生物材料的制作方法

專利名稱：：生物材料的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的合成骨材料領(lǐng)域，具體涉及用于組織工程的包含膠原蛋白、磷酸釣和任選的糖胺聚糖的多孔整體式和多孔分層式支架。
背景技術(shù)：
：天然骨是膠原蛋白、包括糖胺聚糖的非膠原蛋白有機(jī)相、和磷酸釣的復(fù)合生物材料。其復(fù)合的分層結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了特殊的機(jī)械性質(zhì)，包括高的硬度、強(qiáng)度和斷裂韌性，這些性質(zhì)使骨可以承受日常經(jīng)受的生理應(yīng)力。本領(lǐng)域的研究人員面臨的挑戰(zhàn)是制備組成和結(jié)構(gòu)會(huì)使得天然骨在人體或動(dòng)物體內(nèi)在合成材料內(nèi)部或周圍生長(zhǎng)的合成材料。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，骨通過身體環(huán)境中形成的骨類磷灰石層直接結(jié)合人體內(nèi)的磷酸釣(稱為生物活性的性質(zhì))。另一方面，已知膠原蛋白和包括膠原蛋白和其它生物有機(jī)物例如糖胺聚糖的共聚物是多種細(xì)胞類型附著和增殖的最佳基質(zhì)，所述多種細(xì)胞類型包括人體內(nèi)負(fù)責(zé)骨的生成和維持的那些細(xì)胞。羥磷灰石是最普遍用作骨替代材料中的成分的磷酸鈣。但是，和例如透釣磷石、磷酸三鈞和磷酸八鉀等其它形式的磷酸釣材料相比，羥磷灰石是相對(duì)不可溶的材料。由于該材料在人體中的再吸收速率特別低，所以當(dāng)制備生物材料時(shí)，磷灰石相對(duì)低的溶解度是不利的。例如羥磷灰石的磷酸鈣是機(jī)械上的剛性材料。但是，和天然骨相比，它們是相對(duì)脆性的。膠原蛋白是機(jī)械上的韌性材料，但是與天然骨相比具有相對(duì)較低的剛性。包含膠原蛋白和糖胺聚糖的共聚物的材料比單獨(dú)的膠原蛋白具有更高的韌性和剛性，但是，與天然骨相比，仍然具有較低的剛性。之前制備機(jī)械韌性高于羥磷灰石且硬度超過膠原蛋白及膠原蛋白與糖胺聚糖共聚物的人工骨替代材料的嘗試包括通過機(jī)械混合結(jié)合膠原蛋白和罅灰石。這種機(jī)械方法記載于EP-A-0164484中。最新的進(jìn)展包括，通過機(jī)械混合羥磷灰石、膠原蛋白和4-硫酸軟骨素來制備包含這些組分的骨替代材料。該技術(shù)描述在EP-A-0214070中。該文獻(xiàn)還描述了4-硫酸軟骨素與膠原蛋白的脫水熱交聯(lián)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，包含磷灰石、膠原蛋白和4-硫酸軟骨素的材料具有良好的生物相容性。將磷灰石與膠原蛋白和任選的4-硫酸軟骨素機(jī)械混合，基本上形成膠原蛋白/4-硫酸軟骨素包覆的磷灰石顆粒。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，盡管該材料是生物相容性的，但是在人體或動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生有限的天然骨內(nèi)生長(zhǎng)，而且不能重建合成材料的磷酸鉀相。由外傷、畸形或疾病所損傷的骨部位的修復(fù)給骨科醫(yī)生帶來了特殊的挑戰(zhàn)，這是因?yàn)榕c皮膚、神經(jīng)和大多數(shù)其它組織類型中的缺損不同，骨骼的缺損包括多種截然不同的組織類型(即骨、軟骨、腱和韌帶)，涉及承受通常機(jī)械負(fù)荷的部位，并跨越礦化組織至未礦化組織之間的界面(例如韌帶插入點(diǎn)，骨/軟骨界面的"潮標(biāo)")。現(xiàn)有的臨床方法或使用非可再吸收的修復(fù)植入物、自體同源的或異源的組織移植物、化學(xué)藥劑、細(xì)胞移植或這些方法的組合來解決骨骼缺損的修復(fù)。雖然這些方法在單一組織類型的治療中取得了一些成功，但是在涉及礦化和未礦化組織之間的界面例如關(guān)節(jié)連接處缺損的情況下，例如會(huì)導(dǎo)致至多是不完全的愈合。此外，即使最成功的現(xiàn)有治療也要求或從供體部位獲得組織和/或縫合骨、軟骨、韌帶或腱。前者方法遭受供體部位缺乏和供體部位發(fā)病之苦，而后者則難于實(shí)施，并且產(chǎn)生為縫合孔形式的另外的缺損。術(shù)語復(fù)合支架(compositescaffold)和分層支架(layeredscaffold)是同義的，指的是包括兩層或多層的支架，其中每層的材料組成基本上與其相鄰層的材料組成不同。術(shù)語單層支架(single-layeredscaffold)或整體式支架(monolithicscaffold)是同義的，指的是只包含一層的支架，其中每層內(nèi)的材料組成大體上是整體均勻的。少數(shù)最新的嘗試試圖開發(fā)采用多孔的分層支架治療或只涉及軟骨或同時(shí)涉及骨和軟骨的關(guān)節(jié)連接處缺損的組織工程策略。這些構(gòu)想試圖同時(shí)誘導(dǎo)骨和軟骨的再生，但是對(duì)每個(gè)使用單獨(dú)的支架(Niederaueretal.,2000;Schaeferetal"2000;Gaoetal"2001;Gaoetal"2002;Schaeferetal"2002;Sherwoodetal"2002;Hungetal.,2003;HunzikerandDriesang,2003)。分層支架的附加特征是它們擁有通過將骨層直接固定到軟骨下的骨板上來實(shí)現(xiàn)無縫合固定的潛力。如果軟骨部保持牢固地固定至骨部，就不需要另外的固定。無縫合固定也可以使得涉及腱和韌帶到骨的插入點(diǎn)的缺損治療成為可能。盡管這種新方法有前景，但是有兩個(gè)缺點(diǎn)可能限制迄今為止所報(bào)告的分層支架的有效性。第一個(gè)缺點(diǎn)涉及用于該支架各層的材料?？稍傥盏暮铣删酆衔锸怯糜谲浌菍拥奈ㄒ徊牧?，其通常也是許多這些支架中骨部的成分。盡管容易制造，但是已知合成聚合物對(duì)細(xì)胞附著和增殖的促進(jìn)不及如膠原等天然聚合物，并且當(dāng)其降解時(shí)會(huì)釋放出高濃度的酸。此外，對(duì)于必需修復(fù)腱或韌帶的應(yīng)用，不管其交聯(lián)的方式如何，可再吸收的合成聚合物沒有足夠的強(qiáng)度和剛性來承受機(jī)能恢復(fù)訓(xùn)練期間施加的甚至是減少的負(fù)荷。常規(guī)的分層支架的第二個(gè)缺點(diǎn)涉及各層之間的界面。天然的關(guān)節(jié)連接處和腱/韌帶插入點(diǎn)的特征在于礦化和未礦化區(qū)之間膠原纖維蛋白的連續(xù)性。得到的平滑過渡的系統(tǒng)(軟界面)給這些部位提供內(nèi)在的機(jī)械穩(wěn)定性，使得它們承受生理負(fù)荷而沒有機(jī)械故障。與此相反，大多數(shù)現(xiàn)有的分層支架含有硬界面，其在兩種不同材料之間形成明顯邊界?？p合(Schaeferetal"2000)、用纖維蛋白粘合劑粘接(Gaoetal"2001)和其它技術(shù)(Gaoetal.，2002;Hungetal.,2003)已經(jīng)用來強(qiáng)化該界面。但是，在甚至是對(duì)照動(dòng)物模型中仍然報(bào)道界面剝離。這些縫合和粘接方法復(fù)雜，重現(xiàn)性差。之前的工作已經(jīng)開發(fā)出通過其可以控制冷凍干燥方案的參數(shù)以生產(chǎn)膠原蛋白和一種或多種糖胺聚糖(GAGs)的多孔支架的方法(Yannasetal"1989;O'Brienetal"2004;O'Brienetal"2005;Loreeetal1989)。這些技術(shù)允許支架的特征例如孔徑大小和長(zhǎng)寬比以受控方式改變，已知該參數(shù)對(duì)外傷或傷口部位的愈合反應(yīng)具有顯著的影響。但是，對(duì)于涉及骨骼和肌骨骼缺陷的損傷的治療，必需開發(fā)技術(shù)來生產(chǎn)材料組成和機(jī)械特征與骨的材料組成和機(jī)械特征緊密配合的多孔支架，這與未礦化的膠原蛋白-GAG支架相反。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明旨在解決至少一些與現(xiàn)有技術(shù)相關(guān)的問題。一種制備包含無機(jī)材料和有機(jī)材料的復(fù)合生物材料的方法，其包括(a)提供第一漿組合物，其包含液體載體、無機(jī)材料和有機(jī)材料；(b)提供用于所述漿的模具；(c)使所述漿沉積在所述模具中；(d)將沉積在所述模具中的漿冷卻至所述液體載體轉(zhuǎn)化為多個(gè)固體晶體或顆粒的溫度；(e)優(yōu)選通過升華和/或蒸發(fā)移除至少一些所述多個(gè)固體晶體或顆粒，以留下含有無機(jī)材料和有機(jī)材料的多孔復(fù)合材料；和(f)將所述材料從所述模具中移走。此處所用的術(shù)語生物材料指的是可與人體或動(dòng)物體生物相容的材料。此處所用的術(shù)語漿包括漿、溶液、懸浮液、膠體和分散體。所述無機(jī)材料會(huì)通常包括磷酸釣材料。所述有機(jī)材料會(huì)通常包括生物有機(jī)物，例如一種能溶解或懸浮在含水介質(zhì)中以形成漿的物質(zhì)。例子包括白蛋白、糖胺聚糖、乙酰透明質(zhì)酸、殼聚糖、和包含膠原蛋白的部分多肽序列的合成多肽的一種或多種。膠原蛋白是優(yōu)選的材料，任選地與糖胺聚糖一起使用。此處使用的術(shù)語膠原蛋白包括重組人(rh)膠原蛋白。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述無機(jī)材料包括磷酸鉤材料，所述有機(jī)材料包括膠原蛋白和任選的糖胺聚糖。這產(chǎn)生包含所述磷酸鉤材料和膠原蛋白以及任選的糖胺聚糖的多孔復(fù)合材料。優(yōu)選地，所述第一漿包含膠原蛋白和磷酸鈣材料的共沉淀物。更優(yōu)選地，所述第一漿包含膠原蛋白、磷酸鈣材料和糖胺聚糖的三元共沉淀物。作為選擇，所述第一漿可以只包含膠原蛋白和磷酸鉀材料及任選的糖胺聚糖的機(jī)械混合物?？梢酝ㄟ^例如EP-A-0164484和EP-A-0214070中描述的常規(guī)技術(shù)來生產(chǎn)該漿。雖然可以使用機(jī)械混合物形成所述漿，但是優(yōu)選膠原蛋白和所述磷酸鉀材料的共沉淀物或膠原蛋白、磷酸鈞材料和糖胺聚糖的三元共沉淀物。所述磷酸釣材料，可以選自，例如透鉤磷石、磷酸八鈣和/或磷灰石中的一種或多種。所述磷酸鉀材料優(yōu)選包含透釣磷石。所述漿的pH優(yōu)選為2.5到6.5，更優(yōu)選為2.5到5.5,還更優(yōu)選為3.0到4.5,并且還更優(yōu)選為3.8到4.2。所述漿組合物可以包含一種或多種糖胺聚糖。所述漿組合可以包含一種或多種磷酸釣材料。不排除在前體漿中存在其它物質(zhì)(例如銀、硅、二氧化硅、食鹽、糖等)。至少一些所述多個(gè)固體晶體或顆粒可以通過升華和/或蒸發(fā)除去，以留下包含膠原蛋白、磷酸鉤材料和任選的糖胺聚糖的多孔復(fù)合材料。優(yōu)選的方法是升華。步驟(d)和(e)可能受到凍干技術(shù)的影響。如果所述液體載體是水，所述升華步驟包括降低模具周圍環(huán)境的壓力，將漿冷凍至水/水/水蒸氣系統(tǒng)的三相點(diǎn)以下，然后在獲得的真空壓力下將溫度升至比固體-蒸氣轉(zhuǎn)化溫度更高的溫度。當(dāng)周圍的液體蒸氣分壓低于當(dāng)前溫度下凍結(jié)液體分壓時(shí)，所述產(chǎn)品中的水通過升華直接轉(zhuǎn)化為蒸氣。該溫度通常升至ox:或以上。進(jìn)行該步驟以通過升華從所述冷凍漿中除去水晶體。凍干參數(shù)可以被調(diào)整，以控制所需的孔徑大小和長(zhǎng)寬比。一般地，較慢的冷卻速率和較高的最終凍結(jié)溫度(例如以大約0.25t:每分鐘冷卻至約-iot:的溫度)有利于形成具有更大長(zhǎng)寬比的大孔，而較快的冷卻速率和較低的最終凍結(jié)溫度(例如以大約2.5t:每分鐘冷卻至約-4ox:的溫度)有利于形成等軸的小孔。此處所用的術(shù)語"模具"意欲包括任何能夠成形、容納或支持所述漿組合物的模具、容器或基質(zhì)。因此，最簡(jiǎn)單形式的模具可只包括支承表面。所述模具可以是任何所需的形狀，并且可以由包括聚合物(例如聚砜、聚丙烯、聚乙烯)，金屬(例如不銹鋼、鈦、鈷鉻)，陶瓷(例如氧化鋁、氧化鋯)，玻璃陶瓷，和玻璃(例如硼硅酸鹽玻璃)的任何適合的材料制成。本申請(qǐng)人2004年10月28日提交的較早的申請(qǐng)PCT/GB04/004550描述了膠原蛋白、透鈣磷石和糖胺聚糖的三元共沉淀物和其制備方法。PCT/GB04/004550的內(nèi)容在此通過引用并入本文。在附錄1中提供PCT/GB04/004550的副本。PCT/GB04/004550中描述的方法包括提供包含膠原蛋白、釣源和磷源以及糖胺聚糖的酸性水溶液；和將所述膠原蛋白、透釣磷石和糖胺聚糖一起從所述水溶液中沉淀出來，以形成三元共沉淀物。術(shù)語共沉淀物指的是兩種或三種化合物的沉淀，其中所述化合物基本上同時(shí)從相同的溶液/分散體中沉淀。其區(qū)別于由所述成分的機(jī)械混合，成的，料，尤其是當(dāng)這，，分單獨(dú)地從例如不同的，液中沉淀時(shí)。在制備所述共沉淀物的過程中，所述鈣源優(yōu)選選自硝酸鈣、醋酸4丐、氯化鈣、碳酸鈣、鈣醇鹽、氫氧化鈣、硅酸鈣、硫酸鋦、葡萄糖酸鈣和肝素釣鹽中的一種或多種。肝素鈣鹽可以源于豬的腸粘膜。合適的鈣鹽可商業(yè)得到，例如從Sigma-Aldrich公司得到。磷源優(yōu)選選自磷酸二氫銨、磷酸氫二銨、磷酸、二水合正磷酸氫二鈉(Na2HP04.2H20，有時(shí)被稱為GPRSorensen鹽)和磷酸三甲酯，磷酸的堿金屬鹽(例如鈉或鉀)，磷酸的堿土金屬鹽(例如鎂或鉀)中的一種或多種。糖胺聚糖是含有長(zhǎng)的無支鏈聚糖的大分子族，所述聚糖含有重復(fù)的二糖單元。優(yōu)選地，所述糖胺聚糖選自硫酸軟骨素、硫酸皮膚素(dermatin)、肝素、硫酸肝素、硫酸角蛋白和透明質(zhì)酸中的一種或多種。硫酸軟骨素可以是4-硫酸軟骨素或6-硫酸軟骨素，兩者都可商業(yè)得到，例如從Sigma-Aldrich公司得到。所述6-硫酸軟骨素可以源于鯊魚軟骨。透明質(zhì)酸可以源于人的臍帶。肝素可以源于豬的腸粘膜。所述膠原蛋白可以是可溶或不可溶的，并可以源于任何動(dòng)物的任何組織，并且可以用許多常規(guī)技術(shù)提取。沉淀可以通過在酸性水溶液中結(jié)合所述膠原蛋白、鈣源、磷源和糖胺聚糖，然后使所述溶液靜止直到出現(xiàn)沉淀，攪拌溶液，用堿滴定液例如氨水滴定，加入成核劑例如預(yù)制的透鈣磷石，改變鈣源加入的速率，或這些或本領(lǐng)域中公知的許多其它技術(shù)的任意組合來實(shí)現(xiàn)。將會(huì)理解，其它的成分可以存在于所述漿中。例如，可以任選地將生長(zhǎng)因子、基因、藥物或其它生物活性物質(zhì)單獨(dú)地或以組合加入到漿中。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法還有利地包括提供第二漿組合物，其包括液體載體和有機(jī)材料及任選的無機(jī)材料；和在所述冷卻步驟之前，在沉積所述第一漿組合物之前或之后將所述第二漿組合物沉積在所述模具中。如前所述，所述有機(jī)材料將通常包含膠原蛋白(包括重組人(rh)膠原蛋白)、糖胺聚糖、白蛋白、乙酰透明質(zhì)酸、殼聚糖和包含膠原蛋白的部分多肽序列的合成多肽的一種或多種。所述第二漿組合物可以包含無機(jī)材料，例如磷酸鈣材料。優(yōu)選地，所述第二漿組合物包含液體載體、膠原蛋白、任選的磷酸鈣材料和任選的糖胺聚糖。