中所述的第一種和第二種組分物理性地連接成為單分子的形式。
24. 根據權利要求23所述的抗凝劑，其中所述的單分子是蛋白質分子。
25. 根據權利要求至24任意一項所述的抗凝劑，其中所述的第一種和第二種組分在單鏈抗體分子的框架結構中。
26. 根據權利要求25所述的抗凝劑，其中所述的單鏈抗體基本上如本文中的圖1所示，或其衍生物或等價物。
27. —種藥學組合物，其包括根據權利要求1至26任意一項所述的抗凝劑和藥學可接受的鹽。
28. -—種治療或預防凝血障礙的方法，其包括給予需要所述方法的哺乳動物以有效量的根據權利要求27所述的組合物的步驟。
29. 根據權利要求24所述的方法，其中所述的組合物經靜脈內途徑或動脈內推注或輸注給藥。
30. 根據權利要求28或29所述的方法，其中當抗凝劑是蛋白質時，給藥劑量為大約30 mg/kg至大約300 mg/kg。
31. 根據權利要求28至30任意一項所述的方法，其中所述的凝血障礙選自冠狀動脈疾病、急性冠狀動脈綜合征包括心肌梗塞、中風、頸動脈或主動脈的動脈粥樣硬化、深部靜脈血栓形成、肺栓塞、和器官的動脈粥樣硬化或血栓形成。
32. 根據權利要求1至26任意一項所述的抗凝劑在制備用于預防或治療凝血障礙的藥物中的應用。
33. 根據權利要求32所述的應用，其中所述的凝血障礙選自冠狀動脈疾病、冠狀動脈梗塞、急性冠狀動脈綜合征包括心肌梗塞、中風、頸動脈或主動脈的動脈粥樣硬化、深部靜脈血栓形成、肺栓塞、和器官的動脈粥樣硬化或血栓形成。
34. —種用于檢測血管異常的探針，其包括(a)能靶向活化血小板的結合組分和(b)標記物。
35. 根據權利要求34所述的探針，其中所述的結合組分能與活化血小板表面上的標志物結合。
36. 根據權利要求35所述的探針，其中所述的標志物僅在或主要在活化血小板的表面上表達。
37. 根據權利要求35至36任意一項所述的探針，其中在每個血小板的表面上發現有大約60000至80000的所述標志物分子。
38. 根據權利要求34至37任意一項所述的探針，其中所述的結合組分針對的是血小板上的配體誘導結合位點(LIBS)。
39. 根據權利要求35或36所述的探針，其中所述的標志物是 GP謹IIa。
40. 根據權利要求37至40任意一項所述的探針，其中所述的標志物是GPIIb/IIIa的活化形式。
41. 根據權利要求34至40任意一項所述的探針，其中所述的結合組分能與GPIIb/IIIa受體活化過程中形成的新抗原表位結合。
42. 根據權利要求34至41任意一項所述的探針，其中所述的結合組分和標記物在單鏈抗體分子的框架結構中。
43. 根據權利要求34至42任意一項所述的探針，其中所述的標記物是順磁性的、放射性的，或用X-線成像法可檢測到的。
44. 根據權利要求43或44所述的探針，其中所述的標記物包括锝 -99m 、銣-82、鉈201、 F-18、鎵-67或銦-111。
45. 根據權利要求34至44任意一項所述的探針，其中所述的標記物包括超順磁性氧化鐵或gandolinium。
46. 根據權利要求34至45任意一項所述的探針，其中所述的標記物包括微米尺寸的順磁性氧化鐵。
47. 根據權利要求34至46任意一項所述的探針，其中所述的探針能滲透至異常血管的表面之外和/或附著在血管的表面上。
48. —種在受試者內對血管異常成像的方法，其包括檢測受試者血管中的活化血小板。
49. 根據權利要求47所述的方法，其包括將根據權利要求34至 47任意一項所述的探針與受試者的血管接觸的步驟。
50. 根據權利要求48或49所述的方法，其中所述的異常選自破裂的粥樣硬化斑或易于破裂的粥樣硬化斑、血栓、栓子和活化血小板的積聚。
全文摘要
本發明提供了一種抗凝劑，其包括能抑制凝血的第一種組分和靶向活化血小板的第二種組分，其中在對受試者給予該藥劑時，第二種組分將第一種組分引向活化的血小板。本發明還提供了用于檢測血管異常的探針，其包括(a)能靶向活化的血小板的結合組分和(b)標記物。本申請人已證明上述針對活化血小板的藥劑和探針能用于診斷和治療凝血障礙。
文檔編號A61K39/395GK101237879SQ200680024609
公開日2008年8月6日申請日期2006年7月5日優先權日2005年7月5日
發明者K·彼得申請人:貝克醫藥研究所

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