專利名稱：：復合抗原制劑及其使用方法復合抗原制劑及其使用方法引言本申請是2004年1月14日提交、序列號為10/757,692的美國專利申請的部分繼續申請，該申請要求2003年1月16日提交的、序列號為60/441,374的美國臨時申請的優先權，各以其全部內容合并在本文中作為參考。本發明是在過敏與傳染病國立研究院(NationalInstituteofAllergyandInfectiousDisease)資助的研究(NIAID基金編號AI-46457和AI-13989)過程中產生的。美國政府對本發明擁有確定的權利。
背景技術：
：在A型流感病毒體和病毒感染細胞的膜上表達有三類跨膜蛋白。血凝素和神經氨酸苷酶是分別具有510和420個氨基酸較大胞外域的糖蛋白。血凝素是作為同型三聚體進行裝配的，而神經氨酸苷酶則是作為同型四聚體進行裝配的，其在病毒包膜和病毒成熟的細胞位置上形成了13-14nm長、短桿狀表面凸起的致密層。目前的流感病毒疫苗旨在誘導針對于這些糖蛋白，尤其是血凝素的強烈抗體反應，因為公知這類抗體對感染具有較高的保護作用。而問題在于A型流感病毒對于改變這些保護性抗體所識別的決定簇具有高度的傾向性，這就使得必須重復接種能夠反映這些抗原變化的更新疫苗株。相反，第三種病毒跨膜蛋白，基質蛋白2(M2)，含有在人流感病毒株系中保守的胞外域(M2e)。已經研究過使用M2對抗A型流感病毒感染的廣譜保護性免疫性(Sl印ushkin，等人，(1995)Vaccine13:1399-1402;Frace，等人，(1999)Vaccine17:2237-44;Neirynck，等人，(1999)NatureMed.5:1157-63;Okuda，等人，(2001)Vaccine19:3681-91)。M2是甲型流感病毒的一種97個氨基酸長的跨膜蛋白(Lamb，等人，(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA78:4170-4174;Lamb，等人，(1985)Cell40:627-633)。該成熟蛋白形成同型四聚體(Holsinger和Lamb(1991)Virology183:32-43;Sugme禾BHay(1991)，Virology180:617-624)，其具有pH可誘導的離子通道活性(Pinto，等人，(1992)Cell69:517-528;Sugrue和Hay(1991)如上文所引)。M2四聚體在被感染細胞的質膜上高密度表達，但相對排除在病毒成熟的位置以外，因而僅以低頻率得以整合到成熟病毒顆粒的包膜中(Takeda，等人，(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA100:14610-14617;Zebedee禾PLamb(1988)J.Virol.62:2762-2772)。M2(M2e)的24個氨基酸長度胞外域序列在人類流行性病毒株中仍是保守的(Macken，等人，(2001)InOptionsfortheControlofInfluenza.IV.Osterhaus等人編，pi03-106.ElsevierScience，Amsterdam)。從1918年以來所分離到的大多數人類流行性病毒株都具有相同的M2e蛋白序列。除此之外，若干對小鼠的研究表明M2e-特異性抗體能夠限制流感病毒的復制并且降低發病率和死亡率(Fan，等人，(2004)Vaccine22:2993-3003;Liu，等人，(2004)Immunol.Lett.93:131-136;Mozdzanowska，等人，(2003)J.Virol.77:8322-8328;Neirynck，等人，(1999)如上文所弓l;Treanor，等人，(1990)J.Virol.64:1375-1377)。此外，在雪貂，其被認為是對人類流感最具預測性的動物模型中，M2e-特異性免疫的保護活性得以證明(Fan，等人，(2004)如上文所引)，而且來自于用M2e-載體軛合物免疫恒河猴所得的血清轉入小鼠時也表現出了保護活性(Fan，等人，(2004)如上文所引)。因此，除了對豬進行的研究以外，其表明了M2e-特異性免疫能夠增強而不是緩解疾病(Heinen，等人，(2002)J.Gen,Virol.83:1851-1859)，動物模型的證據都表明M2e-特異性免疫能夠提供顯著水平的保護，其旨在對抗明顯保守的病毒靶。M2e中結構變異的程度低的確部分歸因于其與Ml遺傳關系所產生的限制，Ml是該病毒中最保守的蛋白(Ito，等人，(1991)J.Virol.65:5491-5498)。M2是由病毒基因片段7的剪接RNA編碼的，該片段還編碼Ml(Lamb，等人，(1985)如上文所引)。所述剪接事件去除了編碼Ml的大部分核苷酸(nt27-714)，除了26個最5'端和42個最3'端的核苷酸(Lamb，等人，(1985)如上文所引)。因此，編碼基本上完整M2e的M2核苷酸l-68是雙順反子的，從1-26是相同的而從27-68則是不同的閱讀框。可以預期，M2e和Ml之間的這種遺傳關系在顯著限制了M2e中的變異性程度。有助于在人類流感病毒株中M2e所見的改變程度低的其他因素還可以是M2e-特異性抗體的缺乏并由此壓制改變。對從自然感染的急性和恢復期階段所獲得的17對人血清進行的小規模研究發現，M2-特異性抗體在來自急性階段的血清中是缺乏的，且僅在6例恢復期的樣本中得以檢測到(Black，等人，(1993)J.Gen.Virol.74(Pt1):143-146)。這與核蛋白-特異性抗體滴度相反，其在17例恢復期血清的15例中得以升高，從而確證了所述供體的近期流感感染(Black，等人，(1993)如上文所引)。另一個研究發現，在對病毒特異性抗體表現出一個為陽性里另一個為陰性的兩組較大的未配對血清中，并沒有發現M2e-特異性抗體滴度的差異(Liu，等人，(2003)FEMSImmunol.Med.Microbiol.35:141-146)。這些數據說明，雖然人體內的感染能夠導致可檢測的針對于M2的抗體反應，所述反應也并非是一致產生的，而且作用小且持續短。在小鼠模型中可獲得類似的觀察結果，其中用具有相同M2e的病毒株進行的兩次重復感染僅誘導了低滴度的M2e-特異性抗體(Mozdzanowska,等人，(2003)Vaccine21:2616-2626)。因為M2是純化病毒中的少量組分(0.5%)(Zebedee和Lamb(1988)J.Virol.62:2762-2772)，因此同樣也不能預期當前所使用的滅活流感病毒疫苗能夠誘導M2e-特異性免疫。