專利名稱：：對腦膜炎奈瑟球菌所致疾病具有廣譜保護作用的gna1870囊泡疫苗的制作方法
技術領域：
：本發明涉及預防腦膜炎奈瑟球菌(A^^w^mem'"g"W/力所致疾病的廣譜疫苗。
背景技術：
：腦膜炎奈瑟球菌是寄居在人上呼吸道中的革蘭陰性細菌，最值得注意的是其導致腦膜炎和膿毒癥在世界范圍零星和周期性流行爆發。2歲以下兒童中發病和死亡率最高。與其它革蘭陰性細菌相同，腦膜炎奈瑟球菌通常具有細胞質膜、肽聚糖層、與莢膜多糖一起構成細菌細胞壁的外膜和突出在外環境中的菌毛。腦膜炎奈瑟球菌的有被膜菌株是兒童和年輕人細菌性腦膜炎和敗血癥的主要病因(Rosenstein等，JInfectDis1999;180:1894-卯1)。人是腦膜炎奈瑟球菌屬的已知唯一貯存宿主(reservoir)。因此，奈瑟球菌演化出各種高度有效的策略來逃避人免疫系統。這些策略包括表達結構上與宿主聚唾液酸相同的莢膜多糖(即，血清群B)和抗原性高易變的免疫優勢非莢膜表位，即較大量存在于表面、抗生素易于接近和能引發強烈抗體應答的抗原表位。侵襲性腦膜炎奈瑟球菌感染的流行和經濟上的重要性促使研究能賦予對各血清型，特別是B群血清型或血清亞型免疫力的有效疫苗。然而，開發廣譜疫苗的許多工作受阻于奈瑟球菌可逃避人免疫系統的各種高度有效的策略。現有的莢膜疫苗可預防A、C、Y和W-135群菌株所致疾病(綜述見Gmnoff等，MeningococcalVaccines(腦膜炎球菌疫苗)，刊于PlotkinSA，OrensteinWA編，Vaccines(《疫苗》)，第四版，Philadelphia:W.B.SaundersCompany,2003)。然而，美國或歐洲尚未批準使用預防B群菌株所致疾病的疫苗，B群菌株所致疾病在北美占該疾病的約30%(Lingappa等，Vaccine2001;19:4566-75;Raghunathan等，AnnuRevMed2004，55:333-5)，在歐洲病例超過三分之二(Cartwright等，Vaccine2001，19:4347-56;Trotter等，Lancet2004，364:365-7)。缺乏B群莢膜疫苗的原因之一是B群莢膜能在人體中引發自身抗體應答(Finne等，Lancet1983，2:355-7)，其多糖即使與載體蛋白綴合后其免疫原性亦很弱(Jennings等，JImmunol1981，127:1011-8)。能引發自身反應性抗B群莢膜抗體的B群莢膜疫苗也有潛在的安全問題。因此，近年來B群腦膜炎球菌疫苗的研究集中在利用非莢膜抗原。已證實外膜囊泡(OMV)疫苗能誘導人產生抗B群腦膜炎球菌疾病的保護性免疫力(綜述見Jodar等，Lancet2002，359:1499-1508)。近年來，為響應公共健康干預，新西蘭許可并引入OMV疫苗來阻止己流行10年以上的B群(細菌)(Thomas等，NZMedJ2004，117:U1016;Desmond等，NursNZ2004，10:2;Baker等，JPaediatrChildHealth2001，37:S13-9)。免疫接種其它囊泡的方法已有描述(參見，例如CartwrightK等，1999,Vaccine,17:2612-2619;deKleinjn等，2000,Vaccine,18:1456-1466;RouupevanderVoortER,2000,Vaccine,18:1334-1343;Tappero等，1999,JAMA281:1520;RouupevanderVoortER,2000,Vaccine,18:1334-1343;US2002/0110569;WO02/09643)。兒童和成年人免疫接種腦膜炎球菌外膜囊泡(OMV)疫苗能誘導血清殺菌抗體，產生抵御疾病的血清學相關保護作用(Goldschneider等，1969，J.Exp.Med.129:1307)。采用隨機化前瞻性臨床試驗和追溯性病例-對照研究，在年紀較大兒童和成年人中直接證實了OMV疫苗有預防腦膜炎球菌B疾病的效力。因此，外膜囊泡疫苗的臨床效力毋庸置疑。新西蘭已許可這種疫苗應用于兒童，在挪威即將許可應用于年紀較大的兒童和成人，在其它歐洲國家處于后期臨床開發許可中。古巴的FinleyInstitute(芬利研究院)制備的OMV疫苗已可商品化購得，已給予南美洲的數百萬兒童。然而，針對OMV疫苗的血清殺菌抗體應答有菌株特異性傾向(Tappero等，1999,JAMA281:1520;RouupevanderVoortER,2000,Vaccine,18:1334-1343)。此外，目前可用的OMV疫苗也受限于其殺菌抗體應答主要定向針對其主要通道蛋白，PorA的表面暴露環(Tappero等，JAMA1999，281:1520-7)，該蛋白的抗原性可發生變異(Sacchi等，JInfectDis2000，182:1169-76)。由于PorA的免疫優勢，所誘導的特異性免疫力主要針對獲得膜囊泡的菌株(Tappero等，1999,JAMA281:1520;MartinSL等，2000,Vaccine,18:2476-2481)。因此，OMV疫苗可用于預防流行區中由一種PorA血清亞型的優勢腦膜炎球菌菌株，例如新西蘭的P1.4流行菌株所致疾病(Baker等，2001，同上)。