專利名稱：：流感病毒及水包油乳液佐劑誘導cd-4t細胞和/或改善的b-記憶細胞應答的用途的制作方法
技術領域：
：本發明涉及流感疫苗制劑和用于免疫對抗流感疾病的接種方案。具體地說，本發明涉及含水包油乳液佐劑和任選的3D-MPL的疫苗制劑、其在藥物中的用途，尤其是其在增大對流感抗原的免疫應答方面的用途，并涉及制備方法，其中所述水包油乳液包含甾醇、可代謝油和乳化劑。
背景技術：
：流感病毒是世界上最普遍存在的病毒之一，既可感染人類，也可感染家畜。流感產生重大的經濟負擔、發病率乃至死亡率。流感病毒是RNA包膜病毒，顆粒的直徑大小約為125nm。流感病毒的基本組成為內部為與核蛋白結合的核糖核酸(RNA)核衣殼或核心，外部包繞著脂質雙層結構和外層糖蛋白的病毒被膜。病毒被膜內層主要由基質蛋白組成，而外層主要是宿主來源的脂類物質。流感病毒包含兩種表面抗原糖蛋白神經氨酸酶(NA)和血細胞凝集素(HA)，它們以10-12nm長的剌突顯露在顆粒表面上。就是這些表面蛋白、尤其是血細胞凝集素，決定了流感亞型的抗原特異性。這些表面抗原漸進地、有時快速地經歷某些導致流感病毒抗原性變異的改變。這些抗原性改變稱為'漂移，和'轉換，，是不可預見的，由免疫學觀點看可能具有顯著的影響，因為它們最終導致出現新流感抹，能使病毒逃逸免疫系統，幾乎每年都引起眾所周知的流行病。每個季節加入到流感疫苗中的流感病毒^朱由WHO協同國家衛生管理局以及疫苗生產商共同確定。HA是確定不同流感抹的血清學特異性的最重要的抗原。此75-80kD的蛋白包含眾多的抗原決定簇，其中幾個位于在不同毒抹中經歷序列改變的區域中(毒抹特異性決定簇)，其余的位于許多HA分子共有的區域中(共同決定簇)。流感病毒幾乎每年冬天都引起大流行，曱(A)型或乙(B)型病毒的感染率在6周的時間段內高達40%。流感感染產生各種病癥，由亞臨床感染至輕微的上呼吸道感染到嚴重的病毒性肺炎。典型的流感大流行引起肺炎和下呼吸道疾病的發病率增加，證據是住院率或死亡率增加。疾病的嚴重性主要由宿主的年齡、其免疫狀況和感染部位決定。65歲和以上的老年人尤其易受攻擊，占發達國家所有流感相關死亡的80-90%。患有基礎性慢性疾病的個體也非常有可能經歷這種并發癥。幼兒也可能患嚴重疾病。因此，這些群體尤其需要受保護。除了這些'風險，群體以外，衛生當局還推薦對與老年人接觸的健康成人接種。接種對控制每年的流感大流行起關鍵作用。目前可用的流感疫苗是失活流感疫苗或減毒活流感疫苗。失活流感疫苗由3種可能形式的抗原制備物組成失活全病毒、其中純化的病毒顆粒被去污劑或其它試劑破壞以溶解脂質包膜的亞病毒體(所謂的"裂解疫苗，，)或純化的HA或NA(亞單位疫苗)。這些失活疫苗肌內(i.m.)或鼻內(i.n.)給予。所有種類的流感疫苗通常都是三價疫苗。一般來說，它們含有的抗原得自兩種曱型流感病毒林和一種乙型流感病毒抹。據單輻射免疫擴散(SRD)(J.M.Wood等Animprovedsingleradialimmunodiffusiontechniquefortheassayofinfluenzahaemaggiutininantigen:adaptationforpotencydeterminationofinactivatedwholevirusandsubimitvaccines.J.Biol.Stand.5(1977)237-247;J.M.Wood等，InternationalcollaborativestudyofsingleradialdiffusionandImmunoelectrophoresistechniquesfortheassayofhaemaggiutininantigenofinfluenzavirus.J.Biol.Stand.9(1981)317誦330)的檢測，在大多數情況下，標準0.5ml注射劑量含有每種毒株的15iug血細胞凝集素抗原組分。—目前可用的流感疫苗被認為在所有年齡組都是安全的(DeDonato等，1999,Vaccine,17,3094-3101)。但是，很少有證據表明當前的流感疫苗在2歲以下的兒童中有作用。而且，預防典型的已確認流感疾病的疫苗效力的報告比率對老年人為23-72%,這顯著低于對較年輕成年人所報告的60-90。/。的有效率(Govaert,1994，J.Am.Med.Assoc,21,166-1665;Gross,1995,AnnIntern.Med.123,523-527)。業已表明，流感疫苗的有效性與針對病毒林的血凝反應抑制(HI)抗體的血清滴度相關，幾個研究已發現較年長的成年人在流感免疫后表現出的HI滴度^氐于專交年輕成年人(Murasko，2002,Experimentalgerontology,37，427-439)。因此，仍需要具有改良的免疫原性的新疫苗。疫苗抗原和有效佐劑的制劑是一種有可能增強對亞病毒體抗原的免疫應答的方法。用水包油乳液形式的佐劑MF59佐劑化的亞單位流感疫苗已商品化，已表現出其誘導高于無佐劑亞單位疫苗所獲抗體滴度的抗體滴度的能力(DeDonato等，1999,Vaccine,17，3094-3101)。但是，在后來的出版物中，相同疫苗沒有表現出其相比無佐劑裂解疫苗改善的模式(Puig-Barbera等，2004,Vaccine23,283-289)。仍需要改良的流感疫苗，尤其是對于老年人群。發明陳述在本發明的笫一個方面，提供(a)流感病毒或其抗原性制備物和(b)水包油乳液佐劑在生產免疫原性組合物中的用途，所述免疫原性組合物用于在人中誘導抗所述病毒或抗原性組合物的以下至少一種i)改善的CD4T-細胞免疫應答，ii)改善的B-記憶細胞應答，其中所述水包油乳液包含可代謝油、甾醇和乳化劑。適宜地，所述甾醇是a-生育酚。在一個具體實施方案中，所述水包油乳液佐劑包含至少一種可代謝油，其量為總體積的0.5%-20%,并具有油滴，油滴的至少70%(以強度計)具有低于1|jm的直徑。在一個具體實施方案中，相比于用無佐劑抗原或抗原性組合物獲得的應答，所述免疫原性組合物能夠誘導改善的CD4T-細胞免疫應答和改善的B-記憶細胞應答。在本發明的第二個方面，提供(a)流感病毒或其抗原性制備物和(b)水包油乳液佐劑在生產免疫原性組合物中的用途，所述免疫原性組合物用于接種人免疫應答受損個體或群體，例如高風險成人或老年人，以對抗流感，其中所述水包油乳液包含可代謝油、甾醇和乳化劑。在一個優選實施方案中，所述水包油乳液佐劑包含至少一種可代謝油，其量為總體積的0.5%-20%,并具有油滴，油滴的至少70%(以強度計)具有低于1pm的直徑。在本發明的笫三個方面，提供流感病毒或其抗原性制備物在生產免疫原性組合物中的用途，所述免疫原性組合物用于再接種先前用流感病毒或其抗原性制備物接種的人，所述流感病毒或其抗原性制備物用水包油乳液佐劑配制，所述水包油乳液佐劑包含可代謝油、甾醇(適宜地為a-生育酚)和乳化劑。優選地，再接種在已于前一季接種對抗流感的受試者中進行。通常，再接種在第一次接種后至少6個月進行，優選8-14個月后進行，更優選在約10-12個月后進行。優選地，提供(a)流感病毒或其抗原性制備物和(b)水包油乳液佐劑在生產免疫原性組合物中的用途，所述水包油乳液佐劑包含可代謝油、甾醇(例如a-生育酚)和乳化劑，所述免疫原性組合物用于再接種先前用流感病毒或其抗原性制備物和水包油乳液佐劑接種的人，其中所述水包油乳液佐劑包含至少一種可代謝油，其量為總體積的0.5%-20%，并具有油滴，油滴的至少70%(以強度計)具有低于1jum2。在另一個優選實施方案中，用于再接種的免疫原性組合物包含'充感病毒或其裂解病毒抗原性制備物，它們與用于第一次接種'吝病毒或其病毒抗原性制備物共有共同的CD4T-細胞表位或共3細胞表位或兩者。.玍本發明的第四個方面，提供(a)第一流感林的流感病毒或其抗K包油乳液包含可代謝油、甾醇和乳化劑，所述免疫原性組合亍對抗流感抹引起的流感感染的保護作用，所述流感抹是所述乾感抹的變體。在一個優選實施方案中，所述水包油乳液佐劑i少一種可代謝油，其量為總體積的0.5%-20%，并具有油滴，力至少70%(以強度計)具有低于1拜的直徑。^另一方面，提供一種用免疫原性組合物接種免疫應答受損人;;或群體(例如高風險成人或老年人)的方法，所述免疫原性組合^流感病毒或其抗原性制備物和如上文定義的水包油乳液佐主再另一個實施方案中，本發明提供一種再接種先前用流感病;病毒抗原性制備物和水包油乳液佐劑接種的人的方法，其中'c包油乳液佐劑包含可代謝油、甾醇和乳化劑，所述方法包括'「述人含有佐劑或無佐劑流感病毒的免疫原性組合物。適宜地，)醇是a-生育酚。三再一個實施方案中，提供一種方法接種人群或個體對抗一:,病毒抹，接著再接種所述人或群體對抗變體流感病毒株，所V包括給予所述人(i)第一種組合物，其包含第一流感病毒抹的;毒或其抗原性制備物和水包油乳液佐劑，所述水包油乳液佐，可代謝油、甾醇和乳化劑，和(ii)笫二種免疫原性組合物，其亍述笫一個流感病毒4朱的流感病毒4朱變體。適宜地，所述甾醇:育酚。在另一個實施方案中，本發明提供流感病毒或其抗原性制備物和水包油乳液佐劑的用途，所述水包油乳液佐劑包含可代謝油、甾醇和乳化劑。適宜地，所述甾醇是Ot-生育酚。在再另一方面，本發明提供一種設計流感疫苗的方法，包括1)選"l奪含CD4+表位的流感抗原，和2)組合所述流感抗原和如上定義的水包油乳液，其中所述疫苗在哺乳動物中給予時能夠在所述哺乳動物中誘導增強的CD4應答。本發明的其它方面和優勢在以下優選實施方案的詳述中進一步描述。圖1:依據PCS檢測的SB62水包油乳液的油滴粒度分布。圖1A顯示了用MalvernZetasizer3000HS^企測的SB62批號1023的粒度測量結果A-稀釋度1/10000(Rec22至Rec24)(用Contin和適合的光學模型1.5/0.01分析)；B=稀釋度1/20000(Rec28至Rec30)(用Contin和適合的光學模型1.5/0.01分析)。圖1B顯示了依據強度的記錄22(上部)和記錄23(下部)的示意圖。圖2:MPL原液制備的示意圖。圖3:AS03+MPL佐劑制備的示意圖。圖4:ExploFlu-001臨床實驗。針對裂解流感抗原的CD4T細胞應答(Ql-第一四分位數，Q3-笫三四分位數)。圖5:ExploFlu-001臨床實驗。針對裂解流感抗原的CD8T細胞應答(Q1=第一四分位數，Q3=笫三四分位數)。圖6:ExploFlu-001臨床實驗。在用Fluarix+AS03接種后針對裂解流感病毒抗原的交叉反應性CD4T-細胞應答。圖7:ExploFlu-001臨床實驗。接種后的B細胞記憶應答。圖8:ExploFlu-002臨床實驗。再接種后抗裂解流感抗原的CD4T細胞應答。圖9:ExploFlu-002臨床實驗。再接種后的抗HI滴度。圖10:雪貂研究I。溫M測(初免和攻擊)。圖10A是初免，圖10B是攻擊。圖11:雪貂研究I。病毒脫落。圖12:雪貂研究II。溫度監測(初免和攻擊)。圖12A是初免，圖12B是攻擊。圖13:雪貂研究II。病毒脫落。圖14:雪貂研究II。對H3N2A/巴拿馬(疫苗抹)(圖14A)和H3N2A/懷俄明(攻擊抹)(圖14B)的HI滴度。圖15:小鼠研究。使用全失活病毒作為再刺激抗原(免疫后7天)的情況下C57BI/6初免小鼠中CD4T細胞的頻率。圖16:小鼠研究。使用全失活病毒作為再刺激抗原(免疫后7天)的情況下C57BI/6初免小鼠中CD8T細胞的頻率。圖17:小鼠研究。使用全失活病毒作為再刺激抗原(免疫后7天)的情況下用異源毒抹初免的C57BI/6小鼠中CD4T細胞(上部)和CD8T細胞(下部)的頻率。圖18:人臨床實驗。老年人接種Fluarix、Fluarix+AS03、Fluarix+AS03+MPL后的B細胞記憶應答(接種前和接種后之間的差異)。圖19:雪貂研究m。攻擊前和攻擊后的溫度監測。圖20:雪貂研究III。攻擊前和攻擊后的病毒脫落。圖21:雪貂研究III。針對H3N2A/懷俄明(疫苗抹)的HI滴度。圖22:雪貂研究III。針對H3N2A/巴拿馬(攻擊抹)的HI滴度。圖23:人臨床實驗。在接種后21天、90天和180天時的HI滴度(GMT)(持續性)。圖24:人臨床實驗。CD4應答一alldouble(產生至少兩種細胞因子的細胞)檢驗一在接種后21天、90天和180天時的混合抗原(持續性)。圖25:人臨床實驗。與Fluarix相比在使用AS03+MPL的再接種臨床實驗中的HI滴度。圖26:人臨床實驗。CD4應答的CMI—alldouble檢驗-在接種后0和21天時的混合抗原。圖27:采用兩個濃度的AS03+MPL的人臨床實驗。在0和21天的HI滴度。圖28:采用兩個濃度的AS03+MPL的人臨床實驗。反應原性。發明詳述本發明人已經發現，相比于用無佐劑病毒或其抗原性制備物獲得的應答，含流感病毒及其抗原性制備物連同水包油乳液佐劑的流感制劑能夠在人中改善抗所述抗原或抗原性組合物的CD4T-細胞免疫應答和/或B細胞記憶應答，所述水包油乳液佐劑含可代謝油、甾醇如ot-生育酚和乳化劑。要求保護的制劑有利地用于誘導抗流感的CD4-T細胞應答，該應答能夠檢測由MHCII類分子提呈的流感表位。本申請人現在已發現，該制劑有效靶向細胞介導的免疫系統，以便增加對同源和漂移的流感抹的反應性(在接種和感染時)。本發明的有佐劑流感組合物具有幾個優勢1)改善的免疫原性它們允許將老年人(50歲以上，通常65歲以上)中的弱免疫應答恢復至在年輕人中可見的水平(抗體和/或T細胞應答)；2)改善的交叉保護模式增加抗變異(漂移)流感抹的交叉保護作用；3)它們還允許使用減少的抗原劑量獲得相似的應答，因此確保了緊急情況下(例如大流行)增加的效力。具體地說，根據滿足流感相關性保護作用的人受試者數目的評價，本發明的組合物已能夠在再免疫后提供更好的抗流感血清保護作用。而且，本發明使用的組合物還能夠誘導以下趨勢相比于無佐劑組合物，第一次接種人受試者后的B細胞記憶應答較高，以及再接種后的體液應答較高。本發明人還已經能夠表明，相比于用無佐劑組合物獲得保護性抗體水平的個體，要求保護的有佐劑組合物能夠在更多的個體中誘導而且保持對抗疫苗中存在的全部3種毒林的保護性抗體水平(例如參見表43)。因此，在再另一個實施方案中，要求保護的組合物能夠確保抗流感相關疾病的持續性免疫應答。具體地說，所述持續性指HI抗體免疫應答能夠在接種至少3個月后、優選至少6個月后滿足管理標準。具體地說，要求保護的組合物能夠在至少3個月后在>70%的個體中、適宜地在>80%的個體中或適宜地在〉90%的個體中，誘導針對疫苗中存在的至少一種流感林、優選所有毒抹的保護性抗體水平。在一個具體方面，在接種后至少6個月獲得抗疫苗組合物中存在的至少一種、適宜地兩種或全部毒^M々>90%的保護性抗體水平。流感病毒林和抗原按照本發明使用的流感病毒或其抗原性制備物可為裂解流感病毒或其裂解病毒抗原性制備物。在一個替代實施方案中，流感病毒制備物可包含另一類型的失活流感抗原，例如失活全病毒或純化的HA和NA(亞單位疫苗)，或流感病毒顆粒。在再另一個實施方案中，流感病毒可為減毒活流感病毒制備物。適宜地，按照本發明使用的裂解流感病毒或其裂解病毒抗原性制備物為失活病毒制備物，其中病毒顆粒用溶解脂質包膜的去污劑或其它試劑石皮壞。適宜地，裂解病毒或其裂解病毒抗原性制備物如流感病毒，隨后去除全部或大部分溶解劑和某些或大部分病毒脂質物質。所述其裂解病毒抗原性制備物指相對于裂解病毒可能已經受了一定程度的純化而保留了裂解病毒組分的大部分抗原特性的裂解病毒制備物。例如，當在卵中生產時，裂解病毒可由卵雜蛋白中去除，或者在細胞培養物中生產時，裂解病毒可由宿主細胞雜質中去除。裂解病毒抗原性制備物可包含一種以上病毒抹的裂解病毒抗原性組分。含裂解病毒的疫苗(稱為'裂解流感疫苗，)或含裂解病毒抗原性制備物的疫苗一般包含殘余的基質蛋白和核蛋白，有時包含脂質以及膜包膜蛋白。這種裂解病毒疫苗通常包含大部分或全部病毒結構蛋白，但不一定和它們在全病毒中存在的比例相同。或者，流感病毒可為全病毒疫苗形式。對于大流行情況來"i兌，其可表現出超越裂解病毒疫苗的優勢，因為其避免了有關針對新流感病毒抹是否可成功地產生裂解病毒疫苗的不確定性。對于某些毒林來說，用于生產裂解病毒的常規去污劑可損傷病毒，并使其無用。盡管經常有可能使用不同的去污劑和/或開發不同的裂解疫苗生產方法，但這會耗時，在大流行情況下可能不可用。全病毒法除了4交大程度的確定性以外，還有比裂解病毒大的疫苗生產能力，因為在制備適宜裂解疫苗必需的額外純化步驟中有相當大量的抗原損失。在另一個實施方案中，流感病毒制備物為純化的亞單位流感疫苗形式。亞單位流感疫苗一般包含兩種主要的包膜蛋白HA和NA,可能具有超越全病毒體疫苗的額外優勢，因為它們一般無反應原性，尤其是在年輕的接種者中。亞單位疫苗可重組生產，或者可由^C裂的病毒顆粒純化。在另一個實施方案中，流感病毒制備物為病毒體形式。病毒體是球形的單層嚢泡，其保留了真實構象的功能性病毒包膜糖蛋白HA和NA，插入病毒體的^#脂雙層膜中。所述流感病毒或其抗原性制備物可為卵源的或組織培養源的。例如，本發明的流感病毒抗原或其抗原性制備物可來源于常規的含胚卵法，該方法在卵中培養流感病毒，并純化收集的尿嚢液。卵可在短時間內大量累積。或者，它們可來源于任何使用組織培養物的新生產方法，以培養病毒或表達重組流感病毒表面抗原。適于培養病毒的細胞基質包括例如狗腎細胞，例如MDCK或MDCK克隆的細胞、MDCK樣細胞，猴腎細胞，例如AGMK細胞，包括Vero細胞，合適的豬細胞系，或適于生產疫苗用途的流感病毒的任何其它哺乳動物細胞類型。合適的細胞基質還包括人細胞，例如MRC-5細胞。合適的細胞基質不限于細胞系；例如原初細胞，如小雞胚成纖維細胞，還包括禽細胞系。流感病毒抗原或其抗原性制備物可通過眾多商業方法中的任一種生產，例如在專利號DD300833和DD211444(通過引用結合到本文中)中描述的裂解流感病毒法。裂解流感病毒傳統上使用溶劑/去污劑處理產生，例如磷酸三正丁酯，或者二乙醚組合Tween(稱作"Tween-醚"裂解)，該方法仍在某些生產廠家中使用。目前使用的其它裂解劑包括去污劑或蛋白水解酶或膽汁鹽，例如在專利號DD155875(通過引用結合到本文中)中描述的脫氧膽酸鈉。可用作裂解劑的去污劑包括陽離子去污劑，例如溴化鯨蠟基三曱銨(CTAB);其它離子去污劑，例如十二烷基硫酸鹽、牛磺脫氧膽酸鹽；或非離子去污劑，如上述的一種，包括TritonX-100(例如在Lina等，2000,Biologicals28，95-103描述的方法中)和TritonN-101;或者任何兩種或多種去污劑的組合。裂解疫苗的制備方法可包括眾多不同的過濾和/或其它分離步驟，如各種組合的超離心、超濾、區帶離心和層析(例如離子交換)步驟，以及任選的例如采用熱、曱醛或P-丙酸內酯或紫外線的失活步驟，其可在裂解前或后進行。裂解過程可以分批、連續或半連續過程進行。用于裂解免疫原性組合物的優選裂解和純化方法描述于WO02層7072。本發明的優選裂解流感疫苗抗原制備物包括生產過程剩余的殘余量的Tween80和/或TritonX-100,但這些物質可在裂解抗原制備后加入或調整其濃度。優選地，Tween80和TritonX-100都存在。疫苗劑量中這些非離子型表面活性劑的終濃度的優選范圍為Tween80:0.01-1%，更優選約0.1%(體積/體積)TritonX-100:0.001-0.1%(重量/體積)，更優選0.005-0.02%(重量/體積)。在一個具體實施方案中，Tween犯的終濃度在0.045%-0.09%(重量/體積)的范圍內。在另一個具體實施方案中，抗原作為2倍濃縮的混合物提供，其具有的Tween80濃度在0.045%-0.2%(重量/體積)的范圍內，在最終配制時必須用佐劑(或在對照制劑中用緩沖液)稀釋2倍。在另一個具體實施方案中，TritonX-100的終濃度在0.005%-0.017%(重量/體積)的范圍內。在另一個具體實施方案中，抗原作為2倍濃縮的混合物提供，其具有的TritonX-l00濃度在0.005%-0.034%(重量/體積)的范圍內，在最終配制時必須用佐劑(或在對照制劑中用緩沖液)稀釋2倍。優選地，流感病毒制備物在低水平硫柳汞存在下制備，或優選地在沒有硫柳汞的情況下制備。優選地，獲得的流感制備物在沒有有機汞防腐劑的情況下是穩定的，具體地說，所述制備物不含殘余辟u柳汞。具體地說，流感病毒制備物包含在沒有硫柳汞的情況下或在低水平硫柳汞(一般為5)Lig/ml或以下)的情況下穩定的血細胞凝集素抗原。具體地說，乙型流感毒抹的穩定利用a生育酚衍生物如a生育酚琥珀酸酯(也稱為維生素E琥珀酸酯，即VES)來實施。這種制備物及其制備方法/>開于WO02/097072。優選的組合物含3種失活的裂解病毒體抗原，它們由適宜流感季的WHO推薦毒抹制備。優選地，流感病毒或其抗原性制備物和水包油乳液佐劑包含在同一容器中。這被稱為'單瓶法，。優選地，所述瓶為預填充注射器。在一個替代實施方案中，流感病毒或其抗原性制備物和水包油乳液佐劑包含在單獨的容器或瓶中，并在給予給受試者之前不久或給予給受試者時混合。這被稱為'雙瓶法，。作為實例，當疫苗為0.7ml總劑量體積的2組分疫苗時，濃縮的抗原(例如濃縮的三價失活裂解病毒體抗原)存在于1個瓶(335iul)(抗原容器)中，預填充注射器含佐劑(360pl)(佐劑容器)。在注射時，使用含佐劑的注射器將含濃縮的三價失活裂解病毒體抗原的瓶中的內容物取出，接著輕微混合注射器。在注射前，使用的針用肌內針替換，體積調整到530ji1。一劑重配有佐劑流感疫苗候選物相當于530^U。水包油乳液佐劑本發明的佐劑組合物包含水包油乳液佐劑，優選地所述乳液包含可代謝油，其量為總體積的0.5%-20%,并具有油滴，油滴的至少70%(以強度計)具有低于1pm的直徑。為了使任何水包油組合物適于人給予，乳液系統的油碎目必須包含可代謝油。術語可代謝油的含義在本領域眾所周知。可代謝可定義為'能夠通過代謝被轉化，(Dorland'sIllustratedMedicalDictionary,W.B,SandersCompany,第25版(l974))。所述油可為任何植物油、魚油、動物油或合成油，它們對接受者是無毒的，能夠通過代謝被轉化。堅果、種子和谷物是常用的植物油來源。合成油也是本發明的一部分，可包括商品化油，例如NEOBEE⑧等。特別合適的可代i射油是變烯。鯊烯(2,6,10,15,19,23-六曱基-2,6,10,14,18,22-二十四碳六烯)是一種不飽和油，大量存在于鯊魚肝油中，少量存在于橄欖油、麥胚芽油、米糠油和酵母中，是用于本發明的特別優選的油。鯊烯是可代謝油緣于以下事實其是膽固醇生物合成的中間體(Merckindex，笫10版，編目流水號8619)。水包油乳液自身在本領域眾所周知，已表明可用作佐劑組合物(EP399843;WO95/17210)。適宜地，可代謝油以免疫原性組合物總體積的0.5%至20%(終濃度)的量存在，優選以總體積的1.0%至10%的量存在，優選以總體積的2.0%至6.0%的量存在。在一個具體實施方案中，可代謝油以免疫原性組合物總體積的約0.5%、1%、3.5%或5%的最終量存在。在另一個具體實施方案中，可代謝油以免疫原性組合物總體積的約0.5%、1%、3.57%或5%的最終量存在。優選地，本發明的水包油乳液系統具有亞孩t米范圍的小油滴粒度。適宜地，油滴的直徑大小在120-750nm的范圍內，更優選直徑大小在120-600nm的范圍內。最優選地，水包油乳液包含油滴，其至少70%(以強度計)的直徑低于500nm,更優選至少80%(以強度計)的直徑低于300nm，更優選至少90%(以強度計)的直徑在120-200nm的范圍內。本發明的油滴粒度，即直徑，以強度給出。有幾種方法測定以強度計的油滴直徑大小。強度使用粒度測量儀檢測，適宜地通過諸如MalvernZetasizer4000或優選MalvernZetasizer3000HS的動態光散射檢測。詳細的方法在實施例II.2給出。