M2e-特異性單克隆抗體14C2在體外并不能預防病毒感染，但當被整合入培養基或瓊脂覆蓋物時卻能降低病毒產量和噬菌斑尺寸(Zebedee和Lamb(1988)如上文所引；Hughey，等人，(1995)Virology212:411-21)。并非所有M2e-特異性抗體都表現出這種活性(Hughey，等人，(1995)如上文所引)，并且也并非所有病毒株都對其具有易感性(Zebedee和Lamb(1988)如上文所引)。在體內，被動的單克隆抗體14C2類似地降低了病毒生長(Treanor，等人，(1990)J.Virol.64:1375-7)并且還有效對抗PR8(Mozdzanowska，等人，(1999)Virology254:138-46)，其在體外對抗體介導的生長限制不易感(Zebedee和Lamb(1988)如上文所引；Mozdza謂ska,等人，(1999)如上文所引)，說明在體外和體內抗體介導的病毒生長抑制是通過不同的機制發生的。還發現含有連有輔助T細胞決定簇的M2e的復合抗原制劑是誘導病毒保護的有效疫苗。M2e-MAA與霍亂毒素(CT)和具有刺激性CpG基序的合成性寡聚脫氧核苷酸(ODN)—起，在小鼠血清中誘導強烈的M2e-特異性抗體滴度并產生針對抗流感病毒攻擊的顯著保護。發明概述本發明是一種復合抗原制劑(MAA)，結構為<formula>seeoriginaldocumentpage7</formula>式I(SEQIDNO:l)其中，Ri為含有Cys或GlyM，S卜氨基酸殘基或核酸序列；m為至少l;n為至少l;Xaa,為含有&或Gly的0-1個氨基酸殘基；R2，R3和R4可獨立地為B細胞決定簇，T細胞決定簇，或靶分子；而Rs為氨基酸，肽，或核酸序列。在一個實施方案中，當m大于l時，每個R2可獨立為B細胞決定簇，T細胞決定簇，或耙分子；而當n大于l時，每個R3可獨立為B細胞決定簇，T細胞決定簇，或靶分子。在特定實施方案中，所述B細胞決定簇是基質蛋白2的胞外域，或其片段或同源物。在另一個實施方案中，位于第一MAAN-末端上的Cys殘基通過二硫鍵與式I的第二MAAN-末端上的第二Cys殘基共價連接，產生式I的MAA二聚體。本發明還是含有MAA和藥物可接受載體的組合物。在一個實施方案中，含有所述MAA和藥物可接受載體的組合物還可以含有佐劑。這樣的組合物可用來預防或治療病毒感染。因此，本發明還提供了預防或治療病毒感染的方法，其包括向具有易感對象或表現出病毒感染征兆或癥狀的個體施用有效量的本發明組合物，以預防或治療病毒感染的征兆或癥狀。在特定的實施方案中，所述病毒感染是A型流感病毒。本發明的這些以及其他方面將在本發明的以下說明中得到更加詳細的闡述。書圖1顯示了M2e-MAA的劑量對M2e抗體滴度的影響。使用具有指定劑量的在佐劑中含有4種M2e24B細胞決定簇和的MAA，通過i.n.免疫BALB/c小鼠。每次免疫之后3周測定M2e-特異性的血清抗體滴度。所示為得自兩次獨立試驗的平均值。圖2顯示了使用(4)M2e-MAA免疫誘導的反應的特異性。在圖2A中，通過i.n.，s.c.，或i.p.途徑，使用在佐劑中相同劑量的(4)M2e25-MAA免疫四只小鼠的數組。通過ELISA的方法，在第一次加強免疫之后21天(b21)，第二次加強免疫之后14天(2bl4)，以及第二次加強免疫之后90天(2b90),對第一次和第二次加強免疫之后所得血清的抗體滴度特異性進行檢測。通過與使用純化抗-M2e單克隆抗體所見的結合進行比較，來定量與每一種免疫吸附劑的結合。在圖2B中，通過i.n.方式用佐劑中的(4)M2e24-MAP或(4)M^15-MAP對四只小鼠的數組進行免疫，血清的特異性檢測如圖2B所示。發明詳述現己發現，使用含有多種B細胞決定簇和T輔助細胞(Th)決定簇的復合抗原制劑(MAA)接種的動物，表現出對隨后的傳染性病毒攻擊具有顯著的抵抗力。如本說明書所定義的，復合抗原劑是含有超過一種肽或核酸部分的試劑，其能夠在動物中誘導特異性的免疫反應。所述B細胞決定簇能夠誘導抗體反應，并同樣能夠誘導T細胞反應。在本說明書中MAA所提供的益處在于可有許多抗原側鏈與核心肽相連，其含有Lys-Gly重復，從而能夠呈現若干結構性相連的決定簇。除此之外，當Cys殘基在核心肽的N-末端上連接時，兩種核心肽可以通過二硫鍵共價相連從而有效地將抗原性側鏈的數量翻倍，并由此增強哺乳動物體內的免疫反應。此外，由于本說明書所提供的MAA可方便地通過化學方法合成，所述MAA的制備是可以被高度控制的，污染物也將最少化。因此，本發明是具有下列結構的MAA:<formula>seeoriginaldocumentpage9</formula>式I(SEQIDNO:1),其中，m為至少1且n為至少1。在一個實施方案中，m和n的加和為約10至30。在又一個實施方案中，m和n的加和為約10。在式I所述的MAA中，所述氨基酸部分Xaa,是0工「l基酸殘基，其中，當Xaa'為l個氨基酸殘基時，所述氨基酸是A《或Gly。在特定的實施方案中，Xaa,為Gly。在式I所述的MAA中，R,部分為0-2個氨基酸殘基或核酸序列，例如具有刺激性CpG基序的寡脫氧核苷酸(ODN)。在一個實施方案中，R,部分為0個氨基酸殘基。在另一個實施方案中，R,部分為l個氨基酸殘基。當&為1個氨基酸殘基時，所述氨基酸殘基可以是Gly或Cys。在又一個實施方案中，R,是二肽Cys-Gly。當第一MAA的N-末端氨基酸是Cys-Gly二肽時，所述Cys殘基可如愿共價連接于式I所示第二MAAN-末端的第二Cys殘基。在所述第一和第二半胱氨酸殘基之間的二硫鍵連接生成了共價連接的式I的MAA二聚體。本發明預期所述二聚體的肽在Lys-Gly重復的數量(gP，m和n的數量)、Xaa!、R2、R3、R4或R5上可以是相同的或不同的。在式I所述的MAA中，連接于賴氨酸f-氨基基團上的R2、113和R4取代基可以獨立地為B細胞決定簇、T細胞決定簇、或靶分子。在一個實施方案中，在式I所述的MAA中存在有至少一種B細胞決定簇和一種T細胞決定簇。在另一實施方案中，式I所述的MAA具有至少兩種B細胞決定簇。在又一實施方案中，式I所述的MAA具有至少四種B細胞決定簇。有益的是，式I所述的MAA可具有來自多種來源(例如，來自不同病毒科或血清型)的多種組合和數量的B細胞決定簇、T細胞決定簇、或靶分子。為了舉例說明，本發明的單體MAA可含有5種B細胞決定簇，2種T細胞決定簇和2種耙分子側鏈。或者，本發明的單體MAA可以，例如，含有8種B細胞決定簇、1種T'細胞決定簇和1種靶分子側鏈。所述組合沒有特定限制，并且可隨著所選擇的B細胞決定簇、T細胞決定簇或靶分子而改變。此外，m或n長度中Lys-Gly重復的個體R基團也會發生改變。