然而，導致流行病的菌株，例如在美國發現的菌株中PorA有極大多樣性(Sacchi等，2000，同上)。此外，即使很少的氨基酸多態性也可能降低菌株對PorA抗體殺菌活性的敏感性(Martin等，Vaccine2000，18:2476-81)。幾種腦膜炎奈瑟球菌菌株基因組測序項目的完成提供了所有潛在的腦膜炎球菌蛋白抗原的目錄信息。聯用生物信息學、微陣列技術、蛋白質組學和免疫篩選已鑒定了大量候選的新腦膜炎球菌疫苗(Pizza等，Science2000，287:1816-20;DeGroot等，ExpertRevVaccines2004，3:59-76)。這些大量候選對象中有源自基因組的奈瑟球菌抗原1870(GNA1870)。GNA1870也稱為NMB1870(WO2004/048404)或LP2086(參見，例如Fletcher等，InfectImmun200472:2088-2100)，它是在所測試的所有腦膜炎球菌菌株均表達的約27kDa的脂蛋白(Masig腿i等，JExpMed2003，197:789-99;Giuliani等，Infect.Immun2005，73:1151-60;Welsch等，JImmunol2004，172:5606-15)。根據氨基酸序列的變異和免疫學交叉反應性可將腦膜炎奈瑟球菌菌株亞分類為三種GNA1870變體群(v.、v.2和v.3)(Masignani等，JExpMed2003，197:789-99)。變體1菌株占致病性B群分離株的約60%(Masignani等，2003，同上)。在各變體群中，氨基酸序列保守性達約92%或更高。用重組GNA1870免疫的小鼠對表達同源變體群GNA1870蛋白的菌株產生了高度血清殺菌抗體應答(Masignani等，2003，同上;Welsch等，2004，同上)。然而，表達各GNA1870蛋白亞變體的許多菌株對抗-GNA1870補體介導的溶菌作用耐受。雖然此現象的原因未知，據信可能是因為GNA1870的少量多態性或細菌表面上GNA1870的關鍵性表位的可接近性存在菌株差異從而導致抗-GNA1870抗體的結合和/或補體激活降低。以上免疫原性研究中所用的重組GNA1870蛋白疫苗是在大腸桿菌中表達的缺乏前導肽的His-標簽蛋白。該重組蛋白也缺乏翻譯后脂質化所需的基序，可能會降低其免疫原性(Fletcher等，InfectImmun2004，72:2088-100)。研究了重組PorA和重組GNA1870混合疫苗的潛力(Fletcher等，InfectImmun2004,72:2088-1200)。將該混合疫苗給予小鼠時，對兩種抗原的抗體應答沒有明顯干擾。然而，該重組混合物需要恢復PorA表位的構象，這是引發抗-PorA殺菌抗體所需(參見，例如Christodoulides等，Microbiology,1998，144:3027-37和Muttilainen等，MicrobPathog1995，18:423-36)。該混合重組疫苗也未顯示能提高針對表達疫苗所用GNA1870蛋白亞變體的腦膜炎奈瑟球菌菌株的抗-GNA1870殺菌抗體。O'Dwyer等(InfectImmun2004，72:651l-80)描述了共生黃色奈瑟球菌(7V.y7avMce""菌株的外膜囊泡(OMV)疫苗制品，該菌株經遺傳改造能表達奈瑟菌表面蛋白A(NspA)，該制品是一種黃色奈瑟球菌天然不表達的高度保守腦膜炎球菌膜蛋白候選疫苗。免疫的小鼠產生了NspA-特異性血清調理吞噬(opsonophagocytic)活性。另外，抗體經OMV吸附后，殘留的抗-NspA抗體也能賦予用被囊腦膜炎奈瑟球菌菌株致死攻擊的小鼠被動保護作用。然而，在此項研究中，修飾的黃色奈瑟球菌OMV疫苗引發的抗體保護作用顯示不優于不表達該異源抗原的黃色奈瑟球菌引發的保護作用。修飾的黃色奈瑟球菌OMV也未引發血清殺菌抗體應答，而在以前的研究中，用大腸桿菌囊泡中表達(Moe等，InfectImmun1999，67:5664-75;Moe等，InfectImmun2001，69:3762-71)或在月旨質體中重建(Martin等，干U于ThirteenthInternationalPathogenicNeisseriaConference(第13屆國際病原性奈瑟球菌大會)，Oslo:NordbergAksidenstrykkeriAS,2002)的重組NspA免疫的小鼠產生了血清殺菌抗體。PCT公布號WO02/09746和美國公布號US20040126389也描述了由經工程改造而過量表達奈瑟球菌抗原的菌株制備的OMV，這種抗原的具體例子是NspA、Omp85、菌毛(PiIQ、PiIC)、PorA、PorB、Opa、Tbp2、TbpA、TbpB、Hsf、PldA、HasR、FrpA/C、FrpB、Hap、LbpA/LbpB、FhaB、Iipo02、MltA禾口ctrAi。本發明克服了該疫苗現有技術方法的缺點，可引發抗廣譜腦膜炎奈瑟球菌菌株，特別是(但不限于)包括屬于血清群B菌株的保護性免疫力。