第一個可能性是通過動態光散射(PCS-光子相關光譜法)測定z平均直徑ZAD;該方法額外給出了多分散指數(PDI),ZAD和PDI這二者均用累積量算法計算。這些值不需要粒子折射率的信息。第二種方法是通過另一種算法Contin或NNLS或者自動化"Malvern"法(由粒度測量儀提供的默認算法)測定全顆粒大小分布來計算油滴直徑。多半情況下由于復雜組合物的粒子折射率是未知的，所以只能考慮強度分布，如果有需要，由該分布獲得強度平均值。水包油乳液包含甾醇。甾醇在本領域眾所周知，例如膽固醇是周知的，例如公開于MerckIndex,笫11版，341頁，為動物脂肪中天然存在的甾醇。其它適宜的甾醇包括P-谷甾醇、豆甾醇、麥角甾醇、oc-生育酚和麥角鈣化甾醇。所述甾醇適宜地以免疫原性組合物總體積的0.01%至20%(重量/體積)的量存在，優選以0.1%至5%(重量/體積)的量存在。優選地，當甾醇為膽固醇時，其以免疫原性組合物總體積的0.02%至0.2%(重量/體積)的量存在，更優選以0.5ml疫苗劑量體積的0.02%(重量/體積)的量存在，或者以0.5ml疫苗劑量體積的0.07%(重量/體積)的量存在，或者以0.7ml疫苗劑量體積的0.1%(重量/體積)的量存在。適宜地，甾醇是a-生育酚或其衍生物，例如a-生育酚琥珀酸酯。優選地，a-生育酚以免疫原性組合物總體積的0.2%至5.0%(體積/體積)的量存在，更優選以0.5ml疫苗劑量體積的2.5%(體積/體積)的量存在，或者以0.5ml疫苗劑量體積的0.5。/。(體積/體積)的量存在，或者以0.7ml疫苗劑量體積的1.7-1.9%(體積/體積)、優選1.8%的量存在。為明晰起見，以體積/體積給出的濃度可通過應用以下轉換系數轉變為以重量/體積表示的濃度5%(體積/體積)a-生育酚濃度等于4.8%(重量/體積)a-生育酚濃度。水包油乳液還可含有乳化劑。以免疫原性組合物重量計(重量/重量)乳化劑可以0.01-5.0%的量存在，優選以重量計(重量/重量)以0.1-2.0%的量存在。以總組合物的重量計優選的濃度為0.5-1.5%(重量/重量)。乳化劑可適宜地為聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯(Tween80)。在一個具體實施方案中，0.5ml疫苗劑量體積含1%(重量/重量)Tween80，0.7ml疫苗劑量體積含0.7%(重量/重量)Tween80。在另一個具體實施方案中，Tween80的濃度是0.2%(重量/重量)。水包油乳液佐劑可用于其它佐劑或免疫刺激劑，因此本發明的重要實施方案是含鯊烯或另一種可代謝油、a-生育酚和tween80的水包油制劑。水包油乳液還可包含span85和/或卵磷脂。典型地，水包油包含免疫原性組合物總體積的2-10%的鯊烯，2-10。/o的a-生育酚和0.3-3%的Tween80，并可按照WO95/17210中描述的方法生產。優選地，鯊烯:a-生育酚的比率等于或小于1，因為其提供了更穩定的乳液。Span85(聚氧乙烯山梨糖醇酐三油酸酯)也可例如以1%的水平存在。用于本發明第一次接種的免疫原性組合物的免疫原性特性在本發明中，相比于用無佐劑(即不含任何外源佐劑)的對應組合物(本文稱為'普通組合物，)獲得的CD4T-細胞免疫應答，流感組合物能夠誘導抗至少一種組成抗原或抗原性組合物的改善的CD4T-細胞免疫應答。所述'改善的CD4T-細胞免疫應答，指在給予有佐劑免疫原性組合物之后在人類患者中獲得的CD4應答高于在給予無佐劑的相同組合物后獲得的免疫應答。例如，與給予無佐劑的、含流感病毒或流感病毒或其抗原性制備物連同水包油乳液佐劑的免疫原性組合物時于人類患者中獲得較高的CD4T-細胞應答，所述水包油乳液佐劑包含可代謝油、甾醇如oc-生育酚和乳化劑。這種制劑將有利地用于誘導抗流感病毒的CD4-T細胞應答，該應答能夠^^測由MHCII類分子提呈的流感表位。優選地，由用于本發明的有佐劑裂解流感病毒組合物誘導的所述免疫應答高于用任何其它無佐劑常規流感疫苗(例如亞單位流感疫苗或全流感病毒疫苗)誘導的免疫應答。具體地但非排它性地，所述'改善的CD4T-細胞免疫應答，在免疫學上未初免的患者(即對所述流感病毒或抗原為血清陰性的患者)中獲得。此血清陰性可能是從未面對此病毒或抗原的所述患者(所謂的'原初，患者)的結果，或者替代性地是在遭遇時不能對所述抗原應答的所述患者的結果。優選地，所述改善的CD4T-細胞免疫應答在免疫應答受損受試者中獲得，所述免疫應答受損受試者例如為老年人，通常為65歲或以上，或者是具有高風險醫療狀況的小于65歲的成人('高風險成人，)，或者是2歲以下的兒童。改善的CD4T-細胞免疫應答可通過檢測產生任何以下細胞因子的細胞數來評1^介'產生至少兩種不同細胞因子(CD40L、IL-2、IFNy、TNFa)的細胞*產生至少CD40L和另一種細胞因子(IL-2、TNFa、IFN力的細胞'產生至少IL-2和另一種細胞因子(CD40L、TNFa、IFN力的細胞*產生至少IFNY和另一種細胞因子(IL-2、TNFa、CD40L)的細胞'產生至少TNFa和另一種細胞因子(IL-2、CD40L、IFNy)的細胞上細胞因子的細胞量較高時，將存在改善的CD4T-細胞免疫應答。通常，上文提及的5種狀況中的至少一種、優選兩種將被實現。在一個具體實施方案中，與無佐劑組相比，有佐劑組中生產全部4種細胞因子的細胞將以更高量存在。由本發明的有佐劑流感組合物賦予的改善的CD4T-細胞免疫應答實際上可在單次給予后獲得。例如在快速發展的爆發情況下單劑方法將有極為重大的意義。在某些情況下，尤其是對于老年人群，或者對于首次抗流感接種的小孩(9歲以下)，給予兩劑相同的該季組合物可能是有益的。笫二劑所述相同組合物(仍被看作是'用于首次接種的組合物，)可在初始免疫應答正在發展的過程中給予，并有足夠的時間間隔。通常，第二劑組合物在首劑后數周或約1個月(例如2周、3周、4周、5周或6周)給予，以幫助觸發無應答或低應答個體中的免疫系統。在一個具體實施方案中，與在無佐劑組合物免疫個體中誘導的B記憶細胞應答相比，給予所述免疫原性組合物在給予有佐劑免疫原性組合物的患者中替代地或額外地誘導改善的B-記憶細胞應答。改善的B-記憶細胞應答意指在遭遇抗原時能夠分化為抗體分泌性漿細胞的外周血B淋巴細胞的頻率增加，這通過體外分化刺激檢測(參見實施例部分，例如ElispotB細胞記憶的方法)。在再另一個具體實施方案中，用有佐劑的首次接種用組合物接種對CD8應答無可檢測的影響。本申請人已令人驚奇地發現，含用水包油乳液佐劑配制的流感病毒或其抗原性制備物的組合物在免疫受損人群中有效促進T細胞應答，所述水包油乳液佐劑包含可代謝油、甾醇如a生育酚和乳化劑。本申請人已表明，根據在老年人群中進行抗流感再接種后流感疫苗保護作用的關聯性評價，與用無佐劑流感疫苗接種提供的血清保護作用相比，給予單劑如本發明所述的首次接種用免疫原性組合物能夠提供更好的血清保護作用。相比于無佐劑制劑獲得的免疫應答，要求保護的有佐劑制劑還能夠誘導抗流感病毒的改善的CD4T-細胞免疫應答。該觀察結果可能與接種或面對流感抗原性接觸的感染時增加的應答性相關。而且，其還可能與交叉反應性相關，即對變體流感抹應答的能力較高。這種改善的應答可能在免疫受損的人群如老年人群(65歲和以上)以及尤其是高風險老年人群中特別有益。這可導致降低整體的發病率和死亡率，并防止肺炎和其它流感樣疾病的緊急入院。這還可對嬰兒群體(5歲以下，優選2歲以下)有益。而且，與用無佐劑制劑誘導的應答相比，其允許誘導時間更持久的CD4T細胞應答，例如在首次接種后仍存在1年。優選地，CD4T-細胞免疫應答，例如在未初免受試者中獲得的改善的CD4T-細胞免疫應答，包括誘導交叉反應性CD4T輔助應答。具體地說，交叉反應性CD4T細胞的量增加。所述'交叉反應性，CD4應答指CD4T-細胞耙向流感抹之間的共有表位。通常，可用的流感疫苗僅有效對抗具有相似抗原性特征的血細胞凝集素的流感病毒感染株。當感染(循環)性流感病毒已經歷了表面糖蛋白(具體地說是血細胞凝集素)的微小變化(例如點突變或點突變的累積，導致氨基酸改變)時(抗原漂移變體病毒林)，疫苗仍可提供一些保護作用，但其可能僅提供有限的保護作用，因為新產生的變體可能逃脫先前流感感染或接種誘導的免疫性。抗原漂移是兩次大流行期間發生的年度流行的原因(Wiley&Skehel，1987,Ann.Rev.Biochem.56，365-394)。交叉反應性CD4T細胞的誘導為本發明組合物提供了額外的優勢，因為其還可提供交叉保護作用，換句話說是抗異源感染的保護作用，所述異源感染即由循環流感病毒抹引起的感染，該循環流感病毒抹為免疫原性組合物中包含的流感病毒抹的變體(例如漂移變體)。這在循環毒林難以在卵中繁殖或難以在組織培養物中生產時可能是有利的，使漂移抹用作備選工作抹。這在受試者以幾個月或一年間隔接受笫一次和笫二次接種時也可能有利，用于笫二次免疫的免疫原性組合物中的流感抹是用于首次接種的組合物中使用的毒抹的漂移變體林。^^4'if蘿凝并^it義^^Vir-勿應的蟲，/在給予經典的三價流感疫苗后(3周)，對抗原性毒抹制備物(全病毒或裂解抗原)應答的外周血CD4T-細胞的頻率顯著增加，所述抗原性毒抹制備物與疫苗中存在的一種抗原(H3N2:A/巴拿馬/2007/99;H1N1:A/新嗜里多尼亞/20/99;B:B/山東/7/97)(參見實施例III)同源。如果用分類為漂移株(H3N2:A/悉尼/5/97，H1N1:A/北京/262/95，B:B/山梨/166/98)的流感抹再刺激外周血CD4T-細胞，則可以見到相當大的頻率增加。相反，如果用本領域專家分類為漂移株(H2N2:A/新加坡/l/57;H9N2:A/香港/1073/99)的流感抹再刺激外周血CD4T-細胞，則在接種后沒有可觀測的增加。能夠同時識別同源和漂移的流感抹的CD4T-細胞在本文件中已命名為"交叉反應性"。要求保護在本發明中的用途的有佐劑流感組合物已能夠顯示出異亞型的交叉反應性，因為存在抗漂移流感抹的可觀測的交叉反應性。與以上觀測結果相一致，已在人中鑒別出不同流感抹共有的CD4T-細胞表位(GelderC等，1998,IntImmunol.10(2):211-22;GelderCM等，1996JVirol.70(7):4787-90;GelderCM等，1995JVirol.199569(12):7497誦506)。在一個具體實施方案中，有佐劑組合物可提供額外利益，該利益提供了抗循環毒株的更好保護作用，所述循環毒林經歷了血細胞凝集素的大改變(例如基因重組，例如兩個不同物種之間的基因重組)(抗原漂移)，目前可用疫苗對其無效。其它佐劑組合物可包含另外的佐劑，具體地說為TRL-4配體佐劑，適宜地為脂質A的無毒衍生物。適宜的TRL-4配體為3脫-O-酰化單磷酰脂質A(3D-MPL)。其它適宜的TLR-4配體為脂多糖(LPS)和衍生物、MDP(胞壁酰二肽)和RSV的F蛋白。在一個實施方案中，所述組合物可另外包括Toll樣受體(TLR)4配體，例如脂質A的無毒衍生物，具體地說是單磷酰脂質A,或者更具體地說是3-脫酰單磷酰脂質A(3D-MPL)。3D-MPL由Corixa公司以商標MPL⑧銷售(本文稱為MPL),主要促進具有IFNy(Thl)表型的CD4+T細胞應答。其可按照GB2220211A中公開的方法生產。在化學上，其是具有3、4、5或6條酰化鏈的3-脫酰單磷酰脂質A的混合物。優選地，在本發明組合物中使用小顆粒3D-MPL。小顆粒3D-MPL具有的顆粒大小使得其可通過0.22ium濾器除菌過濾。此制備描述于W094/21292和實施例II。3D-MPL可以例如每個組合物劑量1-100)ug(重量/體積)的量使用，優選以每個組合物劑量10-50iug(重量/體積)的量使用。合適量的3D-MPL例如為每個組合物劑量1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50嗎(重量/體積)中的任一個。更優選地，3D-MPL的量在每個組合物劑量25-75昭(重量/體積)的范圍內。通常，組合物劑量將在約0.5ml至約1ml的范圍內。典型的疫苗劑量為0.5ml、0.6ml、0.7ml、0.8ml、0.9ml或1ml。在一個優選實施方案中，每ml疫苗組合物包含50fig3D-MPL的終濃度，或每0.5ml疫苗劑量25貼3D-MPL的終濃度。在其它優選實施方案中，每ml疫苗組合物包含35.7昭或71.4嗎3D-MPL的終濃度。具體地說，0.5ml疫苗劑量體積每劑含25)ug或50ng3D-MPL。MPL的劑量適宜地能夠在人中增強針對抗原的免疫應答。具體地說，相比于無佐劑組合物，或相比于用另一種MPL量作佐劑的組合物，適宜的MPL量改善所述組合物的免疫效力，同時反應原性模式可接受。合成的脂質A衍生物是已知的，其中一些被描述為TLR-4激動劑，其包括但不限于OM174(2-脫氧-6-o-[2-脫氧-2-[(R)-3-十二烷酰氧基四-癸酰基氨基H-o-膦酰基-p-D-他喃葡糖基]-2-[(R)-3-羥基四癸酰基氨基]-a-D-吡喃葡糖基二氫磷酸酯)，(WO95/14026)OM294DP(3S,9R)-3-[(R)-十二烷酰氧基四癸酰基氨基]-4-氧代-5-氮雜-9(R)-[(R)-3-羥基四癸酰基氨基]癸-l,10-二醇,l,10-雙(二氫磷酸酯)(W099/64301和WO00/0462)OM197MP-AcDP(3S-,9R)-3-[(R)-十二烷酰氧四癸酰基氨基]-4-氧代-5-氮雜-9-[(R)-3-羥基四癸酰基氨基]癸-l,10-二醇，l-二氫磷酸酯10-(6-氨基己酸)(WO01/46127)其它合適的TLR-4配體例如為脂多糖及其衍生物、MDP(胞壁酰二肽)和呼吸道合胞體病毒的F蛋白。用于本發明的另一種合適的免疫刺激劑是QuilA及其衍生物。QuilA是分離自南美奎拉雅屬急樹(gwz7q/"Sa;o加haA/o/Z"a)的急苦制備物，首先由Dalsgaard等在1974年描述("Saponinadjuvants",Archiv.fiirdiegesamteVirusforschung,44巻，SpringerVerlag,Berlin,243-254頁)具有佐劑活性。已通過HPLC分離了QuilA的純化片段，其保留了佐劑活性，沒有與QuilA相關的毒性(EP0362278)，例如QS7和QS21(也稱為QA7和QA21)。QS-21是一種來源于奎拉雅屬皂樹(2"〃"7"&^o"an'GfA^/z"a)樹皮的天然皂苷，其誘導CD8+細胞毒性T細胞(CTL)、Thl細胞和主要的IgG2a抗體應答，在本發明范圍內是優選的皂苷。業已描述了QS21的具體制劑，它們是特別優選的，這些制劑還包含甾醇(W096/33739)。構成本發明一部分的皂苷可為水包油乳液形式(WO95/17210)。再接種和用于再接種的組合物(加強組合物)本發明的一個方面提供流感抗原在流感免疫原性組合物生產中的用途，所述流感免疫原性組合物用于再接種先前用以水包油乳液佐劑配制的流感病毒或其抗原性制備物或其變體接種的人，所述水包油乳液佐劑包含可代謝油、甾醇如oc-生育粉和乳化劑。通常，再接種于首次接種后至少6個月進行，優選8-14個月后進行，更優選約10-12個月后進行。用于再接種的免疫原性組合物(力。強組合物)可包含任何類型的抗原制備物，其或者是失活的，或者是減毒活性的。其可包含相同類型的抗原制備物，即裂解流感病毒或其裂解流感病毒抗原性制備物、全病毒體、純化的HA和NA(亞單位)疫苗或病毒顆粒，作為首次接種用的免疫原性組合物。或者，加強組合物可包含首次接種所使用流感抗原類型之外的另一種類型的流感病毒抗原，即裂解流感病毒或其裂解流感病毒抗原性制備物、全病毒體、純化的HA和NA(亞單位)疫苗或病毒顆粒。加強組合物可有佐劑或無佐劑。無佐劑的加強組合物可為肌內全會予的FluarixTM/ct-Rix/Influsplit。所述制劑包含3種由WHO推薦的適宜流感季毒抹制備的失活裂解病毒體抗原。因此，在一個優選實施方案中，本發明提供(a)流感病毒或其抗原性制備物和(b)水包油乳液佐劑在生產免疫原性組合物中的用途，所述免疫原性組合物用于再接種先前用流感病毒或其抗原性制備物和水包油乳液佐劑接種的人，所述水包油乳液佐劑包含可代謝油、甾醇和乳化劑。所述水包油乳液佐劑優選包含至少一種可代謝油，其量為總體積的0.5%-20%,并具有油滴，油滴的至少70%(以強度計)具有低于lMJn的直徑。適宜地，所述甾醇為a-生育酚。在一個具體實施方案中，用于再接種的免疫原性組合物(下文也稱為'加強組合物，)包含流感病毒或其抗原性制備物，它們與用于首次接種的流感病毒或其抗原性制備物共有共同的CD4T-細胞表位。共同的CD4T-細胞表位意指可由相同的CD4細胞識別的不同抗原的li/序列/表位(參見例如以下描述的表位GelderC等，1998，IntImmunol.10(2):211誦22;GelderCM等，1996JVirol.70(7):4787-90;GelderCM等，1995JVirol.199569(12):7497-506)。在一個優選實施方案中，流感抹可與大流行爆發相關，或具有與大流行爆發相關的潛力。具體地說，當疫苗是多價疫苗如二價疫苗或三價疫苗時，至少一種毒抹與大流行爆發相關，或者具有與大流行爆發相關的潛力。合適的毒抹為但不限于H5N1、H9N2、H7N7、H2N2和H1N1。在本發明的另一個方面，提供(c)第一流感抹的流感病毒或其抗所述水包油乳液佐劑包含可代謝油、甾醇和乳化劑，所述免疫原性組合物用于抗由流感抹引起的流感感染的保護作用，所述流感抹為所述第一流感抹的變體。所述水包油乳液佐劑優選包含至少一種可代謝油，其量為總體積的0.5%-20%,并具有油滴，油滴的至少70%(以強度計)具有低于1pm的直徑。適宜地，所述甾醇為a-生育酚。通常，加強組合物在使用時于下一個流感季給予，例如在笫一免疫原性組合物之后約1年給予。加強組合物還可隨后每年給予(笫三次、第四次、笫五次接種等)。加強組合物可與用于首次接種的組合物相同。適宜地，加強組合物包含流感病毒或其抗原性制備物，其為用于首次接種的流感病毒的變體一朱。具體地說，流感病毒^朱或其抗原性制備物按照世界衛生組織發布的參考材料選擇，使得它們適合于在再接種年循環的流感抹。用于再接種的流感抗原或抗原性組合物優選包含適宜地如上所述的佐劑或水包油乳液。所述佐劑可為如上文所述的水包油乳液佐劑，其是優選的，可選地包含額外的佐劑，例如TLR-4配體，如3D-MPL或皂苷，或者可為另一種合適的佐劑，例如鋁或鋁替代物，例如聚磷腈。優選地，相比于用無佐劑流感病毒或其抗原性制備物第一次接種后誘導的對等應答，再接種誘導以下的任何、優選兩個或全部(i)抗流感病毒或其抗原性制備物的改善的CD4應答，或(ii)改善的B細胞記憶應答或(iii)改善的體液應答。優選地，用本文定義的有佐劑流感病毒或其抗原性制備物再接種后誘導的免疫應答高于用無佐劑組合物再接種后誘導的對應應答。優選地，在用有佐劑流感病毒組合物、優選裂解流感病毒組合物首次接種的人群中，用無佐劑流感病毒、優選裂解的流感病毒再接種后誘導的免疫應答高于在用無佐劑流感病毒組合物、優選裂解流感病毒組合物首次接種的人群中的對應應答。本申請人已表明，用含流感病毒和如本文定義的水包油乳液佐劑的加強組合物再接種受試者，顯示出的抗體滴度高于用無佐劑組合物首次接種并用無佐劑組合物加強的人群中的對應值，其中所述水包油乳液佐劑包含可代謝油、甾醇如a生育酚和乳化劑。佐劑增強針對再接種的抗體應答的效力在已知對流感病毒接種或感染具有低應答的老年人中尤其重要。就改善再接種后的CD4T-細胞應答而言，有佐劑組合物相關的利益也是顯著的。相比于對照疫苗賦予的保護作用，本發明的有佐劑組合物能夠誘導抗漂移抹(下一流感季的流感林)的更好交叉響應性。所述交叉響應性表現出的持久性比用無佐劑制劑獲得的持久性高。在實施例3中給出的臨床前數據例如顯示了本發明組合物抗異型流感感染和根據體溫讀數確定的疾病的保護能力。在再接種研究中獲得的臨床實驗數據適用相同的結論。流感病毒林及其抗原所述流感病毒或其抗原性制備物適宜地為單價的或多價的，例如二價或三價或四價。優選地，流感病毒或其抗原性制備物是三價的或四價的，具有來自3種不同流感毒抹的抗原。或者，至少一種毒林與大流行爆發相關，或者具有與大流行爆發相關的潛力。作為背景，在大流行之間的時間段內，與之前大流行的流感病毒相關的流感病毒傳播。病毒以和生命早期感染不同的免疫性水平在人之間傳播。在通常2-3年的時間段內，這種傳播促進對已改變得足以在一般群體中再引起流行病的新毒抹的選擇；此過程稱為'抗原漂移，。'漂移變體，在任一年中在不同的社區、地區、國家或洲都具有不同影響，盡管在幾年內其總體影響經常是相似的。換句話說，當出現人群對其沒有免疫性的新流感病毒時，發生流感大流行。典型的流感大流行引起肺炎和下呼吸道疾病的發病率增加，證據是住院率或死亡率增加。老年人或患有基礎性慢性疾病的人最有可能體驗此并發癥，而幼兒也可能患嚴重疾病。在不可預見的間隔內出現新流感病毒，其具有與之前季節流行的毒株完全不同亞型的關鍵表面抗原血細胞凝集素。此時，產生的抗原可以與先前于人中循環的毒抹的對應蛋白有20%至50%的變化。這可導致病毒逃逸'群體免疫，，并產生大流行。此現象稱為'抗原轉換，。一般認為，至少在過去已發生了大流行，當時不同物種的流感病毒如禽或豬流感病毒已穿過種間屏障。如果這些病毒具有人與人之間傳播的潛力，它們可在數月至一年內全球擴散，導致大流行。例如，在19"年(亞洲流感大流行)，H2N2亞型病毒取代了H1N1病毒，H1N1病毒至少從首先分離到該病毒的1918年開始就在人群中循環。H2HA和N2NA在1957年至1968年之間經歷了抗原漂移，直至HA在1968年(香港流感大流行)被出現的H3N2流感病毒亞型替代，此后N2NA連同H3HA繼續漂移(Nakajima等，1991，Epidemiol.Infect.106,383-395)。給予其引起大流行爆發潛力的流感病毒抹特征是與當前循環林中的血細胞凝集素相比其包含新血細胞凝集素，其可伴有或不伴有神經氨酸酶亞型的改變；其能夠在人群中水平傳播；其對人是致病的。新血細胞凝集素可為長時間段內(可能數十年)在人群中還不明顯的血細胞凝集素，例如H2。或者其可為之前還沒有在人群中循環的血細胞凝集素，例如在鳥中發現的H5、H9、H7或H6。在任一種情況下，大部分或至少大比例的乃至整個群體以前都沒有遇到抗原，在免疫學上對抗原是原初態的。一般來說，在大流行環境下，某些群體被流感感染的風險增加。老年人、慢性疾病和小孩尤其易感，但許多年輕人和表面上健康的人也有風險。對于H2流感，1968年后出生的部分群體承受的風險增加。對這些群體重要的是盡快地和以簡單的方式有效地被保護。承受增加的風險的另一個人群是旅行者。今天，人們比以往任何時候都更常旅行，出現最多新病毒的地區中國和東南亞在近些年已成為受歡迎的旅行目的地。傳播模式的這種改變能使新病毒在約數周內而不是數月或數年內到達全球。因此，對于這些人群來說，在大流行情況下或潛在大流4亍的情況下特別需要接種保護來對抗流感。適宜的毒抹是但不限于H5N1、H9N2、H7N7、H2N2和H1N1。或者，所述組合物可包含3價以上，例如兩種非大流行毒抹加一種大流行毒林。或者，所述組合物可包含3種大流行毒林。在再一個實施方案中，本發明涉及一種接種方案，其中首次接種使用含至少一種流感毒林的裂解流感組合物進行，其中所述流感毒抹可潛在地引起大流行爆發，再接種用或者為流行抹或者為經典抹的循環毒抹進行。HA中的CD4表位此抗原漂移主要存在于病毒表面蛋白血細胞凝集素(HA)和神經氨酸酶(NA)的表位區。已知被病毒用于逃避宿主免疫系統的適應性應答的不同流感抹之間CD4和B細胞表位的任何差異都將在流感接種中起重要作用，并確實如此。已在人中鑒別出不同流感抹共有的CD4T-細胞表位(參見例如GelderC等,1998,IntImmunol.10(2):211-22;GelderCM等,1996JVirol.70(7):4787曙90;和GelderCM等，1995JViroi,199569(12):7497國506)。在一個具體的實施方案中，再接種使用含流感病毒或其抗原性制備物的加強組合物進行，所述流感病毒或其抗原性制備物與用于笫一次接種的流感病毒抗原或其抗原性制備物共有共同的CD4T-細胞表位。因此，本發明涉及含流感病毒或其抗原性制備物和水包油乳液佐劑的免疫原性組合物在生產多劑量疫苗的首次接種組分中的用途，所述水包油乳液佐劑含可代謝油、甾醇如a-生育酚和乳化劑，所述多劑量疫苗還包含作為加強劑量的流感病毒或其抗原性制備物，它們與第一次接種時所給予劑量的流感病毒抗原或其病毒抗原性制備物共有共同的CD4T-細胞表位。接種方法