例如，如果m=3，第一個Lys-Gly重復的R2可以是B細胞決定簇，第二個Lys-Gly重復的112可以是T細胞決定簇，而第三個Lys-Gly重復的R2可以是靶分子。B細胞決定簇，正如本文所使用，可如愿引起可量度的B細胞應答，其是通過，例如測定針對天然病毒蛋白所產生的抗體。可用于式I所述MAA中的B細胞決定簇包括那些本領域中公知的以及任何其他抗原，例如多糖，多肽，或引起B細胞反應的核酸。在一個實施方案中，抗原得自于具有包膜或無包膜的病毒。在另一個實施方案中，得自病毒的抗原包括，但不限于，來自腺病毒科，沙粒病毒科(例如，淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒)，動脈炎病毒屬(例如，馬動脈炎病毒)，星狀病毒科(人星狀病毒1),雙節段RNA病毒科(例如，傳染性胰壞死病毒，傳染性法氏囊病病毒)，布尼亞病毒科例如，加利福尼亞腦炎病毒類型)，杯狀病毒科(例如，杯狀病毒)，冠狀病毒科(例如，人冠狀病毒299E和OC43)，丁型肝炎病毒屬(Deltavirus)(例如，丁型肝炎病毒)，纖絲病毒科(例如，馬爾堡病毒，埃博拉病毒扎伊爾型)，黃病毒科(例如，黃熱病病毒類型，丙型肝炎病毒)，嗜肝DNA病毒科(例如，乙型肝炎病毒)，皰疹病毒科(例如，Epstein-Bar病毒，單純皰疹病毒屬，水痘病毒屬，巨細胞病毒屬，玫瑰疹病毒屬，淋巴濾泡病毒屬，猴病毒屬)，正粘病毒科(例如，流感病毒A、B和C)，乳頭多瘤空泡病毒科(例如，乳頭瘤病毒)，副粘病毒科(例如，副粘病毒，例如人副流感病毒l,麻疹病毒屬，例如麻疹病毒，腮腺炎病毒屬，例如腮腺炎病毒，肺病毒屬，例如人呼吸道合胞病毒)，小RNA病毒科(例如，鼻病毒屬，例如人鼻病毒1A，肝病毒，例如人甲肝病毒，人脊髓灰質炎病毒，心病毒屬，例如腦炎心肌炎病毒，口瘡病毒屬，例如口蹄疫病毒O型，柯薩奇病毒)，痘病毒科(例如，正痘病毒屬，例如類天花病毒)，呼腸孤病毒科(例如，輪狀病毒，例如輪狀病毒類型A-F)，逆轉錄病毒科(靈長類慢病毒屬類型，例如人免疫缺陷病毒1和2)，彈狀病毒科(例如，狂犬病病毒)以及披膜病毒科(例如，風疹病毒屬，例如風疹病毒)等科的抗原。可用于式I所述MAA的示例性B細胞決定簇包括，但不限于，M2的胞外域，或其片段或同源物。在一個實施方案中，式I所述MAA的B細胞決定簇是得自在此用SEQIDNO:ll表述的A型流感病毒。在特定的實施方案中，式I所述MAA的B細胞決定簇是SEQIDNO:12表述的M2e片段。在又一實施方案中，式I所述MAA的B細胞決定簇是得自病毒跨膜蛋白，例如B型流感病毒的NB或C型流感病毒的CM2中的M2e的同源物。T細胞決定簇旨在包括Th和細胞毒性T細胞決定簇。T細胞反應的引發可以測定，例如，按照本文的示例或通過測定產生的細胞因子，例如INF-Y，IL-2，IL-4，IL-5或IL-IO。可用于式I所述MAA的示例性T細胞決定簇包括，但不限于，血凝素T細胞決定簇和限制于人MHCII類蛋白的T細胞決定簇，優選為廣譜范圍的單倍型。與抗原共價連接作為R2、R3或R4部分的靶分子通常是碳水化合物，脂類，肽或寡核苷酸，其能夠將抗原遞送至所希望的位點。可整合入本發明MAA中的耙分子包括，但不限于，霍亂毒素，具有刺激性CpG基序的ODN(參見，例如，Shirota，等人，(2001)J.Immunol.167(1):66-74)，以及內源性人免疫調節物，例如IL-2，IL-12和GM-CSF。式I所述MAA的R5部分沒有特別的限制，且其可以是任意的氨基酸(例如，^-連接的丙氨酸)，肽，或核酸序列，例如具有刺激性CpG基序的ODN。可按照本文所示例的方法或其他任何適合的化學合成肽及肽軛合物的方法制備式I所述的MAA。其中核酸序列得以整合入式I，所述核酸序列可通過間隔區或接頭分子例如羥基羧基酸進行連接。本文所提供的實施例公開了在小鼠中誘導免疫反應的式I所述MAA的多種衍生物(參見表1)，并旨在舉例說明而并非對本發明的范圍進行限制。在其他方面，本發明范圍以內的優點和修飾對于本發明所屬領域的技術人員都是顯而易見的。可通過鼻內(i.n.)途徑以50/xL的劑量向麻醉的小鼠給藥M2e-MAA。初次和加強接種都包含了3ptgMAA，3pg硫代磷酸化的(phosphorothionated)寡脫氧核苷酸(ODN)1826，其含有免疫刺激性的CpG基序，以及存在于磷酸緩沖鹽水(PBS)中的0.5pg霍亂毒素(CT)，并以4-5周的間隔給藥。i.n.接種只有ODN禾nCT或者傳染性病毒的小鼠被分別用作陰性對照和陽性對照。在后一種情況下，第一次感染使用的是PRS，而第二次使用的則是PR8-SEQ14，其是一種變異體，與PR8的區別在于，在被保護性單克隆抗體所識別的血凝素-決定簇中有14個氨基酸取代，并且其能夠在PR8-免疫的小鼠中輕易地誘導感染。在加強之后的10-30天，對來自縱隔淋巴結(MedLN)的細胞測定了其對游離S1肽，血凝素和M2e產生應答進行增殖的能力。來自脾臟和導引上呼吸道淋巴結的細胞給出了較小的反應且并未進行深入研究。M2e-MAA免疫小鼠的反應也始終超過那些釆用佐劑初次處理的對照小鼠的反應。只有2套數據在統計學基礎上超過了對照小鼠的反應(配對t檢驗，p≥0.05)。然而，作為一個組，M2e-MAA免疫的小鼠表現出了顯著大于對照小鼠的Sl-和血凝素特異性反應(非配對t檢驗，p≥0.05)。M2e-MAA免疫小鼠的血凝素特異性反應在程度上與感染免疫小鼠的反應類似，但在精細的特異性上有差別，其中在M2e-MAA免疫的小鼠中檢測到了Sl-特異性Th，但在感染免疫的小鼠中卻沒有。在體內，甘露糖化的MAA并未比非甘露糖化的MAA在誘導Sl-特異性Th反應方面具有優勢，這與其在體外更強烈的刺激效力明顯相反。此外，M2e-MAA免疫而不是感染免疫的小鼠含有M2e-特異性的增殖性T細胞，說明M2e本身含有至少一種H2d-限制的Th決定簇。沒有證據表明M2e-MAA誘導MHCI類限制的細胞毒性記憶T(Tc)反應，這與M2e中缺乏特征性的Kd-限制、Dd-限制或Ld-限制基序相一致(Engelhard(1994)Curr.Opin.Immunol.6:13-23;Corr，等人(1993)J.Exp.Med.178:1877-92)。記憶Tc在感染-免疫的小鼠中是容易檢測到的。M2e-特異性血清抗體滴度是通過ELISA在(l)M2e24-MAA的固相免疫吸附劑和JAP-MDCK細胞單層上測定的。通過純化M2e-特異性單克隆抗體14C2的伴隨滴定對每一次分析進行標準化和定量，并將檢測樣本中的抗體滴度定義為等Mg的M2e-特異性抗體/毫升血清。將來自四次獨立免疫實驗的數據組合，其中小鼠在初次免疫后2周和4周、第二次之后2周和4-5周采血、第三次之后2周和5周采血，提供了來自不同免疫實驗的組滴度的平均數和SEM。