參考文獻Bjune等，NIPHAnn1991，14:125-30;討論130-2;Chen等，刊于ThirteenthInternationalPathogenicNeisseriaConference(第13屆國際病原性奈瑟球菌大會)，NordbergAksidenstrykkeriAS，2002;Christodoulides等，Microbiology1998，144(第11部分):3027-37;Claassen等，Vaccine1996，14:1001-8;deKleijn等，Vaccine2000，18:1456-66;Frasch等，Meningococcalvaccines:methodsandprotocols(腦膜炎球菌疫苗方法與策略)，Totowa，新澤西HumanaPress,2001:81-107;Fukasawa等，FEMSImmunolMedMicrobiol2004，41:205-10;Hoist等，Vaccine2003，21:734-7;Humphries,Vaccine2004，22:1564-9;Jansen等，FEMSImmunolMedMicrobiol2000，27:227-33;Kijet等，刊于ThirteenthInternationalPathogenicNeisseriaConference(第13屆國際病原性奈瑟球菌大會)，NordbergAksidenstrykkeri,2002;Martin等，Vaccine2000，18:2476-81;McGuinness等，Lancet1991，337:514-7;Morley等，Vaccine2001，20:666-87;Muttilainen等，MicrobPathog1995，18:423-36;Parmar等，BiochimBiophysActa1999，1421:77-90;Newcombe等，InfectImmun2004，72:338-44;O'Dwyer等，InfectImmun2004，72:6511-8;Oliver等，InfectImmun2002，70:3621-6;Peeters等,Vaccine1996，14:1009-15;Peeters等，Vaccine1999，17:2702-12;Rouppe■derVoort等，Vaccine2000，18:1334-43;Sanchez等，Vaccine2002，20:2964-71;Steeghs等，EMBOJ2001,20:6937-45;Steeghs等，JEndotoxinRes2004，10:113-9;Tro腦so等，FEMSImmunolMedMicrobiol2000，27:103-9;Vandeputte等，JBiolChem2003;vanderLeyP等，Vaccine1995，13:401-7;Claassen等，Vaccine1996，14:1001-8;Peeters等，Vaccine1996，14:1009-15;Cantini等，JBiolChem.2005年12月31日；[印刷前的電子版]。發明概述總體上，本發明提供能在對象中引發抵御奈瑟球菌屬細菌，特別是抵御腦膜炎奈瑟球菌血清群B菌株的免疫應答的方法和組合物。一方面，本發明的特征在于含有由第一種奈瑟球菌制備的抗原性囊泡和藥學上可接受的載體的組合物，其中所述奈瑟球菌產生的GNA1870多肽水平足夠用于制備給予對象時能引發抗-GNA1870抗體的囊泡產品。所述囊泡可以是外膜囊泡(OMV)、微囊泡(MV)或OMV和MV的混合物。奈瑟球菌可以是天然產生的細菌或其GNA1870多肽的產生經遺傳改造(例如，由異源啟動子表達GNA1870多肽，表達外源性GNA1870多肽等)。對于宿主細胞，該GNA1870多肽可以是內源性的。在一些實施方式中，遺傳修飾該奈瑟菌種細菌以破壞其內源性GNA1870多肽的產生并遺傳修飾產生該宿主細胞的外源性核酸(編碼)的GNA1870多肽。在其它實施方式中，遺傳修飾該奈瑟球菌以產生至少兩種不同的GNA1870多肽(例如，不同變體群(v.l、v.2和v.3)的GNA1870多肽)。在其它相關的實施方式中，該奈瑟球菌不產生莢膜多糖。在一個實施方式中，所述組合物還含有由第二種奈瑟球菌制備的抗原性囊泡，其中所述第二種奈瑟球菌菌種細菌產生的GNA1870多肽水平足夠用于制備給予對象時能引發抗-GNA1870抗體的囊泡產品，其中第二種奈瑟球菌在遺傳學上不同于所述第一種奈瑟球菌(例如，所述第一和第二種細菌所屬的血清群、血清型或血清亞型中至少有一個不同)。在其它相關的實施方式中，所述第二種奈瑟球菌的GNA1870多肽不同于所述第一種奈瑟球菌的GNA1870多肽。在另一實施方式中，所述組合物還含有由第三種奈瑟球菌制備的抗原性囊泡，其中所述第二種奈瑟球菌產生的GNA1870多肽水平足夠用于制備給予對象時能引發抗-GNA1870抗體的囊泡產品，其中所述第三種奈瑟球菌在遺傳學上不同于所述第一種奈瑟球菌(例如，所屬血清群、血清型或血清亞型中至少有一個不同)。在其它相關的實施方式中，所述第一、第二和第三種奈瑟球菌的GNA1870多肽不同。