專利名稱：：熟地黃和五加皮的草藥混合物提取物以及用于預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥的包含其的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及熟地黃(/e/zm朋m'aei"^c/V印arato)禾B五力口皮04caW/2OPawacz>Co/^JC)的草藥混合物提取物和含有所述草藥混合物提取物作為活性成分的用于預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥的組合物。
背景技術(shù)：
：骨是連接至肌肉的鈣化結(jié)締組織，其具有硬和厚的鈣化表面，實現(xiàn)通過保持平衡而支撐身體的功能，以及保護器官。內(nèi)骨髓是在鈣的新陳代謝中扮演關(guān)鍵角色的骨髓組織。骨是由有機物質(zhì)例如膠原、骨鈣蛋白和骨粘連蛋白；無機物質(zhì)例如鈣、磷和氟和水組成的。骨形成和骨吸收是體內(nèi)必要的日常過程。骨形成是由低劑量的甲狀旁腺激素、雄激素、雌激素、氟、磷等剌激的，而骨吸收是由身體減壓、失重、高劑量的甲狀旁腺素和腎上腺皮質(zhì)類固醇等刺激的。因此，骨的新陳代謝是由骨形成和骨吸收之間的平衡調(diào)節(jié)的。骨質(zhì)疏松癥是由骨形成和骨吸收之間的不平衡引起的。精確地，當骨吸收超過骨形成時，骨質(zhì)疏松癥發(fā)展。伴隨骨質(zhì)疏松癥，鈣化的骨組織密度減小，因而骨的緊密物質(zhì)逐漸損失，導(dǎo)致了骨髓腔的擴展。隨著表示骨損失正在增加的癥狀的發(fā)展，甚至最小的沖擊也常常產(chǎn)生骨折。骨組織是動態(tài)組織，該組織設(shè)計用于重復(fù)完成通過成骨細胞的骨形成，以及通過破骨細胞的破壞和骨吸收。骨吸收通過破骨細胞進行，并且NF-B受體的受體活化劑(RANKL)對于破骨細胞的增殖和活化是至關(guān)重要的。RANKL存在于成骨細胞和間充質(zhì)細胞中，并且結(jié)合至NF-B受體的受體活化齊lJ(RANK)[HofbauerL.C.,KhoslaS.，D腦tanC.R.,LaceyD.L.,BoyleW.J,,RiggsB.L，Therolesofosteoprotegerinandosteoprotegerinligandintheparacrineregulationofboneresorption.JBoneMinerRes.,15(1):2-12,2000]。在成骨細胞中產(chǎn)生的護骨蛋白(OPG)作為RANKL的誘殺型受體來截斷RANKL與RANK的結(jié)合，導(dǎo)致抑制了破骨細胞前體分化成破骨細胞以及破骨細胞的活化[KongY.Y.,FeigeU.,SarosiI.,BolonB.，TafliriA.，MoronyS.,CapparelliC.,LiJ.，ElliottR.,McCabeS.,WongT.,Campag腸loG"MoranE.，BogochE.R.,VanG.,NguyenL.T.，OhashiP.S.，LaceyD.L，F(xiàn)ishE.,BoyleW.J.,PenningerJ.M.:ActivatedTcellsregulatebonelossandjointdestructioninadjuvantarthritisthroughosteoprotegerinligand.Nature,402:304-309,1999;SudaT"TakahashiN.,UdagawaN.,JimiE.,GillespieM.T.,MartinT.J,:Modulationofosteoclastdifferentiationandfunctionbythenewmembersofthetumornecrosisfactorreceptorandligandfamilies.EndocrRev,20(3》345-357，1999;AubinJ.E.,BonnelyeE.:Osteoprotegerinanditsligand:anewparadigmforregulationofosteoclastogenesisandboneresorption.,OsteoporosInt，11(11):905-913,2000]。