這些數據表明，含有4種B細胞決定簇的構建體(例如，(4)M2e24-MAA)比含有2種B細胞決定簇的構建體(例如，(2)M2e24-MAA)誘導更迅速和強烈的反應，而后者比含有1種B細胞決定簇的構建體(例如，(1)M2e24-MAA)效果更好。出乎意料地，且與體外Th細胞的增強刺激相反，甘露糖化降低了MAA在體內誘導抗體反應的能力。這可適用于對含有一種M2e24(即，(l)M2e24-MAA)的構建體和JAP-MDCK細胞的抗體滴度檢測。使用含有4種M2e24B細胞決定簇的構建體進行免疫可一致地在第二次免疫兩周之后誘導顯著的抗體滴度，而有時則可在初次免疫4周之后馬上誘導顯著的反應(在4次獨立實驗中，第一次免疫4周之后平均滴度為1.0，2.0，4.6和1035pg/mL)。這一發現說明通過促進M2e-特異性B細胞上膜Ig的交聯，M2e的多聚體提呈增強了B細胞反應(Bachmann禾卩Zinkernagel(1997)Annu.Rev.Immunol.15:235-70)。與0.1，0.6和15μg的劑量相比，與佐劑一起通過i.n.給藥3μgM2e-MAA的劑量誘導了最佳的M應。所述3μg劑量能夠誘導最低的初次反應，但卻是顯著的第二次和第三次抗體反應(圖1)。第三次反應在滴度方面比第二次反應更加具有一致性，并且持續時間較長(>60周)。然而，低至0.6μg的劑量也能夠誘導程度相當大的第二次抗體反應(圖1)。所述數據還說明，來自M2e-MAA免疫小鼠的血清一致表現出對抗M2e-MAA的滴度高于對抗JAP-MDCK細胞的滴度。血清中M2e-MAA與JAP-MDCK反應性抗體的比值顯示平均為10,并且在個體的血清中從2-31不等。這說明在M2e-MAA免疫之后抗體反應的特異性在個體小鼠中是不同的，并且平均~10%的M2e-MAA特異性抗體與感染細胞上病毒誘導的M2e交叉反應。剩余抗體可被導向Th決定簇、腳手架肽、未被病毒誘導M2-四聚體共有的合成性M2e-肽上的決定簇、或這些結構的組合。針對M2e-MAA的ELISA還說明，來自病毒感染小鼠的血清還含有極低的M2e-特異性抗體滴度。針對JAP-MDCK的ELISA檢測到了對應于許多病毒蛋白的抗體，因此不能用來定量感染免疫小鼠中的^2-特異性反應。唯一的例外是一組經過三次連續感染免疫的小鼠，第一次用PR8，第二次用JAP且第三次用X31，其表現出了30μg/ml的M2e-MAA-特異性滴度，這與用(4)M2e24-MAA免疫的小鼠中所見到的病毒M2e-特異性抗體滴度處在相同的范圍(與JAP-MDCK相比)。該數據說明在誘導M2e-特異性抗體反應中，(4)M2e24-MAA比病毒感染更有效。在兩次連續感染免疫的小鼠中，M2e-特異性免疫效應器實際上是不存在的。考慮到M2在感染細胞的質膜上是以高密度表達的(Lamb，等人，(1985)如上文所引；Zebedee和Lamb(1988)如上文所引)，且大多數上皮細胞都在整個呼吸道感染的過程中受到感染(Yilma，等人，(1979)J.Inf.Disease139:458-64)，這種情況是預料之外的。這一發現說明可通過感染和M2e-特異性接種誘導的效應器的伴隨誘導，來增強異源亞型(heterosubtypic)保護的強度。在第二次免疫之后4-5周，用X31攻擊小鼠，并在3天之后測定鼻、氣管和肺組織的病毒滴度。此時，因為初次接受免疫的嚴重聯合免疫缺陷型(SCID)和具有免疫活性的小鼠的病毒滴度在攻擊之后的這一時間點上并未表現出差異，所以病毒滴度幾乎完全受到先天和現存的記憶防御活性的影響。與僅使用佐劑進行初次免疫的小鼠相比，使用含有單獨M2e、有或沒有甘露糖的MAA進行免疫的小鼠對鼻和肺組織中的病毒復制并未表現出明顯的抵抗力(ns，p〉0.01學生t檢驗)，但卻在氣管中表現出病毒復制降低。相反，與僅使用佐劑免疫的小鼠相比，在使用(4)M2e24-MAA進行初次和加強的小鼠中，在總呼吸道攻擊3天之后，鼻、氣管和肺中的病毒滴度平均下降了10-100倍。在加強免疫之后4周進行評價時，鼻和氣管中的保護強度類似于在感染-免疫小鼠中所見到的情況，但卻比肺中的保護強度要弱一些。然而，因為感染-誘導的保護主要是記憶T細胞，且表現的比抗體-介導的保護持續時間短，所以M2e-MAA-誘導的保護可以比感染-誘導的保護持續更長的時間。與單獨使用(4)M2e24-MAA或感染免疫的小鼠相比，(4)M2e24-MAA與傳染性病毒的共給藥導致了在鼻和氣管而并非肺中保護的輕度增加。然而，盡管感染增加了G2a抗體的分數，但卻降低了血清中總M2e-特異性抗體反應的程度；而公知血清抗體在肺的保護中具有重要的作用而在鼻和氣管中作用較小。在單個小鼠中為病毒滴度的相關性測定了M2e-特異性血清抗體滴度。在(4)M2e-MAA-免疫小鼠中，抗體滴度與鼻和肺、而不是氣管的病毒滴度呈逆相關(相關系數，R2，對鼻和肺分別為0.53和0.51，pO.OOl)。然而，所述相關在很大程度上是由于單個突出的含有9C^g抗-M2e抗體/ml血清的小鼠。將其排除在外使得在鼻中的抗體和病毒滴度之間的相關性降低至lj了不顯著的值，但不是肺中，肺中仍保持顯著性(R20.41，p=0.002)。在氣管和感染免疫小鼠中未觀察到M2e-特異性抗體與病毒滴度之間的相關性。使用佐劑中的(4)M2e24-MAA進行鼻內免疫可誘導三種主要特異性的抗體與天然M2e交叉反應的M2e-特異性抗體；不能與天然M2e反應的M2e-肽-特異性抗體，以及除M2e夕卜，對M2e-MAA的決定簇具有特異性的抗體。這些反應可在針對下述物質的ELISA中評價(2)M2e24-MAP，其提供了對總反應的測定；Cys-M2e24，其提供了對M2e-和骨架特異性反應的估計；病毒感染的MDCK細胞，其測定了針對天然M2e的抗體滴度；以及Cys-bb，其測定了針對MAA骨架(和分析背景)的反應。平均而言，三分之一的所述反應是針對Th決定簇和背景的，三分之二(66土17。/。)是對M2e具有特異性的，而大約五分之一(17±11%，SD;n-12)是針對天然M2e的。可使用與肺外免疫途徑(圖2A)以及C-末端截斷的M2e-MAA(圖2B)，進一步提高針對天然M2e的反應。使用(4)M2e24-MAA通過i.n.免疫誘導的M2e-特異性抗體反應的同種型組合物是由IgGl所支配的，IgGl是在M2e-特異性抗體的情況下比IgG2a的保護性要弱一些的同種型。M2e-MAA與100TCID5Q的傳染性PR8(或PR8-Seql4)病毒相伴給藥，導致了G2a的升高和Gl同種型的降低；然而所述反應的總程度也相伴降低。這些結果表明，使用佐劑中的M2e-MAA進行的i.n.