在這個(gè)實(shí)施方案中，所述第二漿組合物優(yōu)選包含膠原蛋白和糖胺聚糖的共沉淀物，或膠原蛋白和磷酸鉤材料的共沉淀物，或膠原蛋白、糖胺聚糖和磷酸鈣材料的三元共沉淀物。已經(jīng)關(guān)于所述第一漿的制備討論過共沉淀。作為選擇，所述第二漿可以只包含膠原蛋白和任選的一種或兩種磷酸釣材料和糖胺聚糖的機(jī)械混合物。已經(jīng)關(guān)于所述第一漿的制備討論過機(jī)械混合物。如果存在，所述第二漿中的磷酸釣材料可以選自透鈣磷石、磷酸八鉀和/或磷灰石的一種或多種。所述第一和第二漿組合物將通常作為第一和第二層沉積在模具中。例如，將所述第一漿沉積在模具中，然后是第二漿。然后可以對(duì)所述模具中內(nèi)含物進(jìn)行步驟(d)、(e)和(f)。相應(yīng)地，該方法可以用于形成多層材料，其中至少一層優(yōu)選包含含有膠原蛋白、磷酸釣材料和任選的糖胺聚糖的多孔復(fù)合材料。所述第二漿組合物得到的層可以是多孔的或無孔的層。如果期望多孔層，則所述孔可以通過升華和/或蒸發(fā)在第二漿內(nèi)形成的多個(gè)固體晶體或顆粒來產(chǎn)生。已經(jīng)關(guān)于第一漿討論過這種技術(shù)，并且優(yōu)選包括凍千技術(shù)。所述方法在液相中進(jìn)行，這樣有助于在第一漿層和第二漿層之間的擴(kuò)散。可以以任何成層順序或幾何的方式沉積所述層。例如，所述層可以垂直地(即一層位于另一層上面)、水平地(即一層在另一層旁邊)和/或放射狀地(一個(gè)球形層在下一個(gè)層的上面)定位。根據(jù)本發(fā)明的澆鑄方法能夠制造用于組織工程的多孔單層和多孔分層支架。在所述第一和第二漿組合物沉積在模具中后，所述模具的內(nèi)含物優(yōu)選在冷卻步驟之前靜置多至24小時(shí)。這樣是有利的，因?yàn)槠湓试S在相鄰的層之間不同漿組分的相互擴(kuò)散。這會(huì)導(dǎo)致層間結(jié)合強(qiáng)度的增加。所述第一漿中的液體載體優(yōu)選包含水。所述第二漿中的液體載體也優(yōu)選包含水。將會(huì)理解，可以在所述冷卻步驟之前，在沉積所述第一和/或第二漿組合物之前或之后，在模具中沉積其它的漿層。冷卻步驟之前沉積在模具中的漿的溫度一般會(huì)影響漿的粘度。如果溫度過高，則會(huì)導(dǎo)致漿的粘度過低，這可導(dǎo)致一旦沉積第二漿，則所述第一和第二層的完全相互混合(因而是不期望的)。也應(yīng)該注意，太高的溫度可能導(dǎo)致膠原蛋白變性。另一方面，過低的溫度可能導(dǎo)致漿粘度過高，而不能有效地展開、平滑或成形，并且可能有過早形成冰結(jié)晶體的風(fēng)險(xiǎn)。相應(yīng)地，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在冷卻步驟之前沉積在模具中的第一漿的溫度優(yōu)選從2至40"C,更優(yōu)選從4至37t:,還更優(yōu)選從20至37匸。如果使用多層的漿組合物，則這些范圍也適用于另外的漿。沉積在模具中的第一漿的冷卻步驟優(yōu)選進(jìn)行到《or;的溫度。更優(yōu)選地，冷卻步驟進(jìn)行到-ioo至ox:的溫度，優(yōu)選從-80至-io"c，更優(yōu)選從-40至-20"C。如果使用多層漿組合物，則這些范圍也適用于另外的漿。沉積在模具中的第一漿的冷卻步驟優(yōu)選以0.02-10"C/分鐘的冷卻速率進(jìn)行，更優(yōu)選0.02-6.0t:/分鐘，還更優(yōu)選0.2-2.71C/分鐘。如果使用多層漿組合物，則這些范圍也適用于另外的漿。一般地，較慢的冷卻速率和較高的最終凍結(jié)溫度(例如以大約0.25"c每分鐘的速率冷卻至-iox:的溫度)有利于形成具有較大的長(zhǎng)寬比的大孔，而較快的冷卻速率和較低的最終凍結(jié)溫度(例如以大約2.5"C每分鐘的速率冷卻至-4ox:的溫度)有利于形成等軸的小孔。沉積在模具中的漿的冷卻步驟優(yōu)選在1200kPa，更優(yōu)選50~150kPa，仍更優(yōu)選50~101.3kPa的壓力下進(jìn)行。如果使用多層漿組合物，則這些范圍也適用于另外的漿。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，低于50kPa的壓力可能導(dǎo)致在漿中形成氣泡，而高于200kPa的壓力可能引起相鄰層的過度混合。沉積在模具中的第一漿的厚度優(yōu)選0.1~500mm，更優(yōu)選0.5~20mm，還更優(yōu)選1.0~10mm。如果4吏用多層漿組合物，則這些范圍也適用于另外的漿。厚度超過500mm的層可能難以完全固化，而厚度小于0.1mm的層可幾乎瞬間凍結(jié)，4吏之難以準(zhǔn)確控制水結(jié)晶體成核和生長(zhǎng)的進(jìn)程。所述第一漿在被沉積到模具中之前的粘度優(yōu)選為0.1~50Pa.s,更優(yōu)選0.1~10Pa.s，還更優(yōu)選0.5~5Pa.s。如果4吏用多層漿組合物，則這些范圍也適用于另外的漿。具有過高粘度的漿可能難以展開、平滑和成形，而具有過低粘度的漿可能導(dǎo)致一旦沉積第二漿則所述第一層和第二層就完全相互混合(因而是不期望的)。通過升華除去第一漿中至少一些固體晶體或顆粒的步驟優(yōu)選在0~0.08kPa,更優(yōu)選0.0025~0.08kPa，還更優(yōu)選0.0025~0.04kPa的壓力下進(jìn)行。如果使用多層漿組合物，則這些范圍也適用于另外的漿。比水的三相點(diǎn)壓力(約0.08kPa)高的壓力可能有發(fā)生融化而不是升華的風(fēng)險(xiǎn)，而過低的壓力則難以實(shí)現(xiàn)，并且不一定促進(jìn)升華。關(guān)于通過升華除去第一漿中至少一些固體晶體或顆粒的步驟，如果升華的持續(xù)時(shí)間過短，殘留的水和溶劑可引起所述支架壁的再溶解，進(jìn)而危及所述孔結(jié)構(gòu)。相應(yīng)地，本發(fā)明AiC現(xiàn)，該步驟優(yōu)選進(jìn)行多至96小時(shí)，更優(yōu)選1272小時(shí)，還更優(yōu)選2436小時(shí)。如果使用多層漿組合物，則這些范圍也適用于另外的漿。通過升華除去第一漿中至少一些固體晶體或顆粒的步驟優(yōu)選在-10至60匸，更優(yōu)選040"C，還更優(yōu)選2037"C，還更優(yōu)選25~37^的溫度下進(jìn)行。如果使用多層漿組合物，則這些范圍也適用于另外的漿。如果在升華期間的溫度過低，完成升華所需的時(shí)間可能變得過長(zhǎng)，而過高的溫度(即高于40"C)可具有膠原蛋白變性的風(fēng)險(xiǎn)。如果所述材料包含膠原蛋白和糖胺聚糖，則根據(jù)本發(fā)明的方法還可以包括使多孔復(fù)合生物材料中的膠原蛋白和糖胺聚糖交聯(lián)的步驟。通常在升華后從模具中移走所述材料后進(jìn)行交聯(lián)。交聯(lián)可以通過以下方式實(shí)現(xiàn)對(duì)共沉淀物進(jìn)行Y射線輻照，紫外線輻照，脫水熱處理，用例如葡萄糖、甘露糖、核糖和蔗糖的筒單的糖進(jìn)行非酶糖化的一種或多種、使該三元共沉淀物與戊二醛、碳二亞胺(例如乙基二甲氨基丙基碳二亞胺)和/或去甲二氫愈創(chuàng)木酸中的一種或多種接觸，或上述方法的任意組合。在本領(lǐng)域中這些都是常規(guī)方法。如果所述材料包含磷酸鋦，則根據(jù)本發(fā)明的方法還可以包括將所述多孔復(fù)合生物材料中的至少一些磷酸鈣材料轉(zhuǎn)化成另一種磷酸鈣相的步驟。例如，該方法可以包括將所述多孔復(fù)合生物材料中的至少一些透4丐磷石轉(zhuǎn)化成磷酸八釣和/或磷灰石。所述透釣磷石到磷酸八釣和/或磷灰石的轉(zhuǎn)化優(yōu)選通過水解實(shí)現(xiàn)。相轉(zhuǎn)換將通常在從模具中移走所述材料(和任選的交聯(lián))之后進(jìn)行。磷灰石是包含釣和磷酸鹽的礦物類，并具有通式Ca5(P04)3(X)，其中x可以是離子，其通常為oh-、F-和cr，以及本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的其它離子。術(shù)語磷灰石也包括取代的磷灰石，例如珪取代的磷灰石。所述術(shù)語磷灰石包括羥磷灰石，它是磷灰石的一個(gè)具體實(shí)例。所述羥磷灰石也可以被其它物質(zhì)例如珪取代。如上所述，在所述冷卻步驟之前，在沉積所述第一和/或第二漿組合物之前或之后，可以在模具中沉積其它的漿層。所述其它的漿層通常也會(huì)包含例如液體載體、膠原蛋白、任選的磷酸鈞材料和任選的糖胺聚糖。模具中的內(nèi)含物優(yōu)選在冷卻步驟之前靜置多至24小時(shí)，以便允許相鄰的層之間的各種漿組分的相互擴(kuò)散。相應(yīng)地，本發(fā)明提供了用于制備包含一個(gè)、二個(gè)或更多層的復(fù)合生物材料的方法。所述層中的至少一個(gè)優(yōu)選包括膠原蛋白、磷酸鈣材料和優(yōu)選的糖胺聚糖的多孔生物復(fù)合物。優(yōu)選所有的層包含膠原蛋白。根據(jù)本發(fā)明的復(fù)合生物材料可用于制造，例如多孔的單層支架，或其中至少一層是多孔的多層支架。根據(jù)本發(fā)明的復(fù)合生物材料被有利地用于肌骨骼和牙科應(yīng)用的組織再生支架。根據(jù)本發(fā)明的方法優(yōu)選包括將膠原蛋白作為有機(jī)成分引入所述第一和第二層中(優(yōu)選膠原蛋白是第一和第二層中的主要有機(jī)成分)。如果存在另外的層，則所述方法優(yōu)選包括將膠原蛋白作為有機(jī)成分51入這些其它層的一層或多層中(也優(yōu)選膠原蛋白是所述一個(gè)或多個(gè)其它層的主要有機(jī)成分)。所述方法包括在液體相中同時(shí)制造所有的層和從而制造它們之間的界面。這樣導(dǎo)致層與層間通過相互擴(kuò)散產(chǎn)生強(qiáng)的界面。術(shù)語相互擴(kuò)散指的是當(dāng)兩種組成不同的漿整體接觸放置時(shí)，由于分子擴(kuò)散或布朗運(yùn)動(dòng)而發(fā)生的混合。在第二方面中，本發(fā)明提供了合成的復(fù)合生物材料，其中至少部分生物材料由包含磷酸釣材料和膠原蛋白(包括重組人(rh)膠原蛋白)、糖胺聚糖、白蛋白、乙酰透明質(zhì)酸、殼聚糖或包含膠原蛋白的部分多肽序列的合成多肽的一種或多種的多孔共沉淀物形成，其中大孔尺寸范圍(孔徑)優(yōu)選為1~1000微米，更優(yōu)選200600微米。所述材料優(yōu)選包含膠原蛋白。所述磷酸鈣材料優(yōu)選選自透鈣磷石、磷酸八鈣和/或磷灰石的一種或多種。所述多孔材料優(yōu)選包含膠原蛋白和磷酸鈣材料的共沉淀物。這已經(jīng)關(guān)于本發(fā)明的第一方面描述過。此處所用的術(shù)語多孔指的是所述材料可以包含大孔和/或微孔。大孔隙率通常指的是與尺度大于約10微米的孔相關(guān)的特征。微孔隙率通常指的是與尺度小于約10微米的孔相關(guān)的特征。將會(huì)理解所述材料內(nèi)可能有開放小室和閉合小室的任意組合。例如，所述材料一般會(huì)含有大孔和微孔。所述大孔隙率一般是開放小室的，盡管可能有閉合的小室部分。根據(jù)本發(fā)明第二方面的多孔材料中大孔的尺寸范圍(孔徑)通常是從1至1200微米，優(yōu)選從10至1000微米，更優(yōu)選從100至800微米，還更優(yōu)選從200至600微米。根據(jù)本發(fā)明第二方面的多孔材料中的平均長(zhǎng)寬比優(yōu)選從1至50，更優(yōu)選從1至10,最優(yōu)選約l。根據(jù)本發(fā)明第二方面的多孔材料中的孔徑分布(平均孔徑的標(biāo)準(zhǔn)偏差)優(yōu)選從1至800微米，更優(yōu)選從10到400微米，還更優(yōu)選從20到200微米。根據(jù)本發(fā)明第二方面的多孔材料中的孔隙率優(yōu)選從50至99.9體積o/o,更優(yōu)選從70至98體積o/o。根據(jù)本發(fā)明第二方面的多孔材料中的開放小室的孔隙率的百分比(作為總的開放和閉合小室的孔的總數(shù)的百分比來測(cè)量)優(yōu)選從1至100%,更優(yōu)選從20至100%，還更優(yōu)選從卯至100%。在第三方面中，本發(fā)明提供了合成的復(fù)合生物材料，其中至少部分生物材料由包含磷酸鈣材料和兩種或多種膠原蛋白(包括重組人(rh)膠原蛋白)、糖胺聚糖、白蛋白、乙酰透明質(zhì)酸、殼聚糖和包含膠原蛋白的部分多肽序列的合成多肽的多孔材料形成。所述材料優(yōu)選包含膠原蛋白和糖胺聚糖。所述磷酸釣材料優(yōu)選選自透釣磷石、磷酸八釣和/或磷灰石的一種或多種。所述多孔材料優(yōu)選包含膠原蛋白、糖胺聚糖和磷酸鈣材料的三元共沉淀物。這已經(jīng)關(guān)于本發(fā)明的第一方面描述過。根據(jù)本發(fā)明第二方面的多孔材料中的大孔尺寸范圍(孔徑)也適用于所述第三方面。其平均長(zhǎng)寬比范圍、孔徑大小分布、孔隙率和開放小室孔隙率百分比同才羊如此。第四方面中，本發(fā)明提供了一種合成的復(fù)合生物材料，其包括第一層，其由根據(jù)本發(fā)明第二或第三方面的復(fù)合生物材料形成；和連接至所述第一層的第二層，其由包含膠原蛋白，或膠原蛋白與糖胺聚糖的共沉淀物，或膠原蛋白與磷酸鉤材料的共沉淀物，或膠原蛋白、糖胺聚糖和磷酸釣材料的三元共沉淀物的材料形成。所述磷酸釣材料優(yōu)選選自透鉤磷石、磷酸八鈣和/或磷灰石的一種或多種。所述第一和第二層優(yōu)選整體地形成。有利地，這可以通過涉及液相共合成的方法實(shí)現(xiàn)。這包括任何方法，其中通過在從所述漿除去液體載體之前，將各層的包含前體的漿以整體彼此接觸的方式放置，來形成包含多層的材料的密實(shí)或多孔相鄰層，和其中優(yōu)選基本上同時(shí)從所有層中除去所述液體載體。在除去液體載體之前(即，仍然在液體相中)，將所述前體漿以整體接觸方式放置允許相鄰的漿之間發(fā)生相互擴(kuò)散。這在所得材料的相鄰層之間的界面處形成相互擴(kuò)散區(qū)域，其中的材料組成為所述相鄰層的材料組成的中間值。相互擴(kuò)散區(qū)域的存在可賦予相鄰層之間的界面機(jī)械強(qiáng)度和穩(wěn)定性。相應(yīng)地，所述第一和第二層優(yōu)選通過相互擴(kuò)散層彼此連接。作為選擇，所述第一和第二層可以通過中間層相互連接。術(shù)語中間層指的是單獨(dú)地沉積于兩個(gè)其它層之間，用于提高層間結(jié)合強(qiáng)度或阻止所得支架的相鄰層之間的細(xì)胞、分子或流體通過，并且可以例如包含膠原蛋白、糖胺聚糖、纖維蛋白、抗血管生成藥物(例如蘇拉明(suramin))、生長(zhǎng)因子、基因或任何其它成分的任何層。中間層通過以下事實(shí)區(qū)別于相互擴(kuò)散層中間層作為組成不同于其相鄰層的組成的漿而單獨(dú)地沉積，而相互擴(kuò)散層只是由于相鄰層之間的相互擴(kuò)散而形成的。所述第一層是多孔的。優(yōu)選第二層也是多孔的，盡管如果需要，可以是無孔的或基本上無孔的層。根據(jù)本發(fā)明第二方面的多孔材料中的大孔尺寸范圍(孔徑)也適用于根據(jù)本發(fā)明第四方面的實(shí)施方案中的第一和/或第二層。其平均長(zhǎng)寬比范圍、孔徑分布、孔隙率和開放小室孔隙率百分比同樣如此。在任意的所述第二、三和四方面中，所述生物材料可以包含連接至所述第一和/或第二層的一個(gè)或多個(gè)其它的層，其中所述其它層中的每一層優(yōu)選由包含膠原蛋白，或膠原蛋白與糖胺聚糖的共沉淀物，或膠原蛋白與磷酸鈞材料的共沉淀物，或膠原蛋白、糖胺聚糖和磷酸鈣材料的三元共沉淀物的材料形成。所述磷酸釣材料優(yōu)選選自透鉤磷石、磷酸八鈣和/或磷灰石中的一種或多種。所述第一和第二層及所述一個(gè)或多個(gè)其它的層優(yōu)選整體的方式形成，并且相鄰的層優(yōu)選通過通常由液相共合成形成的相互擴(kuò)散層彼此連接。