骨質(zhì)疏松癥分為原發(fā)性和繼發(fā)性類型；原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥舉例說明為老年性骨質(zhì)疏松癥和絕經(jīng)期后骨質(zhì)疏松癥，而繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥可以發(fā)展為甲狀腺功能亢進、甲狀旁腺功能亢進、腎上腺皮質(zhì)功能亢進、妊娠、長期固定(例如，石膏模型固定)、營養(yǎng)不良、藥物、癌癥或其它慢性疾病的并發(fā)癥。還沒有公開主要骨質(zhì)疏松癥的起因，但是似乎涉及多種因素。據(jù)推測，骨質(zhì)疏松癥是由于衰老、鈣缺乏、過多的甲狀旁腺激素、降鈣素缺乏、活性維生素D缺乏、雌激素缺乏、不足的鍛煉等骨的新陳代謝的不平衡而發(fā)展的。影響鈣的新陳代謝的因素為甲狀旁腺激素(PTH)、降鈣素(CT)和l,25-(OH)2D3等。涉及鈣新陳代謝的甲狀旁腺激素與甲狀腺的濾泡旁細胞-C細胞中分泌的降鈣素產(chǎn)生相反的效果。作為多肽，具有3，500~4,000的分子量的降鈣素介導(dǎo)骨中的鈣鹽沉積。S卩，降鈣素減少了血鈣和鎂，以及尿中的磷酸鹽和羥脯氨酸。甲狀旁腺激素(PTH)也是具有8447的分子量的多肽。甲狀旁腺激素活化破骨細胞，導(dǎo)致骨吸收和小腸黏膜中維生素D3活性的增加。因而，PTH增加血鈣和鎂，和尿中的羥脯氨酸和磷酸鹽(P043—)。在卵巢中分泌的類固醇雌二醇活化骨中的成骨細胞，由此抑制骨吸收。絕經(jīng)以后的女性表現(xiàn)更低水平的雌激素，并且因此減少了腎中的血降鈣素以及1,25-(OH)2D3合成的水平，同時提高了PTH的水平。因此，促進了白介素6(IL-6)和前列腺素的產(chǎn)生，導(dǎo)致了小腸中的鈣吸收的減少和由于活性破骨細胞介導(dǎo)的骨吸收的骨損失的增加。結(jié)果，產(chǎn)生了骨質(zhì)疏松癥。通常，當骨吸收超過骨形成時，可以觀察到關(guān)節(jié)功能異常、漸進椎骨畸形、椎骨和其它區(qū)域中的微小骨折、由于疼痛的降低的活動性(特別是腰背(lumbo-dorsal)疼痛)和由于脊柱后凸而收縮的腎。骨質(zhì)疏松癥的特征不僅在于其癥狀，還在于導(dǎo)致骨折的在數(shù)量上的骨減少，所述骨折包括股骨骨折或椎骨骨折，并且已經(jīng)成為了一個長期限制公眾活動性的公眾健康問題。因此，老年人死亡原因的15。^歸因于骨質(zhì)疏松癥。骨密度是由遺傳因素、營養(yǎng)、激素改變、鍛煉和習慣影響的。衰老、不足的鍛煉、低體重、吸煙、低鈣飲食、絕經(jīng)和卵巢切除被認為是骨質(zhì)疏松癥的主要原因。同時，已知的是黑人表現(xiàn)比白人更低的骨吸收水平，意味著黑人具有更大的骨質(zhì)量。發(fā)現(xiàn)峰值骨質(zhì)量在年齡14至18之間，然后每年減少1%。特別地，在女性中，從30歲骨就不斷減少，并且在絕經(jīng)以后通過激素變化而迅速減少。骨質(zhì)疏松癥在老年人，特別是在后絕經(jīng)的女性中或多或少是不可避免的，因此隨著發(fā)達國家中老齡人口的增長，骨質(zhì)疏松癥和它的治療藥劑已經(jīng)處于了我們關(guān)注的中心。骨疾病的治療在整個世界形成了約1300億美元的市場，該市場據(jù)推測將進一步擴大。因此，許多的研究組和藥物公司己經(jīng)投資開發(fā)用于骨疾病的治療藥劑和用于骨吸收的抑制劑。迄今為止，骨質(zhì)疏松癥相關(guān)的研究集中在骨中的無機物質(zhì)上，具體而言在鈣和磷的新陳代謝上。然而，至今還沒有公開具體的致病機理?，F(xiàn)今使用的用于骨質(zhì)疏松癥的治療藥劑舉例說明為雙膦酸鹽產(chǎn)品(阿侖膦酸鹽(alendronate)、依替膦酸鹽(etidronate))、激素產(chǎn)物(雷洛昔芬(raloxifene))、維生素D產(chǎn)品、降鈣素產(chǎn)品和鈣產(chǎn)品等。然而，雙膦酸鹽產(chǎn)品具有低吸收速率、麻煩的給藥方法和誘導(dǎo)食道炎的問題。激素產(chǎn)品需要終身給藥，具有帶有副作用例如乳腺癌、子宮癌、膽石病和血栓形成等可能性。維生素D產(chǎn)品昂貴但不太有效。降鈣素產(chǎn)品同樣具有高成本和難以給藥的問題。鈣產(chǎn)品具有較少副作用，但是限于預(yù)防而非治療。短期給藥對于骨質(zhì)疏松癥的治療并非非常有效，因此藥物的長期給藥是不可避免的。因此，需要一種用于長期給藥的具有較少副作用但更多藥效的新穎的藥劑。