技術領域：
：本發明的組合物可通過任何合適的傳遞途徑給予，例如皮內、粘膜如鼻內、口服、肌內或皮下。其它傳遞途徑在本領域眾所周知。M^內傳遞途徑對有佐劑流感組合物是優選的。皮內傳遞是另一個適宜的途徑。任何合適的裝置都可用于皮內傳遞，例如在US4,886,499、US5,190,521、US5,328,483、US5,527,288、US4,270,537、US5,015,235、US5,141,496、US5,417,662中描述的短針裝置。皮內疫苗還可通過限制針進入皮膚的有效穿透長度的裝置給予，例如描述于WO99/34850和EP1092444的裝置及其功能等同物，這兩個文獻通過引用結合到本文中。快速注射裝置也是適宜的，其經液體快速注射器或經刺穿角質層并產生到達真皮的射流的針傳遞液體疫苗至真皮。快速注射裝置描述于例如US5,480,381、US5,599,302、US5,334,144、US5,993,412、US5,649,912、US5,569,189、US5,704,911、US5,383,851、US5,893,397、US5，466，220、US5，339,163、US5,312,335、US5,503,627、US5,064,413、US5,520,639、US4,596,556、US4,790,824、US4,941，880、US4，940,460、WO9W37705和WO97/13537。噴射粉末/顆粒傳遞裝置也是適宜的，其使用壓縮氣體加速粉末形式的疫苗通過皮膚外層至真皮。另外，常規注射器可用于皮內給予的經典結核菌素皮內試驗法。另一個合適的給予途徑是皮下途徑。任何合適的裝置都可用于皮下傳遞，例如經典的針。優選地，使用例如在WO01/05453、WO01/05452、WO01/05451、WO01/32243、WO01/41840、WO01/41839、WO01/47585、WO01/56637、WO01/58512、WO01/64269、WO01/78810、WO01/91835、WO01/97884、WO02/09796、WO02/34317中公開的無針快速注射器服務。更優選地，所述裝置用液體疫苗制劑預填充。或者，疫苗鼻內給予。典型地，疫苗局部給予于鼻咽部，優選沒有吸入到肺中。理想的是使用將疫苗制劑傳遞入鼻咽部而沒有或基本沒有使其進入肺中的鼻內傳遞裝置。本發明疫苗的優選鼻內給予裝置是噴霧裝置。適宜的商用鼻噴霧裝置包括Accuspray(BectonDickinson)。霧化器產生非常細小的霧滴，其可被輕易地吸入到肺中，因此不能有效到達鼻粘膜。因此不優選霧化器。用于鼻內用途的優選噴霧裝置為性能與使用者提供的壓力無關的裝置。這些裝置稱為壓力域裝置。只有在提供臨界壓力時才由噴嘴釋放液體。這些裝置更容易獲得液滴大小規則的噴霧。適用于本發明的壓力域裝置在本領域是已知的，描述于例如WO91/13281和EP311863B和EP516636，這些文獻通過引用結合到本文中。這種裝置可由PfeifferGmbH購買，還描述于Bommer,R.PharmaceuticalTechnologyEurope,1999年9月。優選的鼻內裝置產生的液滴(使用水作為液體檢測)范圍為1-200|um,優選10-120pm。小于10pm存在吸入風險，因此理想的是10pm以下的液滴不超過約5%。120以上的液滴擴散得不如較小的液滴好，所以理想的是120以上的液滴不超過約5%。雙劑量傳遞是用于本發明疫苗的鼻內傳遞系統的更優選特征。雙劑量裝置包含單劑疫苗的兩個亞劑量，每個鼻孔給予一個亞劑量。一般來說，兩個亞劑量存在于一個容器中，裝置的構造允許每次有效傳遞單個亞劑量。或者，可使用單劑量裝置給予本發明疫苗。或者，本發明還設想了表皮或透皮接種途徑。在本發明的一個具體實施方案中，首次給予的有佐劑免疫原性組合物可肌內給予，有佐劑或無佐劑的加強組合物可通過不同途徑給予，例如皮內、皮下或鼻內。在另一個具體實施方案中，首次給予的組合物可包含每個流感毒株15pg的標準HA含量，加強組合物可包含低劑量的HA,即低于15嗎，并根據給予途徑可以較小體積給予。接種群體接種的目標群體可為免疫受損的人。和健康成人相比，免疫受損的人一般不能很好地對抗原、尤其是流感抗原應答。優選地，目標群體是未對流感初免的群體，他們或者是原初態的(例如相對于大流行毒林)，或者先前不能對流感感染或接種應答。優選地，目標群體是老年人，適宜地為65歲和以上；較年輕的高風險成人(即18-64歲)，例如在保健機構工作的人；或者具有高風險因素如心血管病和肺病或糖尿病的年輕成人。另一個目標群體是所有6個月和以上的兒童，尤其是6-23個月齡的兒童，他們經歷了相對高的流感相關住院率。優選地，目標群體是65歲以上的老年人。接種方案、給藥和附加的效力標準適宜地，本發明的免疫原性組合物在大部分情況下為標準0.5ml注射劑量，據據單輻射免疫擴散(SRD)(J.M.Wood等J.Biol.Stand.5(1977)237-247;J.M,Wood等，J.Biol.Stand.9(1981)317畫330)檢測，含各個流感抹的15pg血細胞凝集素抗原組分。適宜地，疫苗劑量體積在0.5ml至1ml之間，具體地說是標準0.5ml或0.7ml疫苗劑量體積。根據原液樣品中的HA濃度，可常規地輕微調整劑量體積。適宜地，所述免疫原性組合物含低劑量的HA抗原一例如每流感才朱1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14HA中的任一個。適宜的低劑量HA在每流感抹1-7.5pgHA之間，適宜地在每流感抹3.5-5jugHA之間，例如每流感抹3.75|xgHA，典型地約每流感抹5嗎HA。有利地，本發明的疫苗劑量，尤其是低劑量疫苗，可以以比一般為每劑約0,5、0.7或1ml的常規注射裂解流感疫苗小的體積提供。本發明的小體積劑量優選每劑不到500pi,更優選每劑不到300pi,最優選每劑不超過約200pi或以下。因此，按照本發明一個方面的優選小體積疫苗劑量是在小體積中具有低抗原劑量的劑量，例如在約200pl體積中有約15嗎或約7.5貼HA或約3.0略HA(每毒抹)。本發明的流感藥物優選滿足疫苗的某些國際標準。國際上提出了檢測流感疫苗效力的標準。在下表1中顯示了有效抗流感疫苗的歐盟官方標準。理論上，為滿足歐盟要求，對疫苗中包含的所有流感抹來說，流感疫苗僅需滿足表中的一項標準。本發明的組合物適宜地滿足這些標準中的至少一項。然而，在實踐中，所有病毒抹必須滿足所述標準中的至少兩項或全部三項，特別是對于新型疫苗(例如經不同途徑傳遞的新型疫苗)而言。在某些情況下，兩項標準可能足夠了。例如，可以接受所有病毒抹滿足三項標準中的兩項，而部分但不是全部病毒林滿足第三項標準(例如三種病毒林中的兩種)。對成年人群體(18-60歲)和老年人群體(大于60歲)的要求是不同的。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>*血清陽轉率定義為接種后針對每種疫苗林的血清血細胞凝集素抑制(HI)滴度增加達至少4倍的接種者的百分率。**轉變因子定義接種后針對每種疫苗林的血清HI幾何平均滴度(GMT)的增加倍數。***保護率定義為接種后(針對每種疫苗株的)血清HI滴度等于或高于1:40的接種者的百分率，通常可被看作指示保護作用。再一方面，本發明提供一種針對已知要通過CD4+T細胞活化治愈或治療的疾病設計疫苗的方法，其包括1)選擇含CD4+表位的抗原，和2)組合所述抗原和上文定義的水包油乳液佐劑，其中所述疫苗在所述哺乳動物中給予時能夠在所述哺乳動物中誘導增強的CD4T細月包應答。本申請的所有參考文獻(包括專利申請和已授予專利)的教導都通過引用完全結合到本文中。為避免疑惑，本發明人意圖是本文的術語'包含，在每種情況下都任選地可被術語"由......組成"替代。可選實施方案在一個可選實施方案中，具體地但非排它性地可在使用裂解流因此，在本
背景技術：
：下還設想了以下具體實施方案1,(a)裂解流感病毒或其裂解病毒抗原性制備物和(b)水包油乳液佐劑在生產免疫原性組合物中的用途，所述免疫原性組合物在人中誘導抗所述抗原或其裂解病毒抗原性制備物的以下至少一種i)改善的CD4T-細胞應答，ii)改善的B細胞記憶應答。2,(c)裂解流感病毒或其裂解病毒抗原性制備物和(a)水包油乳液佐劑在生產免疫原性組合物中的用途，所述免疫原性組合物用于接種人免疫受損個體或群體，例如高風險成人或老年人，以對抗流感。3,有佐劑或無佐劑的流感病毒或其抗原性制備物在生產免疫原性組合物中的用途，所述免疫原性組合物用于再接種先前用裂解流感病毒或其裂解病毒抗原性制備物和水包油乳液佐劑接種的人。優選地，再接種在前一季已進行抗流感接種的受試者中進行。典型地，再接種在首次接種后至少6個月進行，優選首次接種后8-14個月進行，更優選在首次接種后10-12個月進行。4,優選地，提供(a)裂解流感病毒或其裂解病毒抗原性制備物和組合物用于再接種先前用裂解流感病毒或其裂解病毒抗原性制備物和水包油乳液佐劑4妄種的人。5,(e)來自第一流感毒抹的裂解流感病毒或其裂解病毒抗原性制疫原性組合物用于抗由流感毒抹引起的流感感染的保護作用，所述流感毒抹為所述笫一流感毒抹的變體。6,在另一個具體實施方案中，用于再接種的免疫原性組合物包含裂解流感病毒或其裂解病毒抗原性制備物，它們與用于首次接種的裂解流感病毒或其裂解病毒抗原性制備物共有共同的CD4T-細胞表位。7,—種用免疫原性組合物接種免疫受損的人類個體或群體(例如高風險成人或老年人)的方法，所述免疫原性組合物包含裂解流感病毒或其裂解病毒抗原性制備物和如上文定義的水包油乳液佐劑。8,—種再接種先前用裂解流感病毒或其裂解病毒抗原性制備物和水包油乳液佐劑接種的人的方法，包括給予所述人有佐劑或無佐劑的含流感病毒的免疫原性組合物。9,一種對人類群體或個體進行抗一種流感病毒抹的接種、接著對所述人或群體進行抗變體流感病毒林的再接種的方法，所述方法包括給予所述人(i)含第一流感病毒抹的裂解流感病毒或其裂解流感病毒抗原性制備物和水包油乳液佐劑的第一組合物，和(ii)笫二免疫原性組合物，其包含所述第一流感病毒4朱的流感病毒抹變體。10,—種設計流感疫苗的方法，包括1)選擇含CD4+表位的流感抗原，和2)組合所述流感抗原和如上定義的水包油乳液，其中所述疫苗在哺乳動物中給予時能夠在所述哺乳動物中誘導增強的CD4應答。在一個具體實施方案中，與無佐劑抗原或抗原性組合物獲得的應答相比，免疫原性組合物還能夠誘導改善的CD4T-細胞應答和改善的B-記憶細胞應答這二者。在所有這些實施方案中，所述水包油乳液佐劑適宜地包含至少一種可代謝油，其量為總體積的0.5%至20%，并具有油滴，油滴的至少70%(以強度計)具有小于1pm的直徑。本發明將參考以下的非限制性實施例進一步描述實施例I描述了在小鼠、雪貂和人研究中使用的免疫解讀方法。實施例II描述了用于示例性研究的水包油乳液和佐劑制劑的制備和表征。實施例III描述了在65歲以上老年人群中用含裂解流感抗原制備物和AS03佐劑的疫苗進行的臨床實驗。實施例IV描述了第二個臨床實驗一再接種實驗一在65歲以上老年人群中用含裂解流感抗原制備物和AS03佐劑的疫苗進行。實施例V顯示了有佐劑和無佐劑的流感疫苗在雪貂中的臨床前評價(研究I和研究II)。檢測溫度監測、病毒脫落和CD4T-細胞應答。實施例VI顯示了有佐劑和無佐劑的流感疫苗在C57BI/6原初小鼠和初免小鼠中的臨床前評價。實施例VII顯示了有佐劑和無佐劑的裂解和亞單位流感疫苗在用異源毒林初免的C57BI/6小鼠中的臨床前評價。實施例VIII描述了在65歲以上老年人群中用含裂解流感抗原制備物的疫苗進行的臨床實驗，所述制備物含AS03佐劑、AS03+MPL佐劑或沒有外源佐劑。實施例IX顯示了有佐劑和無佐劑的流感疫苗在雪貂中的臨床前評價(研究III)。檢測溫度監測、病毒脫落和HI滴度。實施例X顯示了在65歲以上老年人群中用含裂解流感抗原制備物的疫苗進行的臨床實驗在90天和180天時的免疫原性持久性數據，所述制備物含AS03,有或沒有MPL佐劑。實施例XI顯示了在65歲以上老年人群中用含裂解流感抗原制備物的疫苗進行的臨床實驗，所述制備物含AS03和MPL佐劑。實施例XII顯示了在65歲以上老年人群中用含裂解流感抗原制備物的疫苗進行的臨床實驗，所述制備物含AS03和兩個濃度的MPL佐劑。實施例I-免疫解讀方法1.1.小鼠法A凝X^付飾試使用血凝反應抑制測試(ffl)測定針對3種流感病毒抹的抗血細胞凝集素抗體滴度。HI測試的原理是基于特異性抗流感抗體抑制通過流感病毒血細胞凝集素(HA)的小雞紅細胞(RBC)血凝反應的能力。熱失活血清預先用高嶺土和小雞RBC處理，以去除非特異性抑制劑。在預處理后，將2倍稀釋度的血清與4個血凝單位的每種流感抹溫育。然后加入小雞紅細胞，并記錄凝集抑制。滴度表示為完全抑制血凝反應的血清最高稀釋度的倒數。由于血清的笫一個稀釋度是1:20，所以不可檢測水平記錄為等于10的滴度。使用UNISTAT對接種后的ffl滴度進行統計學分析。用于分析方差的方法可如下簡述翻數據的對數轉換園對各個群體(組)進行的Shapiro-Wilk檢驗，以便驗證組分布的正態性■Cochran檢驗，以便確定不同群體(組)之間的方差均一性固對各組進行的雙因素方差分析困用于多重比較的TukeyHSD檢驗L1.2.月包內細月包因子染色該技術允許根據細胞因子產量定量抗原特異性T淋巴細胞效應子T細胞和/或生產IFN-Y的效應子-記憶T細胞和/或生產IL-2的中樞記憶性T細胞。在免疫后7天收集PBMC。在分泌性抑制劑(Brefeldine)存在下體外再刺激淋巴樣細胞。然后使用熒光抗體(CD4、CD8、IFN-y和IL-2)通過常規免疫焚光法處理這些細胞。結果表示為CD4/CD8T細胞中細胞因子陽性細胞的頻率。在笫二次免疫后7天對PBMC進行T細胞的胞內細胞因子染色。由小鼠收集血液，并合并在肝素化培養基RPMI+添加物中。對于血液，RPMI+添加物稀釋的PBL懸浮液按照推薦的方法(于室溫以2500rpm離心20分鐘)在Lympholyte-Mammal梯度上分層。去除分界面處的單核細胞，用RPMI+添加物清洗2次，用RPMI5%胎牛血清將PBMC懸浮液調整至2xlos個細胞/ml。用WholeFI(1昭HA/毒抹)以lxl()7個細胞/ml(管式FACS)的終濃度對PBMC進行體外抗原刺激，然后在加入抗-CD28和抗-CD49d(均為1嗎/ml)的情況下于37。C溫育2小時。在抗原再刺激步驟后，在Brefeldin(1pg/ml)存在下于37。C過夜溫育PBMC,以抑制細胞因子分泌。IFN-y/IL-2/CD4/CD8染色如下進行清洗細胞懸浮液，重懸浮在含2%Fc封閉試劑(l/50;2.4G2)的50)LilPBS1%FCS中。于4。C溫育10分鐘后，加入抗-CD4-PE(2/50)和抗-CD8perCp(3/50)的50jul混合物，于4。C溫育30分鐘。在PBS1%FCS中清洗后，通過重懸浮在200jtilCytofix-Cytoperm(KitBD)中并于4。C溫育20分鐘使細胞透化。然后用PermWash(KitBD)清洗細胞，并用以PermWash稀釋的抗-IFN-YAPC(1/50)+抗-IL-2FITC(1/50)的50fxl混合物重懸浮。于4'C溫育最少2小時最長過夜后，用PermWash清洗細胞并重懸浮在PBS1%FCS+1%多聚曱醛中。通過FACS進行樣品分析。門控(FSC/SSC)活細胞，對CD4+T細胞上的約20,000事件(淋巴細胞)或35,000個事件進行探測。針對CD4+和CD8+門控的群計算IFN-y+或IL2+的百分率。1.2.雪貂法1.2丄血凝反應抑制測試(ffl)使用血凝反應抑制測試(HI)測定針對3種流感病毒抹的抗血細胞凝集素抗體滴度。HI測試的原理是基于特異性抗流感抗體抑制通過流感病毒血細胞凝集素(HA)的小雞紅細胞(RBC)血凝反應的能力。血清首先用2^/。神經氨酸酶溶液(RDE)處理，并熱失活，以去除非特異性抑制劑。在預處理后，將2倍稀釋度的血清與4個血凝單位的每種流感抹溫育。然后加入小雞紅細胞，并記錄凝集抑制。滴度表示為完全抑制血凝反應的血清最高稀釋度的倒數。由于血清的第一個稀釋度是1:10,所以不可檢測水平記錄為等于5的滴度。使用UNISTAT對HI滴度(41天，攻擊前)進行統計學分析。用于分析方差的方法可如下簡述畫數據的對數轉換鵬對各個群體(組)進行的Shapiro-Wilk檢驗，以便驗證組分布的正態性■Cochran檢驗，以便確定不同群體(組)之間的方差均一性畫對單因素ANOVA的交互作用的檢驗隨用于多重比較的TukeyHSD檢驗1.2.2.體溫監測在攻擊期間用傳感器并通過遙測法記錄監測個體溫度。檢查和整修所有植入物，在放入腹腔之前通過DSI(DataSciencesInternational,Centaurusweg123,5015TCTilburg，TheNetherlands)進行新校準。在這些檢測期間所有動物都獨立地圏養在單獨的籠中。在攻擊前4天直至攻擊后7天每15分鐘記錄溫度。1.2.3.鼻清洗通過在清醒動物的兩個鼻孔中給予5mlPBS進行鼻清洗。將接種物收集在培養皿中，并置于干水上的樣品容器中。所有鼻樣品都首先通過SpinX濾器(Costar)除菌過濾，以去除任何細菌污染物。將50pl連續10倍稀釋度的鼻清洗液轉移至含50)ul培養基(IO孑L/稀釋度)的微量滴定板中。然后將100jalMDCK細胞(2.4xl()5個細胞/ml)加入每個孔，并于35。C溫育5-7天。在5-7天溫育后，小心地取出培養基，加入100pl含1/20WST-1的培養基，再溫育18小時。在存活細胞還原WST-1時產生的黃色甲臘染料的強度與病毒滴定實驗結束時存在于孔中的存活細胞數成比例，并通過在合適波長(450nm)檢測各孔的吸光度定量。截取值定義為未感染對照細胞的OD平均值一0.3OD(O.3OD相當于未感染對照細胞0D±3個標準偏差)。OD〈截取值時定義為陽性得分，相反，OD〉截取值時定義為陰性得分。病毒脫落滴度通過"ReedandMuench"測定，并表示為LogTCID50/ml。1.3.評價人中免疫應答的測定1.3丄血凝反應抑制測定使用WHO流感合作中心，疾病控制中心，Atlanta,USA(1991)描述的方法通過檢測HI抗體測定免疫應答。使用4個血凝反應抑制單位(4HIU)的適宜抗原和0.5%禽紅細胞懸浮液，用標準的和綜合驗證過的微量法對融化的冷凍血清樣品進行抗體滴度檢測。通過熱處理和受體破壞酶去除非特異性血清抑制劑。評價所獲血清的HI抗體水平。以1:10起始稀釋度開始制備連續稀釋度(乘以因數2)，直至最終稀釋度1:20480。把顯示完全抑制(100%)血凝反應的最高稀釋度步驟視為滴定終點。所有實驗都以雙份進行。1.3.2.神經氨酸酶抑制測定在包被胎球蛋白的微量滴定板中進行測定。制備2倍連續稀釋度的抗血清，與標準化量的曱型流感H3N2、H1N1或乙型流感病毒混合。測試基于由胎球蛋白酶解釋放神經氨酸的神經氨酸酶生物活性。在切下末端神經氨酸后，P-D-半乳糖-N-乙酰基-氨基半乳糖暴露出來。向各孔加入來自落花生的辣根過氧化物酶(HRP)標記的花生凝集素，其特異性結合半乳糖結構。可在底物反應中用四曱基聯苯胺(TMB)檢測和定量結合凝集素的量。表明仍抑制病毒神經氨酸酶活性達至少50%的最高抗體稀釋度為NI滴度。1.3.3.中和抗體測定對融化的冷凍血清樣品進行中和抗體檢測。包含在血清中的抗體的病毒中和以微量中和實驗來測定。血清在實驗中無需進一步處理即可使用。各個血清以三重測定進行測試。將標準化量的病毒與連續稀釋的血清混合并溫育，以使抗體結合病毒。然后將含限定量的MDCK細胞的細胞懸浮液力口入病毒和抗血清的混合物中，于33°C溫育。在溫育期后，通過小雞紅細胞的凝集反應顯現病毒復制。利用ReedandMuench的方法計算血清的50%中和滴度。1.3.4.通過細胞因子流式細胞儀(CFC)評價細胞介導的免疫性外周血抗原特異性CD4和CD8T細胞可在體外被再刺激，以產生IL-2、CD40L、TNF-oc和IFN，如果與其對應抗原溫育。因此，抗原特異性CD4和CD8T細胞可在常規免疫熒光標記細胞表型以及胞內細胞因子生產后通過流式細胞儀計數。在本研究中，流感疫苗抗原以及來源于特定流感蛋白的肽用作再刺激流感特異性T細胞的抗原。結T細胞的頻率，1.3.5.統計方法'在接種后的7天隨訪期(即接種日和隨后6天)以及整個過程中訴求的局部和全身征兆和癥狀的百分率、強度以及同接種的關聯。.在接種后的21天隨訪期(即接種日和隨后20天)以及整個過程中主動訴求的局部和全身征兆和癥狀的百分率、強度以及同與接種的關聯。*整個研究過程中嚴重不良事件的發生。對于體液免疫應答'在0天和21天血清血凝反應抑制(ffl)和NI抗體滴度，分別對疫苗中提供的3種流感病毒抹的每一種測試(抗-HlNl、抗-H3N2和抗-B-抗體)。*在0天和21天中和抗體滴度，分別對疫苗中提供的3種流感病毒抹的每一種測試。衍4^#「弄|P5^H且/切.''接種前和接種后具有95%置信區間(95%CI)的血清HI抗體的幾何平均滴度(GMT)21天時具有95%CI的血清陽轉率*21天時具有95%0的轉變因子**21天時具有95%CI的血清保護率***.在所有時間點的血清NI抗體GMT(具有95%置信區間)*血清陽轉率定義為相比于第0天在笫21天時針對每種疫苗抹的血清ffl滴度時增加達至少4倍的接種者百分率。**轉變因子定義為相比于第0天在第21天時針對每種疫苗抹的血清HIGMT的增加倍數。***保護率定義為接種后(針對每種疫苗抹的)血清HI滴度等于40的接種者百分率，通常將該百分率看作指示保護作用。對于細胞介導的免疫(CMI)應答應激#在第0天和21天不同測試中每106當中細胞因子陽性的CD4/CD8細胞的頻率。每個測試都定量CD4/CD8T細胞針對以下物質的應答'肽流感(pf)抗原(這些抗原的精確性質和來源不需要給出/解釋)'裂解流感(sf)抗原'全流感(wf)抗原'產生至少兩種不同細胞因子(CD40L、IL-2、IFNy、TNFa)的細胞'產生至少CD40L和另一種細胞因子(IL-2、TNFa、IFN力的細胞'產生至少IL-2和另一種細胞因子(CD40L、TNFa、IFN力的細胞'產生至少IFNy和另一種細胞因子(IL-2、TNFa、CD40L)的細胞'產生至少TNFa和另一種細胞因子(IL-2、CD40L、IFNy)的細胞免疫原性分析基于整個接種人群。對于每個治療組，計算以下參數(具有95%置信區間)*在第0天和21天時HI和NI抗體滴度的幾何平均滴度(GMT)*在第0天和21天時中和抗體滴度的幾何平均滴度(GMT)21天時的轉變因子21天時的血清陽轉率(SC)，定義為相比于笫0天在笫21天時血清HI滴度增加達至少4倍的接種者百分率。21天時的保護率定義為血清HI滴度=1:40的接種者百分率。.在各個時間點(笫0天、笫21天)針對每個接種組和針對每種抗原(肽流感(pf)抗原、裂解流感(sf)抗原和全流感(wf)抗原)總結CD4/CD8T-淋巴細胞分泌應答的頻率(描述統計)。*在各5種不同測試中對于每個接種組和每種抗原(pf、sf和wf),在時間點(接種后-接種前)之間個體應答差異的描述性統計。'