一般地，所述其它層中的至少一個(gè)將會(huì)是多孔的。此外，根據(jù)本發(fā)明第二方面的多孔材料中的大孔尺寸范圍(孔徑)也適用于這些其它層的一個(gè)或多個(gè)。其平均長(zhǎng)寬比范圍、孔徑分布、孔隙率和開放小室孔隙率百分比同樣如此。相鄰層之間的孔徑大小差可以在幾乎可忽略到大至+/-1000微米之間變化。除非另有說明，下列描述適用于本發(fā)明的任意方面。如果材料包含膠原蛋白和糖胺聚糖，則可以交聯(lián)所述膠原蛋白和糖胺聚糖。所述膠原蛋白優(yōu)選以從l至99wt。/。，優(yōu)選從5至卯wt。/。，更優(yōu)選從15至60wt%的量存在于所述材料中。所述糖胺聚糖優(yōu)選以從0.01至20wt%，更優(yōu)選從1至12wt%，還更優(yōu)選從1至5.5wt%的量存在于所述材料中。如果所述材料包含透鉀磷石，則膠原蛋白和透釣磷石的重量比優(yōu)選從10:1至1:100，更優(yōu)選從5:1至1:20。如果所述材料包含磷酸八鉤，則膠原蛋白和磷酸八釣的重量比優(yōu)選為10:1至1:100，更優(yōu)選從5:1至1:20。膠原蛋白和糖胺聚糖的重量比優(yōu)選為從8:1至30:1。根據(jù)本發(fā)明的生物材料可以用作替代骨或牙科材料。相應(yīng)地，本發(fā)明提供了包含此處描述的生物材料的合成骨材料、骨植入物、骨移植物、骨替代物、骨支架、填充物、涂料或粘固粉。所述生物材料有利地以多層支架的形式提供。具體地，本發(fā)明提供了用于肌骨骼和牙科應(yīng)用的組織再生支架。根據(jù)本發(fā)明的多層(即兩層或多層)支架可以在例如骨/軟骨界面(例如關(guān)節(jié)連接)、骨/腱界面(例如腱插入點(diǎn))、骨/韌帶界面(例如韌帶插入點(diǎn))、和牙齒/韌帶界面(例如牙齒/牙周韌帶結(jié)合點(diǎn))中找到應(yīng)用。盡管本發(fā)明主要涉及用于組織工程應(yīng)用的支架，但是根據(jù)本發(fā)明的材料可以用于制造在體內(nèi)保持很長(zhǎng)時(shí)間的植入物。例如，腱和韌帶應(yīng)用可能必需的半永久性植入物。本發(fā)明還提供可通過此處描述的方法獲得的多孔復(fù)合生物材料。合成方法現(xiàn)在將通過實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明。優(yōu)選的合成方法包括一系列步驟，其可以整體或部分地應(yīng)用以生產(chǎn)具有一個(gè)層或多個(gè)層的多孔支架，其中至少一個(gè)層優(yōu)選包含膠原蛋白、糖胺聚糖和磷酸鈣材料的三元共沉淀物。步驟0:制備漿可以利用本發(fā)明人2004年10月28日提交的較早的專利申請(qǐng)PCT/GB04/004550中概述的方法來實(shí)現(xiàn)礦化的膠原蛋白/GAG/透鉀磷石漿的制備。PCT/GB04/004550的內(nèi)容在此通過引用并入本文。PCT/GB04/004550的副本提供在附錄1中。可以利用Ya腿setal"1989;O'Brienetal"2004;O'Brienetal"(2005);Loreeetal.,(1989)中概述的方法來實(shí)現(xiàn)未礦化的膠原蛋白/GAG漿的制備。在該階段通過機(jī)械混合，可以任選地將生長(zhǎng)因子、基因、藥物或其它生物活性物質(zhì)單獨(dú)地或以組合加入所述漿中，以促使它們并入所述支架中。在支架具有多于一層的情況下，并入一層中的生物活性物質(zhì)不需要與并入下一層中的生物活性物質(zhì)相同。步驟I:澆鑄步驟I-a:澆鑄第1層步驟I-b:澆鑄第2層步驟I-c:澆鑄第3層步驟澆鑄第n層所述澆鑄步驟包括將溶液、懸浮液、膠體或分散體形式(其中水構(gòu)成主要稀釋劑)的漿連續(xù)沉積到模具中，其中至少一種漿包含膠原蛋白、一種或多種糖胺聚糖和磷酸鈣透鈣磷石的三元共沉淀物，并且所有的漿包含膠原蛋白。所述模具可以是任何期望的形狀，可以由包括聚合物(例如聚砜、聚丙烯、聚乙烯)，金屬(例如不銹鋼、鈦、鈷、鉻)，或陶瓷(例如氧化鋁、氧化鋯)，玻璃陶瓷，或玻璃(例如硼硅酸鹽玻璃)的任意的許多材料制成?？梢詫ｉT地構(gòu)造所述模具用于促進(jìn)層化。適合的設(shè)計(jì)的例子示于圖l和2。例如，所述層可以垂直地(即一層位于另一層上面)、水平地(即一層在另一層旁邊)、和/或放射狀(一個(gè)球形層在下一個(gè)的上面)地定位。在所述支架包括一層的情況下，待澆鑄的單層包含含有膠原蛋白、磷酸鈣材料(優(yōu)選透鈣磷石)和任選的糖胺聚糖的共沉淀物的漿。優(yōu)選地，所述漿包含含有膠原蛋白、透鈣磷石和糖胺聚糖的三元共沉淀物。該層的優(yōu)選厚度列于表l的適當(dāng)部分中。在所述支架包括兩層的情況下，待澆鑄的所述層中的至少一層包含含有膠原蛋白、磷酸釣材料(優(yōu)選透鈣磷石)和任選的糖胺聚糖的共沉淀物的漿。優(yōu)選地，所述漿包含含有膠原蛋白、透鈣磷石和糖胺聚糖的三元共沉淀物。該層的優(yōu)選厚度列于表l的適當(dāng)部分中。另一層包括含有膠原蛋白、任選的磷酸鉀材料和任選的糖胺聚糖的漿。該漿組合物優(yōu)選包含膠原蛋白和糖胺聚糖的共沉淀物，或膠原蛋白與磷酸鈣材料(比如透鈣磷石)的共沉淀物，或膠原蛋白、糖胺聚糖和磷酸鈞材料(優(yōu)選透鉤磷石)的三元共沉淀物。可以根據(jù)需要包括其它層，并且這些其它層優(yōu)選由包含膠原蛋白、任選的磷酸釣材料和任選的糖胺聚糖的漿形成。所述其它的漿組合物優(yōu)選包含膠原蛋白和糖胺聚糖的共沉淀物，膠原蛋白和磷酸釣材料(例如透釣磷石)的共沉淀物，或膠原蛋白、糖胺聚糖和磷酸釣材料(優(yōu)選透鉀磷石)的三元共沉淀物。每個(gè)后續(xù)層中的漿的組成可以是相同的，稍微變化的，或顯著變化的，條件是膠原蛋白和優(yōu)選的糖胺聚糖存在于每一層中，并且所述層中的至少一層也包含磷酸釣材料，例如透鈣磷石。步驟II:相互擴(kuò)散所述共擴(kuò)散步驟包括允許澆鑄的、分層的漿的各層相互擴(kuò)散。進(jìn)行這一步步驟，以使得在相鄰層之間的漿組分相互擴(kuò)散，從而增加固化和升華后層間的結(jié)合強(qiáng)度。所述相互擴(kuò)散步驟的優(yōu)選條件列于表2中的適當(dāng)部分。步驟III:控制冷卻所述控制冷卻步驟包括將含有漿的模具置于環(huán)境中，然后以控制速率冷卻至低于O"C的最終溫度。進(jìn)行該步驟，以引發(fā)和控制漿內(nèi)水結(jié)晶體成核和生長(zhǎng)的速率。然后，通過升華除去水結(jié)晶體，留下多孔的支架。所述水結(jié)晶體網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)將決定支架的最終孔結(jié)構(gòu)。冷卻的優(yōu)選參數(shù)列于表3中。步驟IV:退火所述退火步驟包括使得漿在控制冷卻步驟的最終溫度下保持給定的時(shí)間。進(jìn)行該步驟以確保漿完全或基本完全凍結(jié)。退火的優(yōu)選參數(shù)列于表4。步驟V:升華所述升華步驟包括當(dāng)凍結(jié)的漿大致維持在控制冷卻和退火步驟的最終溫度時(shí)，將模具和凍結(jié)漿周圍環(huán)境中的壓力降低至低于水/水/水蒸氣系統(tǒng)的三相點(diǎn)，然后將溫度升至高于在獲得的真空壓力下的固體-蒸氣轉(zhuǎn)化溫度的溫度(通?！祇r;)。進(jìn)行該步驟，以通過升華將水結(jié)晶體從凍結(jié)的漿中除去。作為除去水的方法，升華相對(duì)于蒸發(fā)的優(yōu)點(diǎn)在于其留下了精確模擬之前存在的冰結(jié)晶體網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的空的空間(即孔)網(wǎng)絡(luò)。如果允許冰融化，則冰結(jié)晶體網(wǎng)絡(luò)會(huì)喪失其形狀，并且損害所得到的孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。所述升華步驟的優(yōu)選參數(shù)示于表5。步驟VI:交聯(lián)如果需要，所述方法也可以包括交聯(lián)步驟以交聯(lián)膠原蛋白和糖胺聚糖。這記載于本發(fā)明人2004年10月28日提交的較早的專利申請(qǐng)PCT/GB04/004550中。PCT/GB04/004550的內(nèi)容在此通過引用并入本文。PCT/GB04/004550的副本提供在附件1中。實(shí)施例實(shí)施例1:膠原蛋白/GAG/CaP的單層支架材料膠原蛋白I型，從牛腱獲得的微原纖維膠原蛋白，IntegraLifeSciencesPlainsboro，NJ，USA;GAG:源于鯊魚軟骨的6-石危酸軟骨素，鈉鹽，Sigma-AldrichInc(St.Louis,MO，USA);鉀源(i)氫氧化鉤(Ca(OH)2)Sigma-AldrichInc(St.Louis,MO,USA);(ii)硝酸釣(Ca(N03)24H20)Sigma-AldrichInc(St.Louis,MO，USA);磷源正褲酸(H3P04)，BDHLaboratorySupplies(Poole,UnitedKingdom);交聯(lián)劑1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(=EDAC)，Sigma-AldrichInc(St.Louis,MO，USA);N-羥基琥珀酰亞胺(=NHS)Sigma-AldrichInc(St.Louis，MO,USA)。程序步驟0:制備漿通過^^用配備直徑19mm定子的均質(zhì)器在15000rpm下混合90分鐘，將3.8644g膠原蛋白分散在冰浴中冷卻的171.4mL的0.1383摩爾/升的H3P04中，以產(chǎn)生高粘性的膠原蛋白分散體。平行地，在室溫下使得0.3436g6-硫酸軟骨素(GAG)溶解到14.3mL的0.1383摩爾/升H3P04中，通過周期性振搖分散溶解的GAG,以便生產(chǎn)GAG溶液。卯分鐘后，在15,000rpm的連續(xù)均質(zhì)下,以大約0.5mL/分鐘的速率將14.3mL所述GAG溶液加入到混合的膠原蛋白分散體中，然后另外混合得到的高粘性膠原蛋白/GAG分散體卯分鐘?；旌?0分鐘之后，在30分鐘時(shí)間和15000rpm的恒定混合下，將1.804gCa(OH)2和0.780gCa(N03)2*4H20加入所述高粘性膠原蛋白/GAG分散體中，生成pH約4.0的膠原蛋白/GAG/CaP漿。使得所述膠原蛋白/GAG/CaP漿在攪拌板上在25t:下保持48小時(shí)混合，然后在4X:下放置12小時(shí)。然后冷卻的漿在25Pa的壓力下在真空燒瓶中脫氣25小時(shí)。步驟l:澆鑄使用自動(dòng)吸移管管理器將15mL未礦化的膠原蛋白/GAG/CaP漿澆鑄到長(zhǎng)50mm、寬30mm和深10mm的聚砜模具中。使用手動(dòng)吸移管管理器從所述漿中除去所有的大氣泡。步驟II:相互擴(kuò)散由于實(shí)施例I的支架只包括一層，所以相互擴(kuò)散的步驟是不必要的。步驟III:控制冷卻將所述模具和漿放入VirTisGenesis冷凍干燥器(配有溫控的不銹鋼架)中，并且所述冷凍干燥器的架溫以約2.41C每分鐘的速率從4ic降低至-2or:。步驟IV:退火所述冷凍干燥器的架溫保持在-20匸下10小時(shí)。步驟V:升華當(dāng)仍處于-20C的架溫時(shí)，將低于25Pa的真空(約200亳托)施加到容納所述模具和(目前凍結(jié)的)漿的室中。然后將所述室的溫度升至37C并且允許升華持續(xù)36小時(shí)。然后除去所述真空，溫度恢復(fù)至室溫，留下膠原蛋白/GAG/CaP的單層支架，尺寸為50mmx30mmx10mm。步驟V+I:交聯(lián)支架在40mL去離子水中水合20分鐘。將20mL的0.035摩爾/升EDAC和0.014摩爾/升NHS的溶液加入到容納所述支架和去離子水的容器中，允許所述支架在室溫和輕度攪拌下交聯(lián)2小時(shí)。除去所述EDAC溶液，用磷酸緩沖溶液(PBS)漂洗支架，然后使得在37t:和中度攪拌下在新鮮的PBS中培養(yǎng)2小時(shí)。在PBS中兩個(gè)小時(shí)后，通過使得在371C和中度攪拌下在去離子水中培養(yǎng)兩個(gè)10分鐘間隔來漂洗所述支架。然后通過以大約2.4"C每分鐘的速率從室溫控制冷卻至-201C冷凍干燥所述支架，來除去任何殘余的水，隨后在-20C退火約5小時(shí)，然后在37"C下低于25Pa升華，生成交聯(lián)的膠原蛋白/GAG/CaP支架，尺寸大致為50mmx30mmx10mm。所得單層支架的X射線顯微斷層圖像、掃描電鏡圖像、離子分布圖和壓縮機(jī)械行為示于圖3-10。圖3顯示了通過X射線顯微斷層照相術(shù)看到的通過上述步驟生產(chǎn)的支架的9.5mmx9.5mm圓柱部分的外形。值得注意的是整個(gè)支架中材料組成和孔隙率基本均勻的性質(zhì)。相同支架的連續(xù)橫截面示于圖4，再次說明了所述支架孔結(jié)構(gòu)的均勻性；高度的孔互聯(lián)性、等軸孔形態(tài)和大的(平均直徑500微米)大孔尺寸在圖4中也;f艮明顯。在圖5中，SEM顯微照片再次顯示了大孔的形態(tài)，同時(shí)也顯示了有限的微孔的存在，其可在某些大孔的壁內(nèi)看見。所述支架壁區(qū)域的高(4000x)放大率二次(即外形敏感的)和反向散射的(即組成敏感的)電子圖像(圖6)表明所述支架壁的組成均勻性，盡管存在處于尺寸約為l-2微米的突出瘤狀體的形式有限的拓樸變化。圖7中的鈣和磷圖證實(shí)了整個(gè)支架中組成基本均勻的結(jié)論，其中兩種元素均勻地分布在整個(gè)支架中。圖8顯示了干燥狀態(tài)下的單層支架，并圖解說明它們能夠用普通的外科工具例如手術(shù)刀、剃刀和圓鋸刀片(在角膜移植中使用的環(huán)形切割工具)切成任何期望的形狀，而不會(huì)破碎、裂開或失去完整性；圖8也圖解說明了干的單層支架在鎮(zhèn)靜鋼珠負(fù)載重力下的承載力。在圖9中顯示了在干燥狀態(tài)下的單層支架的行為。這種行為顯示了典型的多孔質(zhì)固體變形的三個(gè)階段，其具有彈性模量762+/-188kPa和壓縮屈服應(yīng)力85.2+/-11.7kPa。重要的是注意到所述干支架的屈服強(qiáng)度使得它們承受有力的拇指壓力(例如在插入缺陷部位時(shí))，其在施加強(qiáng)有力的拇指壓力(例如外科醫(yī)生改變植入物的形狀)時(shí)仍不會(huì)形成永久性的變形。在圖10中顯示了在水合狀態(tài)下的單層支架的壓縮變形。和干燥狀態(tài)下一樣，水合的礦化膠原蛋白/GAG支架在壓縮負(fù)荷下顯示出三個(gè)階段的機(jī)械行為，但是其彈性模量(4.12+/-0.76kPa)和屈服應(yīng)力(0.29+/-0.11kPa)比相應(yīng)的干支架性能低大約一個(gè)數(shù)量級(jí)。此外，在塌陷平臺(tái)區(qū)觀察到了的壓縮應(yīng)力釋放之后粘彈性形變恢復(fù)的證據(jù)。實(shí)施例II:雙層礦化-未礦化支架材料膠原蛋白(用于礦化的漿)從牛腱獲得的I型微原纖維膠原蛋白，IntegraLifeSciencesPlainsboro,NJ，USA;GAG(用于礦化的漿)從篁魚軟骨獲得的6-硫酸軟骨素，鈉鹽，Sigma國(guó)AldrichInc(St.Louis,MO,USA)。II型膠原蛋白+GAG(用于未礦化的漿)從豬的軟骨中溶解的II型膠原蛋白和GAG(膠原蛋白/GAG)漿，GelstlichBiomaterials(Wolhusen,Switzerland)。