免疫提供了顯著的保護，其與兩次連續總呼吸道感染所引起的異源亞型保護強度幾乎一樣。除此之外，還可以通過增加抗體滴度(即，三次注射代替二次注射)、提高天然M2e-特異性抗體的分數(即，C-末端截斷以及肺外免疫途徑)以及通過將同種型組合物偏向于G2a，來進一步增強M2e-特異性保護。給出這些結果之后，本發明還是一種將MAA用作治療和預防劑用于治療或預防病毒感染的方法。總之，這會涉及向具有易感性的對象或表現出病毒感染征兆或癥狀的個體施用有效量的適當形式的一種或多種本發明所述的MAA。本領域所屬技術人員應當體會，用于式I所述MAA的B細胞決定簇的選擇依賴于待預防或治療的病毒感染。例如，為了預防或治療流感病毒感染，應該從流感病毒(例如，M2e)中獲得式I所述MAA的B細胞決定簇。在使用同源B細胞決定簇時，應該預期到式I所述的MAA可有效地產生針對包膜或未包膜的病毒的免疫反應，所述病毒包括，但不限于來自腺病毒科，沙粒病毒科(例如，淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒)，動脈炎病毒屬(例如，馬動脈炎病毒)，星狀病毒科(人星狀病毒1)，雙節段RNA病毒科(例如，傳染性胰壞死病毒，傳染性法氏囊病病毒)，布尼亞病毒科(例如，加利福尼亞腦炎病毒類型)，杯狀病毒科(例如，杯狀病毒屬)，冠狀病毒科(例如，人冠狀病毒299E和OC43)，丁型肝炎病毒科(例如，丁型肝炎病毒)，纖絲病毒科(例如，馬爾堡病毒，埃博拉病毒扎伊爾型)，黃病毒科(例如，黃熱病病毒類型，丙型肝炎病毒)，嗜肝DNA病毒科(例如，乙型肝炎病毒)，皰疹病毒科(例如，Epstein-Barr病毒，單純皰疹病毒屬，水痘病毒屬，巨細胞病毒屬，玫瑰疹病毒濾泡，淋巴濾泡病毒濾泡，猴病毒屬)，正粘病毒科(例如，流感病毒A、B和C)，乳頭多瘤空泡病毒科(例如，乳頭瘤病毒)，副粘病毒科(例如，副粘病毒，例如人副流感病毒1，麻疹病毒屬，例如麻疹病毒，腮腺炎病毒屬，例如腮腺炎病毒，肺病毒屬，例如人呼吸道合胞病毒)，小RNA病毒科(例如，鼻病毒屬，例如人鼻病毒1A，肝病毒屬，例如人甲肝病毒，人脊髓灰質炎病毒，心病毒屬，例如腦炎心肌炎病毒，口蹄疫病毒屬，例如口蹄疫病毒O型，柯薩奇病毒)，痘病毒科(例如，正痘病毒屬，例如類天花病毒)，呼腸孤病毒科(例如，輪狀病毒，例如輪狀病毒類型A-F)，逆轉錄病毒科(靈長類慢病毒屬類型，例如人免疫缺陷病毒1和2)，彈狀病毒科(例如，狂犬病病毒)以及披膜病毒科(例如，風疹病毒屬，例如風疹病毒)等科的病毒。對患有病毒感染個體的治療涉及鑒定表現有病毒感染征兆或癥狀的對象，以及向所述對象給藥有效量的本發明所述式I的MAA,從而與未接受治療的對象相比，減輕與病毒感染相關的征兆或癥狀或縮短病毒感染的持續時間。病毒感染的征兆或癥狀通常取決于具體的病毒，這是有經驗的臨床醫生所熟知的。例如，病毒感染的典型癥狀包括，但不限于，發燒，劇痛(severeaches)和疼痛，頭疼以及咽喉痛。用于治療病毒感染的MAA可作為混合物進行使用或給藥，例如以等量，或連續單獨提供，或一次全部給藥，并且可以用足以有效減輕病毒感染征兆或癥狀的量口服、局部或腸胃外給藥。此外，本發明的MAA還可與其他公知的抗原、疫苗或佐劑共同給藥。同樣，對于病毒感染進行預防或保護的有效免疫涉及施用一種或多種作為疫苗組分的MAA。接種可通過足以使得接受對象能夠產生針對目的病毒的保護性免疫的量口服、局部或腸胃外進行，從而預防病毒感染的征兆或癥狀。如果所述MAA的劑量、給藥途徑等足以影響這樣的反應，那么就說該量足以預防病毒感染的征兆或癥狀。可通過分析患者的生命征象或監測抗體滴度，可以測定對MAA給藥的反應。適于給藥的MAA組合物是能夠為接受對象所耐受的組合物。這樣的MAA組合物可根據生產制劑的已知方法來制備，由此所述MAA可與藥物可接受的載體混合組合。藥物可接受的載體可見于，例如，Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,AlfonsoR.'Gennaro，editor,20版.LippingcottWilliams&Wilkins:Philadelphia,PA，2000。為了形成適合給藥的MAA組合物，這樣的組合物應該含有有效量的MAA以及適合量的載體、賦形劑或穩定劑，所述載體、賦形劑或穩定劑在所用劑量和濃度下，對暴露于其中的細胞或哺乳動物是沒有毒性的。一般地，制劑可含有MAA的終濃度范圍為0.2//g/ml-2mg/ml，或更希望的5/zg/ml-500Mg/ml。通常所述載體是水性pH緩沖溶液。藥物可接受載體的示例包括緩沖液，例如磷酸、檸檬酸和其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸；低分子量(少于約10個殘基)多肽；蛋白質，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰氨，精氨酸或賴氨酸；單糖，二糖及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，例如EDTA;糖醇，例如甘露醇或山梨醇；鹽形成反離子，例如鈉；和/或非離子型表面活性劑，例如TWEEN,聚乙二醇(PEG)以及PLURONICS。MAA，或含有本發明所述MAA的組合物或制劑還可含有佐劑以增強對象針對抗原的T細胞反應。這類佐劑的示例包括，但不限于，鋁鹽；弗氏不完全佐劑；胞壁酰二肽的蘇氨酰和正丁基衍生物；胞壁酰三肽的親脂衍生物；單磷酰脂質A;3'-脫氧乙酰單磷酰脂質A;霍亂毒素；具有CpG基序的硫代磷酸化的寡脫氧核苷酸；以及如美國專利No.6,558,670號中所公開的佐劑。本文所公開的、對MAA或含有MAA的組合物或制劑的給藥可通過任何適合的方法進行，包括腸胃外注射(例如腹膜內，皮下或肌肉注射)，口服，或將所述MAA(通常為藥物制劑所承載)向氣道表面進行局部施用。對注射而言，所述載體通常是液體，例如滅菌的無熱原水，無熱原磷酸緩沖鹽水溶液，抑菌水，或Cremophor(BASF，Parsippany，N丄)。對其他給藥方法而言，所述載體可以是固體或液體。向氣道表面局部施用MAA可通過鼻內給藥(例如，通過使用鼻內沉積藥物制劑的的點滴器、棉簽或吸入器)來實現。向氣道表面局部施用MAA還可通過吸入給藥來實現，例如通過將含有所述MAA的藥物制劑的可呼吸性顆粒(包括固體顆粒和液體顆粒)構建成氣溶膠懸浮劑，然后使對象吸入所述可呼吸性顆粒。藥物制劑可呼吸性顆粒的給藥方法和裝置是公知的，并且可采用任何的常規技術。口服給藥可以是溶液，懸液，片劑，丸劑，膠囊，緩釋制劑或粉劑的形式，并含有10%-95%的活性成分，優選為25%-70%。