在一特別感興趣的實施方式中，所述組合物含有由經遺傳修飾而過量表達GNA1870多肽的第一種腦膜炎奈瑟球菌細菌制備的第一抗原性囊泡；由經遺傳修飾而過量表達GNA1870多肽的第二種腦膜炎奈瑟球菌細菌制備的第二抗原性囊泡；和藥學上可接受的載體；其中所述第一和第二種細菌的GNA1870多肽屬于不同的GNA1870多肽變體群，所述第一和第二種細菌可產生不同的PorA多肽。在一相關實施方式中，所述組合物還含有由經遺傳修飾而過量表達GNA1870多肽的第三種腦膜炎奈瑟球菌細菌制備的第三抗原性囊泡，其中所述第三種細菌的GNA1870多肽屬于不同于所述第一和第二種細菌的GNA1870多肽變體群，其中所述第三種細菌產生的PorA多肽不同于所述第一和第二細菌產生的PorA多肽。在其它相關實施方式中，不利用洗滌劑制備所述囊泡。在另一方面，本發明的另一特征在于通過培養能產生GNA1870多肽的奈瑟球菌來制備抗原性組合物的方法，其中產生的GNA1870多肽水平足夠用于制備給予對象時能引發抗-GNA1870抗體的囊泡產品；制備培養細菌的囊泡；混合該囊泡與藥學上可接受的載體來制備適合給予對象的抗原性組合物。所述第一和第二囊泡各自可以是外膜囊泡(OMV)或微囊泡(MV)。所述奈瑟球菌可以是天然產生的細菌，從而能表達內源性GNA1870，或是在GNA1870多肽的產生經遺傳改造(例如，由異源啟動子表達GNA1870多肽，表達外源性GNA1870多肽等)的細菌。對于宿主細胞，該GNA1870多肽可以是內源性的。在一些實施方式中，遺傳修飾奈瑟菌種細菌以破壞其內源性GNA1870多肽的產生。在其它實施方式中，遺傳修飾奈瑟球菌以產生至少兩種不同的GNA1870多肽(例如，不同變體群(v.l、v.2和v.3)的GNA1870多肽)。在其它實施方式中，遺傳修飾奈瑟菌種細菌以破壞內源性全長GNA1870多肽的產生并由該宿主細胞的外源性核酸產生GNA1870多肽。在其它相關的實施方式中，所述奈瑟球菌不產生莢膜多糖。在另一方面，本發明的特征在于通過給予哺乳動物免疫有效量的含第一抗原制品的組合物來引發抗奈瑟球菌的免疫應答的方法，所述制品含有由第一奈瑟球菌制備的囊泡，其中所述奈瑟球菌產生的GNA1870多肽水平足夠用于制備給予對象時能引發抗-GNA1870抗體的囊泡產品；其中所述給予足以引發針對囊泡中存在的GNA1870多肽的免疫應答。所述囊泡各自可以是外膜囊泡(OMV)、微囊泡(MV)或OMV和MV的混合物。所述奈瑟球菌可以是天然產生的細菌，從而能表達內源性GNA1870，或者是在GNA1870多肽產生中經遺傳改造(例如，由異源啟動子表達GNA1870多肽，表達外源性GNA1870多肽等)的細菌。對于宿主細胞，GNA1870多肽可以是內源性的。在一些實施方式中，遺傳修飾奈瑟菌種細菌以破壞其內源性GNA1870多肽的產生。在其它實施方式中，工程改造奈瑟球菌以過量表達GNA1870。在還有其它實施方式中，GNA1870多肽是嵌合型蛋白質(融合蛋白)，其中所述嵌合型蛋白含有GNA1870以囊泡(例如，OMV、MV)形式呈遞至少一個抗原性部分。在其它相關的實施方式中，所述奈瑟球菌不產生莢膜多糖。在其它實施方式中，遺傳修飾奈瑟球菌產生至少兩種不同的GNA1870多肽(例如，不同變體群(v.l、v.2和v.3)的GNA1870多肽)。在其它實施方式中，遺傳修飾奈瑟菌種細菌以破壞內源性全長GNA1870多肽的產生并由宿主細胞的外源性核酸產生GNA1870多肽。在相關實施方式中，所述方法給予的組合物含有免疫有效量的第二抗原制品，所述制品含有由第二種奈瑟球菌制備的囊泡，其中所述第二種奈瑟球菌產生的GNA1870多肽水平足夠用于制備給予對象時能引發抗-GNA1870抗體的囊泡，其中所述第二種奈瑟球菌與所述第一種奈瑟球菌在遺傳學上不同(例如，所述第一和第二種細菌屬于不同的血清群、血清型或血清亞型)。所述第二種奈瑟球菌的GNA1870多肽不同于所述第一奈瑟球菌的GNA1870多肽。在其它相關的實施方式中，所述組合物還含有第三分離的抗原制品，所述制品含有由第三種奈瑟球菌制備的囊泡，其中所述第二種奈瑟球菌產生的GNA1870多肽水平足夠用于制備給予對象時能引發抗-GNA1870抗體的囊泡，其中所述第三種奈瑟球菌與所述第一或第二種奈瑟球菌在遺傳學上不同(例如，所述第一、第二和第三種奈瑟球菌至少屬于不同的血清群、血清型或血清亞型之一)。所述第一、第二和第三種奈瑟球菌的GNA1870多肽可以不同。所述方法能在對象中引發抵御多種奈瑟球菌菌株，特別是腦膜炎奈瑟球菌，更具體說是血清群B腦膜炎奈瑟球菌的保護性免疫應答。本文所述的抗原性組合物能引發最佳的抗GNA1870、抗-PorA和/或抗-OpC殺菌抗體應答組合，從而賦予抵御腦膜炎球菌疾病的廣泛保護作用。由本文所述過量表達GNA1870的菌株制備的疫苗能引發對以下奈瑟球菌菌株的殺菌抗體應答與制備囊泡的菌株共享GNA1870變體和/或PorA的奈瑟球菌菌株，以及具有GNA1870亞變體和相對于囊泡產生菌株為異源的PorA的奈瑟球菌菌株。由過量表達GNA1870的菌株制備的疫苗也能降低(對象)群中選擇和出現PorA表達減少的致病腦膜炎奈瑟球菌菌株的可能性。如果在(對象)群中廣泛應用常規OMV疫苗，應特別關注這些突變株。因為PorA的表達是階段可變的(vanderEnde等，J.Bacteriology1995，177:2475-2480)，不表達PorA的突變株較常見，不難用抗-PorA抗體和補體殺傷腦膜炎奈瑟球菌來選擇。