鈣源(i)氫氧化鈣(Ca(OH)2)Sigma-AldrichInc(St.Louis,MO，USA);(ii)硝'酸釣(Ca(N03)24H20)Sigma-AldrichInc(St.Louis,MO，USA);磷源正磷酸(H3P04)，BDHLaboratorySupplies(Poole,UnitedKingdom);交聯(lián)劑l-乙基-3-(3-二曱基氨基丙基)碳二亞胺(=EDAC)，Sigma-AldrichInc(St.Louis,MO，USA);N畫羥基琥珀酰亞胺(=NHS)Sigma-AldrichInc(St.Louis,MO，USA)步驟0:制備漿制備礦化的漿通過4吏用配備直徑19mm定子的均質(zhì)器在15000rpm下混合卯分鐘，將3.8644g的膠原蛋白分散在冰浴中冷卻的171.4mL的0.1383摩爾/升的H3P04中，以產(chǎn)生高粘性膠原蛋白分散體。平行地，在室溫下將0.3436g6-硫酸軟骨素(GAG)溶解在14.3mL的0.1383摩爾/升的H3P04+，通過周期性振搖分散溶解的GAG，以產(chǎn)生GAG溶液。卯分鐘后，在15000rpm的持續(xù)均質(zhì)下，以大約0.5mL/分鐘的速率將14.3mL的GAG溶液加入到混合的膠原蛋白分散體中，然后另外混合得到的高粘性膠原蛋白/GAG分散體卯分鐘。混合卯分鐘之后，在30分鐘時(shí)間和15000rpm的恒定混合下，將1.804gCa(OH)2和0.780gCa(N03)2.4H20加入高粘性膠原蛋白/GAG分散體中，生成pH約為4.0的膠原蛋白/GAG/CaP漿。冷卻的漿在25Pa壓力下在真空瓶中脫氣25小時(shí)，使用均質(zhì)器再混合30分鐘，然后再次脫氣48小時(shí)。制備未礦化的漿從冰箱中取出1I型膠原蛋白/GAG漿并允許恢復(fù)到室溫。步驟I:澆鑄將2.5mL未礦化的II型膠原蛋白/GAG漿放入組合聚砜模具的底部，所述底部長(zhǎng)50mm，寬30mm，深2mm。用剃刀將所述漿平整為平坦的表面。將也由聚砜制成的長(zhǎng)50mm寬30mm深6mm的上部環(huán)固定到容納所述平整的未礦化漿的模具底部。將9mL礦化的膠原蛋白/GAG/CaP漿以均勻分布的方式置于所述平整的未礦化層上和之前空的的上部環(huán)內(nèi)。利用手動(dòng)吸移管管理器從所述漿中除去所有大的氣泡。步驟II:相互擴(kuò)散在放入冷凍干燥器之前，使得所述分層的漿保持在室溫和室壓下共4個(gè)小時(shí)。步驟III:控制冷卻將所述模具和分層的漿放入VirTisGenesis冷凍干燥器(配有溫控的不銹鋼架)中，并且所述冷凍干燥器的架溫以約-2.4X:每分鐘的速率從4X:降低至-40"C。步驟IV:退火所述冷凍干燥器的架溫保持在-4ox:下io小時(shí)。步驟V:升華仍處于-40"C的架溫時(shí)，將低于25Pa的真空(約200亳托)施加到容納所述模具和(目前凍結(jié)的)分層漿的室中。然后所述室的溫度升至37X:，并且允許升華持續(xù)36小時(shí)。然后除去所述真空，溫度恢復(fù)至室溫，留下膠原蛋白/GAG/CaP的雙層支架，尺寸為50mmx30mmx8mm，由2mm厚的未》/M匕層和6mm厚的;f;M匕層構(gòu)成。步驟VI:交聯(lián)支架在32mL去離子水中水合20分鐘。將18mL的0.035摩爾/升EDAC和0.014摩爾/升NHS溶液加入到容納所述支架和去離子水的容器中，并且使得所述支架在室溫和輕度攪拌下交聯(lián)2小時(shí)。除去所述EDAC溶液，然后用磷酸緩沖溶液(PBS)漂洗支架，然后允許在37X:和中度攪拌下在新鮮的PBS中培養(yǎng)2小時(shí)。在PBS中兩個(gè)小時(shí)后，通過允許在371C和中度攪拌下在去離子水中培養(yǎng)兩個(gè)10分鐘間隔來漂洗所述支架。然后通過以大約-2.4"C每分鐘的速率從室溫控制冷卻至-20"C來冷凍干燥所述支架，以除去任何殘余的水，然后在-20"C退火5小時(shí)，最終在低于25Pa和37"C下升華24小時(shí)，生成交聯(lián)的分層的膠原蛋白/GAG/CaP支架，尺寸約為50mmx30mmx8mm，由2mm厚的未礦化層和6mm厚的礦化層組成。所得雙層支架的X射線顯微斷層圖像、掃描電鏡圖像、和離子分布圖示于圖11-17。圖ll顯示了通過上述步驟生產(chǎn)的雙層支架的9.5mmx9.5mm圓柱部分的X射線顯微斷層圖象。其不透明的下部區(qū)域顯示了礦化層，而更透明的上部區(qū)域代表未礦化層?？梢钥闯?，在孔隙率和組成方面，兩層都大致均勻。圖12中的連續(xù)橫截面顯示所述礦化層中的平均大孔尺寸為約400微米，而未礦化層中的那些在700微米的級(jí)別上；礦化和未礦化層中的孔都顯示出等軸形態(tài)。圖13中的SEM圖像顯示了未礦化層的俯視圖，其說明幾乎沒有微孔隙率存在的證據(jù)，而圖14中顯示的界面區(qū)的圖像證實(shí)沒有將所述礦化和未礦化層分開的任何大空隙或其它間斷。在圖15中顯示了雙層支架在壓縮負(fù)荷下的行為。在施加壓縮負(fù)荷后，柔性的未礦化層開始?jí)嚎s，在不足以在礦化支架內(nèi)引起任何顯著變形的應(yīng)力下導(dǎo)致軟骨區(qū)室的幾乎完全的壓縮。當(dāng)負(fù)荷釋放后，所述未礦化的膠原蛋白/GAG層幾乎立刻恢復(fù)至原來的形狀(圖15d)。圖16圖解說明了雙層支架在水合狀態(tài)下的機(jī)械行為。一旦7JC合，所述未礦化的膠原蛋白/GAG層在低幅負(fù)荷下可以被壓縮(圖16a-c)。與干燥狀態(tài)不同，所述水合的未礦化區(qū)室在第一次施加壓縮負(fù)荷之后(圖16d)沒有完全恢復(fù)其原始厚度，而是在所述礦化區(qū)室的橫截面上下垂。但是在初始?jí)嚎s后，未礦化層在隨后每次施加壓縮負(fù)荷之后恢復(fù)到其壓縮厚度(圖16d)。在圖17中，通過模擬說明了雙層支架的未礦化層附著到包含關(guān)節(jié)連接處的骨和軟骨界面的外科缺損的壁上的能力。圖17中的載波片與骨軟骨缺損的壁相似，所述未礦化層附著到這個(gè)表面的能力表明這些支架填充這些缺損到它們外圍而不會(huì)在支架的未礦化層和相鄰的關(guān)節(jié)軟骨之間留下空隙的能力。實(shí)施例III:三層礦化-未礦化的礦化支架材料膠原蛋白(用于礦化的漿)源于牛腱的I型微原纖維膠原蛋白，IntegraLifeSciences(Plainsboro,NJ,USA)GAG(用于礦化的漿)源于篁魚軟骨的6-硫酸軟骨素，鈉鹽，Sigma-AldrichInc(St.Louis,MO，USA)。鈣源(i)氫氧化鈣(Ca(OH)2)Sigma-AldrichInc(St.Louis,MO,USA);(ii)硝酸鉤(Ca(N03)2'4H20)Sigma-AldrichInc(St.Louis,MO，USA);磷源正磷酸(H3P04),BDHLaboratorySupplies(Poole,UnitedKingdom)膠原蛋白(用于未礦化的膠原蛋白-GAG漿)從豬的真皮中溶解的85%I型，15%III型胃蛋白酶JapanMeatPackers(Osaka,Japan)GAG(用于未礦化的漿)源于篁魚軟骨的6-硫酸軟骨素，鈉鹽，Sigma-AldrichInc(St.Louis，MO，USA)。用于未礦化膠原蛋白和GAG的稀釋劑冰醋酸(CH3COOH)，F(xiàn)ischerScientific(Loughborough,UK);交聯(lián)劑去曱二氳愈創(chuàng)木酸(NDGA)，Sigma-AldrichInc(St.Louis,MO,USA);磷酸二氫鈉(NaH2P04),BDHLaboratorySupplies(Poole,UnitedKingdom);氯化鈉(NaCl)，Sigma-AldrichInc(St.Louis,MO，USA)步驟0:制備漿制備礦化的漿通過使用配備直徑19mm定子的均質(zhì)器在15000rpm下混合卯分鐘，將3.8644g的膠原蛋白分散在于冰浴中冷卻的171.4mL的0.1383摩爾/升的H3P04+，以制備高粘性的膠原蛋白分散體。平行地，在室溫下將0.3436g6-硫酸軟骨素(GAG)溶解到14.3mL的0.1383摩爾/升H3P04+，通過周期性振搖分散溶解的GAG,以產(chǎn)生GAG溶液。90分鐘后，將14.3mL所述GAG溶液在15，000rpm的持續(xù)均質(zhì)下以大約0.5mL/分鐘的速率加入混合的膠原蛋白分散體中，然后另外混合得到的高粘性膠原蛋白/GAG分散體卯分鐘。混合卯分鐘之后，在30分鐘時(shí)間和15000rpm的恒定混合下，將1.804gCa(OH)2和0.780gCa(N03)2.4H20加入所述高粘性膠原蛋白/GAG分散體中，生成pH約4.0的膠原蛋白/GAG/CaP漿。然后冷卻的漿在25Pa的壓力下在真空燒瓶中脫氣25小時(shí)，使用均質(zhì)器再次混合30分鐘，然后再次脫氣48小時(shí)。制備未礦化的漿通過使用配備直徑19mm定子的均質(zhì)器在15000rpm下混合卯分鐘，將1.9322g1/11I型膠原蛋白分散在于冰浴中冷卻的171.4mL的0.05摩爾/升的醋酸中，以制備高粘性膠原蛋白分散體。平行地，在室溫下將0.1718g6-硫酸軟骨素(GAG)溶解到28.6mL的0.05摩爾/升醋酸中，通過周期性振搖分散溶解的GAG,以生成GAG溶液。90分鐘后，在15，000rpm的持續(xù)均質(zhì)下以大約0.5mL/分鐘的速率，將所述14.3mLGAG溶液加入混合的膠原蛋白分散體中，并另外混合得到的高粘性膠原蛋白/GAG分散體卯分鐘。步驟I:澆鑄將3.5mL礦化的膠原蛋白/GAG/CaP漿置于組合聚砜模具的底部，所述底部長(zhǎng)50mm，寬30mm，深3mm。所述漿用剃刀平整為平面。一個(gè)也由聚砜制成的長(zhǎng)50mm寬30mm深5mm的中間環(huán)連接到容納所述平整的礦化漿的模具底部。將7.5mL未礦化的膠原蛋白/GAG漿以均勻分布的方式置于所述平整的未礦化層上并在之前空的中間環(huán)內(nèi)。將一個(gè)也由聚砜制成的長(zhǎng)50mm寬30mm深3mm的上部環(huán)連接到所述平整的未礦化漿之上的模具的中間部分。將3.5mL礦化的膠原蛋白/GAG/CaP漿以均勻分布的方式置于所述平整的未礦化層上并在之前空的上部環(huán)內(nèi)。利用手動(dòng)吸移管管理器從所述漿中除去所有大的氣泡。步驟II:相互擴(kuò)散在放入冷凍干燥器之前，允許所述三層漿保持在室溫和室壓下20分鐘。步驟III:控制冷卻將所述模具和三層漿置于VirTisAdvantage冷凍干燥器(配有溫控的不銹鋼架)中，并且所述冷凍干燥器的架溫以約-2.4C每分鐘的速率從4t:降低至-4ox:。步驟IV:退火保持所述冷凍干燥器的架溫在-4or:下io小時(shí)。步驟V:升華當(dāng)仍處于-40X:的架溫時(shí)，將低于25Pa的真空(約200亳托)施加到容納所述模具和(目前凍結(jié)的)三層漿的室中。然后所述室的溫度升至371C,并且允許升華持續(xù)36小時(shí)。然后除去所述真空，溫度恢復(fù)至室溫，留下尺寸為50mmx30mmxllmm的三層支架，由5mm厚的未礦化中間層和環(huán)繞它的兩個(gè)3mm厚的礦化層組成。步驟VI:交聯(lián)將三層支架在0.1摩爾/升NaH2PCXt和0.15摩爾/升NaCl的磷酸鹽緩沖液(PBS;pH7.0)中7jC合30分鐘。將NDGA懸浮在1NNaOH中，并加入到PBS中生成3mg/mL的NGDA在PBS中的溶液；然后在攪拌下在該溶液中水合支架24小時(shí)。從NGDA-PBS溶液移走所述三層支架，并用去離子水沖洗。然后通過以大約2.4匸每分鐘的速率從室溫控制冷卻至-20t:冷凍干燥所述支架，以除去任何殘余的水，然后在-201C退火5小時(shí)，并最終在37"C下在低于25Pa下升華24小時(shí)，得到干燥交聯(lián)的支架。然后在濃度為0.1mg/mL的NDGA中進(jìn)行隨后的處理。然后在70%乙醇中清洗支架6小時(shí)，隨后在室溫在PBS中清洗24小時(shí)。然后通過以大約2.4匸每分鐘的速率從室溫控制冷卻至-20X:來冷凍干燥所述支架第二時(shí)間，以除去任何殘余的水，然后在-20C退火5小時(shí)，并最終在37X:下在低于25Pa下升華24小時(shí)。下列表中的參數(shù)可以單獨(dú)地或以組合應(yīng)用到本發(fā)明的任意方面，除非另有說明?；襩:澆鑄的優(yōu)選泰數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>表5:升華的優(yōu)選參數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>參考文獻(xiàn)GaoJ,DennisJE,SolchagaLA,AwadallahAS，GoldbergVM,CaplanAI.2001.Tissue-EngineeredFabricationofanOsteochondralCompositeGraftUsingRatBoneMarrow-DerivedMesenchymalStemCells.TissueEngineering7:363-371。GaoJ，DennisJE,SolchagaLA,GoldbergVM,CaplanAI.2002。RepairofOsteochondralDefectwithTissue-EngineeredTwo-PhaseCompositeMaterialofInjectableCalciumPhosphateandHyaluronanSponge.TissueEngineering8:827-837。HungCT,LimaEG，MauckRL,TakiE，LeRouxMA,LuHH,StarkRG，GuoXE,AteshianGA.2003.AnatomicallyShapedOsteochondralConstructsforArticularCartilageRepair.JournalofBiomechanics36:1853-1864。HunzikerEB,DriesangIMK.2003.FunctionalBarrierPrincipleforGrowth-Factor-BasedArticularCartilageRepair.OsteoarthritisandCartilage11:320-327。NiederauerGG，SlivkaMA,LeatherburyNC,KorvickDL,H.H.HJ,EhlerWC,DuimCJ，KieswetterK.2000.EvaluationofMultiphaseImplantsforRepairofFocalOsteochondralDefectsinGoats.Biomaterials21:2561-2574。O'BrienFJ,HarleyBA,YannasIV，GibsonL.2004.InfluenceofFreezingRateonPoreStructureinFreeze畫Driedcollagen-GAGscaffolds.Biomaterials25:1077-1086。O'BrienFJ,HarleyBA，YannasIV,GibsonLJ.2005.TheEffectofPoreSizeandStructureonCellAdhesionincollagen-GAGscaffolds.Biomaterials26:433-441HMLoree，IVYannas,BMikic，ASChang,SMPerutz,TVNorregaard,andCKararup，AAfreeze-dryingprocessforfabricationofpolymericbridgesforperipheralnerveregeneration'Proc.15thAnnualNortheastBioeng.Conf.P.53-54,1989。SchaeferD，MartinI，JundtG,SeidelJ，HebererM,GrodzinskyA,BerginI，Vunjak-NovakovicFreedLE.2002。Tissue-EngineeredCompositesfortheRepairofLargeOsteochondralDefects.ArthritisandRheumatism46:2524-2534。