使用無參數檢驗(Kruskall-Wallis檢驗)比較3組之間的局部差異，在各5種不同測試中計算每種抗原的統計學p-值。所有統計學檢驗都是雙尾的。低于或等于0.05的P-值被看作是統計學顯著的。實施例II一水包油乳液和佐劑制劑的制備和表征除非另有說明，否則在隨后的實施例中使用的油/水乳液包含2種油(ot-生育酚和鯊烯)組成的有機相和含Tween80作為乳化劑的PBS水相。除非另有說明，否則在隨后的實施例中使用的水包油乳液佐劑制劑都制成含以下的水包油乳液組分(給出終濃度)2.5%畫烯(體積/體積)、2.5%06-生育酚(體積/體積)、0.9%聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯(體積/體積)(Tween80),參見WO95/17210。該乳液在隨后的實施例中稱為AS03，如下制備為2倍濃縮物。IU.乳液SB62的制備IU.l.實驗室規模的制備將Tween80溶解在磷酸緩沖鹽水(PBS)中，獲得2%的PBS溶液。為提供100ml的2倍濃縮乳液，渦旋5gDLa生育酚和5ml鯊烯，以徹底混合。加入90mlPBS/Tween溶液，徹底混合。然后將獲得的乳液通過注射器，最后使用M110S^t流控設備農i射流。獲得的油滴具有約120-180nm的大小(表示為通過PCS檢測的Z均值)。將其它佐劑/抗原組分加入為單一混合物的乳液中。IL1.2.放大規模的制備通過在強攪拌下混合由疏水組分(a-生育酚和鯊烯)組成的油相和含水溶性組分(Tween80和PBSmod(改良型)，pH6.8)的水相，制備SB62乳液制備物。在攪拌的同時，將油相(1/10總體積)轉移至水相(9/10總體積)，于室溫攪拌混合物15分鐘。然后在微流控器的相互作用腔中對獲得的混合物施加剪切力、沖擊力和空化力(15000PSI,8個循環)，以產生亞微米油滴(分布在100-200nm之間)。獲得的pH在6.8±0.1之間。然后使SB62乳液通過0.22拜膜過濾除菌，將除菌的乳化原液冷凍々者存于2-8。C的C叩ac容器中。將無菌惰性氣體(氮氣或氬氣)通入SB62乳化半成品容器的死體積，持續至少15秒。SB62乳液的最終組成如下Tween80:1,8%(體積/體積)19.4mg/ml;鯊烯5%(體積/體積)42.8mg/ml;ot畫生育酚5%(體積/體積)47.5mg/ml;PBS-mod:NaCl121mM,KC12.38mM,N^HPC^7.14mM,KH2P041.3mM;pH6.8±0.1。II.2.油滴粒度的動態光散射檢測n.2丄簡介油滴直徑的大小4姿照以下方法并在以下實-瞼條件下測定。油滴粒度檢測以強度檢測提供，并表示為通過PCS檢測的z均值。11.2.2.樣品制備對水包油乳液佐劑進行粒度檢測，所述水包油乳液佐劑為按照放大規模方法制備的SB62、AS03和AS03+MPL(50昭/ml),后兩種臨用前制備。樣品的組成在下文給出(參見章節II.2.4)。樣品用PBS7.4稀釋4000倍至8000倍。作為對照，用10mMNaCl稀釋PL-Nanocal粒度標準品100nm(目錄號6011-1015)。11.2.3.MalvernZetasizer3000HS粒度檢測所有的粒度檢測都用兩臺MalvernZetasizer3000HS檢測。樣品以合適的稀釋度(通常為4000倍至20000倍的稀釋度，取決于樣品濃度)在用于Malvern分析的塑料比色皿中檢測，并采用兩種光學模式-或者真實的粒子折射率0和假想折射率0。-或者真實的粒子折射率1.5和假想折射率0.01(按照在文獻中可見的值，對乳液采用適合的光學模式)。技術條件是-激光波長532nm(Zeta3000HS)。誦激光功率50mW(Zeta3000HS)。-于90。檢測的散射光(Zeta3000HS)。國溫度25。C，-持續時間由軟件自動確定，-次數3次連續檢測，-z均值直徑通過累積量分析-粒度分布通過Contin或自動^i方法。自動化Malvern算法使用累積量、Contin和非負最小二乘(NNLS)算法的組合。由于Mie理論，強度分布可轉變為體積分布。II.2.4.結果(參見表2)表2<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>(*)如下制備注射用水、PBS10x濃縮液、250|ilSB62乳液和25)MgMPL混合在一起，以達到280pi終體積。Z均值直徑(ZAD)大小以樣品中各種粒度的散射光量來度量。該值與樣品的單形態分析相關，主要用于重現目的。計數率(CR)是散射光的檢測結果其對應于每秒成千上萬的光子。多分散性(Poly)指數是分布的寬度。其是分布廣泛性的無量綱檢測結果。Co齒和々^/"、浙.'已按照以上闡述并帶有微小改變的方法制備和評價兩種另外的SB62制備物(2倍濃縮的AS03):在為獲得用于Zetasizer3000HS的最佳計數率值而確定的兩個稀釋度lOOOOx和20000x,在用于Malvern分析的塑料比色皿中檢測樣品0結果示于表3。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>"-"此時獲得的值不一致。這些結果的示意圖示于圖1的制劑1023。由其可見，大部分粒子(例如至少80%)以強度計具有小于300nm的直徑。II.2.5.整體結論用MalvernZetasizer3000HS和兩種光學模式檢測不同稀釋度的SB62制劑。以上評價的制劑的粒度ZAD(即通過累積量分析獲得的強度平均值)約為150-155nm。當使用累積量算法時，我們觀察到稀釋度對ZAD和多分散性沒有影響。II.3.含MPL的AS03的制備IL3丄MPL液體懸浮液的制備MPL(在整個文件中使用，其是3D-MPL即3-0-脫酰單磷酰脂質A的縮寫)原液由MPL⑧凍干粉制備。MPL原液是穩定的原料濃(約1mg/ml)水分散體，其隨時可用于疫苗或佐劑配制。制備過程的示意圖在圖2中給出。對于最大批量12g,MPL原液制品儲存在無菌玻璃容器中。MPL的分散由以下步驟組成-將MPL粉末懸浮在注射用水中-通過加熱解聚任何大的聚集物(熱處理)-通過微射流將粒度縮小至100nm至200nm畫用Sartoclean預過濾裝置0.8/0.65pm預過濾制品-于室溫除菌過濾制品(SartobranP裝置，0.22pm)MPL粉末通過微射流凍干，產生穩定的膠體水性分散體(MPL粒度小于200nm)。MPL凍干粉末分散在注射用水中，以便獲得粗制的10mg/ml懸浮液。然后在攪拌下對懸浮液進行熱處理。冷卻至室溫后，開始微射流處理，以便降低粒度。使用微流控裝置M110EH,以限定壓力通過孩么射流相互作用腔連續循環分散液達最小通過量(循環次數ivJ進行微射流。代表循環次數的微射流持續時間基于檢測的流速和分散體積計算。對于給定壓力下的給定設備，獲得的流速可在一個至另一個相互作用腔之間以及特定相互作用腔的整個活動周期中有所變化。在本實施例中，使用的相互作用腔是F20Y型微流控器。由于孩么射流效力與壓力-流速對相關，所以處理時間可在一批至另一批之間變化。1次循環需要的時間基于流速計算。所認定的流速是就在將MPL導入裝置前用注射用水檢測的流速。1次循環被定義為MPL總體積通過裝置1次所需要的時間(以分鐘表示)。如下計算獲得n次循環需要的時間nx要處理的MPL的量(ml)/流速(ml/分鐘)由此相應地修改循環次數。描述了對所用的優選設備和相互作用腔要實施的最小循環量(n^)。根據iUn循環后進行的粒度檢測結果確定要實施的總循環量。基于歷史數據確定粒度限制(duJ。檢測通過光子相關光譜法(PCS)技術實現，cU表示為單模式結果(Z均值)。在該限制之下，可在rimh循環后終止微射流。在該限制之上，繼續孩吏射流，直至獲得滿意的粒度減小，最多再進行50個循環。如果在微射流后不立即開始過濾，則分散的MPL儲存在+2至+8°C,等待轉移至過濾區域。在微射流后，用注射用水稀釋分散液，通過0.22濾器在層流下除菌過濾。最后的MPL濃度是1mg/ml(0.80-1.20mg/ml)。II.3.2.AS03+旨1^佐劑化疫苗的制備單瓶法向AS03佐劑制劑中加入MPL，終濃度在每劑疫苗10-50gg之間。將PBS10倍濃縮液(l倍濃縮時為pH7.4)以及含Tween、TritonX-100和VES(維生素E琥珀酸酯)的SB62混合物加入注射用水中。考察流感抹中存在的去污劑的量，以便達到目標終濃度750ng/mlTween80、110pg/mlTritonX-100和100|tig/mlVES。在5分鐘攪拌后，加入15pg的每種目標流感才朱(例如在經典3^介疫苗中的毒才朱H1N1、H3N2和B)。在15分鐘攪拌后，加入250piSB62乳液，然后力口入25jig或50嗎MPL。制備過程的示意圖在圖3中給出。表4給出了每個人體劑量中含MPL的AS03的最終組成。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>II.3.3.AS03+MPL佐劑化疫苗的制備雙瓶法可通過混合2倍濃縮的抗原或抗原制備物和AS03(SB62250pl)或AS03+MPL(SB62250pl+25pg或50嗎MPL)佐劑，由雙瓶法制備相同制劑。在此情況下，其如下進行。AS25-佐劑化流感疫苗的生產由3個主要步驟組成1)配制無佐劑的三價半成品(2x濃縮)并分裝入抗原容器中2)制備AS03+MPL佐劑3)AS03+MPL佐劑化裂解病毒疫苗即時重配。7」^劍尤佐^的三,^f成品Px求/萄并》,入拔^容器^3種單價原液的體積基于配制前各個單價原液中檢測的HA含量，并基于1100ml的目標體積。濃縮的磷酸緩沖鹽水以及Tween80、TritonX-100和ot-生育酚氫琥珀酸酯的預混合物稀釋在注射用水中。然后將3種濃縮的單價原液(A/新喀里多尼亞、A/紐約、B/江蘇)連續稀釋入獲得的磷酸緩沖鹽水/Tween80-TritonX-100-a-生育酚氬琥珀酸酯溶液(pH7.4,137mMNaCl,2.7mMKC1,8.1mMN^HPO"1.47mMKH2P04,990pg/mlTween80,150)ug/mlTritonX-100和130嗎/mla-生育酚氫琥珀酸酯)中，以便具有39.47嗎A毒抹(H1N1、H3N2)的HA/ml三價半成品(15jugHA/A毒抹/380^三價半成品)和46嗎B毒抹的HA(17.5昭HA/B毒林/380^三價半成品)的終濃度。在加入每種單價原液之間，于室溫攪拌混合物達10-30分鐘。在加入最后一種單價原液后，攪拌15-30分鐘，檢查pH，并用HC1或NaOH將pH調節至7.2士0.2。抗原的三價半成品無菌分裝入3-ml無菌I型(歐洲藥典)玻璃瓶中。每瓶含470)iil體積(380|Lil+90pi過充)。南/務^S0J/A^丄佐浙j濕并》、襲入炎浙審器尹。通過混合兩種組分制備佐劑AS03/MPL:SB62乳液(章節IL1.2中的方法)和MPL(章節II.3.1中的方法)。1倍濃縮的PBSmod(通過將10x濃縮的PBSmod稀釋在注射用水中制備)和SB62原液和1mg/ml的MPL原液。測定MPL濃度，以便達到10-50嗎的最終含量，適宜地為每個最終人用疫苗劑量約25pg。混合物于室溫攪拌5-30分鐘，用NaOH(0.05或0.5M)/HC1(0.03M或0.3M)將pH調節至6.8±0.1。于室溫再攪拌5-30分鐘后，將混合物通過0.22^im膜過濾除菌。實施無菌惰性氣體(氮氣)通入，以在最少1分鐘的過程中在分裝容器中產生惰性頂空氣體。無菌AS03+MPL佐劑儲存在+2-8°C,直至無菌分裝入1.25-ml無菌I型(歐洲藥典)玻璃注射器中。每個注射器含80^超量體積(320)il+80^過充)。在注射時，將含佐劑的預填充注射器的內容物注入含濃縮的三價失活裂解病毒體抗原的小瓶中。在混合后，將內容物吸入到注射器中，針用肌內針替換。1劑重配的AS25佐劑化流感候選疫苗相當于0.7mL。II.4.在水包油乳液制劑中含流感抗原和任選MPL的免疫原性組合物的制備向II.l的SB62乳液中加入等體積的2倍濃縮的裂解流感抗原(Fluarix)(15嗎每種毒林的HA)并混合。適宜時將其與50嗎/mlMPL混合，獲得最終制劑。實施例III一在65歲以上的老年人中用含裂解流感抗原制備物和AS03佐劑的疫苗進行的臨床實驗(Explo-Flu-OOl)在2003年于65歲以上的老年人群中進行I期開放隨機研究，以便評價含佐劑AS03的GlaxoSmithKlineBiologicals流感候選疫苗的反應原性和免疫原性。在肌內給予1劑AS03佐劑化疫苗或WV疫苗后21天檢測體液免疫應答(即抗血細胞凝集素抗體滴度、中和抗體滴度和抗神經氨酸酶抗體滴度)和細胞介導的免疫應答(CD4和/或CD8T細胞應答)。FluarixTM用作參比。III.l.研究設計3組受試者平行地肌內接受以下疫苗■1組50名受試者接受1劑重配和有佐劑的SV流感疫苗(FluAS03)■1組50名受試者接受1劑全病毒流感疫苗(FIuWVV)■1組50名受試者接受1劑Fluarix(Fluarix)=對照接種程序在第0天注射1次流感疫苗，收集血樣，在21天進行解讀分析(HI抗體測定、NI抗體測定、中和抗體測定和CMI分析)和得出研究結論。在該研究中使用的標準3價裂解流感疫苗一FluarixTM是一種在2003年由GlaxoSmithKlineBiologicals開發并生產的商品化疫苗。in.2.疫苗組成和給予(表5)ni.2丄疫苗制備必^/必^^《蘿AS03佐劑化的流感疫苗候選物是一種2組分疫苗，由在I型玻璃瓶(335pl)(抗原容器)中提供的濃縮3價失活裂解病毒體抗原和含SB62乳液的預填充I型玻璃注射器(335pl)(佐劑容器)組成。在注射時，抗原容器的內容物借助于SB62乳液預填充注射器被取出，接著輕微混合注射器。SB62乳液與疫苗抗原混合重配AS03佐劑。在注射前，使用的針被肌內針-齊換，并將體積調整到500^。1劑重配的AS03佐劑化流感疫苗相當于0.5ml，含在已注冊的FluarixTM/a-Rix⑧疫苗中的每種流感病毒抹的15嗎HA，并包含10.68mg鯊烯、11.86mgDL-a生育紛和4.85mg聚山梨醇酯80(Tween80)。賴備AS03佐劑化的流感疫苗的生產由3個主要步驟組成l)配制無佐劑的3價半成品并分裝入抗原容器中3種單價原液的體積基于配制前各個單價原液中檢測的HA含量，并基于800ml的目標體積。濃縮的磷酸緩沖鹽水以及Tween80、TritonX-100和a-生育酚氫琥珀酸酯的預混合物稀釋在注射用水中。然后將3種濃縮的單價原液(毒抹A/新喀里多尼亞-、毒抹A/巴拿馬-、毒抹B/山東-)連續稀釋入獲得的磷酸緩沖鹽水/Tween80-TritonX-100-a-生育酚氬琥珀酸酯溶液(pH7.4,137mMNaCl,2.7mMKC1，8.1mMNa^HP04,1.47mMKH2P04,1500貼/mlTween80,220照/mlTritonX-100和200jug/mla-生育酚氬琥珀酸酯)中，以便具有60昭A毒抹的HA/ml三價半成品(15昭HA/A毒抹/250pl三價半成品)和70)igB毒林的HA(n.5嗎HA/B毒抹/250pl三價半成品)的終濃度。在加入每種單價原液之間，于室溫攪拌混合物達10分鐘。在加入最后一種單價原液后，攪拌15分鐘，檢查pH，并用HC1或NaOH將pH調節至7.2士0.1。將抗原的3價半成品無菌分裝入3-mlI型無菌玻璃瓶中。每瓶含34%體積超出量(335iul總體積)。2)射務乾^無蘿j該并為、襲入佐W容器^*水相:在攪拌的同時，將902mlTween80與44105mlPBS-mod緩沖液混合(用HC1調節后pH=6.8)。，油相:在攪拌的同時，將2550ml鯊烯加入2550mla-生育酚中。，混合水相和油相:在攪拌的同時，將S000ml油相(l/10總體積)轉移至45007ml7jc相(9/10總體積)。混合物于室溫攪拌15分鐘。，乳化:在微流控器的相互作用腔中對獲得的混合物施加剪切力、沖擊力和空化力(15000PSI，8個循環)，以產生亞孩i米液滴(分布在100-200nm之間)。荻得的pH在6.8±0.1之間。除菌過濾:使SB62乳液通過0.22|im膜過濾除菌，將無菌乳化原液冷凍儲存于2-8。C的Cupac容器中。將無菌惰性氣體(氮氣或氬氣)通入SB62乳化半成品容器的死體積達至少15秒。給出的所有成分的量都用于制備50L乳液，并以體積給出。實際上，量以成分的密度計量。PBS的密度被視為等于1。SB62乳液的最終組成如下表5<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>然后將無菌SB62乳化原液無菌分裝入1.25-ml無菌I型玻璃注射器中。每個注射器含34%的體積超出量(335pl總體積)。3)AS03佐劑化裂解病毒疫苗的即時重配。在注射時，含濃縮3價失活裂解病毒體抗原的瓶的內容物借助于含SB62乳液的注射器被取出，接著輕微混合注射器。SB62乳液與疫苗抗原混合重配AS03佐劑。III.2.2.疫苗組成(表6)和給予表6<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>疫苗肌內給予于非慣用臂的三角肌區。密切觀察接種者至少30分鐘，對于給予疫苗后罕有的過敏性反應實施容易利用的適宜醫學治療。111.3.研究群體結果該研究總共招錄了148名受試者49名受試者在FluAS03組，49名受試者在Fluarix組，50名受試者在FIuWVV組。總接種人群的平均年齡在接種時為71.8歲，標準偏差6.0歲。受試者的平均年齡和性別分布在3個疫苗組之間是相似的。111.4.安全性結論在研究群體(即65歲以上的老年人)中給予用AS03佐劑化的流感疫苗是安全的，在臨床上是良好耐受的。111.5.免疫原性結果對總接種人群的免疫原性進行分析。m.5丄體液免疫應答為了評價由AS03佐劑化疫苗誘導的體液免疫應答，計算每個治療組的以下參數(具有95%置信區間)'在第0天和21天時ffl和NI抗體滴度的幾何平均滴度(GMT)*在第0天和21天時中和抗體滴度的幾何平均滴度(GMT)21天時的血清陽轉率(SC),定義為相比于笫0天在笫21天時的血清ffl滴度增加達至少4倍的接種者百分率。21天時的轉變因子，定義為相比于第0天在第21天時針對每種疫苗抹的血清HIGMT的增加倍數。21天時的保護率定義為血清ffl滴度=1:40的接種者百分率。///.5.7J在^勿^凝桌#戎#^吝a)HI幾何平均滴度(GMT)具有95%CI的ffl抗體的GMT示于表7(抗HI抗體的GMT)。3個組中針對所有疫苗抹的接種前抗體GMT處于相同范圍內。在接種后，抗血細胞凝集素抗體水平顯著增加。在接種后有一種趨勢在FluAS03和Fluarix組中針對全部3種疫苗抹的HI抗體的GMT較高，盡管Fluarix組和FIuWVV組之間的95%CI有一些重疊。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>N-結果可用的受試者數目；95%0=95%置信區間；LL-下限；UL-上限;MIN/MAX-最小/最大；PRE-接種前笫0天；PI(D21)-接種后笫21天b)抗HI抗體滴度的轉變因子、血清保護率和血清陽轉率(與人中的保護作用相關)結果示于表8。#f^子代表相比于笫0天在笫21天時針對各個疫苗抹的血清HIGMT的增加倍數。轉變因子根據病毒抹和疫苗由6.1至13.6變化。此轉變因子大大地優于歐洲官方要求的2.0倍GMT增加。i滲謬,舉代表在笫21天時血清HI滴度>40的受試者比例。在研究開始時，所有組的一半受試者(范圍在34.0%-69.4%之間)對所有毒抹都具有保護性抗體水平。在第21天時，3個組中對不同病毒林的血清保護率在88.0%至100%的范圍內。就保護作用而言，這意味著超過88%的受試者在接種后具有>40的血清HI滴度，被認為具有抗3種毒抹的保護作用。該比率大大地優于歐洲官方要求的>60歲老年人群中60%的血清保護率。A，/^餘舉代表相比于第0天在第21天時血清HI滴度具有達至少4倍增加的受試者比例。對3種毒^朱的整體應答率在3個組中基本上是相等的。為了被認為有效和符合歐盟標準，疫苗應當在=60歲的老年人群中誘導超過30%的陽轉率。在該研究中，3個組的陽轉率超過50%。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>N-受試者總數總結'在接種后有一種趨勢在FluAS03和Fluarix組中針對全部3種疫苗抹的HI抗體的GMT較高，盡管Fluarix組和FIuWVV組之間的95。/。CI有一些重疊。'轉變因子根據病毒林和疫苗由6.1至13.6變化。此轉變因子大大優于歐洲官方要求的2.0倍GMT增加。*在笫21天時，3個組中對不同病毒;f朱的血清保護率在88.0%至100%的范圍內。該比率大大優于歐洲官方要求的>60歲老年人群中60%的血清保護率。'在該研究中，3個組的血清陽轉率超過50%。對3種毒林的整體應答率在3個組中基本上是相等的。///.5丄2^和在謬諒產為了更好地表征老年人中針對流感接種的免疫應答，評價針對中和抗原的血清抗體應答。結果示于表9(血清保護率和抗中和抗體滴度的幾何平均滴度(GMT))和表10(在接種后21天抗中和的陽轉率(增加倍數=4))。-險測免疫前和免疫后血清中抗3種流感4朱的中和抗體滴度。測定以下參數*接種前和接種后具有95%置信區間(95%CI)的血清中和抗體的幾何平均滴度(GMT)*在21天時具有95%CI的陽轉率，定義為相比于笫0天在第21天時HI滴度具有達至少4倍增加的接種者百分率。<table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table>組1:Flu疫苗(DFLU58A16)混合佐劑(D621024A8)2x濃縮的Flu疫苗;組2:Flu疫苗(18854B9)Flu疫苗；組3:Flu疫苗(DFLU59A2)FluWW疫苗；N=接種前和接種后結果可用的受試者數目；n-應答者數目；%=應答者百分率(n/Nxl00);95。/。CI-精確的95%置信區間；LL-下限；UL-上限；主要的發現是'對于3種疫苗，在21天時，對兩種A毒抹獲得100%的血清保護率。對于B毒才朱，3組中的血清保護率在92%至100%的范圍內。.接種后，3個組中針對所有毒抹的GMT都有顯著增加。然而，有一種趨勢在FluAS03和Fluarix組中針對全部3個疫苗抹的中和抗體的GMT比在FIuWVV中高，盡管Fluarix組和FIuWVV組之間的95。/。CI有一些重疊。*對于血清陽轉率，針對3種毒抹的總體應答率在3個組中基本上相等。在所有組中，結果都與針對抗血細胞凝集素抗體進行分析所獲得的結果相一致。///.5./.3^^經扇^躇f^i)在糸諒！為了更好地表征在老年人群中對流感接種的免疫應答，評價對神經氨酸酶抗原的血清抗體應答。與ffl抗體滴度類似，測定以下終點GMT(采用對數滴度轉化平均值的反對數).血清陽轉率，定義為相比于第0天在21天時對每種疫苗株的HI滴度具有達至少4倍增加的接種者百分率。在表11(抗NA抗體GMT)和表12(接種后的NA血清陽轉率(第21天)(4倍增加))中顯示了具有95%CI的NI抗體的GMT和血清陽轉率。表ll<table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table>FluAS03:與AS03佐劑(D621024A8)混合的Flu疫苗(DFLU58A16)Fluarix:Flu疫苗(18854B9)FluWVV:FluWW疫苗(DFLU59A2)PRE=接種前，PI(D21)=接種后第21天95%CI、LL和UL-95。