對象口服給藥的膠囊、片劑或丸劑可以帶有腸溶性包衣，所述包衣包括，例如，甲基丙烯酸和甲基丙烯酸甲酯共聚物，醋酸纖維素，鄰苯二甲酸乙酸纖維素或羥丙基甲基纖維素。本發明的組合物可以用與劑型相匹配的方式、并以能夠具有預防禾口/或治療有效性的量給藥。擬施用的量，通常范圍為0.1/μg-25CμgMAA/劑，取決于待治療的對象、該患者免疫系統合成抗體的能力、以及所希望的保護程度。優選的范圍為約0.5μg至約20μg/劑。適合的劑量大小為約0.5ml。因此，用于肌肉注射的劑量，例如，應該包括0.5ml含有與0.5%佐劑混合的5μgMAA。確切的劑量應由熟練的醫師根據需要治療的對象的有關因素決定。可對劑量和給藥進行調節，從而提供足夠水平的活性MAA或維持預防或降低病毒征兆或癥狀的預期效果，或降低病毒感染的嚴重性。可供考慮的因素包括疾病狀態的嚴重性，對象的一般健康情況，對象的年齡、體重和性別，膳食，給藥的時間與頻率，聯合用藥，反應敏感性，以及對治療的耐受/反應性。所述組合物可以用單劑量計劃，或期望多劑量計劃給藥。多劑量日程表計劃是在給藥的第一階段可以釆用l-10個分別的劑量，然后在隨后需要維持和/或增強免疫反應的時間段來給予其他劑量，例如，在l-4個月用第二劑量，并且如果需要的話，在若干個月后繼續給藥。給藥方案也將，至少部分，根據個體的需要來確定并要根據醫師的判斷。本發明將通過下述非限制性的實施例更加詳細地描述。實施例1:復合抗原劑構建體(MAA)的合成如表1所示的式I的示例性MAA構建體的固相合成是根據公知方法(Kragol和Otvos(2001)Tetrahedron57:957-66)，使用三種擬正交(quasi-orthogonally)可去除氨保護基團的組合實施的。表1<table>Complextableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>Man-甘露糖T細胞決定簇Sl=Ser-Phe-Glu-Arg-Phe-Glu-Ⅱe-Phe-Pro-Lys-Glu(SEQIDNO:9);T細胞決定簇S2=His-Asn-Thr-Asn-Gly-Val-Thr-Ala-Ala-Ser-Ser-His-Glu(SEQIDNO:10);B細胞決定簇M2e24=Ser-Leu-Leu-Thr-Glu-Val-Glu-Thr-Pro-Ile-Arg-Asn-Glu-Trp-Gly-Cys-Arg-Ser-Asn-Asp-Ser-Ser-Asp-Pro(SEQIDNO:1l);且B細胞決定簇M2el5=Ser-Leu-Leu-Thr-Glu-Val-Glu-Thr-(Pro/His/Leu)-Ile-Arg-Asn-Glu-Trp-Gly(SEQIDNO:12)。在M2el5構建體中，括號中的殘基或者是脯氨酸、組氨酸，或者是亮氨酸。攜帶有4拷貝M2e24以及各2拷貝輔助T細胞決定簇Sl和S2的二硫鍵連接的八聚體肽構建體(4)M2e24-MAA，是通過溶液中游離的含巰基半胱氨酸衍生物的分子間二硫鍵形成而制備的(Kragol，等人，(2001)Bioorg.Med.Chem.Lett.11:1417-20)。在測定針對于MAA骨架抗體滴度的ELISA中用作免疫吸附劑的肽構建體和M2e24構建體分別包括由Cys-Gly-Lys-Gly-Lys-Gly-Lys-/3-Ala(SEQIDNO:13)組成的Cys-骨架構建體，以及由<formula>seeoriginaldocumentpage23</formula>(SEQIDNO:14)組成的Cys-M2e24構建體。這些構建體是使用傳統的Fmoc化學技術(Fields和Noble(1990)Int.J.Pept.ProteinRes.35:161-214)，在連續流自動肽合成儀Miligen9050上裝配的。所使用的是初上樣量為0.3mmol/g的FmocTENTAGELSRAM樹脂(AdvancedChemTech,Louisville,KY)。對鏈延伸而言，使用HATU對過量的4摩爾氨基酸進行原位活化。根據肽伴侶算法(PeptideCompanionAlgorkhm)(Windowchem，Fairfield,CA)預測的軛合難度，軛合時間可從1-2.5小時。在肽構建體Cys-骨架的合成過程中，Cys的N-末端氨基基團是使用Boc基團進行保護的，與此同時Lys側鏈的氨基基團則具有Aloc保護。通過催化加氫，，然后通過兩種M2e24肽的同時肽鏈裝配，選擇性去除Aloc基團，得到了完全保護的肽構建體Cys-M2e24。在存在有5%苯甲硫醚和5%水的情況下，通過三氟乙酸將所述肽從樹脂上解離下來，并通過RP-HPLC進行純化。通過RP-HPLC和MALDI質譜對所述肽的純度進行確證。可通過兩種方法之一制備肽-DNA嵌合體。一種方法涉及使用常規的Fmoc-化學以及適合的羥基-羧酸接頭，對肽或核酸片段進行共合成(Soukchareun，等人，(1995)BioconjugateChemistry6:43-53)。第二禾中方法涉及使用含有巰基的雙官能偶聯的試劑進行化學連接(Soukchareun，等人，(1998)BioconjugateChemistry9:466-475;Stetsenko和Gait(2000)J.Org.Chem.65:4900-4908)。實施例2:培養基和溶液ISC-CM是由添加了0.05mM2-巰基乙醇，0.005mg/ml轉鐵蛋白(Sigma,St.Louis，MO)，2mM谷氨酰胺(JRHBiosciences,Lenexa，KS)以及0.05mg/ml慶大霉素(Mediatech，Herndon，VA)的Iscove'sDulbecco's培養基(LifeTechnologies,Gaithersburg'MD)組成的。按照指示，ISC-CM還補充了胎牛血清(FCS)(HyCloneLaboratories,Logan,UT)或牛血清白蛋白(BSA)(Sigma，St.Louis，MO)。pH7.2的磷酸鹽緩沖鹽水補充了3mMNaN3(PBSN)。實施例3:病毒PR8(A/PR/8/34(HlNl))是小鼠適應株。PR8-SEQ14是選自連續存在14個不同PR8(HA)-特異性單克隆抗體中的PR8的逃離突變體。X31是含有除了那些編碼H3和N2之外全部PR8衍生基因的重組病毒，其來自(A/Aichi/68(H3N2))(Kilbourne(1969)Bull.WHO41:643-5)。JAP是(A/日本/305/57(H2N2))而B/LEE是B型流感病毒株B/Lee/40。