不表達PorA的菌株也有毒性，能致病。與制備包含重組多肽的疫苗，或與摻有需要復性構象表位才能引發殺菌抗體的多種單一抗原或重組蛋白(例如PorA)的組合疫苗制劑相比，本文也提供易于制備的有效疫苗組合物的優選方法。閱讀本文內容后，本領域普通技術人員不難明白本發明的各方面、特征和優點。附圖簡述圖1A顯示了通過間接熒光流式細胞術檢測抗-GNA1870抗體與有被囊腦膜炎奈瑟球菌菌株RM1090和RM1090突變體的活細胞表面結合的實驗結果。行A.RM1090AGNA1870菌株。行B.RM10卯野生型菌株。行C.用含GNA1870基因的穿梭載體pFP12轉化的RM1090菌株。列l.單用磷酸鋁免疫的小鼠的陰性對照血清(l:10稀釋液)。列2.陽性對照抗-C群多糖mAb(10ng/ml)。列3.陽性對照抗-PorAmAb(抗-P1.2，1:500稀釋液)。列4.抗-GNA1870(v.l)mAb(2嗎/ml)。列5.制備的抗v.l、2和3重組蛋白的多克隆抗-GNA1870抗血清(l:10稀釋液)。列6.與列5相同，但血清稀釋1:250。圖1B顯示了通過間接熒光流式細胞術檢測抗體與B群腦膜炎奈瑟球菌活細胞表面的結合。行1.野生型H44/76菌株(灰色區域)；過量表達GNA1870的H44/76突變體(黑色區域)。行2.H44/76AGNA1870。圖A，抗佐劑陰性對照抗血清，1:10稀釋液；圖B，抗-PorAmAb(P1.16)，1:500稀釋液；圖C，抗莢膜mAb10(ig/ml;圖D，抗-rGNA1870mAbJAR3，10|ig/ml;圖E，抗-rGNA1870多克隆抗血清，1:10稀釋液；圖F，與圖E相同，l:250稀釋液。圖2A提供了OMV的SDSPAGE和Western印跡分析結果。圖A是考馬斯染色SDSPAGE的照片。泳道l-5，OMV制品(各泳道加入約5pg蛋白，但泳道5加入10pg)。泳道l,野生型(WT)菌株RM1090;泳道2，用不含GNA1870基因的穿梭載體pFP12轉化的WT菌株；泳道3.RM1090△GNA1870敲除(KO);泳道4，用不含GNA1870基因的pFP12轉化的RM1090AGNA1870KO;泳道5，用含GNA1870基因的穿梭載體pFP12-GNA1870轉化的RM1090AGNA1870KO;泳道6，rGNA1870(約1pg)。圖B和C是利用變體1、2和3rGNA1870蛋白免疫小鼠的多克隆抗-GNA1870血清的Western印跡照片。圖B:與變體1重組GNA1870蛋白(v.l)相比，檢測到該抗血清的靈敏度對于變體2(v.2)重組GNA1870蛋白略高。圖C:泳道l，重組GNA1870v.l;泳道2，WTRM1090的OMV;泳道3，RM1090AGNA1870的OMV;泳道4，用含GNA1870基因的pFP12穿梭載體轉化的RM10卯的OMV。用pFP12穿梭載體轉化的RM1090AGNA1870菌株中GNA1870v.l的過量表達高于野生型菌株中GNA1870的天然表達水平(泳道2)。圖2B提供了用抗-rGNA1870多克隆抗體檢測OMV疫苗的Western印跡分析結果。野生型，從野生型H44/76菌株制備的OMV;AGNA1870，從編碼GNA1870的基因已滅活的突變型H44/76制備的OMV;OEGNA1870，經工程改造而過量表達GNA1870的H44/76突變體的OMV;rGNA1870，大腸桿菌表達的純化的His-標簽GNA1870。圖3A顯示檢測到的對以下四種代表性有被囊腦膜炎奈瑟球菌菌株的小鼠血清殺菌(抗體)滴度Cu385、M6190、Z1092和NZ98/254。疫苗組是柱l，單用磷酸鋁佐劑；柱2，RM1090野生型的OMV疫苗；柱3，RM1090AGNA1870的OMV疫苗；柱4，RM1090AGNA1870的OMV疫苗+重組GNA1870蛋白的混合物；柱5，過量表達GNA1870的RM1090的OMV疫苗；柱6，重組GNA1870蛋白。顯示幾何平均值有95%可信限的柱代表檢驗了其中9-10只動物個體的血清的各疫苗組。有星號(*)的柱代表各疫苗組的兩種混合血清(各為4-5只不同小鼠的血清混合物)的檢驗結果幾何平均值。圖3B顯示用H44/76OMV疫苗免疫小鼠血清的血清殺菌活性(1/GMT±SD)。如圖3A中所述制備混合血清。各組小鼠用(1)佐劑，(2)rGNA1870，(3)H44/76野生型，(4)H44/76AGNA1870，(5)H44/76OEGNA1870免疫。雖然未在圖上顯示，但用補體+陽性對照抗莢膜和/或抗-PorA單克隆抗體可殺傷所有菌株。圖4A的一系列圖顯示通過間接熒光流式細胞術測定到活化的人C3b和iC3b補體沉積在有被囊腦膜炎奈瑟球菌活細胞表面。行A.菌株NZ98/254。行B.菌株M1390。列1，補體+陽性對照B群抗莢膜MAb，25pg/ml(開放區域)或單用磷酸鋁免疫的陰性對照小鼠混合血清1:40稀釋液(封閉區域)。列2，補體+抗-GNA1870MAbJAR3，1嗎/ml(開放區域)或熱滅活的補體+抗-GNA1870MAb，5^g/ml(封閉區域)。