SchaeferD,MartinI,ShastriP，PaderaRF，LangerR,FreedLE,Vunjak-NovakovicG.2000.InVitroGenerationofOsteochondralComposites.Biomaterials21:2599-2606。SherwoodJK,RileySL,PalazzoloR,BrownSC,MonkhouseDC,CoatesM,GriffithLandeenLK,RatcliffeA.2002.AThree畫DimensipnalOsteochondralCompositescaffoldforArticularCartilageRepair.Biomaterials23:4739-4751。YannasIV,LeeE,OrgillDP,SkrabutEM,MurphyGF.1989.SynthesisandCharacterizationofaModelExtracellularMatrixthatInducesPartialRegenerationofAdultMammalianSkin.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica86:933-937。本發(fā)明在很多領(lǐng)域找到了應(yīng)用，以舉例的方式提供下列應(yīng)用。關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)產(chǎn)品雙層支架雙層支架具有提高現(xiàn)有的將源自骨髓的干細(xì)胞補(bǔ)充至關(guān)節(jié)軟骨創(chuàng)傷部位的首要外科手術(shù)療效的潛力。例如，作為干燥的2cmx2cmxlcm的干燥、真空包裝、Y滅菌的類似于聚苯乙烯泡沫的塊狀物遞送，這些支架可以利用手術(shù)刀或其它工具切割，簡(jiǎn)單地用拇指或鈍器壓力輕易地插入缺損處，并且直接結(jié)合到所述部位，而不用縫合或膠粘。髕韌帶供體部位的修復(fù)產(chǎn)品三層支架三層支架具有在前十字韌帶(ACL)重建期間增強(qiáng)髕韌帶(髕骨腱)再生的潛力，減輕前膝痛并降低髕韌帶斷裂和膝蓋骨折的風(fēng)險(xiǎn)。腱修復(fù)產(chǎn)品雙層支架具有擴(kuò)大的未礦化成分的雙層支架具有提高肌腱套(rotator-cuff)手術(shù)期間腱修復(fù)療效和解決現(xiàn)在尚無有效解決方案的小腱應(yīng)用的潛力。還在大型家畜的基礎(chǔ)上研究了本發(fā)明，總結(jié)如下。試驗(yàn)l:綿羊骨缺損模型本發(fā)明使之可以生產(chǎn)分層的組織再生支架，其一側(cè)的結(jié)構(gòu)和組成模擬骨，另一側(cè)上為未礦化組織(例如軟骨、韌帶、腱)，在其間具有平滑穩(wěn)定的界面。此外，本發(fā)明還提供了系統(tǒng)地改變這種植入物的骨區(qū)室礦物相的化學(xué)組成的能力。動(dòng)物骨骼成熟的Texcel陸地綿羊(雌性)。缺損外側(cè)股骨髁上的直徑9mm、深9mm的松質(zhì)骨缺損植入時(shí)間6周實(shí)驗(yàn)組每個(gè)實(shí)驗(yàn)組的6個(gè)植入物被以相同的植入類型對(duì)側(cè)地植入同一動(dòng)物的每一側(cè)。對(duì)照組正對(duì)照用從脛骨粗隆收獲的多孔自體移植物填充四個(gè)部位。負(fù)對(duì)照用包含完全不含礦物相(即只含有ChondroMimetic骨質(zhì)側(cè)的有機(jī)成分)的植入物的對(duì)照植入物填充四個(gè)部位。研究目的鑒別化學(xué)組成不同的四個(gè)實(shí)驗(yàn)植入組的性能差別，并將這些植入組中最期望的組確定為ChondroMimetic骨區(qū)室的最終組成。重大發(fā)現(xiàn)三個(gè)實(shí)驗(yàn)組都沒有引發(fā)任何種類的不良免疫響應(yīng)；所有三個(gè)實(shí)驗(yàn)組和未礦化的負(fù)對(duì)照組通過細(xì)胞介導(dǎo)的直接取代機(jī)理支持骨的內(nèi)生長(zhǎng)；三個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間沒有觀察到顯著的統(tǒng)計(jì)上的差別；并且在全部三個(gè)實(shí)驗(yàn)組中觀察到的骨形成比負(fù)對(duì)照組中的骨形成高出顯著的統(tǒng)計(jì)水平。植入物設(shè)計(jì)的應(yīng)用該項(xiàng)研究所涉及的直接取代機(jī)理表明與在傳統(tǒng)的骨移植替代物中觀察到的典型的外加機(jī)理相比，所述骨形成的機(jī)理更接近于在胎兒和新生動(dòng)物(包括人)的生長(zhǎng)面上出現(xiàn)的模板骨形成。在未礦化的對(duì)照組中存在的這種取代機(jī)理表明所述植入物的有機(jī)組分賦予了這種特性。所述植入物的孔徑大小應(yīng)該通過降低植入物的骨區(qū)室的平均孔徑來改變，以解釋這種取代機(jī)理。所述三個(gè)實(shí)驗(yàn)組的骨形成行為沒有顯著的統(tǒng)計(jì)差異表明處理參數(shù)可以用來識(shí)別最適合的植入物的礦物組成。試驗(yàn)2:公山羊的骨軟骨缺損模型該項(xiàng)研究的目的在于評(píng)估作為增強(qiáng)骨髓刺激術(shù)(軟骨下鉆孔)效果的方法的ChondroMimetic的性能。動(dòng)物骨骼成熟的西班牙山羊(雌性)。缺損直徑4mm、深6mm的骨軟骨缺損(1個(gè)在滑車溝內(nèi)；1個(gè)在外側(cè)髁上)。植入時(shí)間16周實(shí)驗(yàn)組ChondroMimetic工作原型的6個(gè)植入物。對(duì)照組模擬傳統(tǒng)的軟骨下鉆孔(即不含植入物)的6個(gè)缺損。研究目的評(píng)估ChondroMimetic作為骨髓刺激輔助物的性能。發(fā)現(xiàn)外科醫(yī)生關(guān)于ChondroMimetic的處理性能的反饋無一例外地是壓倒性的正面的。附錄l2004年10月28日提交的PCT/GB04/004550的說明書文本本發(fā)明涉及用于生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的人工骨、牙科材料和再生支架領(lǐng)域，尤其涉及包含膠原蛋白、磷酸鉀材料和一種或多種糖胺聚糖的人工骨、牙科材料和再生支架及其前體。天然骨是膠原蛋白、包括糖胺聚糖的非膠原蛋白有機(jī)相和磷酸鈣的生物復(fù)合材料。其復(fù)雜的分層結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了出色的機(jī)械性能，包括高的剛性、強(qiáng)度和破裂韌性，從而使骨能夠承受日常經(jīng)受的生理應(yīng)力。本領(lǐng)域的研究人員面臨的挑戰(zhàn)是制造組成和結(jié)構(gòu)允許天然骨可以在人體或動(dòng)物體中在合成材料里面和周圍生長(zhǎng)的合成材料。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，骨通過人體環(huán)境中形成的骨狀磷灰石層直接連接到人體內(nèi)的磷酸釣(稱為生物活性的性能)。另一方面，已知膠原蛋白和包含膠原蛋白和例如糖胺聚糖的其它生物有機(jī)物質(zhì)的共聚物是多種細(xì)胞類型附著和增殖的最佳基質(zhì)，所述細(xì)胞類型包括在人體中負(fù)責(zé)骨的生成和維持的那些細(xì)胞。鞋磷灰石是最通常用作骨替代材料的成分的磷酸鈣。但是，與例如透釣磷石、磷酸三鈣和磷酸八鈣等其它形式的磷酸鈣材料相比，羥磷灰石是相對(duì)不可溶的材料。由于該材料在人體中的再吸收速率特別低，所以當(dāng)制備生物材料時(shí)，磷灰石相對(duì)低的溶解度是不利的。例如羥磷灰石的磷酸釣是機(jī)械上的剛性材料。但是，和天然骨相比，它們是相對(duì)脆性的。膠原蛋白是機(jī)械上的韌性材料，但是與天然骨相比具有相對(duì)較低的剛性。包含膠原蛋白和糖胺聚糖的共聚物的材料比單獨(dú)的膠原蛋白具有更高的韌性和剛性，但是，與天然骨相比，仍然具有較低的剛性。之前制備機(jī)械韌性高于羥磷灰石且硬度超過膠原蛋白及膠原蛋白與糖胺聚糖共聚物的人工骨替代材料的嘗試包括通過機(jī)械混合結(jié)合膠原蛋白和磷灰石。這種機(jī)械方法記載于EP-A-0164484中。該技術(shù)最新的進(jìn)展包括，通過機(jī)械混合羥磷灰石、膠原蛋白和4-硫酸軟骨素來制備包含這些組分的骨替代材料。該技術(shù)描述在EP-A-0214070中。該文獻(xiàn)還描述了4-硫酸軟骨素與膠原蛋白的脫水熱交聯(lián)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，包含磷灰石、膠原蛋白和4-硫酸軟骨素的材料具有良好的生物相容性。將磷灰石與膠原蛋白和任選的4-硫酸軟骨素機(jī)械混合，基本上形成膠原蛋白/4-硫酸軟骨素包覆的磷灰石顆粒。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，盡管該材料是生物相容性的，但是在人體或動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生有限的天然骨內(nèi)生長(zhǎng)，而且不能重建合成材料的磷酸釣相。本發(fā)明旨在解決至少一些與現(xiàn)有技術(shù)相關(guān)的問題。第一方面，本發(fā)明提供一種制備包含膠原蛋白、透鈣磷石和一種或多種糖胺聚糖的復(fù)合材料的方法，所述方法包括以下步驟提供包含膠原蛋白、鈣源和磷源以及一種或多種糖胺聚糖的酸性水溶液；和從該水溶液中一起沉淀膠原蛋白、透鈣磷石和一種或多種糖胺聚糖以形成三元共沉淀物。術(shù)語三元共沉淀物包含三種化合物的沉淀，其中，基本上同時(shí)從相同的溶液/分散體中沉淀所述化合物。這應(yīng)與機(jī)械混合這些組分形成的材料不同，特別是與例如在不同溶液中單獨(dú)沉淀出的這些組分不同。共沉淀物的微結(jié)構(gòu)明顯不同于機(jī)械混合其組分形成的材料。在第一方面中，所述溶液優(yōu)選具有2.5~6.5的pH，更優(yōu)選2.5~5.5。更優(yōu)選地，所述溶液具有3.0~4.5的pH。進(jìn)而更優(yōu)選地，所述溶液具有3.8~4.2的pH。最優(yōu)選地，所述溶液具有約為4的pH。所述釣源優(yōu)選選自硝酸釣、醋酸釣、氯化鉤、碳酸釣、釣醇鹽、氫氧化鈣、硅酸釣、硫酸釣、葡萄糖酸釣和肝素的鈣鹽中的一種或多種。肝素的鈣鹽可以得自豬的腸粘膜。合適的鈣鹽可自Sigma-AldrichInc.商業(yè)得到。所述磷源優(yōu)選選自磷酸二氫銨、磷酸氫二銨、磷酸、二水合正磷酸氫二鈉(Na2HP04.2H:j0,有時(shí)稱為GPRSorensen鹽)和磷酸三甲酯、磷酸的堿金屬(例如Na或K)鹽、磷酸的堿土金屬(例如Mg或Ca)鹽中的一種或多種。糖胺聚糖是含有長(zhǎng)的無支鏈多糖的大分子族，所述多糖含有重復(fù)的二糖單元。優(yōu)選地，所述一種或多種糖胺聚糖選自硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、肝素、硫酸肝素、硫酸角質(zhì)素和透明質(zhì)酸。硫酸軟骨素可以是4-硫酸軟骨素或6-硫酸軟骨素，它們都可以從Sigma-AldrichInc.商業(yè)得到。6-硫酸軟骨素可以得自鯊魚軟骨。透明質(zhì)酸可以源于人的臍帶，肝素可以源于豬的腸粘膜。優(yōu)選地，在三元共沉淀物的沉淀中，所述溶液具有4.0501C的溫度。更優(yōu)選地，所述溶液具有1540"C的溫度。所述溶液可以在室溫，即2030"C，優(yōu)選2027X:的溫度。最優(yōu)選地，該溫度為約25匸。所述水溶液中釣離子的濃度通常為0.00025~1摩爾/升，優(yōu)選0.001~1摩爾/升。當(dāng)所述方法還包括另外的過濾和/或低溫干燥的步驟時(shí)，所述水溶液中的鉤離子濃度更優(yōu)選為0.05~0.5摩爾/升(例如0.08~0.25摩爾/升)，最優(yōu)選0.1~0.5摩爾/升。當(dāng)所述方法還包括另外的冷凍干燥和任選的注塑成型的步驟時(shí)，所述水溶液中的鈣離子濃度更優(yōu)選為0.01~0.3摩爾/升，最優(yōu)選0.05~0.18摩爾/升。優(yōu)選地，所述溶液包含磷酸根離子，溶液中磷酸根離子的濃度通常為0.00025~1摩爾/升，優(yōu)選0.001~1摩爾/升。當(dāng)所述方法還包括另外的過濾和/或低溫干燥的步驟時(shí)，溶液中磷酸根離子的濃度更優(yōu)選為0.05~0.5摩爾/升，進(jìn)而更優(yōu)選0.1~0.5摩爾/升，例如0.1~0.35摩爾/升。當(dāng)所述方法還包括另外的冷凍干燥和任選的注塑成型的步驟時(shí)，溶液中磷酸根離子的濃度更優(yōu)選為0.01~0.3摩爾/升，進(jìn)而更優(yōu)選0.05~0.18摩爾/升。優(yōu)選地，在沉淀之前，溶液中膠原蛋白與一種或多種糖胺聚糖的總量的重量比為8:1~30:1。更優(yōu)選地，膠原蛋白與一種或多種糖胺聚糖總量的重量比為10:1~12:1,最優(yōu)選該比例為11:1~23:2。優(yōu)選地，三元共沉淀物中膠原蛋白與透鈣磷石的重量比為10:1~1:100，更優(yōu)選5:1~1:20，進(jìn)而更優(yōu)選3:2~1:10,最優(yōu)選3:21:4。在沉淀之前，所述溶液中膠原蛋白的濃度通常為l~20g/L，更優(yōu)選l10g/L。當(dāng)所述方法還包括過濾和/或低溫干燥的步驟時(shí)，所述溶液中膠原蛋白的濃度更優(yōu)選為l~10g/L，進(jìn)而更優(yōu)選1.52.5g/L，最優(yōu)選1.5~2.0g/L。當(dāng)所述方法包括冷凍干燥和任選的注塑成型時(shí)，在沉淀之前，所述溶液中膠原蛋白的濃度優(yōu)選為5~20g/L,更優(yōu)選5~12g/L，最優(yōu)選9~10.5g/L。在沉淀之前，所述溶液中一種或多種糖胺聚糖的總濃度通常為0.01~1.5g/L,更優(yōu)選0.01~1g/L。當(dāng)所述方法還包括另外的過濾和/或低溫干燥的步驟時(shí)，所述溶液中一種或多種糖胺聚糖的總濃度更優(yōu)選為0.03~1.25g/L，進(jìn)而更優(yōu)選0.125~0.25g/L，最優(yōu)選0.13~0.182g/L。當(dāng)所述方法還包括另外的冷凍干燥和任選的注塑成型的步驟時(shí)，所述溶液中一種或多種糖胺聚糖的總濃度更優(yōu)選為0.15~1.5g/L，進(jìn)而更優(yōu)選0.41~1.2g/L，最優(yōu)選0.78~0.96g/L。優(yōu)選所述溶液包含鉤離子，膠原蛋白與釣離子的重量比通常為1:40~500:1。當(dāng)所述方法還包括另外的過濾和/或低溫干燥的步驟時(shí)，膠原蛋白與鈣離子的比更優(yōu)選為1:40~250:1，進(jìn)而更優(yōu)選1:13~5:4，最優(yōu)選1:13~1:2。當(dāng)所述方法還包括另外的冷凍干燥和任選的注塑成型的步驟時(shí)，膠原蛋白與鈞離子的比更優(yōu)選為1:8500:1，進(jìn)而更優(yōu)選5:12~30:1，最優(yōu)選5:5~5:1。沉淀可以通過以下方法實(shí)現(xiàn):在酸性水溶液中混合膠原蛋白、釣源、磷源和一種或多種糖胺聚糖；或使溶液靜止直到沉淀發(fā)生，攪拌溶液，使用例如氨的堿性滴定劑滴定，加入例如預(yù)制透鈣磷石的成核劑；改變釣源的加入速率；和這些方法的任意組合。在第二方面，本發(fā)明提供一種制備包含膠原蛋白、磷酸八鉤和一種或多種糖胺聚糖的復(fù)合生物材料的方法，所述方法包括以下步驟提供包含膠原蛋白、透鉀磷石和一種或多種糖胺聚糖的復(fù)合材料，和通過水解將復(fù)合材料中的至少一部分透釣磷石轉(zhuǎn)化為磷酸八鉤。