實施例4:M2e24-特異性雜交瘤的制備三種M2e24-特異性雜交瘤(M2-56，M2-80，M2-86)得自用兩次連續感染攻擊的BALB/c小鼠，第一次用PR8，而第二次用X31。在融合前3天，小鼠靜脈(i.v.)注射5/xg(4)M2e24-MAA的PBS溶液，并將脾臟細胞與Sp2/0骨髓瘤細胞融合。兩種雜交瘤(M2-1，M2-15)源自從三次連續異源亞型感染(第一次用PR8，第二次用X31，第三次用JAP)恢復、并用5pg(4)M2e24-MAA連同3pg硫代磷酸化的寡脫氧核苷酸(ODN)cl826和0.5/_ig霍亂毒素(CT)一起，對其進行鼻內(i.n.)加強的小鼠。三天后對來自導引淋巴結(頸淺淋巴結和縱隔淋巴結)的細胞進行融合。篩査雜交培養物中分泌的抗體，所述抗體能在ELISA中與(1)M2e24-MAA禾口/或JAP-感染的MadinDarby狗腎(MDCK)細胞反應。所有通過這些方案產生的M2e24-特異性雜交瘤都可以與M2e24-MAA和JAP-感染的MDCK細胞以幾乎等摩爾的量進行交叉反應，說明M2e-MAA與天然的M2e共有若干B細胞決定簇。雜交瘤14C2是本領域所公知的(Zebedee和Lamb(1988)如上文所引)。實施例5:使用ELISA測定抗體通過使用25/xl溶于PBSN的0.5pg/ml的構建體，在室溫下過夜孵育(覆蓋以防止蒸發)，用(l)M2e24-MAA對Coastarserocluster的圓底、聚乙烯板的小孔進行包被。在進行分析之前，使用含有1。/。BSA的PBSN對板封閉1至2小時。JAP-MDCKELISA板的制備如下通常通過向小孔中接種含有4x104MDCK細胞的100^1含有5%FCS的ISC-CM,MDCK細胞在FALCON⑧的微檢測、平底、96孔、聚苯乙烯tc板中生長至匯合。孵育(37'C，6%C02)—天之后，使用PBS洗滌單層從而去除血清成分，并使用含有106TCID5()JAP病毒的50/ilISC-CM孵育(37。C)以進行感染。一小時后，向每個小孔中加入含有5%FCS的100plISC-CM，并如上所述繼續孵育6-7小時。然后使用PBS洗滌單層，使用5%緩沖的FORMALDE-FRESH(FisherChemicaI，Pittsburgh,PA)在室溫孵育5分鐘進行固定，用PBSN洗滌，用含有1%BSA的PBSN在4T進行封閉和儲存。在ELISA中，所有的檢測樣本和試劑都稀釋于含有1%BSA的PBSN中，用量為25/xl/圓底小孔或50/xl/平底小孔，并在室溫孵育90分鐘。通常可使用生物素偶聯的大鼠抗小鼠Ck單克隆抗體187.1，然后使用抗生物素蛋白鏈菌素-AP(Sigma，St.Louis，MO)和pNPP(Sigma，St.Louis，MO)，檢測結合的小鼠抗體。在每個圓底和平底的小孔中，pNPP溶液分別使用50/d和100/xl。使用EMAX讀板儀(MolecularDevices,Sunnyvale,CA)測定吸附，通常在孵育30-25分鐘之后，記錄OD4。5和OD750之間的差異(OD405—750)。全部分析包括對特異性適合的純化單克隆抗體進行滴定，用于對檢測樣本定量。ELISA數據用SOFTMAXPRC^軟件(MolecularDevices,Sunnyvale,CA)進行分析。在ELISA中，結構不同的M2e24-MAA在反應性上并未表現出與M2e-特異性單克隆抗體有顯著的差異。所有單克隆抗體都與等摩爾量的含有(4)M2e24-MAA的MAA禾n在10位上具有脯氨酸的(4)M2el5-MAP的反應同樣好，說明天然的與合成性M2e所共有的相關B細胞決定簇是通過M2e的N-末端區域形成的。實施例6:CD4+T細胞反應的分析從首次用于試驗的BLAB/c小鼠脾臟制備抗原提呈細胞(APC)。向細胞懸液中加入PERCOLLtm(PHARMACIA⑧，Uppsala,瑞典)，使終濃度為33%。所述懸液的下面鋪有少量的70%PERCOLLTM并進行離心(10分鐘，600g，室溫)以去除細胞碎片和紅細胞。收集在33%/70%界面上的細胞，洗滌，輻射處理(2200rad)并以5x106細胞/ml懸浮在ISC-CM中。向平底的組織培養板的每個小孔中分配100pl。每個小孔中加入50^1體積的ISC-CM中的抗原。每個小孔中加入50/xl響應細胞懸液，通常是ISC-CM中10totheseventhpower/mlMedLN細胞或4x10tothefifthpower/mlTh克隆。在孵育的第三(Th克隆)或第四天(LN效應細胞)，加入1μCi的H、胸苷。然后將板凍融一次，用Skatron細胞收集器(SkatronInstrumentsInc.，Sterling，VA)將所述細胞收集到過濾墊(SkatronInstrumentsInc.，Sterling,VA)上。將過濾墊上打孔出來的小片轉移至閃爍液中并進行放射性計數。在摩爾基礎上，M2e24-MAA在刺激Sl-特異性Th細胞上表現出了與游離SI肽類似的效力，除了一個明顯的意外即甘露糖化的MAP((l)M2e24-Man-MAA)在體外表現出了比游離SI肽和非甘露糖化MAA高100-1000倍的刺激效力。所述刺激效力可與純化的完整HA具有可比性，所述HA在完整HA1多肽的成分中含有S1決定簇并還含有甘露糖化的烴側鏈。實施例7:CD8+記憶T細胞反應的分析在所提供的33%/70%PERCOLLtm梯度上對得自免疫小鼠的脾臟細胞進行純化，并將其用作效應細胞。使用PRS(106TCID5Q/106A20，37°C,1小時)感染A20細胞(H2d，MHCII類陽性)，用4400rad進行輻射，洗滌并將其用作刺激物。在FALCON⑧培養瓶中建立培養物(6ml)，并在含有5%FCS的ISC-CM中含有25x106效應細胞和106刺激細胞。在孵育(靜止，向上)5天之后，在33%/70%PERC0L1JM梯度上純化存活的細胞，計數，并使用標準方法(Mozdzanowska,等人，(1997)Virology239:217-25)檢測其在4小時孵育階段內誘導Cr51從PR8和B/LEE感染的P1.HTR耙細胞中釋放的能力。實施例8:免疫方案將總體積為50jd的M2e-MAA和佐劑放置于被麻醉小鼠(分別以70mg/kg和7mg/kg體重向腹膜內注射氯胺酮和甲苯噻嗪)的鼻孔，可導致將其吸入呼吸道中。50jLd的一劑含有3jugM2e-MAA，3pgODN1826(Krieg，等人，(1995)Nature374:546-9;Yi，等人，(1998)J.Immunol.160:4755-61)和0.5pgCT(Sigma，St.Louis，MO)。佐劑組合以及給藥劑量基于標準方法(Mozdzanowska，等人，(1999)，如上文所引)。