因而，本發(fā)明人研究了熟地黃和五加皮的各種生理活性。并且本發(fā)明人通過確定以下內(nèi)容完成了本發(fā)明熟地黃和五加皮的草藥混合物提取物沒有毒性；增強了作為抑制破骨細胞的增殖與活化的蛋白質(zhì)的護骨蛋白的表達；以及抑制了破骨細胞的增殖，使得該混合物可以有效地用于骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防與治療。公開內(nèi)容技術(shù)問題本發(fā)明的一個目的是提供熟地黃和五加皮的草藥混合物提取物，所述草藥混合物提取物具有促進成骨細胞中護骨蛋白(OPG)表達以及抑制破骨細胞增殖的活性。本發(fā)明的另一個目的是提供用于預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥的組合物，所述組合物包含所述草藥混合物提取物作為有效組分。技術(shù)解決方案為了實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明提供了熟地黃和五加皮的草藥混合物提取物，所述草藥混合物提取物具有促進成骨細胞中護骨蛋白(OPG)表達以及抑制破骨細胞增殖的活性。同樣，本發(fā)明提供了用于預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥的包含所述草藥混合物提取物作為有效組分的組合物。附圖描述通過參考附圖來最好地理解本發(fā)明的優(yōu)選實施方案的應(yīng)用，其中圖1是表示由ELISA檢測的OPG在用根據(jù)本發(fā)明實施方案實施例的草藥混合物提取物處理的成骨細胞系MG63中表達的圖，圖2是表示由根據(jù)本發(fā)明的實施方案實施例的草藥混合物提取物對破骨細胞增殖的抑制的圖。最佳方式以下詳細描述本發(fā)明。本發(fā)明提供了一種熟地黃和五加皮的草藥混合物提取物，所述草藥混合物提取物具有促進成骨細胞中護骨蛋白(OPG)表達以及抑制破骨細胞增殖的活性。熟地黃是一類屬于玄參科(&rap/m/an^c^e)的藥物植物，其在汽蒸和干燥以后用作常規(guī)中藥(orientalmedicine)。粗熟地黃稱為Ae/wa""/aera&xcrwt/"51Libosch，而干火喿的賽冉土也黃禾爾為ie/w7am/aeiacfccLibosch。牛寺另廿是，在9次浸入到醇中以后經(jīng)過汽蒸-干燥過程的熟地黃稱為"Gujihwang"，己知其藥效是最好的。它同時具有甜和苦的味道，并且具有致暖的性質(zhì)，它通過該性質(zhì)可以補充血液和能量(對于生命(life)和生命(vital)活性必要的一種基本物質(zhì))，以致它除使頭發(fā)烏黑和健康以外，還可以幫助治療膝和下背的寒冷以及月經(jīng)紊亂。熟地黃是Samultang的主要成分之一，并且將其施用而用于緩解發(fā)燒、喉干和善渴、虛弱癥狀。此外，在偏方(folkremedies)中已知的是，當將熟地黃與豬肉湯(porksoup)—起給藥時，熟地黃在便秘上可以表現(xiàn)療效。五加皮是屬于五加科(Araliaceae)的灌木，僅在北半球的亞洲遠東發(fā)現(xiàn)。特別是，五加皮在韓國分類為受保護的野生植物，處于滅絕的邊緣。五力口皮分為刺五力口G4ca"^zo;a"ax:se""aww)、五力口屬(Jca"^20/fl"ax)禾口韓國五加(^c朋Ao;a"a;cA:omw"附)。己經(jīng)將五加皮的根和皮用作頂級藥物，因為它們迄今未顯示任何毒性或副作用。五加皮的葉含有具有藥用效果的chiisanoside。五加皮的根不僅含有五加皮糖苷，而且含有丁香苷和香豆素糖苷。五加皮含有作為五加皮糖苷的無梗五加苷B和D，以及增加免疫性的水溶性多糖。它的味道是苦和辣的，并且它具有致暖的性質(zhì)。己知其除去肝和神經(jīng)系統(tǒng)中的痛風，滋補身體并增長元氣。其已經(jīng)藥用于這樣的疾病諸如Oro(由五臟器官虛弱所引起的疲勞)、Chilsang(由身體虛弱所引起的男子中顯示的七種典型癥狀)和難以移動腿。五加皮的長期給藥增加能量，保護胃，使精力充沛，凈化心靈，增加意志力，防止衰老，幫助具有輕松的心臟并且凈化身體中的血液。所以，五加皮己經(jīng)用于治療這樣的癥狀如脊椎疼痛、男性陽痿、陰囊濕疹、女性閉經(jīng)等。本發(fā)明的熟地黃和五加皮的草藥混合物提取物是采用熟地黃和五加皮與水、C,C4醇或水和C,C4醇的混合物，并且更優(yōu)選使用水的混合溶液來提取的。