/o置信區間、下限和上限表12<table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table>FluAS03:與AS03佐劑(D621024A8)混合的Flu疫苗(DFLU58A16),Fluarix:Flu疫苗(18854B9),FluWW:FluWW疫苗(DFLU59A2)N=接種前和接種后結果可用的受試者數目；n-應答者數目；%=應答者比例(n/Nxl00);95%CI=精確的95%置信區間；LL=下限；UL=上限主要發現是*對血細胞凝集素觀察到的GMT和血清陽轉率的值高于對神經氨狻酶觀察到的值。*在3個組中針對所有疫苗林的接種前抗體GMT都在相同范圍內。在接種后，抗神經氨酸酶抗體水平顯著增加。至于HI抗體滴度，在接種后有一種趨勢在FluAS03和Fluarix組中針對全部3種疫苗抹的HI抗體的GMT較高，盡管Fluarix組和FIuWVV組之間的95%CI有一些重疊。'關于血清陽轉率，在3個組中以及對3種毒抹來說，針對3種毒林的總體應答率基本上是相等的。我們的結果表明，在該研究中抗流感接種的健康老年人發展出針對神經氨酸酶的良好抗體應答，無論哪種流感疫苗。但是，針對神經氨酸酶抗原的應答低于針對血細胞凝集素抗原的應答。in.5.2.細胞免疫應答可在體外再刺激外周血抗原特異性CD4和CD8T細胞，以產生IL-2、CD40L、TNF-a和IFNY,如果與其對應抗原溫育。因此，抗原特異性CD4和CD8T細胞可在常規免疫熒光標記細胞表型以及胞內細胞因子生產后通過流式細胞儀計數。在本研究中，流感疫苗抗原以及來源于特定流感蛋白的肽用作抗原來再刺激流感特異性T細胞。在表13-18中提供了CD4和CD8T細胞應答的結果。表13以產生至少兩種不同細胞因子的細胞表示的抗原特異性CD4T-細胞應答對接種前和接種后的CD40L/IL2/TNF-a/IFN-Y的描述性統計(總接種A^)<table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table>.00組l:FluAS03:Flu疫苗Fluarix,與AS03佐劑混合組2:Fluarix:Flu疫苗FluarixTM組3:FIuWVV:FluWVV疫苗SD-標準偏差；Min、Max-最小，最大Ql-笫一四分位數；Q3-第三四分位數N-結果可用的受試者數目P-值=Kruskall-Wallis檢驗(非參數方法)，測試3組之間于笫21天時的局部差異(Wilcoxon秩和檢驗)表14以產生至少兩種不同細胞因子的細胞表示的抗原特異性CD4T-細胞應答對接種前和接種后U:的描述性統計(總接種人群)<table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table>表15以產生至少CD40L和另一種細胞因子的細胞表示的抗原特異性CD4T-細胞應答對接種前和接種后M的描述統計(總接種人群)<table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table>表16已產生至少IFNy和另一種細胞因子的細胞表示的抗原特異性CD4T-細胞應答對接種前和接種后^的描述統計(總接種A^)<table>complextableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table>表17以產生至少IL2和另一種細胞因子的細胞表示的抗原特異性CD4T-細胞應答對接種前和接種后M的描述統計(總接種人群)<table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table>表18以產生至少TNFa和另一種細胞因子的細胞表示的抗原特異性CD4T-細胞應答對接種前和接種后i^的描述統計(總接種人群)<table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table>結果還表示為CD4或CD8T細胞亞群中細胞因子陽性的CD4或CD8T細胞的頻率，并示于圖4和圖5。在相似的分析中，使用漂移林(A/HlNl/北京/262/95(HlNld)、A/H3N2/悉尼/5/97(H3N2d)、B/山梨/166/98(Bd》或轉換林(A/新加坡/1/:57(H2N2)、A/香港/1073/99(H9N2》的流感抗原評價交叉反應性CD4T-細胞應答。結果表示為細胞因子陽性的CD4T細胞的頻率，示于圖6。主要發現是'用Fluarix和全病毒接種稍孩b^強CD4T-細胞應答。用FluAS03接種誘導強CD4T-細胞應答(圖4)，其在統計學上是顯著的。在用裂解抗原或全病毒在體外刺激后得出相同的結論，對研究的所有細胞因子(IL-2、IFNy、TNFoc和CD40L)也是如此。'大部分個體具有抗全流感病毒的CD8T-細胞應答，但是接種對CD-8T細胞應答沒有可檢測的影響(即接種前=接種后)，無論哪一個研究組(圖5)。用Fluarix接種僅誘導低水平的交叉反應性CD4T-細胞應答(圖6)。用FluAS03接種誘導抗漂移流感抹的強CD4T-細胞應答，其在統計學上是顯著的(圖6)。基本沒有檢測到抗轉換抹的應答。III.5.3.B-細胞ELISPOT記憶瓜5.3J踏為了更好地表征由AS03佐劑化流感疫苗誘導的CMI應答，評價使用流感疫苗抹或抗人免疫球蛋白體外誘導分化為漿細胞的B-細胞Elispot記憶應答，以便計數抗流感或分泌IgG的漿細胞。結果描述于表19和表20以及圖7。選擇22名首次接受1劑FluAS03疫苗的受試者和21名首次接受1劑Fluarix疫苗的受試者中的一部分，以使用B-細胞記憶Elispot技術評價接種對流感特異性記憶B細胞的影響。測定以下終點*在笫0天和第21天已通過B-細胞Elispot檢測了所有受試者中的流感特異性記憶B細胞。結果表示為每百萬個(106)抗體形成細胞中流感特異性抗體形成細胞的頻率。'接種后(第21天)和接種前(笫0天)之間的差異也表示為每百萬個(l06)抗體形成細胞中流感特異性抗體形成細胞的頻率。各個接種組在第0天和笫21天的描述統計表示為每百萬(106)個抗體形成細胞中流感特異性抗體形成細胞的頻率。第21天和第0天之間(接種后-接種前)個體差異的描述統計為每百萬(106)個抗體形成細胞中流感特異性抗體形成細胞的頻率。Wilcoxon檢驗用于對比兩個組之間的局部差異，計算針對3種毒4朱(A/新喀里多尼亞、A/巴拿馬和B/山東)中的每種的統計學p-值。///.5.3j潛^相比于Fluarix組，存在一種有利于AS03佐劑化流感疫苗的趨勢。對于A/新喀里多尼亞抹，相比于Fluarix存在有利于FluAS03的統計學顯著差異(p-值-0.021)。對于A/巴拿馬和B/山東抹沒有觀察到兩個組之間的統計學差異。表19B-細胞記憶對接種前(第0天)和接種后(第21天)的描述統計以及106個產IgG漿細胞(一部分受試者)中抗原-漿細胞的接種后(第21天)頻率的推論統計<table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table>組1:Flu疫苗Fluarix+AS03水包油乳液佐劑組2:Flu疫苗FluarixSD=標準偏差Min、Max-最小，最大Ql=第一四分位數Q3-第三四分位數N-結果可用的受試者數目P-值-Wilcoxon檢驗(非參數方法)，測試第21天時2組之間的局部差異(Wilcoxon秩和檢驗)。表20B-細胞記憶對106個產IgG漿細胞(一部分受試者)中抗原特異性漿細胞頻率在接種后(第21天)和接種前(第0天)之間的差異的描述統計和推論統計<table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table>組1:Flu疫苗Fluarix+AS03水包油乳液佐劑組2:Flu疫苗FluarixTMSD=標準偏差Min、Max-最小，最大Ql-第一四分位數Q3-第三四分位數N-結果可用的受試者數目P一直-Wilcoxon檢驗(非參數方法)，測試第21天時2組之間的局部差異(Wilcoxon秩和檢驗)。III.6.整體結論m.6丄反應原性和安全性結果盡管流感免疫顯著降低了肺炎和相關死亡的風險，但老年人接種僅提供了23-72%的抗流感疾病的保護作用。疫苗抗原和有效佐劑的制劑是一種增強對亞單位抗原的免疫應答的有吸引力方法。本研究設計用于評價(l)用水包油乳液即AS03佐劑化的流感疫苗在健康老年人中安全性和反應原性，(2)抗體和細胞介導的免疫應答。反應原性數據表明，用AS03佐劑化的流感疫苗比其它兩種疫苗誘發更多的局部和全身癥狀。但是，對于主動訴求的不良事件，未觀察到3種疫苗之間的差異。由這些結果可得出結論，候選疫苗的反應原性和安全性是令人滿意的，在臨床上是可接受的。III.6.2.免疫原性結果就免疫應答而言，3種疫苗超出了歐洲官方對每年注冊的裂解病毒體流感疫苗的要求("關于協調流感疫苗要求的指引說明"，用于免疫學評價年度毒抹變化-CPMP/BWP/214/96)。在本研究中測試的3種流感疫苗在健康老年人中是免疫原性的，這些老年人對流感血細胞凝集素和中和抗原發展出良好的抗體應答(表21)。表21<table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table>對于細胞介導的免疫(CMI)應答，用AS03佐劑化的流感疫苗誘導的CD4應答(包括漂移林)顯著強于其它兩種疫苗(Fluarix和全流感病毒疫苗)。但是，接種對CD8應答沒有可檢測的影響。關于B細胞記憶應答，相比于無佐劑疫苗，存在有利于有佐劑流感疫苗的趨勢。實施例IV—用含裂解流感抗原制備物和AS03佐劑的疫苗在65歲以上的老年人群中的臨床實驗一Explo-Flu-002為評《介含佐劑AS03的GlaxoSmithKlineBiologicals流感4美選疫苗在先前于2003年在Explo-Flu-OOl臨床實驗中接種候選疫苗的65歲以上老年人群中的反應原性和免疫原性，已進行了開放、可控的I/II期研究。對于免疫原性和安全性評價，FluarixTM疫苗(在比利時稱為a-rixTM)已用作參比。IV.l.目標在肌內給予1劑AS03佐劑化的疫苗之后21天，檢測體液免疫應答(即抗血細胞凝集素抗體滴度)和細胞介導的免疫應答(CD4和/或CD8T細胞應答)和B記憶細胞應答。FluarixTM用作參比。目標是1)確定AS03佐劑化的Flu(40名受試者)相對于Fluarix(18名受試者)是否證實了其對CD4-和/或CD8-介導的流感抗原接種個體的免疫性的最強免疫刺激活性；2)使用縱向分析研究AS03做佐劑對2004年接種前的免疫應答(正是2003年首次接種后1年的應答)的影響。IV.2.研究設計、疫苗組成和終點■40名〉65歲的受試者，他們先前在2003年的Explo-Flu-OOl臨床實驗中接受了1劑AS03佐劑化的流感疫苗(FluAS03)。■1個約20名65歲以上受試者的對照組，他們先前在2003年的Explo-Flu-OOl臨床實驗中接受了1劑FluarixTM(Fluarix)。IV.2丄疫苗組成疫苗組成類似于用于研究Explo-Flu-001的疫苗組成，只是包含在疫苗(2004年疫苗)中的流感抹不同。毒;f朱如下A/新嚷里多尼亞/20/99(IVR-116)(H1N1)=A/新喀里多尼亞/(HlNl)-類似毒林A/懷俄明/3/2003(X-147)(H3N2)=A/福建(H3N2)-類似毒抹B/江蘇/10/2003=B/上海-類似毒抹IV.2.2.免疫原性(ffl)終點GMT(采用對數滴度轉化平均值的反對數)'轉變因子(相比于笫0天在笫21天時血清HIGMT的增加倍數)'血清陽轉率(相比于第0天在第21天時對每種疫苗抹的HI滴度具有達至少4倍增加的接種者百分率)'保護率(在第21天時血清HI滴度>1:40的接種者百分率)IV.2.3.CMI-終點在第O天和笫21天每106個細胞中針對4種不同細胞因子的細胞因子陽性CD4/CD8細胞的頻率。每個測試都定量針對以下的CD4/CD8T細胞應答b以下3種抗原的混合物國新喀里多尼亞抗原麗懷-賊明抗原b江蘇^元原在5種不同測試(細胞因子)中由以下表示的抗原特異性CD4T細胞和CD8T細胞應答1.產生至少兩種不同細胞因子(CD40L、IL-2、IFNy、TNFa)的細胞2.產生至少CD40L和另一種細胞因子(IL-2、TNFa、IFN力的細胞3.產生至少IL-2和另一種細胞因子(CD40L、TNFot、IFN力的細胞4.產生至少IFNy和另一種細胞因子(IL-2、TNFa、CD40L)的細胞5.產生至少TNFa和另一種細胞因子(IL-2、CD40L、IFNy)的細胞IV.2.4.CMI分析首個CM分析基于總接種人群(FluAS03組N-40名受試者，Fluarix組N=18名受試者)。縱向分析基于Explo-Flu-OOl(裂解蛋白)和Explo-Flu-002(混合的flu抗原)研究的動態人群園接種前FluAS03組N=36名受試者，Fluarix組N=15名受試者。畫接種后-接種前FluAS03組N=34名受試者，Fluarix組N=15名受試者。(a)通過對每種抗原、每種細胞因子、每個疫苗組和每個時間點(接種前和接種后)的描述統計總結CD4/CD8T-淋巴細胞分泌應答的頻率。(b)對每種抗原、每種細胞因子和每個疫苗組在時間點(接種前和接種后)之間的個體應答差異的描述統計制表。(c)對于接種后和(接種后-前)的時間點，使用非參數Wilcoxon檢驗比較兩個疫苗組之間的局部差異，并就4種不同細胞因子計算以下的統計學p-值-針對新喀里多尼亞、懷俄明、江蘇和3種毒抹混合物的CD4T-細胞應答-針對新喀里多尼亞、懷俄明、江蘇和3種毒抹混合物的CD8T-細胞應答(d)非參數檢驗(Wilcoxon-檢驗)還用于-依據各個疫苗組中Explo-Flu-OOl和Explo-Flu-002之間特異性CD4的頻率，研究接種前(第O天)免疫應答的動力學-依據在Explo-Flu-001和Explo-Flu-002研究的每一個中2個疫苗組之間的特異性CD4的頻率，研究接種前(第0天)免疫應答的動力學-依據各個疫苗組中Explo-Flu-001和Explo-Flu-002之間特異性CD4的頻率差異(接種后-接種前)，研究免疫應答的動力學國依據在Explo-Flu-001和Explo-Flu-002研究的每一個中2個疫苗組之間的特異性CD4的頻率差異(接種后-接種前)，研究免疫應答的動力學所有顯著性檢驗都是雙尾的。小于或等于0.05的P-值被認為是統計學顯著的。IV.3.結果結果表示為CD4或CD8T細胞亞群中細胞因子陽性CD4或CD8T細胞的頻率。IV.3丄抗原特異性CD4T-淋巴細胞通過對每種抗原、每種細胞因子、每個疫苗組和每個時間點(接種前和接種后)的描述統計總結抗原特異性CD4T-淋巴細胞分泌應答的頻率。在表22中顯示了對于每種抗原、各5種不同的細胞因子和每個疫苗組在時間點(接種后-接種前)之間CD4T-淋巴細胞應答個體差異的描述統計。表22接種后(在第21天)和接種前(在第0天)之間抗原特異性CD4T-淋巴細胞應答差異的描述統計(總接種人群)<table>tableseeoriginaldocumentpage84</column></row><table>SD=標準偏差Min、Max-最小,最大Ql-第一四分位數03=第三四分位數N=結果可用的測試受試者的數目疫苗誘導的CD4T細胞顯示出能夠持續至少1年，因為用Fluarix接種的個體和前一年用Fluarix/AS03接種的個體之間相比，接種前CD4T-細胞應答水平存在可觀測的差異。結果還示于圖8，表明了再接種之前和之后針對裂解流感病毒抗原的CD4T-細胞應答。DO對應于首年接種后12個月，因此指示持續性。相比于接種后2個組之間抗原特異性CD4T-淋巴細胞的頻率差異(依據Wilcoxon檢驗)，幾乎所有的p-值都小于0.05，在統計學上被認為是顯著的(參見表23),這有利于FluAS03組。表23推論統計在第21天來自Wilcoxon秩和檢驗的2個疫苗組之間抗原特異性CD4T-淋巴細胞應答的p值(總接種人群)<table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table>P-值Wilcoxon檢驗(非參數方法)測試第21天時2個組之間的局部差異(Wilcoxon秩和檢驗)。通過Wilcoxon檢驗對比2個組之間抗原特異性CD4-T淋巴細胞應答頻率的個體差異(接種后-接種前)，以下抗原-細胞因子組合出現小于0.05并被認為是統計學顯著的p-值混合的流感病毒抗原-alldouble、混合的流感病毒抗原-IFNY和江蘇-IFNy,這有利于FluAS03組(表24)。表24推論統計通過Wilcoxon秩和檢驗計算的不同組之間抗原特異性CD4T-淋巴細胞應答在接種后(第21天)和接種前(第0天)之間差異的p值(總接種人群)<table>tableseeoriginaldocumentpage86</column></row><table>P-值Wilcoxon檢驗(非參數方法)測試2個組之間的局部差異(Wilcoxon秩和檢驗)。IV.3.2.抗原特異性CD8T-淋巴細胞通過對每種抗原、每種細胞因子、每個疫苗組和每個時間點(接種前和接種后)的描述統計總結抗原特異性CD8T-淋巴細胞分泌應答的頻率，類似于對CD4T細胞應答采用的方法。通過Wilcoxon檢驗對比接種后2個組之間抗原特異性CD8T-淋巴細胞的頻率差異，所有p-值都高于0.05，被認為不是統計學顯著的。通過Wilcoxon檢驗對比2個組之間抗原特異性CD8T-淋巴細胞應答頻率的個體差異(接種后-接種前)，所有p-值都高于0.05,被認為不是統計學顯著的。IV.3.3.動力學分析接種前(于2003年首次接種后l年)的免疫應答通過對表25中每種細胞因子和每個疫苗組和兩個研究的每一個的描述統計、對表27中的兩個研究的每一個和每個疫苗組的描述統計，總結接種前抗原特異性CD4T-淋巴細胞分泌應答的頻率。推理統計在表16和表28中給出。表25對接種前(第0天)特異性CD4T淋巴細胞應答接種的描述統計(動力學)<table>tableseeoriginaldocumentpage87</column></row><table>SD-標準偏差Min、Max=最小，最大Ql=第一四分位數Q3-第三四分位數N-結果可用的受試者數目通過Wilcoxon檢驗對比2個研究之間各個疫苗組的抗原特異性CD4T-淋巴細胞的頻率差異，僅對于FluAS03組和采用TNFa纟田月包因子的情況出現小于0.05并被認為是統計學顯著的p-值(有利于Explo-Flu-002)(參見表26)。表26推理統計來自Wilcoxon秩和檢驗的不同研究之間第0天抗原特異性CD4T-淋巴細胞應答的p-值(動力學)<table>tableseeoriginaldocumentpage88</column></row><table>P-值Wilcoxon檢驗(非參數方法)測試2個組之間在第21天的局部差異(Wilcoxon秩和檢驗)。表27對接種前(第0天)特異性CD4T淋巴細胞應答接種的描述統計(動力學)<table>tableseeoriginaldocumentpage88</column></row><table>Min、Max:最小，最大Ql=第一四分位數Q3=第三四分位數N-結果可用的受試者數目通過各個研究的Wilcoxon檢驗對比2個疫苗組之間抗原特異性CD4T-淋巴細胞頻率的差異，Explo-Flu-002的所有p值都小于0.05，被認為是統計學顯著的(有利于FluAS03)(參見表28)。表28推理統計來自Wilcoxon秩和檢驗的不同組之間第21天抗原特異性Cn4T-淋巴細胞應答的p-值(動力學)<table>tableseeoriginaldocumentpage89</column></row><table>P-值Wilcoxon檢驗(非參數方法)測試2個組之間在第21天的局部差異(Wilcoxon秩和4企驗)。IV.3.4.動力學分析接種后減去接種前的免疫應答通過對表29中每種細胞因子和每個疫苗組和每個研究的描述統計、對表31中的每個研究和每個疫苗組的描述統計，總結在(接種后-接種前)時間點的抗原特異性CD4T-淋巴細胞分泌應答的頻率。推理統計在表30和表32中給出。表29接種后(第21天)和接種前(第0天)之間特異性CD4T淋巴細胞應答接種的描述統計(動力學)<table>tableseeoriginaldocumentpage90</column></row><table>SD=標準偏差Min、Max:最小，最大Ql=第一四分位數03=第三四分位數N-結果可用的受試者數目通過各個疫苗組的Wilcoxon檢驗對比2個研究之間抗原特異性CD4T-淋巴細胞頻率的差異，FluAS03組的所有p-值都小于0.05，被認為是統計學顯著的(有利于Explo-Flu-001)(參見表30)。表30對接種后(第21天)和接種前(第0天)之間差異的推理統計來自Wikoxon秩和檢驗的不同研究之間第21天抗原特異性CD4T-淋巴細胞應答的p-值(動力學)<table>tableseeoriginaldocumentpage91</column></row><table>P-值Wilcoxon檢驗(非參數方法)測試2個組之間第21天的局部差異(Wilcoxon秩和檢驗)。表31對接種后(第21天)和接種前(第0天)之間特異性CD4T淋巴細胞應答接種差異的描述統計(動力學)<table>tableseeoriginaldocumentpage91</column></row><table>Min、Max-最小，最大Ql-第一四分位數Q3-第三四分位數N-結果可用的受試者數目通過各個研究的Wilcoxon檢驗對比2個疫苗組之間抗原特異性CD4T-淋巴細胞頻率的差異，僅Explo-Flu-001的p值小于0.05，被認為是統計學顯著的(有利于FluASO"(參見表32)。表32推理統計來自Wilcoxon秩和檢驗的不同組之間第21天抗原特異性CD4T-淋巴細胞應答的p-值(動力學)<table>tableseeoriginaldocumentpage92</column></row><table>P-值Wilcoxon檢驗(非參數方法)測試2個組之間在笫21天的局部差異(Wilcoxon秩和檢驗)。IV.4.HI滴度結果示于圖9和表33-36。表33:抗HI滴度的幾何平均滴度(GMT)和血清陽性率(GMT針對接種的受試者計算)<table>tableseeoriginaldocumentpage93</column></row><table>PRE-接種前PI(D21)-接種后21天95%CI、LL和化=95%置信區間、下限和上限S+=血清陽性受試者的數目表34:抗HI滴度的轉變因子(所有接種的受試者)<table>tableseeoriginaldocumentpage93</column></row><table>N-受試者總數GMR=幾何平均比率(第21天/第0天滴度比率的平均對數的反對數)95%。1=95%置信區間表35:抗HI滴度的血清保護率(所有接種的受試者)<table>tableseeoriginaldocumentpage94</column></row><table>PRE-接種前PI(D21)-接種后21天N-結果可用的受試者數目n=滴度在特定范圍內的受試者數目%=滴度在特定范圍內的受試者百分率表36:在PI第21天的血清陽轉率(增加倍數-4)(全部接種的受試者)<table>tableseeoriginaldocumentpage94</column></row><table>N=接種前和接種后結果可用的受試者數目n-應答者數目%=應答者比例(n/Nx100)95%CI=精確的95%置信區間；LL=下限，UL=上限IV.5.