列3、4和5，補體+列3(rGNA1870疫苗)、列4(RM1090WT菌株的OMV疫苗)或列5(rGNA1870疫苗和菌株RM10卯AGNA1870的OMV疫苗的混合物)免疫小鼠混合血清的1:100稀釋液。列6，補體+用過量表達GNA1870菌株RM10卯的OMV疫苗免疫小鼠混合血清稀釋液(開放區域是1:IOO稀釋液，灰色區域是l:400稀釋液)。為進行比較，列6的圖也顯示了補體+用菌株RM1090AGNA1870的OMV疫苗免疫小鼠混合血清的1:IOO稀釋液的數據(封閉區域)。圖4B的一系列圖顯示通過間接熒光流式細胞術測定到活化的人C3b和iC3b補體沉積在有被囊腦膜炎奈瑟球菌活細胞表面。菌株NZ98/254、BZ198、Z1092和M6190。圖A，開放區域補體+抗莢膜mAb(B群菌株NZ98/254、BZ198和M61903為25嗎/ml，A群菌株Z1092為1嗎/ml);填充區域補體+抗佐劑抗血清的1:IOO稀釋液。圖B，開放區域補體+抗-rGNA1870mAbJAR325pg/ml;填充區域補體+多克隆抗rGNA1870抗血清的1:IOO稀釋液。圖C，補體+抗野生型H44/76的OMV的抗血清1:100稀釋液；圖D，開放區域補體+已用陰性對照柱(只有Ni-NTA)吸附的過量表達GNA1870的制備的抗OMV抗血清1:IOO稀釋液；填充區域補體+用固相GNA1870柱吸附的過量表達GNA1870制備的抗OMV抗血清1:25稀釋液。圖5是顯示通過ELISA(GMT±SD)檢測血清抗-GNA1870抗體應答的柱狀圖。平板上的抗原是rGNA1870變體l。第二抗體是堿性磷酸酶綴合的山羊抗小鼠IgG+A+M。這些柱代表用(1)佐劑；(2)rGNA1870;(3)H44/76野生型OMV;(4)H44/76AGNA1870OMV;(5)H44/76OEGNA1870OMV免疫的各組小鼠兩份抗混合血清(各為4-5只小鼠的混合物)的各自幾何平均滴度。圖6提供的圖顯示了對乳大鼠腦膜炎球菌菌血癥模型被動保護力分析的結果。在0時，用免疫小鼠的混合血清(N二每份混合物9-10只小鼠)稀釋液腹膜內處理乳大鼠，兩小時后用B群菌株NZ98/294攻擊(腹膜內給予約60,000CFU/大鼠)。細菌攻擊4-6小時后獲得定量的血液培養物。圖A:1:15血清稀釋液。圖B:1:60血清稀釋液。柱l:單用磷酸鋁免疫小鼠的血清；柱2:抗莢膜mAb(10pg/大鼠)；柱3:抗-GNA1870mAb(10ng/大鼠)；柱4:用RM1090AGNA1870的OMV疫苗免疫小鼠的血清；柱5:用RM1090AGNA的OMV疫苗+重組GNA1870蛋白疫苗混合物免疫小鼠的血清；柱6:用過量表達GNA1870的RM1090的OMV疫苗免疫小鼠的血清；柱7:用重組GNA1870蛋白免疫小鼠的血清。圖7分別是腦膜炎奈瑟球菌菌株MC58、951-5945和M1239的GNA1870變體l、2和3的示范性氨基酸序列的比對。"1"表明成熟蛋白質的第一個氨基酸，負數表示的氨基酸是前導序列的一部分。灰色和黑色背景分別表示保守和相同的氨基酸殘基。圖8A-8H提供本發明所用示范性GNA1870多肽的氨基酸序列，包括選出的示范性GNA1870多肽的氨基酸比對(圖8H)。圖9提供示范性PorAVR1家族原型(圖A)的氨基酸序列和示范性PorAVR2家族原型(圖B)的氨基酸序列的比對。在描述本發明和具體的示范性實施方式之前，應理解本發明不限于所述的具體實施方式，因為這些實施方式當然可變。既然本發明的范圍僅受附加的權利要求書限制，則文中使用的術語也應理解僅是為了描述具體的實施方式而非限制。除非文中另有明確指出，在提供數值范圍之處應理解為本發明包括該范圍上下限之間的各中間值至下限單位的十分之一，或者也包括該范圍中其它任何所述或中間值。這些較小范圍的上下限可獨立包括在也屬于本發明所述范圍內排除端點的任何具體較小范圍內。當所述范圍包括一邊或兩邊界限時，排除一邊或兩邊界限的范圍也屬于本發明。除非另有定義，本文所用的所有技術和科學術語和本發明所屬領域的普通技術人員通常理解的意義相同。雖然可用任何相似或等價于文中所述的方法和材料來實施或測試本發明，但優選方法和材料是本文所述的。文中提及的所有出版物均納入本文作為參考來公開和描述與所引用出版物有關的方法和/或材料。必須注意，除非文中另有明確指出，文中和附加的權利要求書所用的單數形式"一種"、"和"與"該"包括其復數形式。因此，例如，"一種抗原"包括多個這種抗原，"該囊泡"包括本領域技術人員已知的一種或多種囊泡及其等價物，等等。提供本文所述的出版物僅是因為其在本申請提交日期之前公開。本文沒什么可解釋為承認由于在先發明而使本發明不具資格早于該出版物。此外，提供出版物的發表日期可能不同于實際發表日期，這些日期可能需要獨立證實。發明詳述本發明的依據是發現與重組GNA1870(rGNA1870)蛋白疫苗，或由天然產生菌株制備的OMV或重組蛋白疫苗與OMV混合疫苗相比，用經工程改造而過量表達GNA1870的突變型腦膜炎奈瑟球菌菌株制備的OMV疫苗能在小鼠中引發更廣泛的殺菌抗體應答。OMV疫苗已安全地給予數百萬人，并證明能有效抵御腦膜炎球菌疾病。