該草藥混合物提取物的制備如下。將熟地黃和五加皮用水徹底清洗并且在陰暗處干燥。將它們放入到提取容器中，向其添加溶劑，隨后提取。在室溫下使提取物冷卻，隨后用濾紙過濾。然后，通過使用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在減壓下將該提取物濃縮，隨后冷凍干燥。結(jié)果，分別制備了粉末類型的熟地黃和五加皮的提取物。將熟地黃和五加皮的兩個提取物混合以制備草藥混合物提取物。提取可以通過使用適當?shù)娜軇ㄟ^常規(guī)方法例如浸漬(maceration)、浸泡(inflision)和熱提取來完成，并且特別地，在10(TC熱水提取4小時是優(yōu)選的。并且，對于該草藥混合物提取物優(yōu)選的是，熟地黃提取物和五加皮提取物以15.0:0.50.15:5.0的重量比混合，并且更優(yōu)選的是以8:11:4的比率混合。最優(yōu)選的是將熟地黃提取物和五加皮提取物以4:1~1:1的重量比混合。本發(fā)明的草藥混合物提取物增強抑制破骨細胞的增殖和活化的護骨蛋白的表達(圖1)。本發(fā)明的草藥混合物提取物具有抑制破骨細胞增殖的作用(圖2)。當熟地黃提取物和五加皮的草藥混合物提取物是以8:1~1:4的重量比，并且更優(yōu)選以4:11:1的重量比制備時，可以觀察到對成骨細胞中護骨蛋白表達的顯著促進效果，和對破骨細胞增殖的抑制效果。當將兩種組分一起混合時，以上影響比獨自使用各個提取物更大。本發(fā)明的草藥混合物提取物具有增強護骨蛋白抑制破骨細胞的增殖與活化的表達以及抑制破骨細胞增殖的活性，以致其可以有效地用作預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥的組合物。將本發(fā)明的草藥混合物提取物經(jīng)口給藥于大鼠以研究毒性。結(jié)果，它被評價為安全物質(zhì)，因為它在大鼠中的估計LD5o值(50。X致死劑量)比1g/kg大得多。本發(fā)明還提供了一種用于預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥的包含以上草藥混合物提取物作為有效成分的組合物。除草藥混合物提取物以外，本發(fā)明的組合物可以另外包含一種或多種具有與本發(fā)明的提取物相同或類似功能的有效成分。本發(fā)明的草藥混合物提取物可以經(jīng)口或腸胃外給藥，并且可以以藥物制劑的一般形式使用。本發(fā)明的草藥混合物提取物可以通過與通常使用的填料、補充劑、粘合劑、潤濕劑、崩解劑、稀釋劑例如表面活性劑或賦形劑混合，以為了經(jīng)口或腸胃外給藥而制備。經(jīng)口給藥用固體制劑為片劑、丸齊l」、撲粉(dustingpowders)、顆粒劑和膠囊。這些固體制劑是通過混合一種或多種適宜的賦形劑例如淀粉、碳酸鈣、蔗糖、乳糖、凝膠等來制備的。除簡單的賦形劑以外，可以使用潤滑劑，例如硬脂酸鎂、滑石等。經(jīng)口給藥用液體制劑為混懸劑、溶液、乳劑和糖漿劑，并且除通常使用的簡單稀釋劑例如水和液體石蠟以外，上述制劑還可以包含各種賦形劑，例如潤濕劑、甜味劑、芳香劑和防腐劑。腸胃外給藥用制劑為滅菌水溶液、水溶性賦形劑、混懸劑、乳劑和栓劑。除一種或多種活性化合物以外，水溶性賦形劑和混懸劑還可以包含丙二醇、聚乙二醇、植物油例如橄欖油、可注射酯例如油酸乙酯(ethylolate)等。除一種或多種活性化合物以外，栓劑還可以包含witepsol、聚乙二醇、吐溫6K可可脂、月桂油(laurinbutter)、甘油明膠等。另外，可以包含鈣或維生素D3以增強對骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防和治療效果。組合物的有效劑量可以根據(jù)重量、年齡、性別、健康狀況、飲食、給藥頻率、給藥方法、排泄和疾病的嚴重程度來確定。組合物的劑量為每天1~1000mg/kg，并且優(yōu)選每天300700mg/kg。更優(yōu)選地，所述劑量為每天150~450mg/kg。給藥頻率為一天16次。本發(fā)明的組合物可以單獨給藥，或隨同外科手術(shù)、激素治療、化學(xué)療法和生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑一起治療，以預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥。本發(fā)明的組合物可以包含于用于緩解骨質(zhì)疏松癥癥狀的目的的健康食品中。此時，本發(fā)明的草藥混合物提取物可以根據(jù)常規(guī)方法原樣，或在與其它的食品或成分混合以后添加。有效成分的混合比率是由使用目的(預(yù)防、健康或治療處理)決定的。在可應(yīng)用的食品中不存在限制，可以例舉肉類、香腸類、面包、巧克力、糖果、小吃、餅干、比薩餅、mmyim、面條、包括冰激凌的奶制產(chǎn)品、湯、飲料、茶、飲料(drinks)、酒精飲料和維生素復(fù)合物等，并且事實上一般生產(chǎn)的每種健康食品全部包括在內(nèi)。類似于其它飲料，含有本發(fā)明組合物的健康飲料可以另外包括多種香料或天然糖類等。上面的天然糖類可以是單糖諸如葡萄糖和果糖，二糖諸如麥芽糖和蔗糖，多糖諸如糊精和環(huán)糊精，和糖醇諸如木糖醇、山梨糖醇和赤藻糖醇其中之一。作為甜味劑，可以使用天然甜味劑諸如奇甜蛋白和甜菊(stevia)提取物或人造增甜劑諸如糖精和阿司帕坦。天然糖類對本發(fā)明組合物的比率優(yōu)選是0.01-0.04g比100ml，更優(yōu)選0.02~0.03g比100ml。除上述成分之外，本發(fā)明的組合物可以包括多種營養(yǎng)物、維生素類、電解質(zhì)類、增香劑、著色劑、果膠酸及其鹽、藻酸(arginicacid)及其鹽、有機酸、保護性膠體增粘劑、pH調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、甘油、醇類、用于加入到碳酸水的碳酸化劑(carbonators)等。本發(fā)明的組合物還可以包括天然果汁、果汁飲料和/或可加入到蔬菜飲料的果肉。全部提到的成分可以單獨或一起添加。事實上那些成分的混合比無關(guān)緊要，但是通常，各自可以添加0.01~0.1重量份/100重量份的本發(fā)明組合物。實施方式如下列實施例所示說明本發(fā)明的實際的和目前優(yōu)選的實施方案。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員在考慮公開內(nèi)容上應(yīng)當理解，在本發(fā)明的實質(zhì)和范圍之內(nèi)可以進行修改和改進。<實施例1>草本植物提取物的制備栽植的熟地黃和五加皮是從批發(fā)干草藥店購買的。<1-1>熟地黃提取物的制備將熟地黃用清水洗滌并且在在陰暗處干燥。將100g的干燥的熟地黃放置在3￡的提取容器中，向其中加入1C的蒸餾水，隨后在IO(TC熱水提取4小時。將該過程重復(fù)三次，并且在室溫下將產(chǎn)生的溶液冷卻，隨后用濾紙過濾。在4(TC，通過使用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在減壓下將該提取物濃縮。結(jié)果，獲得了熟地黃提取物(收率42%)。<1-2>五加皮提取物的制備將五加皮用清水洗滌并且在陰暗處干燥。將100g干燥的五加皮放置在3￡的提取容器中，向其中加入1￡的蒸餾水，隨后在10(TC熱水提取4小時。將該過程重復(fù)三次，并且在室溫下將產(chǎn)生的溶液冷卻，隨后用濾紙過濾。在40。C，通過使用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在減壓下將該提取物濃縮，隨后冷凍干燥。結(jié)果，獲得了五加皮的粉末提取物(收率5.8%)。<1-3>草藥混合物提取物的制備將實施例1-1中獲得的0.15~15.0重量份的熟地黃提取物與實施例<1-2>中獲得的0.5~5.0重量份的五加皮提取物以適當?shù)谋壤旌希⑶覍⒃摬菟幓旌衔锾崛∥锵♂屧诩毎囵B(yǎng)基中，以用于進一步的實驗。<實驗例1>本發(fā)明的草藥混合物提取物對成骨細胞中護骨蛋白表達的影響進行下列實驗以研究本發(fā)明的草藥混合物提取物對成骨細胞中護骨蛋白表達的影響。<1-1>成骨細胞的培養(yǎng)為了評價本發(fā)明的草藥混合物提取物對成骨細胞中護骨蛋白的表達的影響，從ATCC(美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection),羅克維爾，美國)商購人類骨肉瘤細胞系MG-63和HOS。將所述細胞在具有95%濕度的37°CC02的培養(yǎng)箱中，在補充有10%胎牛血清(FBS)的DMEM(Dulbecco'smodifiedEagle'smedium)中培養(yǎng)。