術(shù)語生物材料包含與人體或動(dòng)物體可生物相容的材料。在第二方面中，所述復(fù)合材料優(yōu)選包含或基本上由以下物質(zhì)組成含有膠原蛋白、透鉀磷石和一種或多種糖胺聚糖的三元共沉淀物。所述三元共沉淀物可以利用這里所述的與本發(fā)明第一方面有關(guān)的方法形成。優(yōu)選地，透鈣磷石水解為磷酸八鈣的步驟包括使所述三元共沉淀物與水溶液接觸，所述水溶液的pH等于或大于磷酸八鈣比透鈣磷石在熱力學(xué)上更穩(wěn)定的pH。優(yōu)選地，該水溶液具有6~8的pH。更優(yōu)選地，該水溶液具有6.3~7的pH。最優(yōu)選地，該水溶液具+約6.65的pH。所述水溶液可以包括，例如用滴定劑、緩沖液、用另一種含鉤化合物和/或含磷化合物所飽和的溶液控制pH的去離子水。優(yōu)選的水溶液包含使用氨滴定到所需pH的醋酸。優(yōu)選地，透鈣磷石水解為磷酸八鈣的步驟在2050X:的溫度下進(jìn)行，更優(yōu)選3040X:,進(jìn)而更優(yōu)選3638X:，最優(yōu)選約37"C。優(yōu)選地，透鉀磷石水解為磷酸八鈣的步驟進(jìn)行12~144小時(shí)，更優(yōu)選1872小時(shí)，最優(yōu)選24~48小時(shí)。在第三方面，本發(fā)明提供一種制備包含膠原蛋白、磷灰石和一種或多種糖胺聚糖的復(fù)合生物材料的方法，所述方法包括以下步驟提供包含膠原蛋白、透鈣磷石和一種或多種糖胺聚糖的復(fù)合材料，和通過水解將復(fù)合材料中的至少一些透鈣磷石轉(zhuǎn)化為磷灰石。磷灰石是一類包含鈣和磷酸根的礦物質(zhì)，它具有通式Ca5(P04)3(X)，其中X可以是離子，通常為OH-、F-和Cr以及本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其它離子。磷灰石也包括取代的磷灰石，例如硅取代的磷灰石。磷灰石包括羥磷灰石，羥磷灰石是磷灰石的具體例子。羥磷灰石也可以用硅取代。在第三方面中，復(fù)合材料優(yōu)選包含或基本由以下物質(zhì)組成包含膠原蛋白、透鈣磷石和一種或多種糖胺聚糖的三元共沉淀物。所述三元共沉淀物可以按照這里所述的與本發(fā)明第一方面有關(guān)的方法形成。優(yōu)選地，透鉀磷石水解為磷灰石的步驟包括使所述三元共沉淀物與水溶液接觸，所述水溶液的pH等于或大于磷灰石比透鉤磷石熱力學(xué)上更穩(wěn)定的pH。優(yōu)選地，為了將透鈣磷石轉(zhuǎn)化為磷灰石，該水溶液具有6.65~9，更優(yōu)選7~8.5，進(jìn)而更優(yōu)選7.2~8.5的pH。所述水溶液可以包括，例如用滴定劑、緩沖液、用另一種含鈣化合物和/或含磷化合物飽和的溶液控制pH的去離子水。優(yōu)選地，透釣磷石水解為磷灰石的步驟在2050X:的溫度下進(jìn)行，更優(yōu)選3040r:，進(jìn)而更優(yōu)選3638"C，最優(yōu)選約37X:。優(yōu)選地，透釣磷石水解為磷灰石的步驟進(jìn)行12~288小時(shí)，更優(yōu)選1872小時(shí)，最優(yōu)選24~48小時(shí)的時(shí)間。提高透鈣磷石向磷酸八鉀和/或磷灰石轉(zhuǎn)化速率的方法包括提高(i)溫度、(ii)溶液中透鈣磷石的濃度、和或(iii)攪拌速度。需制備同時(shí)包含磷灰石和磷酸八鈣的根據(jù)本發(fā)明的生物材料。可以結(jié)合本發(fā)明第二和第三方面的方法，以制備同時(shí)包含磷酸八鉀和磷灰石的材料。三元共沉淀物中的透釣磷石可以先轉(zhuǎn)化為磷酸八鉀，然后磷酸八鈞可以部分地轉(zhuǎn)化為磷灰石。通常在8.0或8.0以上的pH下水解約12小時(shí)，透鈣磷石或磷酸八鉀全部或接近全部(即至少98%)轉(zhuǎn)化為磷灰石。因此，可以通過水解小于12小時(shí)的時(shí)間來實(shí)現(xiàn)材料中透鈣磷石和/或磷灰石的部分轉(zhuǎn)化。優(yōu)選地，磷酸八鈣水解為磷灰石的步驟在6.65~10，更優(yōu)選7.2~10，進(jìn)而更優(yōu)選8~9的pH下進(jìn)行。優(yōu)選地，磷酸八鉤水解為磷灰石的步驟在20501C的溫度下進(jìn)行，更優(yōu)選3040X:,進(jìn)而更優(yōu)選3638"C,最優(yōu)選約37"C。優(yōu)選地，磷酸八鉤水解為磷灰石的步驟進(jìn)行2~144小時(shí)的時(shí)間，更優(yōu)選1296小時(shí)，最優(yōu)選2472小時(shí)。在本發(fā)明的第二和第三方面中，透鈣磷石向磷酸八鈣和/或磷灰石的轉(zhuǎn)化優(yōu)選在3040"C的溫度下進(jìn)行。更優(yōu)選地，該轉(zhuǎn)化在36~38匸的溫度下進(jìn)行。最優(yōu)選地，該轉(zhuǎn)化在約37C的溫度下進(jìn)行。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法還包括交聯(lián)三元共沉淀物中的一種或多種糖胺聚糖和膠原蛋白的步驟。關(guān)于三元共沉淀物，它包括包含膠原蛋白、透鈣磷石和一種或多種糖胺聚糖的三元共沉淀物和該共沉淀物的衍生物。該衍生物包括其中至少一部分透鈣磷石已轉(zhuǎn)化為磷酸八鈣和/或磷灰石的共沉淀物，和已經(jīng)成形或模制、或進(jìn)行了任何另外的化學(xué)或機(jī)械處理的共沉淀物。可以使用任何常規(guī)技術(shù)實(shí)現(xiàn)交聯(lián)。優(yōu)選地，至少一些透釣磷石轉(zhuǎn)化為磷酸八釣和/或磷灰石，在透釣磷石轉(zhuǎn)化為磷酸八鈣和/或磷灰石之前使糖胺聚糖與膠原蛋白交聯(lián)。該交聯(lián)可以通過下列方法實(shí)現(xiàn)對(duì)三元共沉淀物進(jìn)行Y射線輻照，紫外線輻照，脫水熱處理，用例如葡萄糖、甘露糖、核糖和蔗糖的簡(jiǎn)單糖進(jìn)行非酶糖化的一種或多種，使該三元共沉淀物與戊二醛、乙基二甲氨基丙基碳二亞胺和/或去甲二氫愈創(chuàng)木酸中的一種或多種接觸，或這些方法的任意組合。在本領(lǐng)域中這些都是常規(guī)方法。優(yōu)選地，如果至少一些透釣磷石轉(zhuǎn)化為磷酸八釣和/或磷灰石，則在透鈣磷石轉(zhuǎn)化為磷酸八鈣和/或磷灰石之后使糖胺聚糖和膠原蛋白交聯(lián)。透鈣磷石轉(zhuǎn)化為磷灰石和/或磷酸八鈣之后的交聯(lián)可以通過上述的一種或多種方法，或通過脫水熱處理，或這些方法的任意組合來實(shí)現(xiàn)。脫水熱處理包括使基材在升高的溫度下經(jīng)歷低壓環(huán)境。脫水熱處理的溫度可以為95t:~135X:。如果需要使脫水熱處理通常在18~36小時(shí)完成，則該溫度可優(yōu)選為100"ciiox:,最優(yōu)選105x:iiox:。如果需要使脫水熱處理通常在4~8小時(shí)完成，則該溫度可優(yōu)選為120X:~135X:，最優(yōu)選125"C~135X:。優(yōu)選地，在透釣磷石轉(zhuǎn)化為磷酸八釣和/或磷灰石之前和之后都使膠原蛋白和糖胺聚糖交聯(lián)。本發(fā)明的方法可以包括以下步驟使復(fù)合生物材料成形為適合用作骨或牙科替代物的結(jié)構(gòu)?？梢栽谛纬扇渤恋砦镏?，但是在可能發(fā)生透釣磷石的任何轉(zhuǎn)化或膠原蛋白與糖胺聚糖交聯(lián)發(fā)生之前進(jìn)行該步驟?？商娲兀梢栽谕?丐磷石轉(zhuǎn)化為磷灰石和/或磷酸八鈣或膠原蛋白與糖胺聚糖的交聯(lián)之后，進(jìn)行生物材料的成形步驟。優(yōu)選地，使用選自以下的技術(shù)使復(fù)合材料成形(i)過濾和/或低溫干燥，(ii)冷凍干燥，(iii)注塑成型和(iv)冷壓。溫度為15t:40X:，最優(yōu)選35x:4ox:的過濾和/或低溫干燥通常產(chǎn)生致密顆粒形式的材料。冷凍干燥通常產(chǎn)生開放的多孔形式。根據(jù)所用模頭(dye)的形狀，注塑成型可以產(chǎn)生多種形狀/形態(tài)的材料。冷壓通常產(chǎn)生致密的丸狀形式。本發(fā)明還提供適合轉(zhuǎn)化為合成生物材料的前體材料，所述前體材料包含復(fù)合材料，所述復(fù)合材料包含膠原蛋白、透鈣磷石和一種或多種糖胺聚糖。優(yōu)選地，所述復(fù)合材料包含或基本上由以下物質(zhì)組成:包含膠原蛋白、透鈣磷石和一種或多種糖胺聚糖的三元共沉淀物。所述三元共沉淀物可以通過根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法制備。本發(fā)明還提供包含膠原蛋白、透鈣磷石和一種或多種糖胺聚糖的復(fù)合生物材料，該生物材料可以通過這里描述的本發(fā)明的方法得到。本發(fā)明還提供包含膠原蛋白、磷酸八鈣和一種或多種糖胺聚糖的復(fù)合生物材料，該生物材料可以通過根據(jù)本發(fā)明第二方面的方法得到。本發(fā)明還提供包含膠原蛋白、磷灰石和一種或多種糖胺聚糖的復(fù)合生物材料，該生物材料可以通過根據(jù)本發(fā)明第三方面的方法得到。本發(fā)明還提供包含膠原蛋白、糖胺聚糖和透鈣磷石的三元共沉淀物的復(fù)合生物材料。本發(fā)明還提供包含一種和多種磷酸鈣材料的顆粒、膠原蛋白和一種或多種糖胺聚糖的生物材料，其中所述膠原蛋白和所述一種或多種糖胺聚糖交聯(lián)并形成基質(zhì)，所述磷酸鈣材料的顆粒分散在所述基質(zhì)中，所述磷酸釣材料選自透鉤磷石、磷酸八釣和/或磷灰石中的一種或多種。如果沒有其它說明，下面的描述與根據(jù)本發(fā)明的復(fù)合生物材料的所有方面都相關(guān)。優(yōu)選使膠原蛋白和一種或多種糖胺聚糖交聯(lián)。膠原蛋白優(yōu)選以5(干)重量％~90(干)重量％的量存在于所述材料中，更優(yōu)選15(干)重量％~60(干)重量％,更優(yōu)選20(干)重量％~40(干)重量％。優(yōu)選地，一種或多種糖胺聚糖以0.01(干)重量％~12(干)重量％的量存在于所述材料中，更優(yōu)選1(干)重量％~5.5(干)重量％，最優(yōu)選1.8(干)重量。/。~2.3(干)重量％。優(yōu)選地，如果所述材料包含透釣磷石，則膠原蛋白與透鉀磷石的重量(干)比為10:1~1:100,更優(yōu)選重量(干)比為5:1~1:20，最優(yōu)選重量(干)比為3:2~1:10，例如重量(干)比為3:2~1:4。優(yōu)選地，如果所述材料包含磷酸八鉀，則膠原蛋白與磷酸八釣的重量(干)比為10:1~1:100，更優(yōu)選重量(干)比為5:1~1:20，最優(yōu)選重量(干)比為3:2~1:10。優(yōu)選地，膠原蛋白與一種或多種糖胺聚糖的總量的重量(干)比為8:1~30:1，更優(yōu)選重量(干)比為10:1~30:1，進(jìn)而更優(yōu)選重量(干)比為10:1~12:1,最優(yōu)選重量(干)比為11:1~23:2。本發(fā)明的復(fù)合生物材料可以用作骨或牙科的替代材料。本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明的復(fù)合生物材料的人工骨材料、骨植入物、骨移植物、骨替代物、骨支架、填充物、涂料或粘固劑。術(shù)語涂料包括任何包含本發(fā)明的生物材料或前體的涂料。涂料可以施用于修復(fù)件、骨或任何欲用在人體或動(dòng)物體中的基材的外表面或內(nèi)表面上，該涂料中包含顆粒材料。本發(fā)明的組合物可以用于礦化生物材料的體內(nèi)和體外修復(fù)，包括但不局限于骨和牙科材料。本發(fā)明的生物材料可以用于同種異體移植物和自身移植物的生長(zhǎng)。根據(jù)本發(fā)明的包含磷酸八釣的生物材料可以不含或基本不含任意前體透鈣磷石相。在該生物材料的磷酸釣材料的總量中，該生物材料可以包含小于2重量o/。的透鈣磷石。磷酸鈣材料可以包含或基本上由相純的磷酸八鈣或磷灰石組成。相純是指優(yōu)選含有至少98%,更優(yōu)選至少99%和最優(yōu)選至少99.5%的所需相(用X射線衍射測(cè)定)?？纱娴兀鶕?jù)生物材料的所需性能，該生物材料可以包含磷酸八鈣和磷灰石的混合物。本發(fā)明的包含透鈣磷石的材料可以用作制備生物材料的前體材料，或本身適合用作生物材料。本發(fā)明的方法可以使用遵從下列順序的方法來進(jìn)行，其可以整體地或部分地應(yīng)用來制備膠原蛋白、一種或多種糖胺聚糖和一種或多種磷酸釣組分的生物復(fù)合物。下列說明是以舉例的方式提供，可適用于本發(fā)明方法的任何方面。I:在酸性pH下的膠原蛋白、GAG和磷酸釣透釣磷石的三元共沉淀進(jìn)行該步驟，以通過溶液沉淀同時(shí)形成復(fù)合物的三種(或三種以上)組分，和控制三種(或三種以上)各個(gè)相的比例。通過改變pH、溫度、老化時(shí)間、鈣離子濃度、磷離子濃度、膠原蛋白濃度和GAG濃度中的一個(gè)或多種來實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)合物的組成性能(尤其是膠原蛋白GAG:CaP的比)的控制。pH可以保持恒定(例如使用緩沖液、恒pH滴定或其它方法)或使其變化?？赡艿拇渭?jí)(污染物)相包括其它酸性磷酸鈣(例如三斜磷鈣石、磷酸氫釣)和包括滴定的副產(chǎn)物和加入反應(yīng)物的混合物(例如磷酸銨、硝酸銨)。在該步驟中也可以加入輔助交聯(lián)(例如葡萄糖、核糖)或增加體內(nèi)響應(yīng)(例如生長(zhǎng)因子、基因轉(zhuǎn)錄因子、硅、促尿鈉排泄肽)的添加劑。II:凈形狀的形成進(jìn)行該步驟以制備最終復(fù)合物形式的所需結(jié)構(gòu)，特別強(qiáng)調(diào)對(duì)孔結(jié)構(gòu)的控制。該技術(shù)的例子包括過濾和低溫干燥(產(chǎn)生致密顆粒形式)、冷凍干燥(產(chǎn)生開放的多孔形式)、注塑成型(根據(jù)模頭類型產(chǎn)生多種形狀)和冷壓(產(chǎn)生致密的丸狀形式)。III:第一交聯(lián)可以進(jìn)行該步驟以優(yōu)選確保當(dāng)放在pH升高的溶液中時(shí)，復(fù)合物的gag含量不會(huì)迅速流失，而且提高復(fù)合物的機(jī)械和降解性能。該技術(shù)的例子包括低溫物理技術(shù)(例如y射線輻照、紫外線輻照、脫水熱處理)、化學(xué)技術(shù)(例如用簡(jiǎn)單糖、戊二醛、乙基二甲氨基丙基碳二亞胺、去甲二氫愈創(chuàng)木酸的非酶糖化)、或組合方法(例如同時(shí)的非酶糖化和y射線輻照)。在需要轉(zhuǎn)化為磷酸八釣時(shí)(即步驟IV中)，有利地在低于約37匸的溫度下進(jìn)行第一交聯(lián)，以防止透鉀磷石相轉(zhuǎn)化為其脫水形式，三斜磷鉤石，三斜磷鉤石是不易水解為磷酸八鉀的磷酸鉤。IV:水解可以進(jìn)行該步驟，以便從透鈣磷石將CaP相(在生理pH下具有高溶解度的相)部分地或完全地水解為磷酸八鈣和/或磷灰石(在生理pH下具有較低溶解度的相)，并基本上除去任何可溶性污染相(例如硝酸銨、磷酸氫鈣)。在水解為OCP的情況中，將選定的pH有利地保持恒定在約6.65(使用緩沖液、恒pH滴定或其它方法)，和在約37r溫度下約24-48小時(shí)。如步驟I的情況，在水解步驟(步驟IV)期間也可以加入輔助交聯(lián)(例如葡萄糖、核糖)或增加體內(nèi)響應(yīng)(例如生長(zhǎng)因子、基因轉(zhuǎn)錄因子、硅、促尿鈉排泄肽)的添加劑。V:第二交聯(lián)進(jìn)行該步驟以進(jìn)一步調(diào)整復(fù)合物的機(jī)械和降解性能。可以使用上述步驟III中列出的任何或全部交聯(lián)方法以實(shí)現(xiàn)第二交聯(lián)。提供下列實(shí)施例和附圖以幫助進(jìn)一步理解本發(fā)明。