整體結論由此臨床研究證實，就流感特異性CD4T細胞的頻率而言，也就至再接種研究DO(ExploFlu002,即±1年后)為止首次Flu-AS03接種(在ExploFlu001中的初免接種)激發的免疫應答的持久性而言，有佐劑疫苗Flu-AS03優于對等的無佐劑疫苗Fluarix。而且，該應答能夠識別新疫苗中存在的漂移流感林，并識別2004年流感疫苗的毒抹。與第一年接種相反，再接種時先前用有佐劑FluarixTM接種的個體時顯示出比無佐劑FluarixTM接種的個體增加的HI滴度響應性。可觀察到一種趨勢抗H1N1和H3N2毒抹的HI滴度增加至I.5-2倍，抗B毒株的ffl滴度具有已表明的統計學增加。實施例V—有佐劑和無佐劑的流感疫苗在雪貂中的臨床前評價第一個研究-新制劑AS03和AS03+MPL的效力V.l.基本原理和目標就感染的敏感性和臨床應答這二者而言，雪貂模型中的流感感染酷似人流感。在先前未進行病毒棘免疫的情況下，雪貂對曱型流感和乙型流感這二者的感染極為敏感。因此，其為研究由給予的流感疫苗賦予的保護作用提供了極佳的模型系統。該研究研究了有佐劑或無佐劑的各種3價裂解疫苗對用同源毒棘攻擊的雪貂的減少病征(體溫)和鼻分泌物中病毒脫落的效力。該實驗的目標是表明有佐劑流感疫苗相比于普通(無佐劑)疫苗的效力。終點是1)主要終點減少同源攻擊后鼻清洗液中的病毒脫落；2)次要終點通過IHA分析體液應答以及監測初免和攻擊前后的溫度。V.2丄治療/組另，K表37)由MISAYConsultancy(Hampshire,UK)獲得14-20周齡的雌性雪貂(地中海雪貂(M"We/a;wton^/wra))(6只雪貂/組)。雪貂在第0天用異種亞型毒抹H1N1A/斯德哥爾摩/24/90(4LogTCID5。/ml)初免。在第21天，用全人劑量(500嗎疫苗劑量，15(tigHA/毒林)的H1N1A/新喀里多尼亞/20/99、H3N2A/巴拿馬/2007/99和B/山東/7/97的組合肌內注射雪貂。然后在第41天通過鼻內途徑用同型毒林H:3N2A/巴拿馬/2007/99(4.51LogTCID5。/ml)攻擊雪貂。表37<table>tableseeoriginaldocumentpage96</column></row><table>V.2.2.疫苗制劑的制備辨麻/.'三,"#遞^￡炎/力賴;#(^"http:///」,將PBS10倍濃縮液(l倍濃縮時為pH7.4)以及含Tween80、TritonX-100和VES的混合物(量計入毒抹中存在的去污劑)加入注射用水中。達到的去污劑量如下每1ml有750嗎Tween80、110嗎TritonX-100和100嗎VES。攪拌5分鐘后，按順序加入15昭每種毒抹H1N1、H3N2和17.5嗎B毒抹，每次加入之間攪拌10分鐘。制劑于室溫攪拌15分鐘，如果不立即給予的話則儲存于4'C。^M滯3炎^^^三,襲席^感浙W(^^///」.'將PBS10倍濃縮液(l倍濃縮時為pH7.4)以及含Tween80、TritonX-100和VES的混合物(量計入毒林中存在的去污劑)加入注射用水中。達到的去污劑量如下每1ml有750Tween80、110pgTritonX-100和100嗎VES。攪拌5分鐘后，加入15iag每種毒株HlNl、H3N2和17.5昭B毒抹，每次加入之間攪拌10分鐘。攪拌15分鐘后，加入250jilSB62乳液(如在實施例II.l中的教導制備)。于室溫攪拌制劑15分鐘，如果不立即給予的話則儲存于4。C。浙浙3.'^^幼3佐w必W三,襲庫^:感賴浙將PBSIO倍濃縮液(I倍濃縮時為pH7.4)以及含Tween80、TritonX-100和VES的混合物(量計入毒抹中存在的去污劑)加入注射用水中。達到的去污劑量如下每1ml有750嗎Tween80、110TritonX-100和100jigVES。攪拌5分鐘后，加入15昭每種毒抹HINI、H3N2和17.5昭B毒林，每次加入之間攪拌10分鐘。攪拌l5分鐘后，加入250|ilSB62乳液(如在實施例III中的教導制備)。再攪拌混合物15分鐘，之后由如實施例11.3.1的教導制備的懸浮液立即加入25|igMPL。于室溫攪拌制劑15分鐘，如果不立即給予的話則儲存于4'C。備注在每種制劑中，加入PBSIO倍濃縮液至等滲，在最終體積中為1倍濃縮液。計算H20體積以達到目標體積。V.2.3.解讀(表38)表38<table>tableseeoriginaldocumentpage97</column></row><table>111=單獨的/0=混合的V.3.結果結果的示意圖在圖IO和圖11中給出。V.3丄溫度監測用傳感器并通過遙測記錄(按照在1.2.2中詳述的方法)監測個體溫度。檢查和整修所有植入物，在放入腹腔之前通過DSI進行新校準。在這些檢測期間所有動物都獨立地圈養在單獨的籠中。在攻擊前3天直至攻擊后5天每15分鐘記錄溫度，由日中計算出平均值。基線至基線體溫的結果示于圖10A(顯示了-]至+3天的結果)和10B(顯示了-2至+3天的結果)。在攻擊后，僅在用三價裂解普通疫苗或PBS免疫后觀察到體溫峰值。在用AS03或AS03+MPL佐劑化的三價裂解疫苗免疫后未觀察到峰值。V.3.2.病毒脫落(圖11)對每組6只動物進行鼻清洗液的病毒滴定。通過在清醒動物的兩個鼻孔中給予5mlPBS進行鼻清洗。將接種物收集在培養皿中，并置于-80。C(干冰)的樣品容器中。所有鼻樣品都首先通過SpinX濾器(Costar)除菌過濾，以去除任何細菌污染。將50)Lil連續10倍稀釋的鼻清洗液轉移至含50pl培養基(IO孔/稀釋度)的微量滴定板中。然后將100julMDCK細胞(2.4x105個細胞/ml)加入每個孔，并于35。C溫育，直至對照細胞達到細胞匯合，例如5-7天。在6-7天溫育后，小心地取出培養基，加入100ial含1/20WST-的培養基，再溫育18小時。在存活細胞還原WST-1時產生的黃色甲臘染料的強度與病毒滴定實驗結束時存在于孔中的存活細胞數成比例，并通過在合適波長(450nm)檢測各孔的吸光度定量。截取值定義為未感染對照細胞的OD平均值一0.3OD(0.3OD相當于未感染對照細胞OD±3個標準偏差)。OD〈截取值時定義為陽性得分，相反，OD〉截取值時定義為陰性得分。病毒脫落滴度通過"ReedandMuench"測定，并表示為LogTCID50/m。相比于三價裂解普通疫苗或PBS,在用AS03或ASO3+MPL佐劑化的三價裂解疫苗攻擊后觀察到較低的病毒脫落。采用AS03的保護作用比AS03+MPL稍好(參見攻擊后第2天)。由于每組的動物數量少，所以不能確定統計學顯著性。V.3.3.實驗結論相比于三^r裂解普通疫苗，用AS03或AS03+MPL佐劑化的三價裂解疫苗觀察到針對全部3種毒抹的較高體液應答(HI滴度)(對3種毒抹中的2種(即tBN2和B毒抹)至少為2倍)。就在雪貂中的保護效力而言，AS03和AS03+MPL制劑顯示出額外的利益(較低的病毒脫落和溫度)(圖10和11)。攻擊后，用AS03或AS03+MPL佐劑化的三價裂解疫苗免疫后沒有觀察到體液應答的加強。第二個研究一在雪貂中的異型攻擊研究表明測試的新制劑的效力V.4.基本原理和目標本研究通過減輕病征(體溫)的能力及其對異源攻擊后免疫雪貂鼻分泌物中的病毒脫落的作用，研究了有佐劑或無佐劑的各種三價裂解疫苗的效力。V.5.實驗設計由MISAYConsultancy(Hampshire,UK)獲得14-20周齡的雌性雪貂(地中海雪貂(MwWe/a;wtont^/wro))(6只雪貂/組)。測試4個小組*Fluarix*三價裂解疫苗AS03*三價裂解疫苗AS03+MPL*PBS雪貂在第0天用異種亞型毒抹H1N1A/斯德哥爾摩/24/90(4LogTCIDVml)初免。在第21天，用全人劑量(500嗎疫苗劑量，15昭HA/毒抹)的H1N1A/新喀里多尼亞/20/99、H3N2A/巴拿馬/2007/99和B/山東/7/97(17.5ngHA)的組合肌內注射雪貂。然后在第43天通過鼻內途徑用異種亞型毒林H3N2A/懷俄明/3/2003(4.51LogTCID50/ml)攻擊雪貂。V.6.結果結果的示意圖在圖12和圖13中給出。V.6丄溫度監測在攻擊期間用傳感器并通過遙測記錄監測個體溫度。檢查和整修所有植入物，在放入腹腔前通過DSI進行新校準。在這些檢測期間所有動物都獨立地圏養在單獨的籠中。結果(圖12)表明-在初免前后觀察一組與另一組之間的高可變性。基線看起來在初免前比初免后高。-盡管體溫存在高可變性，但僅在PBS(6/6雪貂)、三價裂解普通疫苗(5/6雪貂)和AS03佐劑化三價裂解疫苗(2/6雪貂)免疫的雪貂中于攻擊后觀測到峰值。在用AS03+MPL佐劑化三價裂解疫苗免疫后未觀測到峰值(0/6雪貂)。畫就發熱預防而言，抗異源毒株AS03看起來不如AS03+MPL有效。我們不能斷定佐劑間差異是源于不同的攻擊前抗體水平的可能性。V.6.2.病毒脫落(圖13)通過在清醒動物的兩個鼻孔中給予5mlPBS進行鼻清洗。將接種物收集在培養皿中，并置于-80。C(干水)的樣品容器中。所有鼻樣品都首先通過SpinX濾器(Costar)除菌過濾，以去除任何細菌污染。將50pl連續10倍稀釋的鼻清洗液轉移至含50pi培養基(IO孔/稀釋度)的微量滴定板中。然后將100jilMDCK細胞(2.4x105個細胞/ml)加入每個孔，并于35。C溫育，直至對照細胞達到細胞匯合，例如達5-7天。在6-7天溫育后，小心地取出培養基，加入100ju含1/20WST-1的培養基，再溫育18小時。在存活細胞還原WST-1時產生的黃色曱臘染料的強度與病毒滴定實驗結束時存在于孔中的存活細胞數成比例，并通過在合適波長(450nm)檢測各孔的吸光度定量。截取值定義為未感染對照細胞的OD平均值一0.3OD(0.3OD相當于未感染對照細胞OD士3個標準偏差)。OD〈截取值時定義為陽性得分，相反，OD〉截取值時定義為陰性得分。病毒脫落滴度通過"ReedandMuench"測定，并表示為LogTCID50/ml。*充者的4毒應漆檢測初免前第1天至初免后第7天l2只血貂的病毒脫落。結果以混合方式表示。在初免后7天觀測所有雪貂中的病毒清除。攻擊/^的病#應',檢測6只雪貂/租由攻擊前1天至攻擊后7天的病毒脫落。攻擊后2天，相比于用三價裂解普通疫苗和PBS免疫的雪貂，在用AS03和AS03+MPL佐劑化三價裂解疫苗免疫的雪貂中觀測到統計學顯著較低的病毒滴度(與普通疫苗相比，佐劑組AS03/AS03+MPL的差異分別為1.25/1.22log和1.67/1.64log)。在第50天，在鼻清洗液中未檢測到病毒。V.6.3.血凝反應抑制測試(HI滴度X圖14A和B)在初免前1天、初免后21天、免疫后22天和攻擊后14天收集血清樣品。使用血凝反應抑制測試(HI)測定針對H3N2流感病毒(疫苗抹和攻擊抹)的抗血細胞凝集素抗體滴度。HI測試的原理是基于特異性抗流感抗體通過流感病毒血細胞凝集素(HA)抑制小雞紅細胞(RBC)的血凝反應的能力。血清首先用25。A神經氨酸酶溶液(RDE)處理，并熱失活，以去除非特異性抑制劑。預處理后，將2倍稀釋度的血清與4個血凝單位的每種流感毒抹溫育。然后加入小雞紅細胞，并記錄凝集抑制。滴度表示為完全抑制血凝反應的最高血清稀釋度的倒數。由于第一個血清稀釋度為1:10,所以將不可檢測的水平記錄為等于5的滴度。潛果'結果示于圖14A和14B。在用H3N2A/巴拿馬免疫后，在用AS03或AS03+MPL佐劑化三價裂解疫苗免疫的雪貂中觀測到的體液應答(HI滴度)比用無佐劑(普通)三價裂解疫苗(FluarixTM)免疫雪貂后觀測到的體液應答高。在用AS03或AS03+MPL佐劑化的H3N2A/巴拿馬免疫的雪貂中觀測到相似的HI滴度。僅在用AS03或AS03+MPL佐劑化的含A/巴拿馬H3N2毒抹的疫苗免疫后，觀測到針對異源毒抹A/懷俄明H3N2的交叉反應性HI滴度(在用三價裂解普通疫苗免疫后未觀測到)。在用異源毒抹A/巴拿馬H3N2免疫并用A/懷俄明H3N2攻擊的雪貂中觀測到A/懷俄明特異性HI滴度的增強。正如所料，與同源攻擊相反，異源攻擊導致用AS03和AS03+MPL佐劑化的A/巴拿馬H3N2免疫的雪貂中A/巴拿馬特異性HI滴度增加。V.6.4.該實驗的結論正如所料，與同源攻擊后的情況(無加強)相比，在異源攻擊后觀測到抗H3N2HI滴度的加強。但是，在異源和同源攻擊后觀測到相似的保護作用(病毒脫落)。實施例VI—有佐劑和無佐劑的流感疫苗在CWBI/6初免小鼠中的臨床前評價VI丄實驗設計和目標與Fluarix普通(無佐劑)疫苗相比，在Explo-Flu-001臨床研究(參見實施例III)中觀察到針對三價流感裂解疫苗AS03的CD4T細胞應答顯著較高。在這兩個組之間未觀察到CD8T細胞和體液應答這二者的差異。目標是選擇解讀方式，以在小鼠中誘導類似于人中觀察到的CMI應答。具體地說，目標是通過^f吏用裂解疫苗AS03或裂解疫苗AS03+MPL在小鼠中顯示出比裂解普通疫苗高的CMI應答。VU丄治療/組別由HarlanHorst,Netherland獲得6-8周齡的雌性C57BI/6小鼠(15只小鼠/組)。測試組是-三價裂解普通疫苗-三價裂解疫苗AS03-三價裂解疫苗AS03+MPL-PBS小鼠在第O天用異種亞型毒林(5figHA全失活H1N1A/約翰內斯堡/82/96、H3N2A/悉尼/5/97、B/哈爾濱/7/94)初免。在第28天，用1.5卩igHA三價裂解疫苗(A/新喀里多尼亞/20/99、A/巴拿馬/2007/99、B/山東/7/97)普通疫苗或有佐劑疫苗(參見以下組另'0肌內注射小鼠。VI丄2.疫苗制劑的制備在每種制劑中，加入PBSIO倍濃縮液以達到等滲，在最終體積中為1倍濃縮液。曱酸H20體積以達到目標體積。襲，三,普遞(^E炎籾纖'制劑1(達500將PBS10倍濃縮液(l倍濃縮時為pH7.4)以及含Tween80、TritonX-100和VES的混合物(量計入毒抹中存在的去污劑)加入注射用水中。達到的去污劑量如下每1ml有750jigTween80、110jigTritonX-100和100jigVES。5分鐘攪拌后，加入15pg每種毒林HlNl、H3N2和B，每次加入之間攪拌10分鐘。制劑于室溫攪拌15分鐘，如果不立即給予的話則儲存于4°C。^/;^S^^濕炎^j朋3佐身化的襲席；,賴刺.'將PBSIO倍濃縮液(I倍濃縮時為pH7.4)以及含Tween80、TritonX-100和VES的混合物(量計入毒林中存在的去污劑)加入注射用水中。達到的去污劑量如下每1ml有750|ugTween80、110|igTritonX-100和100嗎VES。攪拌5分鐘后，加入15昭每種毒抹H1N1、H3N2和B，每次加入之間攪拌10分鐘。攪拌15分鐘后，加入250^SB62乳液(如在實施例I1.1中的教導制備)。于室溫攪拌制劑15分鐘，如果不立即給予的話則j諸存于4'C。^j幼3佐^^的三,襲席賴^/將PBSIO倍濃縮液(I倍濃縮時為pH7.4)以及含Tween80、TritonX-100和VES的混合物(量計入毒抹中存在的去污劑)加入注射用水中。達到的去污劑量如下每1ml有750pigTween80、110jigTritonX-100和100叫VES。攪拌5分鐘后，加入15fig每種毒抹HlNl、H3N2和B,每次加入之間攪拌10分鐘。攪拌l5分鐘后，加入250piSB62乳液(如在實施例III中的教導制備)。再攪拌混合物15分鐘，之后立即加入25MPL。于室溫攪拌制劑15分鐘，如果不立即給予的話則儲存于4'C。VI.1.3.解讀在免疫后7天收集初免小鼠的PBMC。在混合物/組別中測試它們。VI.2.結果通過使用C57BI/6初免小鼠和作為再刺激抗原的全失活病毒1(_ig/ml，確定顯示出較高CD4和CD8+T細胞頻率以及較低背景的條件。結果示于圖15(CD4T-細胞應答)和圖16(CD8T-細胞應答)。在這些條件下，有可能誘導相比于裂解普通疫苗針對裂解AS03疫苗的較高CD4T細胞應答，如在人中所觀察到的。相比于裂解普通疫苗針對裂解AS03+MPL疫苗的較高CD4T細月包應答。,在裂解普通疫苗和裂解AS03疫苗之間相似的CD8T細胞應答，如在人中所觀察到的。與裂解AS03疫苗或裂解普通疫苗相比針對AS03+MPL的CD8T細胞應答較高的趨勢。實施例VII—在用異源毒林初免的(37BI/6小鼠中有佐劑和無佐劑的裂解和亞單位流感疫苗的臨床前評價VII.l.實發沒計和目的與Fluarix普通(無佐劑)疫苗相比，在Explo-Flu-OOl臨床研究(參見實施例III)中觀察到針對三價流感病毒裂解AS03疫苗的CD4T細胞應答顯著較高。在這兩個組之間未觀察到CD8T細胞和體液應答這二者的差異。使用異源毒林初免的C57BI/6小鼠開發出一種動物模型，該模型重現了在人中觀察到的相似的免疫模式。對于ICS(胞內細胞因子染色)，再刺激用失活全病毒進4亍。目的是比4交GlaxoSm池Kline商用裂解疫苗(FluarixTM)相對于亞單位疫苗(Chiron的疫苗FluacFM)誘導的CMI應答以及用AS03或AS03+MPL或另一種水包油乳液佐劑(OW)佐劑化的這些疫苗獲得的CMI應答。VII丄l.治療/組別由HarlanHorst,Netherland獲得6-8周齡的雌性C57BI/6小鼠(24只小鼠/組)。小鼠在第0天用異種亞型毒抹(5嗎HA全曱醛失活H1N1A/約翰內斯堡/82/96、H3N2A/悉尼/5/97、B/哈爾濱/7/94)鼻內初免。在笫29天，用1.5嗎HA三價裂解(A/新喀里多尼亞/20/99、A/懷俄明/3/2003、B/江蘇/10/2003)普通疫苗或有佐劑疫苗(參見以下表39中的組別)肌內注射小鼠。表39<table>tableseeoriginaldocumentpage106</column></row><table>*FluarixTM**如在以下部分中的闡述生產的OWVII丄2.疫苗制劑的制備OW的制備按照在ChironBehringFIuAd疫苗中包含的說明書小冊子中公布的處方制備稱為OW的水包油乳液。將注射用水、36.67mg檸檬酸和627.4mg檸檬酸鈉二水合物混合在一起，將體積調整至200ml。將470mgTween80與94.47ml該緩沖液混合，此混合物稱為"溶液A"。通過在磁力攪拌下混合3.9g堇蹄和470mgSpan85制備油性混合物。然后將溶液A加入油性混合物中，獲得的終體積是100ml。然后，混合物首先通過18Gxl'/2針，然后被以兩個樣品放入M110S微流控器(得自Microfluidics)中，以減小油滴大小。當每個樣品獲得約150nm的粒度時，合并兩個樣品，經0.2|im濾器過濾。在TO時對合并的樣品獲得143nm的z均值，多分散性為O.IO,在4。C儲存4個月后獲得145nm的z均值，多分散性為0.06。該粒度使用Zetasizer3000HS(得自Malvern)在以下技術條件下獲得畫激光波長532nm(Zeta3000HS)-激光功率50mW(Zeta3000HS)-于90。檢測的散射光(Zeta3000HS)-溫度25°C-持續時間由軟件自動確定-次數3次連續檢測-z均值直徑利用累積量分析將PBSIO倍濃縮液(I倍濃縮時為pH7.4)以及含Tween80、TritonX-100和VES的混合物(量計入毒抹中存在的去污劑)加入注射用水中,以達到終濃度375jag/mlTween80、55jag/mlTritonX-100和50嗎/mlVES。攪拌5分鐘后，加入15嗎每種毒抹H1N1、H3N2和B,每次加入之間攪拌10分鐘。制劑于室溫攪拌15分鐘，如果不立即給予的話則儲存于4'C。逸2的刺浙f考f將PBSIO倍濃縮液(I倍濃縮時為pH7.4)以及含Tween80、TritonX-100和VES的混合物(量計入毒抹中存在的去污劑)力口入注射用水中,以達到終濃度375pg/mlTween80、55(ig/mlTritonX-100和50嗎/mlVES。攪拌5分鐘后，加入15iug每種毒林HlNl、H3N2和B,每次加入之間攪拌IO分鐘。攪拌15分鐘后，加入250fxlOW乳液。攪拌制劑15分鐘，如果不立即給予的話則儲存于4'C。邀3/w/人將PBSIO倍濃縮液(I倍濃縮時為pH7.4)以及含Tween80、TritonX-100和VES的混合物(量計入毒抹中存在的去污劑)加入注射用水中，以達到終濃度375|Lig/mlTween80、55fig/mlTritonX-100和50嗎/mlVES。攪拌5分鐘后，加入15jig每種毒抹HlNl、H3N2和B，每次加入之間攪拌0分鐘。攪拌15分鐘后，加入250^SB62乳液。攪拌制劑15分鐘，如果不立即給予的話則儲存于4。C。逸4的斜;Wf^/"于7m/入將PBSIO倍濃縮液(I倍濃縮時為pH7.4)以及含Tween80、TritonX-100和VES的混合物(量計入毒抹中存在的去污劑)加入注射用水中，以達到終濃度375|ug/mlTween80、55(ig/mlTritonX-100和50jig/mlVES。攪拌5分鐘后,加入15卩ig每種毒抹H1N1、H3N2和B，每次加入之間攪拌10分鐘。攪拌15分鐘后，加入250^SB62乳液。再攪拌混合物15分鐘，之后立即加入25pgMPL。攪拌制劑15分鐘，如果不立即給予的話則儲存于4T。iff5的劍浙卩對f/w/入混合等體積的PBS和FluAdTM/GripguardTM疫苗(商用疫苗)。攪拌制劑15分鐘，如果不立即給予的話則儲存于4。C。顏6的斜浙f^f將250piPBSmodpH7.4加入1劑500的Aggripal(商用疫苗)中。攪拌15分鐘后，加入250|ulSB62(按照對大規模生產詳述的方法制備)。攪拌制劑15分鐘，如果不立即給予的話則儲存于4'C。逸7的劍游f^f7w/"將PBSmodpH7.4加入1劑500jil的AggripalTM(商用疫苗)中(以達到終體積1ml)。攪拌15分鐘后，加入250piSB62(按照對大規模生產詳述的方法制備)。然后加入25jigMPL。攪拌制劑15分鐘，如果不立即給予的話則儲存于4'C。逸S^浙浙(^/"f/m/"將250jxlPBSmodpH7.4加入1劑500pl的Aggripal中。攪拌15分鐘后，加入250fil如組2制備的OW,攪拌制劑15分鐘，如果不立即給予的話則儲存于4'C。邀9W賴身p,f/m/六混合等體積的PBSmodpH7.4和Aggripal。攪拌制劑15分鐘，如果不立即給予的話則儲存于4'C。VIU.3.解讀(表40)CMI(ICS):免疫后7天。IHA/中和測定免疫后21天。表40<table>tableseeoriginaldocumentpage109</column></row><table>IHA、中和111=單獨的"0=混合的在免疫后7天由24只小鼠/組收獲PBMC,在混合物/組別中測試。VII.2.結果VII.2丄體液免疫性在鼻內異源初免后14天和克疫后16天檢測24只動物/組的血清中抗3種疫苗林的血凝反應抑制活性。對于3種毒抹和所有組，在免疫后觀測到加強的HI滴度。-對于相同佐劑和3種毒4朱，亞單位疫苗和裂解疫苗誘導相似的HI滴度。'對于3種毒林，和AggripalOW相比對Fluad7見測到相似的HI滴度。'對于H1N1和B毒林，沒有觀察到Fluarix和Aggripal之間的差異。*對于3種毒林，與普通流感疫苗相比，用有或沒有MPL的AS03佐劑化流感疫苗(裂解疫苗或亞單位疫苗)的時觀察到統計學上顯著較高的HI滴度。.與普通流感疫苗相比，僅對于A/懷俄明毒抹用OW佐劑化的流感疫苗(裂解疫苗或亞單位疫苗)的HI滴度在統計學上顯著較高。VII.2.2.細胞介導的免疫應答(在免疫后7天的ICS)CXMT勿應^吝一房/7J:部在免疫后7天收集24只小鼠/組的PBMC，并在1個混合物/組中測試。失活的三價全病毒(lpg/ml)用作再刺激抗原。結果示于圖17上部。就表達IL-2、IFN-Y或這兩種細胞因子的流感全病毒特異性CD4+T細胞而言(圖17上部)1.GSK佐劑顯示出和先前觀測(實施例VI)相同的趨勢AS03+MPL優于AS03，AS03又優于用普通疫苗獲得的結果。