<1-2>對抑制破骨細胞增殖的護骨蛋白表達的測量本發(fā)明人研究了通過實施例1中的提取物處理成骨細胞的培養(yǎng)物是否提高OPG的水平。將以上實驗例〈l-l〉中制備的MG-63細胞在96-孔板中培養(yǎng)直至匯合。用2ml以多種濃度含有草藥混合物提取物的無血清的DMEM處理所述板，隨后進一步培養(yǎng)16小時。獲得上清液。通過ELISA測量OPG的水平。通過使用DynatechMR-7000(DynatechLaboratorie)在450nm測量光密度(O.D.)，并且根據(jù)下面的數(shù)學(xué)公式1，通過僅用培養(yǎng)基處理的對照的百分數(shù)來計算分泌的OPG的量。<數(shù)學(xué)公式1>OPG釋放的增加率(。/。)(l-實驗組的0.D.45。/對照組的O.D.45。)100(在式中，0.D.45o是指在450nm的光密度)如表1中所示，采用3和6mg/ml的<實施例1>的熟地黃提取物的處理將抑制破骨細胞增殖的蛋白OPG的表達分別增加了200%和221%，并且采用1.25mg/ml的五加皮的處理也將OPG的表達增大至194%，表明兩個單獨的草藥提取物劑量依賴地增加OPG表達。同時，當將草本植物提取物作為混合物使用時，OPG水平增加120130%(表1、圖1)。與加入6mg/ml的熟地黃時相比，當將分別具有3mg/ml和1.25mg/ml的熟地黃提取物和五加皮提取物混合時可以顯著地增強該草藥混合物提取物的OPG表達誘導(dǎo)效應(yīng)。以上結(jié)果表明，草藥混合物制備中的熟地黃提取物和五加皮提取物的混合比率對于增強OPG的表達是重要的。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>由以上結(jié)果，可以確定的是，本發(fā)明的草藥混合物提取物增加了抑制破骨細胞增殖的蛋白OPG的表達，并由此抑制了破骨細胞的增殖。<實驗例2>本發(fā)明的草藥混合物提取物的破骨細胞增殖抑制活性為了檢測本發(fā)明的草藥混合物提—取物對破骨細胞的增殖和活性的影響，將破骨細胞前體細胞在磷酸鈣涂敷的平板(OAAS,OscotecInc.)中培養(yǎng)，隨后研究破骨細胞標記TRAP(耐酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistantacidphosphatase))的活性。<2-1>破骨細胞前體細胞的分離和破骨細胞前體細胞分化成成熟破骨細胞為了分離小鼠骨髓細胞，通過折裂頸部處死7-9周齡的雄性小鼠，然后在無菌條件下提取股骨和脛骨。除去軟組織并切掉骨的兩端。通過利用26G針，將1ml含有0.1。/。膠原酶(Gibco)、0.05°/。胰蛋白酶和0,5mMEDTA(Gibco)的酶溶液沖洗(flush)到髓腔的一端中。取出骨髓，接著攪拌30分鐘。回收骨髓細胞并在補充有10%FBS的a-MEM(a-極限必需培養(yǎng)基)中預(yù)培養(yǎng)24小時。獲得獨立的細胞。將所述獨立的細胞，破骨細胞前體細胞，接種到平板中(2><105細胞/孔)，接著培養(yǎng)。將本發(fā)明的草藥混合物提取物在8天培養(yǎng)期間處理含有20ng/ml巨噬細胞-集落刺激因子(M-CSF,Peprotech,美國)和30ng/ml的RANKL(Peprotech，美國)的a-MEM。在培養(yǎng)完成后，固定細胞并進行TRAP染色以檢驗破骨細胞的增殖?！?-2〉TRAP(+)多核細胞(MNCs)的形成為了檢測破骨細胞的增殖，將破骨細胞前體細胞在磷酸鈣涂敷的平板中培養(yǎng)，然后計數(shù)TRAP(+)MNCs。具體地，在完成細胞培養(yǎng)的時候，用PBS清洗貼壁細胞并用檸檬酸鹽-乙酸鹽-甲醛固定5分鐘。將細胞在37。C的含有萘酚AS-BI磷酸鹽、堅牢(fast)GarnetGBC溶液和7mM酒石酸鹽緩沖液(pH5)的乙酸鹽緩沖液(pH5.0)中進一步培養(yǎng)一小時，接著用TRAP染色。具有超過3個核的TRAP(+)多核細胞被認為是破骨細胞。將實施例1中制備的草藥混合物提取物和各個單獨的提取物處理所述細胞。在培養(yǎng)8天以后，再次計數(shù)TRAP(+)多核細胞，并且由此根據(jù)以下數(shù)學(xué)公式2計算破骨細胞增殖抑制率。