實(shí)施例和附圖不應(yīng)認(rèn)為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例或附圖中描述的任何特征適用于以上說明的任何方面。實(shí)施例1實(shí)施例i是上述合成方法的例子，僅僅進(jìn)行步驟iin。在室溫(2025"C)和約3.2的pH(用氨滴定來維持)下進(jìn)行三元共沉淀。在本實(shí)施例中，共沉淀物在37"C下干燥，通過脫水熱處理進(jìn)行交聯(lián)。在本實(shí)施例中既不進(jìn)行CaP的水解轉(zhuǎn)化，也不進(jìn)行第二交聯(lián)。材料膠原蛋白再生的提取了胃蛋白酶的豬皮膠原蛋白(端膠原(atelocollagen));85%I型，15%111型；JapanMeatPackers(Osaka,Japan)。GAG:來自篁魚軟骨的6-石克酸軟骨素；鈉鹽；Sigma-AldrichInc(St.Louis,MO,USA)釣源(i)氫氧化鉤Ca(OH)2;Sigma-AldrichInc(St.Louis,MO,USA);(ii)硝酸鉤；Ca(N03)2.4H20;Sigma畫Aldrichlnc(St.Louis，MO，USA);磷源正磷酸；H3P04;BDHLaboratorySupplies(Poole，UnitedKingdom)滴定劑氨；NH3;BDHLaboratorySupplies(Poole,UnitedKingdom)步驟步驟I溶液A:畫在室溫下將Ca(OH)2溶解在0.48摩爾/升的H3P04中至0.12摩爾/升的濃度，使用氨將得到的溶液滴定至p1^3.2。懸浮液B:-將6-硫酸軟骨素溶解在去離子水中至3.2g/L的濃度。然后在恒定攪拌下，以1.5的硝酸根氫氧根的摩爾比將Ca(N03)2.4H20和Ca(OH)2加到硫酸軟骨素溶液中，以制備出總鈣濃度為2.4摩爾/升的懸浮液。-將0.144g的膠原蛋白加到20ml的溶液A中，使用均質(zhì)器混合至溶解。然后在恒定攪拌下將4mL的懸浮液B加到溶液A中。-繼續(xù)攪拌60分鐘，監(jiān)測(cè)pH以確保pH維持在3.15<pH<3.30的范圍中。然后使得到的漿在室溫下老化24小時(shí)。步驟n-使所述漿在37"C下在空氣中干燥5天，用去離子水漂洗剩余的三元共沉淀物，接著在37匸下再干燥24小時(shí)。-所得到的三元共沉淀物的X射線衍射譜圖示于圖l(Cu-K(a)射線)中，SEM照片示于圖2中。步驟III通過在105"C和50亳托的真空下脫水熱處理(DHT)48小時(shí)，使三元共沉淀物交聯(lián)。DHT后的三元共沉淀物的TEM照片示于圖3中。圖4表示DHT后的三元共沉淀物的X射線衍射鐠圖，表明透鈣磷石相轉(zhuǎn)化為其脫水形式三斜磷鋦石。實(shí)施例2實(shí)施例2是上述合成方法的例子，僅僅進(jìn)行步驟IIV。在室溫和pH4.0下進(jìn)行三元共沉淀。在本實(shí)施例中，通過仔細(xì)控制氫氧化鈣和硝酸鈣的濃度實(shí)現(xiàn)pH的控制，該方法也能控制三元共沉淀物中透鈣磷石與膠原蛋白+GAG的質(zhì)量比。然后將得到的三元共沉淀物冷凍至-20匸，放置在真空下，然后加熱使游離水(即水)升華。使用1-乙基3-(3-二曱氨基丙基)碳二亞胺處理進(jìn)行第一交聯(lián)。然后通過在約37t:和6.67的pH下水解將得到的干燥三元共沉淀物轉(zhuǎn)化為磷酸八鈣。在本實(shí)施例中，不進(jìn)行第二交聯(lián)。材料I型由牛腱溶解的酸，IntegraLifeSciencesPlainsboro，NJ,USAGAG:源于篁魚軟骨的6-硫酸軟骨素；鈉鹽；Sigma-AldrichInc(St.Louis,MO,USA)4丐源(i)氳氧化釣Ca(OH)2;Sigma-AldrichInc(St.Louis,MO,USA);和(ii)硝酸釣；Ca(N03)2.4H20;Sigma-Aldrichlnc(St.Louis,MO,USA);磷源正磷酸；H3P04;BDHLaboratorySupplies(Poole，UnitedKingdom)滴定劑無交聯(lián)劑(i)l-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺(=EDAC);Sigma-AldrichInc(St.Louis,MO,USA);和(ii)N-羥基琥珀酰亞胺(=NHS);Sigma-Aldrichlnc(St.Louis,MO，USA)步驟步驟I-選擇透鈣鱗石與膠原蛋白+糖胺聚糖的目標(biāo)質(zhì)量比為1:1。畫在200mL的總反應(yīng)體積中，膠原蛋白+GAG的濃度設(shè)定為21mg/mL。-使用pH變量的經(jīng)驗(yàn)三維圖(在1.0的恒定[Ca"]與[P反應(yīng)物離子比下制作)，改變(i)離子濃度(即[Ca^4H3P04)和(ii)硝酸鈣氫氧化鉤的比，確認(rèn)pH恒定為4.0的點(diǎn)的軌跡。這示于圖5中(離子濃度和硝酸鈣氫氧化鈣比的組合設(shè)定，以維持pl^4.0)。-將該點(diǎn)的軌跡疊加在具有相同的坐標(biāo)軸的透鈣磷石質(zhì)量產(chǎn)率的圖上，確認(rèn)它與21mg/mL的等值線的交叉點(diǎn)，使得可以設(shè)定反應(yīng)物濃度，在該反應(yīng)物濃度下，在pH為4.0([Ca2+]-[H3PO4]-0.1383摩爾/升；Ca(N03)2'4H20:Ca(OH)2=t).1356)時(shí)，可以制備含有質(zhì)量比為1:1的磷酸釣(21mg/mL)與膠原蛋白+GAG(21mg/mL)的三元共沉淀物漿。見圖6:確定含有質(zhì)量比為1:1的磷酸鈣與膠原蛋白+GAG的三元共沉淀物漿的pH4.0下的合成條件。國(guó)將3.8644g的膠原蛋白分散在冰浴中冷卻的171.4mL的0.1383摩爾/升的H3P04中，^使用配備直徑19mm定子的均質(zhì)器在15000rpm下混合90分鐘，制備高粘性的膠原蛋白分散體。畫在室溫下將0.3436g6-硫酸軟骨素溶解在14.3mL的0.1383摩爾/升中，通過周期振蕩分散溶解的GAG，制備GAG溶液。-90分鐘后，在15000rpm的連續(xù)均質(zhì)下，將14.3mLGAG溶液以約0.5mL/分鐘的速率加到攪拌的膠原蛋白分散體中，所得到的高粘性膠原蛋白/GAG分散體總共混合卯分鐘。-在混合卯分鐘后，在15000rpm的恒定攪拌下，用30分鐘時(shí)間將1.804g的Ca(OH)2和0.780g的Ca(N03)2.4H20加到高粘性膠原蛋白/GAG分散體豐，制備膠原蛋白/GAG/CaP三元共沉淀物漿，此后向漿中混入另外的14.3mL的0.1383摩爾/升的H3P04。-三元共沉淀物漿的pH約為4.0。畫使三元共沉淀物漿保持在25X:下48小時(shí)。步驟n-將三元共沉淀物漿置于-20"€的冷凍機(jī)中，并允許固化過夜。-然后從冷凍機(jī)中取出冷凍的漿，置于約80亳托的真空中，使溫度升至室溫，這樣引起冰從漿中的升華，使其進(jìn)行48小時(shí)。-除去游離水后的膠原蛋白/GAG/透鈣磷石三元共沉淀物的X射線衍射鐠圖(Cu-K(a)射線)示于圖7中，共沉淀物表面的SEM照片示在圖8中(CaP:膠原蛋白+GAG-l:l的三元共沉淀物表面的二次電子(SE)和反向散射電子(BSE)照片)。步驟III-在完全除去游離水之后，在40mL的去離子水中水合得到的1.25g的干燥的三元共沉淀物20分鐘。國(guó)將20mL的0.035摩爾/升的EDAC和0.014摩爾/升的NHS的溶液加到容納三元共沉淀物和去離子水的容器中，在緩和攪拌和室溫下使三元共沉淀物交聯(lián)2小時(shí)。-除去EDAC溶液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌三元共沉淀物，并在溫和攪拌下在新鮮的PBS中，在37匸下培養(yǎng)2小時(shí)。-在PBS中2小時(shí)后，用去離子水漂洗三元共沉淀物，并在溫和攪拌下在371C下培養(yǎng)兩個(gè)10分鐘的間隔。-然后將三元共沉淀物在37"€下干燥72小時(shí)。圖9表示EDAC交聯(lián)后的膠原蛋白/GAG/透鈣磷石三元共沉淀物的X射線衍射譜圖(Cu-K(a)射線)。步驟IV-將交聯(lián)的三元共沉淀物顆粒放在50mL37r:的去離子水中，使用氨將溶液的pH調(diào)節(jié)為6.67。-溫度和pH保持恒定48小時(shí)，此后過濾出共沉淀物，在去離子水中漂洗，在37匸下在空氣中干燥。-轉(zhuǎn)化為OCP后的共沉淀物的X射線衍射譜圖表示在圖10中(EDAC交聯(lián)的膠原蛋白/GAG/CaP三元共沉淀物在37*0和pH6.67下向OCP轉(zhuǎn)化72小時(shí)后，形成膠原蛋白/GAG/OCP生物復(fù)合物，Cu-K(a)射線)。實(shí)施例3實(shí)施例3是上述合成方法的例子，通過進(jìn)行步驟I~V實(shí)施。在室溫和約4.5的pH下進(jìn)行三元共沉淀。如在實(shí)施例2中，通過仔細(xì)控制氫氧化鈣和硝酸鈣濃度實(shí)現(xiàn)pH控制，不使用滴定劑。然后將得到的三元共沉淀物冷凍至-20X:，放置在真空下，然后加熱以引起游離水(即水)的升華。使用1-乙基3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺處理進(jìn)行第一交聯(lián)。然后將得到的干燥的共沉淀物在pH8.50和37X:下轉(zhuǎn)化為磷灰石。使用Y射線輻照進(jìn)行第二交聯(lián)。材料I型由牛鍵溶解的酸，IntegraLifeSciencesPlainsboro，NJ,USAGAG:來自篁魚軟骨的6-硫酸軟骨素；鈉鹽；Sigma-AldrichInc(St.Louis,MO,USA)釣源(i)氫氧化釣Ca(OH)2;Sigma-AldrichInc(St.Louis,MO,USA);和(ii)硝酸釣；Ca(N03)2'4H20;Sigma-AldrichInc(St.Louis,MO，USA);磷源正磷酸；H3P04;BDHLaboratorySupplies(Poole，UnitedKingdom)滴定劑無交聯(lián)劑(i)l-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺(=EDAC);Sigma-AldrichInc(St.Louis，MO，USA);和(ii)N-羥基琥珀酰亞胺(=NHS);Sigma-AldrichInc(St.Louis，MO,USA)步驟步驟I-選擇3:1的透釣磷石與膠原蛋白+糖胺聚糖的目標(biāo)質(zhì)量比。-在200mL的總反應(yīng)體積中，將膠原蛋白+GAG的濃度設(shè)定為10mg/mL。-使用pH變量的經(jīng)驗(yàn)三維圖(在1.0的恒定的[Ca"與[P反應(yīng)物離子比下)，改變(i)離子濃度(即[Ca"-[H3P04)和(ii)硝酸釣:氫氧化鈣的比，確認(rèn)pH恒定為4.5的點(diǎn)的軌跡。這示于圖11中(設(shè)定離子濃度和硝酸釣:氫氧化鈣的比的組合，以保持pH-4.5)。-將該點(diǎn)的軌跡疊加在透鈣磷石質(zhì)量產(chǎn)率的圖上(具有相同的坐標(biāo)軸)，確認(rèn)它與30mg/mL(即3倍于膠原蛋白+GAG的濃度)的等值線的交叉點(diǎn)，使得設(shè)定反應(yīng)物濃度，在該反應(yīng)物濃度下，在pH為4.5([Ca2+h[H3PO4卜0.1768摩爾/升；Ca(NO3)2'4H2O:Ca(OH);H).049)下，可以制備含有質(zhì)量比為3:1的磷酸鈣(30mg/mL)與膠原蛋白+GAG(10mg/mL)的三元共沉淀物漿。這示于圖12中確定含有質(zhì)量比為3:1的磷酸釣與膠原蛋白+GAG的三元共沉淀物漿的pH4.5下的合成條件。-將1.837g的膠原蛋白分散在冰浴中冷卻的171.4mL的0.1768摩爾/升的H3P04+，4吏用配備直徑19mm定子的均質(zhì)器在15000rpm下混合卯分鐘，以制備膠原蛋白分散體。畫在室溫下將0.163g6-硫酸軟骨素溶解在14.3mL的0.1768摩爾/升的磷酸中，通過周期地振蕩分散溶解GAG,以制備GAG溶液。-90分鐘后，在15000rpm的連續(xù)均質(zhì)下，將14.3mLGAG溶液以約0.5mL/分鐘的速率加到混合的膠原蛋白分散體中，所得到的膠原蛋白/GAG分散體總共混合卯分鐘。-在90分鐘的混合后，在15000rpm的恒定攪拌下，在30分鐘時(shí)間將2.498g的Ca(OH)2和0.380g的Ca(N03)2.4H20加到膠原蛋白/GAG分散體中，制備膠原蛋白/GAG/CaP三元共沉淀物漿，此后向混合漿體中加入另外的14.3mL的0.1768摩爾/升的H3P04。-三元共沉淀物漿的pH約為4.5。-使三元共沉淀物漿保持在25匸下48小時(shí)。步驟II-將三元共沉淀物漿置于-20*€的冷凍機(jī)中，使其冷凍過夜。-然后從冷凍機(jī)取出冷凍的漿，放在約80亳托的真空中，使溫度升至室溫，這樣引起冰從漿中的升華，使其進(jìn)行48小時(shí)。除去游離水后的膠原蛋白/GAG/透鈣磷石三元共沉淀物的X射線衍射鐠圖(Cu-K((x)射線)示于圖13中。步驟III-在完全除去游離水之后，使得到的1.25g的干三元共沉淀物在40mL的去離子水中水合20分鐘。-將20mL的0.018摩爾/升EDAC和0.007摩爾/升NHS的溶液加到含有三元共沉淀物和去離子水的容器中，在緩和攪拌和室溫下使三元共沉淀物交聯(lián)2小時(shí)。-除去EDAC溶液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌三元共沉淀物，允許在溫和攪拌下在新鮮的PBS中，在37t:下培養(yǎng)2小時(shí)。-在PBS中2小時(shí)后，用去離子水洗滌三元共沉淀物，并在溫和攪拌和37"C下培養(yǎng)兩個(gè)IO分鐘的間隔。-然后將三元共沉淀物在37"€下干燥72小時(shí)。EDAC交聯(lián)后的膠原蛋白/GAG/透鈣磷石三元共沉淀物的X射線衍射譜圖(Cu-K(a)射線)示于圖14中。步驟IV-將交聯(lián)的三元共沉淀物顆粒置于37"C的50mL用透鈣磷石預(yù)先飽和的去離子水中，使用氨將溶液的pH調(diào)節(jié)為8.50。-維持溫度和pH恒定72小時(shí)，此后過濾出共沉淀物，在去離子水中漂洗，在37X:下在空氣中干燥。轉(zhuǎn)化為磷灰石后的共沉淀物的X射線衍射鐠圖示于圖15中(EDAC交聯(lián)的膠原蛋白/GAG/CaP三元共沉淀物在37C和8.50的pH下向磷灰石轉(zhuǎn)化72小時(shí)后，形成膠原蛋白/GAG/磷灰石生物復(fù)合物，Cu-K(a)射線)。步驟V-將干燥的膠原蛋白/GAG/Ap三元共沉淀物進(jìn)行32.1kGy劑量的Y射線輻照。圖16表示Y射線輻照后的X射線衍射鐠圖(經(jīng)Y輻照第二交聯(lián)后的EDAC交聯(lián)的膠原蛋白/GAG/Ap三元共沉淀物)。實(shí)施例4材料膠原蛋白再生的提取了胃蛋白酶的豬皮膠原蛋白(端膠原)；85wt%I型，15wt%III型；JapanMeatPackers(Osaka，Japan)。GAG:來自篁魚軟骨的6-硫酸軟骨素；鈉鹽；Sigma-AldrichInc(St.Louis,MO,USA)鉀源(i)氫氧化鉤Ca(OH)2;Sigma-AldrichInc(St.Louis，MO,USA);和(ii)硝酸鉤；Ca(N03)24H20;Sigma-AldrichInc(St.Louis,MO,USA);磷源正磷酸；H3P04;BDHLaboratorySupplies(Poole，UnitedKingdom)滴定劑氨；NH3;BDHLaboratorySupplies(Poole，UnitedKingdom)步驟步驟I畫通過在室溫下將Ca(OH)2溶解在0.48摩爾/升的H3P04中至0.12摩爾/升的濃度，制備溶液A，將所得到的溶液滴定至pH為3.2。