對于裂解疫苗或亞單位疫苗這二者均觀察到此趨勢。2.無論哪種制劑(普通疫苗、AS03或AS03+MPL),裂解疫苗都誘導比亞單位疫苗高的CD4+T細胞應答。3.Fluad(亞單位+水包油乳液OW—參見制備部分)看起來誘導與Fluarix普通疫苗相似的頻率。4.制劑三價裂解疫苗/AS03或三價裂解疫苗/AS03+MPL誘導高于制劑亞單位/水包油乳液OW的CD4+T細胞應答。7，勿/^^lt一激/77"豐在免疫后第7天由24只小鼠/組收集PBMC,并在1個混合物/組中測試。失活的三價全病毒(lfig/ml)用作再刺激抗原。就表達IL-2、IFN-Y或兩種細胞因子的流感全病毒特異性CD8+T細胞而言(圖17下部)'該實驗的截取值相對較高，原因是對PBS陰性對照組觀測到的背景尚。'但是，與其它疫苗制劑相比，對于用三價裂解疫苗/AS03+MPL免疫的小鼠觀測到較高的特異性CD8T細胞應答。VII.3.結果概述和結論荻得以下結果l)在免疫后7天通過ICS獲得的流感病毒特異性CD4+T細胞表明1.與Fluarix相比對Fluad獲得相似的應答。2.與無佐劑疫苗相比，對于裂解流感疫苗(如在人中觀測到的)和亞單位疫苗(Aggripal)(在人中未評價)這二者來說，有佐劑制劑均誘導較高的免疫應答。補加MPL的水包油乳液佐劑AS03(組4和組9)產生比水包油乳液佐劑AS03(組3和組8)高的應答。3.與裂解疫苗/AS03相比，有針對裂解疫苗/AS03+MPL的較高CD4應答的趨勢(圖1"。4.由裂解疫苗誘導的應答優于用亞單位疫苗獲得的應答(對比組1-4和組5-9)。5.裂解疫苗，無論用有還是用沒有MPL的AS03做佐劑(組3和4)，都顯示出比亞單位疫苗(Fluad(組5)或者Aggripal+OW(組7》高的CD4+T細胞應答。2)在免疫后7天通過ICS獲得的流感病毒特異性CD8+T細胞沒有顯示出在裂解疫苗/AS3和普通裂解疫苗(如在人中觀測到的)之間觀測到的差異。與裂解疫苗/AS3和普通裂解疫苗相比，使用裂解疫苗/AS3+MPL獲得的CD8+T細胞應答有較高的趨勢。3)對于相同佐劑和3種毒林，亞單位疫苗和裂解疫苗誘導相似的HI滴度。對于3種毒抹，與普通流感疫苗相比，當流感疫苗(亞單位疫苗或裂解疫苗)用AS03或AS03+MPL佐劑化時觀察到統計學上顯著較高的滴度(僅對于A/懷俄明毒抹流感疫苗OW〉普通流感疫苗)。實施例VIII—用含裂解流感抗原制備物和有或沒有MPL佐劑的AS03的疫苗在65歲以上老年人群中進行的臨床實驗V1II丄實驗設計在65歲以上(>65歲)老年人群中進行開放、隨機、可控的1期研究，以便評價與FluarixTM疫苗(在比利時稱為ot-RixTM)相比，肌內給予的含佐劑AS03或AS03+MPL的GlaxoSm池KlineBiologicals流感候選疫苗的反應原性和免疫原性。評j介3個平4亍組1組50名受試者接受1劑重配和AS03佐劑化的SV流感疫苗(FluAS03)1組50名受試者接受1劑重配和FluAS03+MPL佐劑化的SV流感疫苗(FluAS03+MPL)1個對照組50名受試者接受1劑Fluarix(Fluarix)VIII.2.疫苗組成和給予在3種疫苗中使用的毒抹是已由WHO推薦用于2004_2005北半球流感季的毒株，即A/新喀里多尼亞/20/99(H1N1)、A/新加利福尼亞/3/2003(H3N2)和B/江蘇/10/2003。同FluarixTM/a-RixTM—樣，商用疫苗用作對比物，有佐劑疫苗(AS03或AS03+MPL)每劑含每種流感病毒抹的15)Lig血細胞凝集素(HA)。有佐劑流感候選疫苗是一種2組分疫苗，由在I型玻璃瓶中提供的濃縮3價失活裂解病毒體抗原和含佐劑(AS03或AS(B+MPL"々預填充I型玻璃注射器組成。它們如在實施例II中的詳述制備。用于有佐劑流感候選疫苗配制的3種失活裂解病毒體抗原(單價原液)與用于配制商用FluarixTM/a-Rix的活性成分完全相同。在謝必好《麥,AS03佐劑化的流感候選疫苗是一種2組分疫苗，由在I型玻璃瓶(335jil)(抗原容器)中提供的濃縮3價失活裂解病毒體抗原和含SB62乳液的預填充I型玻璃注射器(335pl)(佐劑容器)組成。AS03候選疫苗的描述和組成闡述于實》包例III。+MPI佐^化的瘦,.'簡而言之，AS03+MPL佐劑化的流感疫苗候選物是一種2組分疫苗，由在I型玻璃瓶(335^)(抗原容器)中提供的濃縮3價失活裂解病毒體抗原和含AS03+旨1^佐劑的預填充1型玻璃注射器(360fil)(佐劑容器)組成。在注射時，抗原容器的內容物通過使用含AS03+MPL佐劑的注射器由瓶中取出，接著輕微混合注射器。在注射前，使用的針被肌內針替換，并將體積調整到530fil。1劑重配的AS03+MPL佐劑化流感候選疫苗相當于530pl。為在AS03+MPL佐劑化疫苗重配時獲得每種流感抹的15figHA,與Fluarix(即30嗎HA/ml)相比，失活的裂解病毒體抗原在抗原容器中被濃縮2倍(即60嗎HA/ml)。1劑重配的有佐劑流感疫苗的組成與表45(參見實施例XI)中報告的相同，只是流感抹不同。兩種疫苗都肌內給予。VIII.3.CMI目標、終點和結果CMI目標是確定相對于無任何佐劑的組合物，用AS03或AS03+MPL佐劑化的制劑之間哪種免疫原性組合物對流感抗原接種個體的CD4和CD8介導的免疫性具有最強的免疫刺激活性。VIII.3丄CMI終點和結果觀厳#在第0天和第21天每106個細胞中針對5種不同細胞因子的細胞因子陽性CD4/CD8細胞的頻率。每個測試定量針對以下的CD4/CD8T細胞應答-以下3種抗原的混合物-新喀里多尼亞抗原-懷j我明抗原-江蘇抗原射經'在5種不同測試中用以下細胞表示的抗原特異性CD4和CD8-T-細胞應答(a)產生至少兩種不同細胞因子(CD40L、IL-2、IFN卩TNFot)的纟田胞(b)產生至少CD40L和另一種細胞因子(IL-2、TNFa、IFN力的細胞(c)產生至少IL-2和另一種細胞因子(CD40L、TNFoc、IFN力的細胞(d)產生至少IFN丫和另一種細胞因子(IL-2、TNFa、CD40L)的細胞(e)產生至少TNFoc和另一種細胞因子(IL-2、CD40L、IFN力的細胞CA^吝為、浙,CMI分析基于總接種人群。(a)對于每個治療組，針對每個接種組、每個時間點(第0天、第21天)和每種抗原新喀里多尼亞、懷俄明和江蘇以及合并的3種不同毒抹測定CD4/CD8T-淋巴細胞分泌應答的頻率。(b)針對各5種不同的細胞因子，在時間點(接種后-接種前)之間對各個接種組和各種抗原的應答的個體差異的描述統計。(c)就5種不同細胞因子對比3組的以下方面-針對新喀里多尼亞、懷俄明、江蘇以及合并的3種毒林的CD4T-細胞應答-針對新喀里多尼亞、懷俄明、江蘇以及合并的3種毒抹的CD8T-細胞應答(d)非參數檢驗(Kmskall-Wallis檢驗)用于對比3組間的局部差異，針對各5種不同細胞因子計算各種抗原的統計學p-值。(e)Wilcoxon檢驗分別用于檢驗FluAS03+MPL對Fluarix、FluAS03+MPL對FluAS03以及FluAS03對Fluarix之間的2組成對比較。(f)所有顯著性檢驗都是雙尾的。小于或等于O.O5的P-值被認為是統計學顯著的。VIII.3.2.CMI纟吉果結果表示為CD4或CD8T細胞亞群中細胞因子陽性的CD4或CD8T細胞的頻率。#0>/7，-^S勿應^Jf季(a)與在實施例III中所實施的類似，針對每個接種組、每個時間點(第0天、第21天)和每種抗原(合并的、新喀里多尼亞、懷俄明和江蘇)測定抗原特異性CD4T-淋巴細胞分泌應答的頻率。(b)通過Kmskall-Wallis檢驗對比3個組之間抗原特異性CD4T-淋巴細胞的頻率差異，所有p-值都小于0.O5，被認為是統計學顯著的。(c)通過Wilcoxon檢一瞼對比FluAS03+MPL和Fluarix組之間抗原特異性CD4T-淋巴細胞的頻率差異，所有p-值都小于O.O5,被認為是統計學顯著的。(d)通過Wilcoxon檢驗對比FluAS03和Fluarix組之間抗原特異性CD4T-淋巴細胞的頻率差異，所有p-值都小于0.05,被認為是統計學顯著的。(e)通過Wilcoxon檢驗對比Flu和FluAS03+MPL組之間抗原特異性CD4T-淋巴細胞的頻率差異，所有p-值都小于0.05,被認為是統計學顯著的。4秒河,《「凝#者-###)之河CD47，-淋6勿應(a)與已在實施例III中實施的類似，對于各5種不同細胞因子針對每個接種組和每種抗原在時間點(接種后-接種前)之間的CD4T-淋巴細胞應答的個體差異做描述統計。(b)通過Kruskall-Wallis檢馬僉對比3個組之間抗原特異性CD4T-淋巴細胞應答的接種后-接種前個體差異，所有p-值都小于0.001，被認為是高度統計學顯著的。(c)使用Wilcoxon檢驗對比FluAS03+MPL和Fluarix之間抗原特異性CD4T-淋巴細胞應答的接種后-接種前個體差異，所有p-值都小于0.05，被認為是統計學顯著的。(d)使用Wilcoxon檢驗對比FluAS03和Fluarix之間抗原特異性CD4T-淋巴細胞應答的接種后-接種前個體差異，所有p-值都小于0.001，被認為是高度統計學顯著的。(e)使用Wilcoxon檢驗對比FluAS03+MPL和FluAS03之間抗原特異性CD4T-淋巴細胞應答的接種后-接種前個體差異，所有p-值都大于0.05，被認為不是統計學顯著的。VHI.4.B細胞記憶應答目標、終點和結果研究的目標是研究與老年人群中的Fluarix相比，用含佐劑AS03+MPL或AS03的流感候選疫苗進行1次肌內接種時，對流感病毒抗原特異性的記憶B細胞的頻率是否被顯著誘導。記憶B細胞的頻率通過B細胞Elispot測定評價。VIII.4丄B細胞記憶應答終點終點是(a)在笫0、21天時就百萬(106)個產IgG漿細胞中的特異性抗原漿細胞頻率而言，在所有受試者中都通過B細胞ELISPOST檢測在體外培養的記憶B細胞中產生的細胞。(b)在接種后(第21天)和接種前(第0天)之間的差異也表示為每百萬(106)個抗體形成細胞中流感特異性抗體形成細胞的頻率。VIII.4.2.B細胞記憶應答結果測定每百萬(106)個抗體形成細胞中流感特異性抗體形成細胞的頻率。結果表明，通過Wilcoxon4金驗獲得的FluAS03+MPL和Fluarix組之間流感病毒抗原特異性記憶B細胞的頻率對B/江蘇毒抹而言顯著(p〈0.05)較高，而對其它兩種毒株(A毒抹新喀里多尼亞和懷俄明)則不會這樣。還測定了對流感抗原特異性的記憶B細胞在時間點(接種后-接種前)之間的個體差異。結果表明，通過Kmskall-Wallis檢驗獲得的FluAS03+MPL和Fluarix組之間流感病毒抗原特異性記憶B細胞頻率在時間點(接種后-接種前)之間的個體差異對B/江蘇毒林而言顯著(p<0.05)較高，而對其它兩種毒4朱(A毒抹新喀里多尼亞和懷俄明)不會這樣。結果示于圖18。實施例IX—有佐劑和無佐劑的流感疫苗在雪貂中的臨床前評價(研究III)IX丄基本原理和目標本研究對比無佐劑的(FluarixTM)或用AS03+MPL佐劑化的GSK商用三Y介裂解流感疫苗和兩種其它商用亞單位疫苗-FluadTM，Chiron有佐劑亞單位疫苗(佐劑為Chiron的MFW佐劑)，-Agrippal,Chiron的無佐劑商用亞單位疫苗，其在本研究中用AS03佐劑做佐劑。本實驗的目標是評價這些疫苗在用異源毒抹攻擊的雪貂的鼻分泌物中減輕病征(體溫和病毒脫落)的能力。終點是1)主要終點在異源攻擊后減輕鼻清洗液中的病毒脫落2)次要終點通過IHA分析體液應答，并監測初免和異源攻擊前后的溫度。IX.2.實驗沒計1X.2丄治療/組由MISAYConsultancy(Hampshire,UK)獲得14-20周齡的雌性雪貂(地中海雪貂(M仏"e/fir;^om^/wra))。雪貂在第0天用異種亞型毒抹H1N1A/斯德哥爾摩/24/90(4LogTCID5。/ml)鼻內初免。在第21天，用全人劑量(lml疫苗劑量，15貼HA/毒抹)的H1N1A/新喀里多尼亞/20/99、H3N2A/懷俄明/3/2003和B/江蘇/10/2003的組合肌內注射雪貂。然后在第42天通過鼻內途徑用異型毒才朱H3N2A/巴拿馬/2007/99(4.51LogTCID5。/ml)通過鼻內途徑攻擊雪貂。各組(6只雪貂/組)描述于表41。要實施的解讀方式詳述于表42。表41<table>complextableseeoriginaldocumentpage119</column></row><table>IX.2.2.疫苗制劑的制備三,襲,爭遞卩無佐/力斜;W.'""/賴^/.'X-100和VES的混合物(量計入毒抹中存在的去污劑)力。入注射用水中。達到的去污劑量如下每1ml有375嗎Tween80、55嗎TritonX-100和50figVES。攪拌5分鐘后，加入15嗎每種毒抹H1N1、H3N2和17.5貼B毒株，每次加入之間攪拌10分鐘。制劑于室溫攪拌l5分鐘，如果不立即給予的話則儲存于4'C。^佐^^的三,襲席斜L'7m/斜麻將PBSIO倍濃縮液(I倍濃縮時為pH7.4)以及含Tween80、TritonX-100和VES的混合物(量計入毒林中存在的去污劑)加入注射用水中。達到的去污劑量如下每1ml有375(igTween80、55pgTritonX-100和50嗎VES。攪拌5分鐘后，加入15昭每種毒抹H1N1、H3N2和B,每次加入之間攪拌10分鐘。攪拌15分鐘后，加入250SB62乳液(如在實施例II.l中的教導制備)。再攪拌混合物15分鐘，之后立即加入25|igMPL。于室溫攪拌制劑15分鐘，如果不立即給予的話則儲存于4'C。在PBS援沖液pH7.4中配制FluAdTM疫苗的2倍稀釋液。y4gn》/7a/TMj別3賴游/m/斜^/.'將250iulPBS緩沖液pH7.4加入1劑AggripaFM中。混合后，加入250piSB62乳液(如在實施例II.l中的詳述制備)。混合物于室溫挽掉。IX.2.2.解讀表42<table>tableseeoriginaldocumentpage120</column></row><table>111=單獨的/150=混合的IX.3.結果(圖19-22)IX.3丄溫度監測用傳感器并用通過遙測記錄監測個體溫度。檢查和整修所有植入物，在放入腹腔之前通過DSI進^"新校準。在這些檢測期間所有動物都獨立地圈養在單獨的籠中。由攻擊前2天直至攻擊后4天每l5分鐘記錄溫度，由日中計算出平均溫度。結果示于圖19。潛l-攻擊后，用無佐劑(普通)三價裂解疫苗(FluarixTM)或亞單位疫苗FluadTM(其含MF59水包油乳液)免疫雪貂后觀測到體溫峰值。在用AS03+MPL佐劑化的三價裂解疫苗和用AS03佐劑化的亞單位AgrippaFM免疫雪貂后均未觀測到峰值。總之，對于裂解和亞單位測試疫苗，均顯示出含AS03的疫苗在攻擊后防止體溫升高的附加價值，與含MF59的疫苗于攻擊后不能在雪紹中防止此體溫升高相反。IX.3.2.病毒脫落對每組6只動物進行鼻清洗物的病毒滴定。通過在清醒動物的兩個鼻孔中給予5mlPBS進^f亍鼻清洗。將接種物收集在培養皿中，并置于干冰(-80。C)上的樣品容器中。所有鼻樣品都首先通過SpinX濾器(Costar)除菌過濾，以去除任何細菌污染。將50^連續10倍稀釋的鼻清洗液轉移至含50)Lil培養基(IO孔/稀釋度)的微量滴定板中。然后將100plMDCK細胞(2.4x105個細胞/ml)加入每個孔，并于35。C溫育5-7天。在5-7天溫育后，小心地取出培養基，加入100pl含1/20WST-1的培養基，再溫育18小時。在存活細胞還原WST-1時產生的黃色曱臘染料的強度與病毒滴定實驗結束時存在于孔中的存活細胞數成比例，并通過在合適波長(450nm)檢測各孔的吸光度定量。截取值定義為未感染對照細胞的OD平均值一0.3OD(0.3OD相當于未感染對照細胞0D士3個標準偏差)。OD〈截取值時定義為陽性得分，相反，OD〉截取值時定義為陰性得分。病毒脫落滴度通過"ReedandMuench"測定，并表示為LogTCID50/ml。結果示于圖20。與用無佐劑(普通)三價裂解疫苗(FluarkTM)或FluadTM亞單位疫苗免疫雪貂后觀察到的非常低的病毒脫落減少相比，用AS03+MPL佐劑化的三價裂解疫苗或用AS03佐劑化的AgrippalTM亞單位疫苗攻擊后觀察到較低的病毒脫落。與針對體溫升高所討論的相類似，相比于含MF59的疫苗觀察到含AS03疫苗的附加價值。IX.3.3.HI滴度使用血凝反應抑制測試(HI)測定針對H3N2流感病毒一朱的抗血細胞凝集素抗體滴度。HI測試的原理是基于特異性抗流感抗體通過流感病毒血細胞凝集素(HA)抑制小雞紅細胞(RBC)的血凝反應的能力。血清首先用25。/。神經氨酸酶溶液(RDE)處理并熱失活，以去除非特異性抑制劑。在預處理后，將2倍稀釋的血清與4個血凝單位的每種流感林溫育。然后加入小雞紅細胞，并記錄凝集抑制。滴度表示為完全抑制血凝反應的血清最高稀釋度的倒數。由于血清的第一個稀釋度是1:10，所以不可檢測水平記錄為等于5的滴度。潛l'在用H3N2A/懷俄明免疫后，與用無佐劑(普通)三價裂解疫苗(FluarixTM)或FluadTM亞單位疫苗免疫雪貂后觀察到的體液應答相比，在用AS03+MPL佐劑化的三價裂解疫苗或AS03佐劑化的Agrippal亞單位疫苗免疫的雪貂中觀測到較高的體液應答(HI滴度)(圖21)。在用H3N2A/懷俄明免疫后，與用三價裂解普通疫苗或Fluad免疫的雪貂相比，在用AS03+MPL佐劑化的三價裂解疫苗或AS03佐劑化的AgnppalTM免疫的雪貂中，還觀測到針對用做攻擊抹的漂移抹H3N2A/巴拿馬的較高體液應答(HI滴度)(圖22)。用我們的佐劑(AS03或AS03+，1^)觀測到的針對異源毒林的此交叉反應與用AS03+MPL佐劑化三價裂解疫苗或AS03佐劑化AgrippalTM亞單位疫苗免疫并隨后用此異源毒抹攻擊的雪貂中觀測到的保護作用相關聯。由含AS03的疫苗誘導的針對異源毒林的此交叉反應性不由MF59佐劑化的疫苗(FIuAdTM)誘導。實施例X—用含裂解流感抗原制備物和有或無MPL佐劑的AS03的疫苗在65歲以上老年人群中進行的臨床實驗在第90天和180天的免疫原性持久性數據X.l.研究設計于65歲以上(>65歲)的老年人群中進行開放、隨機、可控的I期研究，以便評價與FluarixTM疫苗相比(在比利時稱為a-RixTM)，肌內給予的含佐劑AS03或AS03+MPL的GlaxoSmithKlineBiologicals流感候選疫苗的反應原性和免疫原性。該研究遵循在實施例vm中報告的研究。評價三個平行組1組50名受試者接受1劑重配和AS03佐劑化的SV流感疫苗(FluAS03)1組50名受試者接受1劑重配和FluAS03+MPL佐劑化的SV流感疫苗(FluAS03+MPL)1個對照組50名受試者4妻受1劑FluarixTM(Fluarix)X.2.免疫原性結果X.2丄體液免疫應答終點和結果為了評價由AS03和AS03+MPL佐劑化的疫苗誘導的體液免疫應答及其持久性，對各個治療組計算以下參數。在第0、21、90和WO天針對在疫苗中提供的3種流感病毒林的每一種單獨測試的血清血凝反應抑制(HI)抗體滴度(抗-H1N1、抗-H3N2和抗-B-抗體)。*在第0、21、90和180天具有95。/。CI的血清HI抗體GMT.在第21、90和l肌天具有95%CI的血清陽轉率*在第21天具有95%CI的轉變因子*在第0、21、90和l80天具有95%CI的血清保護率趁果具有95%CI的HI抗體的GMT示于圖23。3個組中針對全部3種疫苗抹的抗體的接種前GMT處于相同范圍內。在接種后，抗血細胞凝集素抗體水平顯著增加。^f旦是，接種后針對3種疫苗抹的抗體的接種后GMT對所有疫苗而言都仍在相同的范圍內。在第21天，對于A/新喀里多尼亞和B/江蘇毒抹來說，觀察到和Fluark相比有利于2種有佐劑疫苗的輕樣i趨勢，在兩種有佐劑疫苗中，用FLUAS03觀察到針對A/懷俄明和B/江蘇毒抹的較高GMT。在第90天觀察到相同的趨勢。在第180天，對3種疫苗來說，針對3種疫苗株的抗體GMT在相同范圍內。在60歲以上的受試者中，所有流感疫苗都滿足歐洲官方對每年注冊的流感失活疫苗的要求["關于用于免疫學評價年度毒抹變化的協調流感疫苗要求的指引說明"(CPMP/BWP/214/96)]。在接種后3個月(90天)和6個月(180天)，無論哪個所考察的研究組，血清保護率都仍高于歐洲官方要求的最低60%的保護率。在第90天，在3個疫苗組中對所有疫苗抹都仍達到歐洲官方要求的30%的最低血清陽轉率，Fluanx的A/新喀里多尼亞抹除外。在笫1犯天，用3種疫苗對A/懷俄明和B/江蘇抹仍可達到該血清陽轉率，但對A/新喀里多尼亞林不行(表43和表44)。表43以血清血凝反應抑制滴度優于或等于1:40的接種者百分率表示的血清保護率(免疫原性的ATP人群)<table>tableseeoriginaldocumentpage125</column></row><table>N-結果可用的受試者數目n/%==滴度在特定范圍內的受試者的數目/百分率PRE-接種前滴度PI(D21)=在第21天采接種后血樣PI(D90)=在第90天采接種后血樣PI(D化0)-在第180天采接種后血樣表44代表血凝反應抑制(HI)抗體滴度的血清陽轉率，定義為相比于笫0天在各個接種后時間點的血清ffl滴度具有至少達4倍增加的接種者百分率(免疫原性的ATP人群)<table>tableseeoriginaldocumentpage126</column></row><table>N=接種前和接種后結果可用的受試者數目n/%=具有至少4倍增加的受試者數目/百分率95%CI=精確的95%置信區間；LL=下限，UI^上限X.2.2.CMI應答終點和結果為了評價由有佐劑疫苗誘導的細胞免疫應答及其持久性，對每個治療組計算以下參數在各個時間點(第0、21、卯和180天)在不同測試中每106個細胞中細胞因子陽性CD4/CD8細胞的頻率(在笫0天和21天單獨考察的以及合并的新喀里多尼亞、懷俄明和江蘇抗原；在笫90天和180天單獨考察的以及合并的新喀里多尼亞、懷俄明、江蘇和紐約抗原)。Alldouble:產生至少兩種不同細胞因子的細胞(CD40L、IFN-y、IL-2、TNF-oc)。CD40L:產生至少CD40L和另一種細胞因子(IFN-y、IL-2、TNF-a)的細胞。IFN卞產生至少IFN-y和另一種細胞因子(CD40L、IL-2、TNF-a)的細月包。IL畫2:產生至少IL-2和另一種細胞因子(CD40L、IFN卞TNF-ot)的細月包。TNF-a:產生至少TNF-oc和另一種細胞因子(CD40L、IFN卞IL-2)的細力包。潛采主要發現是(圖24):(a)接種后21天，相比于Fluarix組，在2個有佐劑疫苗組中細胞因子陽性的CD4T細胞(IL-2、CD40L、TNF畫oc和IFN-"的頻率顯著較高。但是，在兩種佐劑之間沒有顯著差異。(b)有佐劑疫苗和Fluarix之間的所有統計差異保持至第90天和笫180天，在第1S0天以下幾項除外'對于Alldouble、CD40L、IFN-y和IL2(僅懷俄明抹)和對于Alldouble、CD40L和TNF-a(僅紐約林)，在FluAS03/MPL和Fhiarix之間沒有統計學顯著差異，*對于IL2(僅江蘇林)，在FluAS03和Fluarix之間沒有統計學顯著差異(c)至第90天和第180天，證實在兩種有佐劑的疫苗之間沒有統計學顯著的差異。(d)對于兩種有佐劑的疫苗，接種前和接種后(第21天)之間針對所研究的所有細胞因子(IL-2、CD40L、TNF-a和IFN-力的CD4T-淋巴細胞應答的差異顯著高于FluarixTM。