<數(shù)學(xué)公式2>TRAP(+)多核細胞增殖抑制率(％)=1OO-(實驗組的TRAP(+)多核細胞的數(shù)目/對照組的TRAP(+)多核細胞的數(shù)目)x100表2破骨細胞增殖抑制率(Q％)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>如表2和圖2中所示，認為沒有經(jīng)提取物處理的對照組的破骨細胞增殖抑制率為0，并且基于此，比較用具有不同濃度的不同提取物處理的每個實驗組的破骨細胞增殖抑制率。當獨自用熟地黃提取物處理時，在0.125、0.25、0.5、l和2mg/ml的濃度的TRAP(+)多核細胞增殖抑制率分別為12.43、12.68、40.10、49.01和81.75%。同時，當獨自用五加皮提取物處理時，在0.125、0.25、0.5和lmg/ml的濃度受到抑制的破骨細胞的增殖和活化分別為12.77、19.28、61.61和99.74%，表明各個草藥提取物的獨自處理劑量依賴地抑制TRAP(+)多核細胞的增殖。雖然熟地黃提取物在高達0.5mg/ml的濃度，或者甚至通過增加濃度也沒有表現(xiàn)出大于50%的抑制效果，但是熟地黃提取物與五加皮提取物的共處理甚至在低濃度下也顯示了100%的抑制效果。當熟地黃提取物和五加皮提取物各自以超過0.25mg/ml混合，特別是當包含超過20重量％的熟地黃提取物和超過10重量％的五加皮提取物，更優(yōu)選當包含超過50重量％的熟地黃提取物和超過25重量％的五加皮提取物時，顯著抑制破骨細胞的形成。當這些提取物的含量低于以上范圍時，不那么多地抑制破骨細胞的增殖。因此，可以確定的是，本發(fā)明的草藥混合物提取物比熟地黃提取物和五加皮提取物的各自獨立的草藥提取物更好地抑制破骨細胞的增殖和活化。<實驗例3>通過經(jīng)口給藥測試的大鼠中的急性毒性進行以下實驗以了解本發(fā)明的草藥混合物提取物在大鼠中是否具有急性毒性。將6-周齡的無特殊病原(SPF)的SD大鼠用于急性毒性的測試中。將本發(fā)明的草藥混合物提取物懸浮在0.5%的甲基纖維素溶液中，并且以1g/kg/ml的劑量一次經(jīng)口給藥于每組2只大鼠。觀測大鼠中的死亡、臨床癥狀和重量變化，進行血液的血液學(xué)測試和生化測試，并且在尸體解剖期間用眼睛檢査胸和腹的胃腸器官中的任何異常病征。結(jié)果表明，本發(fā)明的草藥混合物提取物在大鼠中沒有導(dǎo)致任何特定的臨床癥狀、重量變化或死亡。在血液的血液學(xué)測試、生化測試以及尸體解剖中沒有觀察到變化。因此，將該實驗中使用的草藥混合物提取物評價為安全物質(zhì)，因為它在大鼠中高達1g/kg的水平?jīng)]有導(dǎo)致任何的毒性變化，并且它在小鼠中的估計LD5。值比lg/kg大得多。以下描述本發(fā)明的組合物的制備例。<制備例1>藥物制劑的制備<1-1>散劑的制備本發(fā)明的草藥混合物提取物2g乳糖lg通過混合全部以上組分制備散劑并用它們填充氣密袋。<1-2>片劑的制備本發(fā)明的草藥混合物提取物100mg玉米淀粉100mg乳糖100mg硬脂酸鎂2mg通過用制備片劑的常規(guī)方法混合全部以上組分制備片劑。<1-3>膠囊的制備本發(fā)明的草藥混合物提取物100mg玉米淀粉100mg乳糖100mg硬脂酸鎂2mg根據(jù)用于膠囊的常規(guī)方法，通過混合以上組分制備膠囊并用它們填充明膠膠囊。<制備例2>食品的制備含有本發(fā)明草藥混合物提取物的食品制備如下。<2-1>面粉食品的制備通過將本發(fā)明的草藥混合物提取物以0.55.0重量％添加到小麥粉，然后將所述面粉制成面包、蛋糕、餅干、薄脆餅干和面條而制備改善健康的面粉食品。<2-2>乳制品的制備將本發(fā)明的草藥混合物提取物以5~10重量％添加到乳以制備改善健康乳制品諸如黃油、冰淇淋等。<2-3>Sunsik的制備通過常規(guī)方法將糙米、大麥、糯米和薏苡(coix)(job'stear)膠質(zhì)化，接著干燥。將干燥的混合物分散并磨碎，得到60-篩目尺寸的顆粒粉末。將黑豆、黑芝麻和紫蘇通過常規(guī)方法蒸煮并干燥。將干燥的混合物分散并磨碎，得到60-篩目尺寸的顆粒粉末。將本發(fā)明的草藥混合物提取物利用真空濃縮器在減壓下真空濃縮，然后將其用熱風干燥器噴霧干燥。用研磨器將干燥物質(zhì)磨碎，產(chǎn)生60-篩目尺寸的顆粒粉末。將制備的谷物、種子和干燥的草藥混合物提取物粉末全部以下列比率混合。谷物(糙米30重量％，薏苡15重量％，大麥20重量％)，種子(紫蘇7重量％，黑豆8重量％，黑芝麻7重量％)，草藥混合物提取物的干燥粉末(3重量％)，地黃(/e/zwa"m.