如引言部分所述，它們的主要局限性在于引發的是菌株特異性殺菌抗體應答。如果OMV疫苗廣泛用于(對象)群，也應關注免疫應答可能選擇腦膜炎奈瑟球菌菌株"逃逸突變體"(即，PorA的表面可接近環氨基酸序列中發生突變或PorA表達減少的菌株)。簡言之，通過選擇流行的PorA血清亞型和制備過量表達GNA1870的突變株，本發明可制備能引發最佳抗GNA1870和抗-PorA殺菌抗體應答組合的囊泡疫苗(例如，OMV、MV)，從而賦予抵御腦膜炎球菌疾病的廣泛保護作用。對于選擇(對象)群中致病的PorA缺陷突變株，使用這種疫苗的風險也低于常規OMV疫苗。此外，與用GNA1870表達水平較低的菌株制備的囊泡相比，過量表達GNA1870的菌株制備的囊泡的蛋白分布概況有所改變。如實施例中詳述的，與由野生型疫苗RM1090菌株或RM1090AGNA1870敲除菌株制備的OMV相比，由過量表達GNA1870的菌株制備的OMV顯示許多其它包膜蛋白表達減少。雖然用過量表達GNA1870(菌株)的OMV免疫小鼠的抗血清能引發針對菌株Cu385的殺菌抗體，或活化C3b沉積在菌株NZ98/294上是GNA1870引發的抗體所致，但這些其它細胞外包膜蛋白減少可進一步提高由過量表達GNA1870菌株制備的囊泡的免疫原性和引發的保護性免疫應答(例如，因為"暴露"了囊泡中的其它抗原)。本發明提供的實施例說明了由過量表達(例如，經遺傳工程改造而過量表達)GNA1870的腦膜炎奈瑟球菌菌株制備的OMV疫苗免疫所引發的保護作用幅度。過量表達GNA1870的OMV疫苗所引發的抗-GNA1870抗體功能活性高于重組GNA1870疫苗或重組GNA1870與野生型菌株制備的OMV的混合疫苗所引發的抗體。例如，雖然ELISA檢測到抗-GNA1870抗體應答的數量級較低(表2)，但用經工程改造而過量表達GNA1870的菌株制備的OMV疫苗免疫的小鼠血清顯示對菌株Z1092的殺菌活性高于用重組蛋白GNA1870疫苗，用野生型或GNA1870敲除RM1090菌株制備的OMV疫苗或用混合的重組GNA1870蛋白疫苗和OMV疫苗免疫的小鼠血清(圖3)。此外，即使沒有強殺菌活性，與其它疫苗產生的抗體相比，過量表達GNA1870(菌株制備)的OMV疫苗所引發的抗體能使更多的C3b沉積在菌株NZ98/254或M1390表面(圖4A，列6)，后者在用菌株NZ98/254攻擊的乳大鼠時能賦予對菌血癥更強的被動保護作用(圖6，圖A-B)。抗-GNA1870抗體經吸收后，活化C3b沉積到菌株NZ98/254上的能力喪失(表3)。簡言之，修飾的OMV疫苗比GNA1870重組蛋白或野生型疫苗菌株的OMV疫苗能賦予更廣泛的保護作用，因為修飾的OMV疫苗能引發的血清亞型特異性殺菌活性而抵御能表達與該疫苗菌株同源的PorA分子的菌株，同時與重組GNA1870疫苗所引發的抗體相比，所引發的抗-GNA1870抗體抵御表達GNA1870變體1蛋白亞變體的菌株的功能活性更強。對于抵御表達變體1GNA1870蛋白的亞變體和/或表達同源性PorA血清亞型的菌株，由過量表達GNA1870菌株制備的修飾OMV疫苗優于重組GNA1870(疫苗)。有趣的是，與用編碼NspA的基因已滅活菌株RM1090制備的對照囊泡疫苗免疫的對照小鼠相比，用經工程改造而過量表達NspA的腦膜炎奈瑟球菌菌株(RM10卯)制備的囊泡疫苗免疫的小鼠的ELISA抗-NspA抗體滴度高10倍，但對一些腦膜炎奈瑟球菌菌株，例如Cu385或Z1092的血清殺菌滴度較低(表5)。0'Dwyer等也觀察到用經工程改造而過量表達NspA的黃色奈瑟球菌菌株制備的OMV疫苗免疫接種的小鼠血清缺乏殺菌活性(Infect.Innun.2004，72:6511-80)。因此，發現對過量表達GNA1870(的菌株制備)的OMV疫苗的殺菌和保護性抗體應答提高是意外的。與由H44/76野生型菌株制備的OMV中天然GNA1870含量較高相比，菌株H44/76中GNA1870v.l過量表達導致OMV中GNA1870增加約3倍。與我們以前用野生型菌株RM1090的OMV免疫小鼠研究相反，ELISA檢測到用野生型H44/76制備的OMV免疫小鼠產生了抗-GNA1870抗體(圖5)。然而，給予過量表達GNA1870菌株的OMV的小鼠組(抗體)滴度約高10倍。ELISA檢測的滴度與抗體功能活性不良好相關。例如，用重組GNA1870疫苗免疫的小鼠具有最高的血清抗-GNA1870滴度，但用重組蛋白免疫的小鼠血清殺菌活性和C3b沉積活性限于對菌株H44/76。預計該菌株(對該抗體)敏感，是因為實際上具有ET5遺傳譜系的所有腦膜炎奈瑟球菌菌株都高度表達典型的GNA1870v.l蛋白(與MC58的氨基酸序列相同)，故這些菌株對抗-GNA1870抗體的補體介導殺菌活性高度敏感(Masignani等，2003，同上；Welsch等，2004，同上)。我們研究的其余五種腦膜炎奈瑟球菌測試菌株表達的GNA1870含量低于菌株H44/76，相應的蛋白質是GNA1870v.1的亞變體。這5種菌株也具有對H44/76疫苗菌株而言為異源性的PorA分子。這5種菌株對重組GNA1870疫苗所引發抗體或OMV疫苗所引發的抗-ProA抗體導致的殺菌活性和補體活化耐受。