但是，在兩種佐劑之間沒有檢測到顯著差異。(e)接種對CD8應答沒有可檢測的影響，無論哪一個治療組。實施例XI—用含裂解流感抗原制備物以及AS03和MPL佐劑的疫苗在65歲以上老年人群中進行的臨床實驗XI丄研究設計和目標在65歲以上(〉65歲)老年人群中進行開放、可控的1/1I期研究，以便評價含AS03+MPL佐劑的GlaxoSmithKlineBiologicals流感候選疫苗的反應原性和免疫原性，所述老年人群先前于2004年用相同候選疫苗接種。為進行免疫原性和安全性評價，FluarixTM疫苗(在比利時稱為a-RixTM)用作參比。評價2個平行組l組約50名受試者，他們先前已在預先的臨床實驗中接受了1劑重配的有佐劑流感疫苗1個對照組(Fluarix)約50名受試者，他們在先前的臨床實驗當中已預先接受了1劑Fluarix此研究的1個目標是評價在首次施藥后約1年給予有佐劑流感疫苗FluAS03+MPL進行的再4妄種的體液免疫應答(抗血細胞凝集素和抗-MPL滴度)。為比較目的，已在先前實驗中接受FluarixTM的受試者接受l劑商用疫苗，并構成該實驗的對照組。XI.2.疫苗組成和給予在3種疫苗中使用的毒林是由已WHO推薦用于2005-2006北半球流感季的毒林，即A/新喀里多尼亞/20/99(H1N1)、A/新加利福尼亞/7/2004(H3N2)和B/江蘇/10/2003。同FluarixTM/oc-RixTM—樣，商用疫苗用作對比物，AS03+MPL佐劑化的疫苗(后文簡稱為"有佐劑疫苗")每劑含每種流感病毒抹的15蹄血細胞凝集素(HA)。有佐劑的流感候選疫苗是一種2組分疫苗，由在I型玻璃瓶中提供的濃縮3價失活裂解病毒體抗原和含AS03+MPL佐劑的預填充I型玻璃注射器組成。它們已按照實施例II中詳述的方法制備。在注射時，將含佐劑的預填充注射器的內容物注入含濃縮三價失活裂解病毒體抗原的瓶中。在混合后將內容物吸入到注射器中，針用月幾內針替換。1劑重配的有佐劑流感候選疫苗相當于0.7ml。有佐劑流感候選疫苗是無防腐劑的疫苗。1劑重配的有佐劑流感疫苗的組成在表45中給出。兩種疫苗都肌內給予。表45重配有佐劑(AS03+MPL)流感候選疫苗的組成<table>tableseeoriginaldocumentpage129</column></row><table>XI.3.免疫原性結果XI.3丄抗-HA體液免疫應答終點和結果在0天和21天血清血凝反應抑制(HI)抗體滴度，分別對疫苗中提供的3種流感病毒林的每一種測試(抗-HlNl、抗-H3N2和抗-B-抗體)。好i^rJY弄,,(f)接種前和接種后具有95%置信區間(95%CI)的血清HI抗體的幾何平均滴度(GMT)(g)"天時具有95%CI的血清陽轉率*(h)21天時具有95%CI的血清轉變因子**(i)21天時具有95%CI的血清保護率****血清陽轉率定義為針對每種疫苗林的接種前HI滴度<1:10且接種后滴度>1:40的接種者百分率，或接種前滴度>1:10且接種后滴度增加至最少4倍的接種者百分率。**血清轉變因子定義為相比于第0天在第"天時針對每種疫苗抹的血清HIGMT的增加倍數。***保護率定義為接種后(針對每種疫苗林的)血清HI滴度>40的接種者百分率，通常將該百分率看作指示保護作用。正如所料，在接種前2個組中的大部分受試者對3種毒抹已經是血清陽性的。針對全部3種疫苗抹的接種前GMT在2個組中處于相同范圍內。相比于Fluarix組，在FluAS03+MPL組中針對全部3種疫苗抹的接種后GMT有較高的趨勢，盡管95%CI是重疊的(圖25)。在60歲以上的受試者中，2種流感疫苗滿足歐洲官方對每年注冊的流感失活疫苗的要求[關于用于免疫學評價年度毒林變化的協調流感疫苗要求的指引說明"(CPMP/BWP/214/96)](表46)。表46在第21天時的血清保護率、血清陽轉率和轉變因子(免疫原性的ATP人群)<table>tableseeoriginaldocumentpage131</column></row><table>N-受試者總數；％=在第21天時滴度處于特定范圍內的受試者百分率；CI=置信區間實施例XII—用含裂解流感抗原制備物、以兩個不同濃度的AS03和MPL有佐劑的疫苗在65歲以上老年人群中進行的臨床實驗XII丄研究設計和目標與在成人(18-40歲)中給予的FluarixTM(在比利時稱為a-RixTM)相比，對在老年人群(65歲及以上)中給予的含各種佐劑的GlaxoSmithKlineBiologicals流感候選疫苗的細胞介導免疫應答來說，開放、隨機的1/n期研究表現出非劣效性。評價4個平行組(a)在一個對照組中的75名成人(18-40歲)接受1劑Fluarix(Fluarix組)(b)200名老年受試者(65歲及以上)按照3:3:2隨機分為3組畫一組75名受試者，他們接受以AS03+MPL佐劑化的流感疫苗(濃度1-25嗎)-一組75名受試者，他們接受以AS03+MPL佐劑化的流感疫苗(濃度2-50jug)■具有50名受試者的參比Flu組，他們接受1劑Fluarix##蹄首要目標是就產生至少兩種不同細胞因子(CD40L、IL-2、TNF-a、IFN-力的流感特異性CD4T-淋巴細胞的頻率而言，與在成人(18-40歲)中給予的FluarixTM相比，在老年受試者(65歲或以上)中給予的有佐劑流感疫苗在接種后21天表3E見出非劣效性。次要目標是(a)評^h在老年人(65歲及以上)中肌內給予疫苗后的21天當中用有佐劑候選流感疫苗接種的安全性和反應原性。FluarixTM用作參比。(b)評價用有佐劑流感候選疫苗接種后21、90和180天的體液免疫應答(抗血細胞凝集素滴度)。FluarixTM用作參比。#;豬第三目標是評價用有佐劑流感疫苗接種后21、90和180天的細胞介導的免疫應答(產生IFN-y、IL-2、CD40L和TNF-a以及記憶B-細胞應答)。FluarixTM用做參比。xii.2.疫苗組成和給予用AS03+MPL(每劑25ng)系統佐劑化的流感疫苗也用于在實施例XI中闡述的研究。用AS03+MPL(每劑50昭)系統佐劑化的流感疫苗具有相同組成，只是MPL濃度加倍。方法與實施例VIII中針對AS03+MPL佐劑化的流感疫苗描述的方法相同，唯一的區別是MPL濃度加倍。對照全劑量FluarixTM,通過IM給予。每名受試者進行4次預定隨訪于0、21、90和180天的每次隨訪時收集血樣，以評價免疫原性。接種程序在笫0天進行1次流感疫苗注射。xii.3.免疫原性結果XII.3.1.CMI終點和結果一/,的i要終^在第21天在產生至少兩種不同細胞因子(IL-2、IFN-y、TNF-a和CD40L)的測試中，依據每106個細胞中流感特異性CD4T-淋巴細胞頻率的所有受試者的CMI應答為評價CMI應答，如下分析流感特異性CD4的頻率使用涉及對數變換滴度的ANCOVA模型獲得依據有佐劑疫苗和FluYNG接種的組之間流感特異性CD4頻率的GM比率。ANCOVA模型包括作為固定效果的疫苗組和作為回歸量的接種前對數變換滴度。GM比率及其98.75%CI來源于模型中相反的對應組的指數變換。調整的GM的98.75%CI通過以上ANCOVA模型的組最小平方法的98.75%CI的指數變換獲得。潛耒一推理為V^n^7)在用"合并的抗原II"體外再剌激后，于第21天產生至少兩種細胞因子(IL-2、IFN-y、TNF-a和CD40L)的流感特異性CD4T-淋巴細胞的調整后GM和GM比率(及其98.75%CI)示于表47。對于每種有佐劑流感疫苗，GM比率的雙側98.75%CI的上限遠低于2.0的臨床限度。這表明了相比于在18-40歲的成人中給予的FluarixTM疫苗給予給老年受試者的兩種有佐劑流感疫苗就流感特異性CD40的接種后頻率而言的非劣效性。表47第21天產生至少兩種細胞因子的流感特異性CD4的調整的GM比率(免疫原性的ATP人群)<table>tableseeoriginaldocumentpage134</column></row><table>調整的GM-根據基線滴度調整的幾何平均抗體；N-接種前和接種后結果可用的受試者^:目；98.8%CI-調整的GM比率的98.8%置信區間(Ancova模型對基線調整)；LL-上限；UL-下限。潛果-潛迷》浙〈恩20主要發現是'接種前CMI應答如果在年輕人中比在老年人中高*接種后，o流感疫苗對年輕成人(18-40歲)中的CMI應答有加強作用o在已接受有佐劑流感疫苗的老年人中的CMI應答與年輕成人中的CMI應答相當。'當我們對比Fluarix(18-40歲)和F1U/AS03+MPL(濃度l)時，除了IFNy之外，對于所有測試，與Fluarix(18-40歲)相比，接種前和接種后之間針對所研究的所有細胞因子(IL-2、CD40L、TNF-ot和IFN-力的CD4T淋巴細胞應答的差異在采用有佐劑疫苗時都顯著較高。應當指出的是，體外剌激用Flu抹(i)B/江蘇,(")A/H3N2/紐約和(iii)A/H3N2/懷俄明進行，而不是包含在疫苗中的A/HlNl/新喀里多尼亞。但是，包含來自一部分受試者的A/HlNl/新喀里多尼亞疫苗棘的初步數據表明結果是相似的。潛果-年,#三泉^1W)為了評價第三終點，在第0、21、90和180天檢測流感特異性CD4/CD8T-淋巴細胞和記憶B細胞的頻率。總結了對于每種抗原、每個疫苗組在笫0和21天的流感特異性細胞因子陽性的CD4/CD8T-淋巴細胞的頻率(描述統計)。非參數檢驗(Wilcoxon檢驗)用于對比兩個組之間的局部差異(才炎/"悉^^欽#F/ww/jctm),計算在各個測試中針對每種抗原的統計學p-值。在各個測試中針對每個接種組和每種抗原計算21天/0天(接種后/接種前)之間的應答個體差異的描述統計。非參數檢驗(Wilcoxon檢驗)用于對比個體差異(接種后/接種前接種)，計算每個不同檢驗中每種抗原的統計學p-值。用于對比流感特異性CD4T-淋巴細胞頻率差異的Wilcoxon檢驗的p-值示于表48。表48推理統計來自Kruskal-Wallis檢驗的CD4T細胞在各個時間點的p-值(免疫原性的ATPA^)<table>tableseeoriginaldocumentpage135</column></row><table>組1:用AS03+MPL佐劑化的流感疫苗(濃度1)組2:用AS03+MPL佐劑化的流感疫苗(濃度2)主要結論是(a)流感特異性CD4的接種前GM頻率在所有老年受試者組中都是相似的，但在18-40歲的成人中較優。(b)在用有佐劑疫苗接種的老年受試者中和在FluarixTM接種的18-40歲成人中，流感特異性CD4T淋巴細胞的接種后(第21天)頻率是相似的。(c)與FluarixTM相比，在用有佐劑疫苗接種后，老年受試者中流感特異性CD4T淋巴細胞的接種后(笫21天)頻率顯著較高。(d)流感特異性CD8T細胞的接種前和接種后GM頻率在所有組中都基本相似。潛^-^/介沐濕i瘦應吝煞《在笫0、21、90和180天血清血凝反應抑制(HI)抗體滴度，針對疫苗中提供的3種流感病毒抹的每一種單獨測試(抗-HlNl、抗-H3N2和抗-B抗體)。抗所有疫苗抗原的HI抗體的截取值在分析前由實驗室確定(等于1:10)。血清陰性受試者是其抗體滴度低于截取值的受試者。血清陽性受試者是其抗體滴度大于或等于截取值的受試者。低于測定截取值的抗體滴度以一半截取值的任何值給出。基于HI抗體滴度，計算以下參數(j)在第0天和21天的ffl抗體的幾何平均滴度(GMT)，采用對數滴度轉換平均值的反對數計算(k)笫21天時的血清轉變因子(SF)，定義為相比于第0天在第21天時血清HIGMT的增加倍數。(I)笫21天時的血清陽轉率(SC),定義為接種前HI滴度<1:10且接種后滴度>1:40的接種者百分率，或接種前滴度>1:10且接種后滴度有最少達4倍增加的接種者百分率。(m)第21天時的血清保護率(SPR),定義為血清HI滴度>1:40的接種者的百分率。分別獲得每個組的GM的95%CI。假定對數轉換滴度以未知方差正態分布，首先獲得對數轉換滴度平均值的95%CI。然后通過對數轉換滴度平均值的95%CI的指數轉換獲得GM的95%CI。具體抗體檢測的缺失的血清學結果不被替換。因此，在給定時間點無血清學結果的受試者不影響該時間點的測定分析。似顛^吝潛果f^iZ^4i^全部3種疫苗抹的HI抗體的接種前GMT在4個治療組中都處于相同范圍內。在接種后，相比于相同群體中的標準Fluarix，增加老年人中的體液應答的2種佐劑有明顯的作用。GMT是*對于AS03+MPL(濃度2)，針對H1N1的GMT顯著較高，.對于兩種佐劑，針對H3N2和B的GMT顯著較高，接種后21天，Fluarix(18-40歲)受試者對新嚷里多尼亞和B/江蘇抹的HI應答較高。如表49所示，在60歲以上的受試者中，有佐劑流感疫苗超出了歐洲官方對每年注冊的裂解病毒體流感疫苗的要求["關于用于免疫學評價年度毒抹變化的協調流感疫苗要求的指引說明"(CPMP/BWP/214/96)]。在接種后，就HI抗體的血清保護率而言，FluarixO65歲)組和以下組具有統計學差異'FluAS03+MPL(濃度2)，對于A/新喀里多尼亞抹對于各個疫苗抹，2種有佐劑流感疫苗組的血清保護率相比于Fluarix(18-40歲)組處于相同范圍內。就HI抗體的陽轉率而言，Fluarix(>65歲)組和以下組具有統計學差異'FluAS03+MPL(濃度2)，對于A/新喀里多尼亞抹FluAS03+MPL(濃度1)，對于B/江蘇抹對于各個疫苗抹，2種有佐劑流感疫苗組的陽轉率相比于Fluarix(18-40歲)組處于相同范圍內，新喀里多尼亞林除外。表49在第21天的血清保護率、陽轉率和轉變因子(免疫原性的ATP人群)<table>tableseeoriginaldocumentpage138</column></row><table>N-受試者總數；％=在21天時滴度處于特定范圍內的受試者百分率；CI=置信區間XII.3.2.免疫原性結論(a)相比于18-40歲的成人，老年人中的流感特異性CD4的接種前頻率明顯較差。在用FluarixTM接種后，相比于年輕人，老年人中的接種后頻率(第21天)仍較差。相反，相比于在18-40歲成人中用FluarixTM接種，在用有佐劑疫苗接種老年受試者后表現出流感特異性CD4的接種后頻率的非劣效性。(b)關于依據HI抗體滴度的體液免疫應答，所有流感疫苗都滿足歐洲官方對每年注冊的流感失活疫苗的要求["關于用于免疫學評價年度毒抹變化的協調流感疫苗要求的指引說明"(CPMP/BWP/214/96)]。在老年人中，有佐劑疫苗介導至少一種趨勢針對流感血細胞凝集素的體液免疫應答比FluarixTM高。表50總結了相比于FluarkTM在老年受試者中由有佐劑疫苗介導的針對每種疫苗株的體液免疫應答之間的差顯著異。相比于用FluarixTM接種的18-40歲成人，用有佐劑疫苗接種的老年受試者顯示出一種趨勢在第21天時抗A/紐約抹的接種后GMT和血清轉變因子較高。表50在老年受試者中有佐劑疫苗和Fluarix之間體液免疫應答的顯著差異<table>tableseeoriginaldocumentpage139</column></row><table>表52成人中訴求癥狀的強度等級<table>tableseeoriginaldocumentpage140</column></row><table>*發熱定義為腋下體溫>37.5匸(".5°F)局部注射部位發紅/腫脹的最大強度如下記錄0是0mm;l是〉0至^20mm;2是〉20至^50mm;3是〉50mm。如下記錄發熱的最大強度1是>37.5至^38.0。C;2是〉38.0至<39.0。C;3是〉39.0。C。研究者針對所有其它AE進行強度判斷，其它AE即主動訴求的癥狀，包括在研究當中報告的SAE。評價基于研究者的臨床判斷。記錄的每種AE的強度分配為以下的一種類別1(輕微)-受試者容易耐受的AE，引起最低的不適，且不干擾曰常的活動；2(中等)=不適足以干擾每日正常活動的AE;3(嚴重)=阻礙每曰正常活動的AE(在成人/青少年中，這種AE例如會阻礙工作/上學，應必須給予正確的治療)。XII.4.2.記錄不良事件(AE)就局部和全身癥狀這二者來說，發現釆用有佐劑疫苗在老年受試者中觀察到的反應原性比相同群體中用FluarixTM觀察到的高。但是，其顯示出與成人群體中觀察到的水平相似。相比于用FluarixTM在老年受試者中觀察到的反應原性相比，癥狀的發病率和強度在用有佐劑疫苗接種后增加(圖28)。在所有情況下，癥狀都快速消退。3級癥狀表現出一種趨勢與接受有佐劑疫苗(其中MPL為較低濃度)的組別相比，接受最高MPL濃度有佐劑的疫苗的組別較高。但是，在所有情況下，癥狀都快速消退。權利要求1.(a)流感病毒或其抗原性制備物和(b)水包油乳液佐劑在生產免疫原性組合物中的用途，所述免疫原性組合物用于在人中誘導抗所述病毒或抗原性組合物的以下至少一種i)改善的CD4T-細胞免疫應答，ii)改善的B-記憶細胞應答，其中所述水包油乳液包含可代謝油、甾醇和乳化劑。2.流感病毒或其抗原性制備物和水包油乳液佐劑在制備免疫原性組合物中的用途，所述免疫原性組合物用于接種老年人對抗流感，其中所述水包油乳液包含可代謝油、甾醇和乳化劑。3.權利要求2的用途，其中所述組合物在所述老年受試者中i秀導抗所述病毒或抗原性組合物的改善的CD4T-細胞免疫應答。4.權利要求1-3中任一項的用途，其中所述水包油乳液包含油滴，所述油滴的至少70%以強度計直徑低于1)nm。5.權利要求1-4中任一項的用途，其中所述水包油乳液包含油滴，所述油滴的至少70%以強度計直徑低于500nm。6.權利要求1-5中任一項的用途，其中所述水包油乳液包含油滴，所述油滴的至少80%以強度計直徑低于300nm。7.權利要求1-6中任一項的用途，其中所述水包油乳液包含油滴，所述油滴的至少90%以強度計直徑在120-200nm的范圍內。8.權利要求1-7中任一項的用途，其中所述甾醇為ot-生育酚。9.權利要求8的用途，其中所述a-生育酚以所述免疫原性組合物總體積的1.0%至20%的量存在。10.權利要求9的用途，其中所述a-生育酚以所述免疫原性組合物總體積的1.0%至5.0%的量存在。11.權利要求1-10中任一項的用途，其中所述可代謝油為畫烯。12.權利要求1-11中任一項的用途，其中所述可代謝油以所述免疫原性組合物總體積的0.5%至20%的量存在。13.權利要求12的用途，其中所述可代謝油以所述免疫原性組合物總體積的1.0%至10%的量存在。14.權利要求13的用途，其中所述可代謝油以所述免疫原性組合物總體積的2.0%至6.0%的量存在。15.權利要求1-14中任一項的用途，其中所述水包油乳液還包含甾醇。16.權利要求15的用途，其中所述另外的甾醇為膽固醇。17.權利要求8-16中任一項的用途，其中所述鯊烯:a-生育酚的比例等于或低于1。18.權利要求1-17中任一項的用途，其中所述乳化劑為Tween80。19.權利要求18的用途，其中所述乳化劑以所述免疫原性組合物的0.01%至5.0%重量(重量/重量)的量存在。20.權利要求19的用途，其中所述乳化劑以所述免疫原性組合物的0.1%至2.0%重量(重量/重量)的量存在。21.權利要求1-20中任一項的用途，其中所述水包油乳液佐劑具有以下組成2-10%的畫烯、厶10。/。的a-生育酚和0.3-3%的Tween80。22.權利要求1-21中任一項的用途，其中所述免疫原性組合物還包含TLR-4配體。23.權利要求22的用途，其中所述TLR-4配體選自脂質A的無毒衍生物，例如3D-MPL;脂質A的合成書t生物；MDP;和RSVF蛋白。24.權利要求23的用途，其中所述脂質A衍生物是3D-MPL。25.權利要求24的用途，其中3D-MPL以每劑組合物10-:50昭(重量/體積)的量存在。26.權利要求25的用途，其中3D-MPL以每劑組合物約25嗎(重量/體積)的量存在。27.權利要求1-26中任一項的用途，其中所述免疫原性組合物的給予額外地誘導改善的CD4T-細胞免疫應答和改善的B-記憶細胞應答二者。28.權利要求1和3-27中任一項的用途，其中所述CD4T-細胞免疫應答包括誘導交叉反應性CD4T輔助應答。29.權利要求1-28中任一項的用途，其中所述目標群體為50歲以上。30.權利要求1-29中任一項的用途，其中所述目標群體為65歲以上的老年人。31.流感病毒或其抗原性制備物在生產免疫原性組合物中的用途，所述免疫原性組合物用于再接種先前用流感病毒或其抗原性制備物和水包油乳液佐劑接種的人，所述水包油乳液佐劑包含可代謝油、甾醇和乳化劑。32.權利要求31的用途，其中所述用于再接種的組合物包含佐劑。33.權利要求32的用途，其中所述佐劑選自水包油乳液佐劑、鋁佐劑、TLR-4配體、皂苦。34.權利要求31-33中任一項的用途，其中所述水包油乳液佐劑如權利要求1、2和4-21中任一項的定義，所述TLR-4配體如權利要求23-26中任一項的定義。35.權利要求31-34中任一項的用途，其中所述用于再接種的免疫原性組合物包含流感病毒或其抗原性制備物，所述流感病毒或其抗原性制備物與用于笫一次接種的裂解流感病毒或其裂解病毒抗原性制備物共有以下至少一種i)共同的CD4T-細胞表位，ii)共同的B細胞表位。36.權利要求31-35中任一項的用途，其中再接種后的免疫應答是以下的任何一種或兩種或全部抗流感病毒或其抗原性制備物的改善的CD4應答，或改善的體液應答或改善的B細胞記憶應答。37.(a)笫一流感抹的流感病毒或其抗原性制備物和(b)水包油乳液佐劑在制備免疫原性組合物中的用途，所述免疫原性組合物用于對抗變體流感抹引起的流感感染的保護作用，其中所述水包油乳液包含可代謝油、甾醇和乳化劑。38.權利要求37的用途，其中所述水包油乳液佐劑如權利要求1、2和4-21中任一項的定義，所述TLR-4配體如權利要求22-26中任一項的定義。39.權利要求1-38中任一項的用途，其中所述流感病毒或其抗原性制備物是單價的、二價的或三價的。40.權利要求1-39中任一項的用途，其中所述流感病毒或其抗原性制備物來自三種不同的流感抹。41.權利要求40的用途，其中至少一種毒抹與大流行爆發相關，或者具有與大流行爆發相關的潛力。42.權利要求41的用途，其中所述大流行毒棘選自H5N1、H9N2、H7N7、H2N2和H1N1。43.權利要求31-42中任一項的用途，其中所述第一次接種用含可潛在地引起大流行爆發的流感株的裂解流感組合物進行，所述再接種用循環大流行毒4朱進行。44.權利要求1-43中任一項的用途，其中所述免疫原性組合物包含低劑量的HA抗原。45.權利要求1-44中任一項的用途，其中所述流感抗原或其抗原性制備物是卵源的或組織培養源的。46.—種設計疫苗的方法，所述疫苗針對已知要通過004+T細胞活化治愈或治療的疾病，所述方法包括1)選擇含CD4+表位的抗原，和2)組合所述抗原和在權利要求1、2、4-21中任一項定義的水包油乳液佐劑，其中所述疫苗在所述哺乳動物中給予時能夠在所述哺乳動物中誘導增強的CD4應答。47.權利要求1-46中任一項的用途，其中所述流感病毒選自裂解流感病毒、全流感病毒、亞單位流感病毒、流感病毒顆粒及其抗原性制備物。48.權利要求47的用途，其中所述流感病毒是裂解流感病毒抗原或其抗原制備物。全文摘要本發明涉及流感疫苗制劑和用于免疫對抗流感疾病的疫苗接種方案。具體地說，本發明涉及含水包油乳液佐劑和任選的3D-MPL的疫苗制劑、其在藥物中的用途，尤其是其在增強對流感抗原的免疫應答方面的用途，并涉及制備方法，其中所述水包油乳液包含甾醇、可代謝油和乳化劑。文檔編號A61K39/145GK101180076SQ200680017562公開日2008年5月14日申請日期2006年3月21日優先權日2005年3月23日發明者E·J·哈農,J·斯蒂芬尼申請人:葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司