(3g/w""仍fl)(0.5重量%)<制備例3>飲料的制備<3-1>充碳酸氣飲料的制備將糖(5~10%)、檸檬酸(0.05~0.3%)、焦糖(0.005~0.02°/。)和維生素C(0.1l。/。)混合，向其添加純化水(79~94%)以制造糖漿。將制備的糖漿在8598匸滅菌20180秒，然后用冷卻水以1:4的比率混合。然后，將二氧化碳氣(0.50.82%)給予所述混合物以制備含有本發(fā)明草藥混合物提取物的充碳酸氣飲料。<3-2>保健飲料的制備將酸性果糖(0.5%)、寡糖(2%)、糖(2%)、鹽(0.5%)和水(75%)全部與本發(fā)明的草藥混合物提取物均勻混合，接著滅菌。將所述混合物放在小容器諸如玻璃瓶或小瓶(patbottle)中，產(chǎn)生保健飲料。<3-3〉蔬菜汁的制備將5g本發(fā)明的草藥混合物提取物添加到1,000ml的番茄或胡蘿卜汁以制備保健蔬菜汁。<3-4>果汁的制備將1g本發(fā)明的草藥混合物提取物添加到1,000ml的蘋果或葡萄汁以產(chǎn)生保健果汁。工業(yè)應(yīng)用性如上所述，本發(fā)明的熟地黃和五加皮的草藥混合物提取物通過增加成骨細胞中護骨蛋白表達和抑制破骨細胞的增殖，由此具有抑制破骨細胞的增殖和活化的效果。特別是，與用各個提取物獨自處理相比較，當混合物包含超過20重量％的熟地黃提取物和超過10重量％的五加皮提取物，更優(yōu)選當混合物包含超過50重量％的熟地黃提取物和超過25重量％的五加皮提取物時，抑制效果顯著增加。因而，由于它的協(xié)同效應(yīng)，本發(fā)明的草藥混合物提取物可以有效地作為藥物制劑和健康食品用于骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防和治療。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，可以將上述說明中公開的概念和具體實施方案容易地用作修改或設(shè)計其它用于實施本發(fā)明相同用途的實施方案的基礎(chǔ)。本領(lǐng)域技術(shù)人員也將理解，這樣的等價實施方案不背離如后附權(quán)利要求中陳述的本發(fā)明的實質(zhì)和范圍。權(quán)利要求1.一種熟地黃和五加皮的草藥混合物提取物。2.如權(quán)利要求1中所述的草藥混合物提取物，其中熟地黃提取物和五加皮提取物以15.0:0.5-0.15:5.0的重量比混合。3.如權(quán)利要求1中所述的草藥混合物提取物，其中熟地黃提取物和五加皮提取物以8:1~1:4的重量比混合。4.如權(quán)利要求1中所述的草藥混合物提取物，其中熟地黃提取物和五加皮提取物以4:1~1:1的重量比混合。5.如權(quán)利要求2至權(quán)利要求4的任何一項中所述的草藥混合物提取物，其中所述熟地黃提取物是利用熟地黃用水、C廣Q醇或它們的混合物提取的。6.如權(quán)利要求2至權(quán)利要求4的任何一項中所述的草藥混合物提取物，其中所述五加皮提取物是利用五加皮用水、C,C4醇或它們的混合物提取的。7.—種成骨細胞中護骨蛋白(OPG)表達的促進劑，所述促進劑包含權(quán)利要求1至權(quán)利要求4的任何一項的草藥混合物提取物作為有效成分。8.—種破骨細胞增殖的抑制劑，所述抑制劑包含權(quán)利要求1至權(quán)利要求4的任何一項的草藥混合物提取物作為有效成分。9.一種用于預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥的組合物，所述組合物包含權(quán)利要求1至權(quán)利要求4的任何一項的草藥混合物提取物作為有效成分。全文摘要本發(fā)明涉及熟地黃和五加皮的草藥混合物提取物和含有所述草藥混合物提取物的用于預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥的組合物。本發(fā)明的草藥混合物提取物增加成骨細胞中護骨蛋白(OPG)的表達，并且有效抑制破骨細胞的增殖和活化，以便該草藥混合物提取物可以有效地用于骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防和治療。文檔編號A61P19/10GK101128210SQ200680005613公開日2008年2月20日申請日期2006年2月23日優(yōu)先權(quán)日2005年2月23日發(fā)明者白東憲,金世源,金正根,金炯建,高鮮一申請人:奧斯考泰克公司