-通過將6-硫酸軟骨素溶解在去離子水中至3.2g/L的濃度，制備出懸浮液B。在恒定攪拌下，以1.5的硝酸根氫氧根的摩爾比將Ca(N03)2.4H20和Ca(OH)2加到硫酸軟骨素溶液中，以制備總釣濃度為2.4摩爾/升的懸浮液。-將0.144g的膠原蛋白加到20mL的溶液A中，使用均質(zhì)器混合至溶解。然后在恒定攪拌下將4mL的懸浮液B加到溶液A中。持續(xù)攪拌60分鐘，監(jiān)測(cè)？11以確保？11維持在3.15<卩11<3.30的范圍中。然后使所得到的漿在室溫下老化24小時(shí)。步驟II-使所述漿在37C下在空氣中干燥5天，用去離子水漂洗剩余的三元共沉淀物，接著在371C下再干燥另外的24小時(shí)。步驟III國(guó)將共沉淀物放在稀醋酸(pH-3.2)中，用30kGy的y射線輻照劑量輻照。然后從溶液中除去交聯(lián)的沉淀物，漂洗，在37C下在空氣中干步驟IV-將交聯(lián)的共沉淀物顆粒放在37X:的50mL去離子水中，使用氨將溶液的pH調(diào)節(jié)為6.65。維持恒定溫度和pH48小時(shí)，此后過濾出共沉淀物，在去離子水中漂洗，在37X:下在空氣中干燥。步驟V-將交聯(lián)的水解的共沉淀物顆粒置于室溫的真空箱中，施加50亳托的真空，然后將溫度升高至1051C。24小時(shí)后，將溫度降至室溫，并釋放真空。圖17表示剛剛進(jìn)行三元共沉淀和干燥(步驟I和II)后的復(fù)合物的X射線衍射譜圖。該譜圖證實(shí)主要存在的相是透鈣磷石。圖18表示第一交聯(lián)(步驟III)后的共沉淀物顆粒的結(jié)構(gòu)的SEM顯微照片。值得注意的是顆粒微觀結(jié)構(gòu)的均一性質(zhì)。水解為磷酸八鉤的過程(步驟IV)表示在圖19的XRDi普?qǐng)D中。在12.5。的透釣磷石峰強(qiáng)度逐漸減弱，在4.5°的磷酸八鉀(OCP)的主峰增強(qiáng)，這表明無*14目在48小時(shí)轉(zhuǎn)化為OCP。復(fù)合物的TEM圖表示在圖20中?？梢钥闯觯稚⒃谀z原蛋白/GAG基質(zhì)中的10~20nm的低長(zhǎng)寬比的磷酸鈣晶體的無規(guī)分布。本發(fā)明的復(fù)合生物材料可以用作可生物吸收的材料。可以預(yù)期，移植后，由該材料制備的構(gòu)件將完全吸收，僅留下健康的再生組織，絲亳不留下移植物本身。[附錄1完權(quán)利要求1.一種用于制備包含無機(jī)材料和有機(jī)材料的復(fù)合生物材料的方法，所述方法包括(a)提供第一漿組合物，其包含液體載體、無機(jī)材料和有機(jī)材料；(b)提供用于所述漿的模具；(c)使所述漿沉積在所述模具中；(d)將沉積在所述模具中的漿冷卻至所述液體載體轉(zhuǎn)化為多個(gè)固體晶體或顆粒的溫度；(e)通過升華和/或蒸發(fā)除去至少一些所述多個(gè)固體晶體或顆粒，以留下含有無機(jī)材料和有機(jī)材料的多孔復(fù)合材料；和(f)從所述模具中取出所述材料。2.根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中所述無機(jī)材料包括磷酸鉤材料。3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述磷酸釣材料包括透鈣磷石。4.根據(jù)權(quán)利要求l-3任一項(xiàng)的方法，其中所述有機(jī)材料包含膠原蛋白(包括重組人(rh)膠原蛋白)、糖胺聚糖、白蛋白、乙酰透明質(zhì)酸、殼聚糖、和包含膠原蛋白的部分多肽序列的合成多肽中的一種或多種。5.根據(jù)權(quán)利要求l-4任一項(xiàng)的方法，其中所述無機(jī)材料包括磷酸鉤材料，所述有機(jī)材料包括膠原蛋白和任選的糖胺聚糖，和其中所述多孔復(fù)合材料包含所述磷酸釣材料和膠原蛋白以及任選的糖胺聚糖。6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述第一漿包含膠原蛋白和所述磷酸鈣材料的共沉淀物。7.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述第一漿包含膠原蛋白、所述磷酸鈣材料和糖胺聚糖的三元共沉淀物。8.根據(jù)權(quán)利要求5-7任一項(xiàng)的方法，其中所述磷酸鉤材料包括透鈣磷石。9.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，還包括提供第二漿組合物，其包含液體載體和有機(jī)材料以及任選的無機(jī)材料；和在所述冷卻步驟之前，在沉積所述第一漿組合物之前或之后將所述第二漿組合物沉積在所述模具中。10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述有機(jī)材料包含膠原蛋白(包括重組人(rh)膠原蛋白)、糖胺聚糖、白蛋白、乙酰透明質(zhì)酸、殼聚糖、和包含膠原蛋白的部分多肽序列的合成多肽中的一種或多種。11.根據(jù)權(quán)利要求9或10的方法，其中所述第二漿組合物包含無機(jī)材料，優(yōu)選磷酸鉤材料。12.根據(jù)權(quán)利要求9-ll任一項(xiàng)的方法，其中所述第二漿組合物包含液體載體、膠原蛋白、任選的磷酸鉀材料和任選的糖胺聚糖。13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述第二漿組合物包含膠原蛋白和糖胺聚糖的共沉淀物，或膠原蛋白和磷酸鉀材料的共沉淀物，或膠原蛋白、糖胺聚糖和磷酸鈣材料的三元共沉淀物。14.根據(jù)權(quán)利要求12或13的方法，其中所述第二漿組合物包含為透鈣磷石的磷酸鉤材料。15.根據(jù)權(quán)利要求9-14任一項(xiàng)的方法，其中所述第一和第二漿組合物作為第一和第二層沉積在所述模具中。16.根據(jù)權(quán)利要求12-15任一項(xiàng)的方法，其中所述方法導(dǎo)致多層材料的形成，其中至少一層包含含有膠原蛋白、磷酸鈣材料和任選的糖胺聚糖的多孔復(fù)合材料。17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中由所述第二漿組合物得到的層是多孔的。18.根據(jù)權(quán)利要求9-17任一項(xiàng)的方法，其中在將所述第一和第二漿組合物沉積在所述模具中后，在冷卻步驟之前，靜置所述模具的內(nèi)含物長(zhǎng)達(dá)24小時(shí)。19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中靜置所述模具的內(nèi)含物的步驟在1~200kPa，優(yōu)選50150kPa，更優(yōu)選50-101.3kPa的壓力下進(jìn)行。20.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述液體載體包括水。21.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中在所述冷卻步驟之前沉積在所述模具中的漿的溫度為2到40n，優(yōu)選4到37C，更優(yōu)選20到37x:。22.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中冷卻沉積在所述模具中的漿的步驟進(jìn)行到<oC的溫度。23.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中冷卻沉積在所述模具中的漿的步驟進(jìn)行到-100到0C、優(yōu)選-80到-10n、更優(yōu)選-40到-20"C的溫度。24.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中以0.02到1ox:/分鐘，優(yōu)選0.02到6.0"C/分鐘，更優(yōu)選0.2到2.7t:/分鐘的冷卻速率，進(jìn)行冷卻沉積在所述模具中的漿的步驟。25.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中沉積在所述模具中的漿的厚度為0.1到500mm,優(yōu)選0.5到20mm，更優(yōu)選1.0到10mm。26.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中在沉積到所述模具中之前，所述漿的粘度為0.1到50Pa's,優(yōu)選0.1到10Pa*s,更優(yōu)選0.5到5Pa-s。27.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中在0到0.08kPa，優(yōu)選0.0025到0.08kPa，更優(yōu)選0.0025到0.04kPa的壓力下，進(jìn)行通過升華除去至少一些所述固體晶體或顆粒的步驟。28.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中通過升華除去至少一些所述固體晶體或顆粒的步驟進(jìn)行長(zhǎng)達(dá)120小時(shí)，優(yōu)選12到72小時(shí)，更優(yōu)選24到36小時(shí)。29.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中在-10到60X:，優(yōu)選0到40更優(yōu)選20到371C下，進(jìn)行通過升華除去至少一些所述固體晶體或顆粒的步驟。30.根據(jù)權(quán)利要求5-8和12-29中任一項(xiàng)的方法，還包括交聯(lián)所述多孔復(fù)合生物材料中的所述膠原蛋白和所述一種或多種糖胺聚糖的步驟。31.根據(jù)權(quán)利要求2-8和11-30中任一項(xiàng)的方法，還包括將所述多孔復(fù)合生物材料中的至少一些磷酸鈣材料轉(zhuǎn)化成不同的磷酸鈣相的步驟。32.根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其中所述磷酸釣材料包括透鈣磷石，并且被轉(zhuǎn)化成磷酸八鈣和/或磷灰石。33.—種合成的復(fù)合生物材料，其中至少部分所述生物材料由包含磷酸鈣材料，和膠原蛋白(包括重組人(rh)膠原蛋白)、糖胺聚糖、白蛋白、乙酰透明質(zhì)酸、殼聚糖或包含膠原蛋白的部分多肽序列的合成多肽中之一的多孔共沉淀物形成，其中大孔尺寸范圍(孔徑)優(yōu)選為l到1000微米，優(yōu)選200到600微米。34.根據(jù)權(quán)利要求33的合成的復(fù)合生物材料，其中至少部分所述生物材料由包含磷酸釣材料和膠原蛋白的多孔共沉淀物形成。35.—種合成的復(fù)合生物材料，其中至少部分所述生物材料由包含磷酸鈣材料，和膠原蛋白(包括重組人(rh)膠原蛋白)、糖胺聚糖、白蛋白、乙酰透明質(zhì)酸、殼聚糖和包含膠原蛋白的部分多肽序列的合成多肽中的兩種或多種的多孔三元共沉淀物形成，其中所述大孔尺寸范圍(孔徑)優(yōu)選為1到1000微米，更優(yōu)選200到600微米。36.根據(jù)權(quán)利要求35的合成的復(fù)合生物材料，其中至少部分所述生物材料由包含膠原蛋白、糖胺聚糖和磷酸鈣材料的多孔三元共沉淀物形成。37.—種合成的復(fù)合生物材料，包含第一層，其由包含膠原蛋白和磷酸鈣材料以及任選的糖胺聚糖的多孔材料形成；和第二層，其連接到所述第一層，并且由包含膠原蛋白，或膠原蛋白與糖胺聚糖的共沉淀物，或膠原蛋白與磷酸釣材料的共沉淀物，或膠原蛋白、糖胺聚糖和磷酸鉤材料的三元共沉淀物的材料形成。38.根據(jù)權(quán)利要求37的生物材料，其中所述第一層由權(quán)利要求33或36中任一項(xiàng)所定義的材料形成。39.根據(jù)權(quán)利要求37或38的生物材料，其中所述第一和第二層是整體形成的，優(yōu)選通過液相共合成法形成。40.根據(jù)權(quán)利要求33-39中任一項(xiàng)的生物材料，其中所述第一和第二層通過相互擴(kuò)散層彼此連接。41.根據(jù)權(quán)利要求33-39中任一項(xiàng)的生物材料，其中所述第一和第二層通過中間層彼此連接。42.根據(jù)權(quán)利要求33-41中任一項(xiàng)的生物材料，其中所述第二層是多孔的或無孔的。43.根據(jù)權(quán)利要求33-42中任一項(xiàng)的生物材料，包含一個(gè)或多個(gè)連接到所述第一和/或第二層的另外的層，每個(gè)所述另外的層由包含膠原蛋白，或膠原蛋白與糖胺聚糖的共沉淀物，或膠原蛋白與磷酸釣材料的共沉淀物，或膠原蛋白、糖胺聚糖和至少一種磷酸釣材料的三元共沉淀物的材料形成。44.根據(jù)權(quán)利要求43的生物材料，其中所述第一和第二層以及所述一個(gè)或多個(gè)另外的層是整體形成的。45.根據(jù)權(quán)利要求43或44的生物材料，其中相鄰的層通過相互擴(kuò)散層彼此連接。46.根據(jù)權(quán)利要求43-45中任一項(xiàng)的生物材料，其中所述一個(gè)或多個(gè)另外的層中的至少一個(gè)是多孔的或無孔的。47.根據(jù)權(quán)利要求33-46中任一項(xiàng)的生物材料，其中所述材料包含膠原蛋白和糖聚胺糖，和其中所述膠原蛋白和糖胺聚糖是交聯(lián)的。48.根據(jù)權(quán)利要求33-47中任一項(xiàng)的生物材料，其中所述材料包含膠原蛋白，和其中所述膠原蛋白以1到99wt%，優(yōu)選5到卯wt。/。，更優(yōu)選15到60wt%的量存在于所述材料中。49.根據(jù)權(quán)利要求33-48中任一項(xiàng)的生物材料，其中所述材料包含糖胺聚糖，和其中所述糖胺聚糖以0.01到20wt。/。，優(yōu)選l到5.5wt。/。的量存在于所述材料中。50.根據(jù)權(quán)利要求33-49中任一項(xiàng)的生物材料，其中所述材料包含膠原蛋白，和其中如果所述磷酸釣包含透鈣磷石，則膠原蛋白和透鈣磷石的重量比為10:1到1:100，優(yōu)選重量比為5:1到1:20。51.根據(jù)權(quán)利要求33-49中任一項(xiàng)的生物材料，其中所述材料包含膠原蛋白，和其中如果所述磷酸鉤材料包含磷酸八釣，則膠原蛋白和磷酸八釣的重量比為10:1-1:100，優(yōu)選重量比為5:1-1:20。52.根據(jù)權(quán)利要求33-51中任一項(xiàng)的生物材料，其中所述材料包含膠原蛋白和糖胺聚糖，并且其中膠原蛋白和糖胺聚糖的重量比為8:1到30:1。53.—種合成的骨材料、骨植入物、骨移植物、骨替代物、骨支架、填充物、涂料或粘固粉，其包含權(quán)利要求33-52中任一項(xiàng)所定義的生物材料。54.—種用于組織工程的整體或分層的骨支架，其包含權(quán)利要求33-52中任一項(xiàng)所定義的生物材料。55.—種可通過權(quán)利要求1-32中任一項(xiàng)定義的方法得到的多孔復(fù)合生物材料。全文摘要一種用于制備包含無機(jī)材料和有機(jī)材料的復(fù)合生物材料的方法，所述方法包括(a)提供第一漿組合物，其包含液體載體、無機(jī)材料和有機(jī)材料；(b)提供用于所述漿的模具；(c)使所述漿沉淀在所述模具中；(d)將沉淀在所述模具中的漿冷卻至所述液體載體轉(zhuǎn)化為多個(gè)固體晶體或顆粒的溫度；(e)通過升華和/或蒸發(fā)移除所述多個(gè)固體晶體或顆粒的至少一些，以留下含有無機(jī)材料和有機(jī)材料的多孔復(fù)合材料；和(f)從所述模具中取出所述材料。文檔編號(hào)A61L27/46GK101175513SQ200680011492公開日2008年5月7日申請(qǐng)日期2006年3月6日優(yōu)先權(quán)日2005年3月7日發(fā)明者威廉·邦菲爾德,安德魯·K·林恩,布倫丹·A·哈萊,揚(yáng)尼斯·V·揚(yáng)納斯,洛娜·J·吉普森申請(qǐng)人:劍橋有限公司;麻省理工學(xué)院