加強接種以4至5周的間隔給藥。接受沒有M2e-MAA的佐劑溶液的小鼠用作陰性對照，而接受了兩次連續呼吸道感染的小鼠，第一次使用PR8，第二次使用PR8-SEQ14，用作陽性對照。實施例9:病毒攻擊實驗通過用~103MIDso(50。/。小鼠感染劑量)的X31i.n.攻擊小鼠來檢測疫苗-誘導保護的強度。3天之后，將小鼠麻醉，心臟穿刺放血，并切片收集鼻、氣管和肺組織。使用標準方法，通過滴定MDCK細胞培養物或雞胚的組織勻漿物來測定感染病毒的滴度(McCluskie和Davis(2000)如上文所引)。實施例10:對MAA免疫反應的體外分析為了誘導對天然病毒性M2e的Th-依賴性抗體反應，M2e-MAA與天然病毒誘導的M2e共有B細胞表位并含有能夠提呈至Th細胞的決定簇。在ELISA中，比較了JAP-MDCK細胞和M2e-MAA對若干M2e-特異性單克隆抗體的反應。從使用純化病毒M2免疫的小鼠中生成了14C2單克隆抗體(Zebedee和Lamb(1988)如上文所引)；所有其他抗體是從連續感染A型流感病毒中恢復并在融合前3天使用(4)M2e24-MAA加強的小鼠中分離得到的。進行(4)M2e24-MAA的最終加強是為了提高M2e-特異性雜交瘤的分離頻率。全部的6種M2e-特異性單克隆抗體都可與M2e-MAA和JAP-MDCK反應良好，盡管4種在與JAP-MDCK的結合上比與1.5ng/小孔(1)M2e24-MAA包被的小孔結合上要略好一些，而另外2種則稍弱一些。這些數據說明M2e-MAA有效地模擬了天然病毒-誘導四聚體M2e的若干B細胞決定簇。當以等摩爾的M2e濃度進行使用時，結構不同的M2e-MAA并未表現出與M2e-特異性單克隆抗體的反應有明顯差異。為了優化Th介導的輔助，向MAA中整合了兩種不同的Th決定簇，一種(SO表示為Ed，另一種(S2)表示為Ad。這些決定簇可被鑒定為BALB/c(H-2d)小鼠的HA(PR8)-特異性Th反應的兩種免疫顯性耙(Gerhard，等人，(1991)J.Virol.65:364-72)。Sl相應于所述HA區域的110-120而S2相應于126-138。然而，通過用絲氨酸替換135位上的半胱氨酸以避免了S2與所述M2e肽中所含半胱氨酸之間形成二硫鍵，本構建體中的S2肽與天然的S2相比是有所改變的。所述MAA刺激Sl-和S2-特異性Th克隆的效力是在含有輻射BALB/c脾臟細胞作為APC、Sl-或S2-特異性Th克隆作為效應器以及各種濃度的游離Sl和S2肽、M2e-MAA或純化HA的培養基中得以確定的。Th克隆的增殖通過在培養第三天的3H-胸苷的整合進行評價。所有的M2e-MAA都以與游離Sl肽相等或更高的效力刺激Sl特異性Th克隆V2.1。觀察到所述甘露糖化的MAA具有高出100倍的刺激效力，最有可能是由于通過APC上表達的甘露糖受體改善這種MAA的捕獲(Engering，等人，(1997)Eur.J.Immunol.27:2417-2;Tan，等人，(1997)Eur.J.Immunol.27:2426-35)。在摩爾基礎上，這種MAA的刺激活性類似于同樣含有甘露糖化烴側鏈的HA分子的活性(Keil,等人，(1985)EMBOJ.4:2711-20)。相反，沒有一種MAA能夠刺激S2-特異性的Th克隆5.1-5R6。這種Th克隆對分離的天然S2肽和完整HA的刺激具有良好的反應，因此Cys(135)向Ser的改變就降低了其對于這種Th克隆的刺激效力。對兩種其他的、克隆不相關的S2-特異性Th克隆進行了檢測，也不能對MAA有反應。因為Cys(135)~>Ser并沒有影響肽對于Ad的結合能力(Sette，等人，(1989)J.Immunol.142:35-40)，所以可以形成具有新抗原性的Th決定簇，其不能為天然S2決定簇的Th特異性識別。對S2/Ad復合物的晶體結構分析表明在135位上的氨基酸不是錨定殘基(Scott，等人，(1998)Immunity8:319-29)。因此，體外分析表明，所述M2e-MAA模擬了天然病毒-誘導的M2e的B細胞決定簇并含有至少一個官能性Th決定簇。權利要求1.復合抗原劑，其包括id="icf0001"file="A2006800108690002C1.gif"wi="83"he="20"top="37"left="35"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/>式Iid="icf0002"file="A2006800108690002C2.gif"wi="147"he="15"top="67"left="21"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/>個氨基酸殘基；R2，R3和R4獨立地為B細胞決定簇，T細胞決定簇，或靶分子；而R5為任一的氨基酸，肽或核酸序列。2.權利要求1的復合抗原劑，其中當m大于1時，每個R2可獨立地為B細胞決定簇，T細胞決定簇，或靶分子；而當n大于l時，每個R3可獨立地為B細胞決定簇，T細胞決定簇或靶分子。3.權利要求1的復合抗原劑，其中所述B細胞決定簇包括基質蛋白2的胞外域或其片段或同源物。4.權利要求1的復合抗原劑，其中第一和第二復合抗原劑的R1為Cys-Gly，且所述第一和第二復合抗原劑的所述Cys殘基共價連接產生二聚體。5.—種組合物，包括權利要求1的復合抗原劑和藥物可接受的載體。6.權利要求5的組合物，其中所述組合物還包括佐劑。7.權利要求5的組合物，其中所述組合物包括疫苗。8.權利要求6的組合物，其中所述組合物包括疫苗。9.預防或治療病毒感染的方法，包括向對象施用有效量的權利要求5的組合物來預防或治療病毒感染的征兆或癥狀。10.預防或治療病毒感染的方法，包括向對象施用有效量的權利要求6的組合物來預防或治療病毒感染的征兆或癥狀。11.預防或治療病毒感染的方法，包括向對象施用有效量的權利要求7的組合物來預防或治療病毒感染的征兆或癥狀。12.預防或治療病毒感染的方法，包括向對象施用有效量的權利要求S的組合物來預防或治療病毒感染的征兆或癥狀。13.權利要求9的方法，其中所述病毒感染包括A型流感病毒。14.權利要求10的方法，其中所述病毒感染包括A型流感病毒。15.權利要求ll的方法，其中所述病毒感染包括A型流感病毒。16.權利要求12的方法，其中所述病毒感染包括A型流感病毒。全文摘要本發明提供了復合抗原制劑組合物，及其預防或治療病毒感染的應用。文檔編號A61K39/385GK101208105SQ200680010869公開日2008年6月25日申請日期2006年3月13日優先權日2005年3月29日發明者拉斯洛·厄特沃什,沃爾特·格哈德申請人:威斯特研究所