相反，這5種菌株的4種對用過量表達GNA1870的H44/76OMV疫苗免疫的小鼠血清的殺菌活性和/或補體沉積活性敏感。C3b在活細菌表面活化引起對乳大鼠產生預計的抵御腦膜炎球菌菌血癥的被動保護力(Welsch等，JInfectDis2003，188:1730-40;Welsch等，JImmunol2004，172:5606-15;Hou等，JInfectDis2005，192:580-90;Moe等，InfectImmun2002，70:6021-31)。含過量表達GNA1870的OMV疫苗由復雜的抗原混合物構成，預計能引發針對許多靶抗原的抗體。然而，在吸收實驗中，抵御這些菌株的抗體功能活性針對對照GNA1870的(表3)。與用選擇的GNA1870表達較高的野生型菌株制備的OMV疫苗相比，用GNA1870水平只有適度增加的突變型菌株制備的OMV疫苗引發了更高且更廣的GNA1870-特異性殺菌抗體應答和/或更多的C3沉積。因此，OMV疫苗制品中GNA1870與總蛋白的比例即使只有少許變化看來也能決定對GNA1870是否會產生抗體應答。此外，含過量表達的GNA1870的OMV疫苗所引發抗體的質量優于重組GNA1870疫苗所引發的抗體。例如，該重組疫苗引發的ELISA抗體結合滴度高于含過量表達GNA1870的OMV疫苗引發的，但抗該重組蛋白(所引發)抗體的殺菌和補體活化活性較低。要確定經修飾的GNA1870-OMV疫苗通過何種機制引發比重組蛋白或對照OMV疫苗更廣泛功能活性的抗體需要進一步研究。因此，本發明提供引發能與各種致病性腦膜炎奈瑟球菌菌株起廣泛反應的免疫應答的方法和組合物。本發明通過提高對疫苗菌株中GNA1870和其它可能的共同抗原的抗體應答克服了囊泡或PorA疫苗中PorA抗原可變結構域所具有的免疫優勢問題。重要的是，本發明方法引發的血清殺菌抗體能抵御表達該疫苗制品中未使用的血清亞型表位的奈瑟球菌菌株，唯一經證實的血清學與人體保護作用的相關性(Goldschneider等，1969，同上)。此外，所述方法引發的血清殺菌抗體能抵御針對保守性蛋白(例如奈瑟球菌表面蛋白A，一種候選腦膜炎球菌疫苗)(Martin等，2000.J.Biotechnol.83:27-31;Moe等，1999Infect.Immun.67:5664;Moe等，InfectImmun.200169:3762)的抗體無法殺傷的菌株。不希望受理論的束縛，本發明疫苗和免疫接種方案的優點是通過引發保守和非保守抗原的特異性抗體來提供出乎意料的廣譜保護性免疫力。定義術語"保護性免疫力"表示給予哺乳動物的疫苗或免疫接種方案能誘導預防、延遲腦膜炎奈瑟球菌所致疾病的發生或減輕其嚴重程度或降低或完全消除其癥狀的免疫應答。短語"腦膜炎奈瑟球菌血清群B菌株所致疾病"包括存在腦膜炎奈瑟球菌血清群B某成員感染所致的任何臨床癥狀或臨床癥狀組合。這些癥狀包括但不限于腦膜炎奈瑟球菌血清群B病原菌株寄居上呼吸道(例如，鼻咽和扁桃體粘膜)，細菌穿過進入粘膜和粘膜下血管床，敗血癥、膿毒性休克、炎癥、出血性皮膚病損、激活血纖蛋白溶解和血液凝結，器官功能失調，例如腎、肺和心力衰竭，腎上腺出血和肌肉梗死，毛細血管滲漏，水腫，外周肢體缺血(peripherallimbischaemia)，呼吸窘迫綜合征，心包炎和腦膜炎。短語"廣譜保護性免疫力"表示疫苗或免疫方案引發了針對至少一種或多種(或針對至少兩種、至少三種、至少四種、至少五種、針對至少8種或至少針對8種以上)腦膜炎奈瑟球菌菌株的"保護性免疫力"，其中所述各菌株屬于與制備疫苗所用菌株不同的血清亞型。本發明專門考慮并包括能抵御腦膜炎奈瑟球菌血清群B某成員所致疾病，也抵御其它血清群，特別是血清群A、C、Y和W-135保護力的疫苗或疫苗接種方案。當短語"與某抗體特異性結合"或"特異性免疫反應"指某抗原，例如多糖、磷脂、蛋白質或肽時，表示根據樣品中存在的抗原和/或檢驗其存在的結合反應，所述樣品也可以是包含其它分子的異質群體。因此，在指定的免疫測定條件下，所述一種或多種特異性抗體能與樣品中的一種或多種特定抗原結合，而不與樣品中存在的顯著含量的其它分子結合。在這種條件下某抗體的特異性結合可能需要選用對一種或多種特定抗原具有特異性的抗體或抗血清。短語"用量足以引發針對所述制品中存在表位的免疫應答"表示在給予特定抗原制品前后檢測到的免疫應答指示物之間存在可檢測的差異。免疫應答指示物包括但不限于通過例如以下試驗檢測的抗體滴度或特異性酶聯免疫測定(ELISA)、殺菌試驗、流式細胞術、免疫沉淀、Ouchter-Lowny免疫擴散、例如斑點、Western印跡或抗原陣列的結合檢測試驗、細胞毒性試驗等。"表面抗原"是存在于腦膜炎奈瑟球菌的表面結構(例如，外膜、內膜、周質間隙、莢膜、菌毛等)中的抗原。在腦膜炎奈瑟球菌遺傳學多樣性菌株的說明中所用的短語"遺傳學多樣性"指至少一種、通常至少兩種、更常見至少三種多肽，特別是抗原性多肽的氨基酸序列彼此不同的菌株。可通過選擇至少一種或以上、優選至少兩種或以上血清群、血清型或血清亞型不同的菌株(例如，選自外膜、PorA和PorB蛋白的至少一種蛋白不同的兩種菌株稱為彼此遺傳學不同)而實現菌株的遺傳多樣性。也可通過，例如多個基因座序列分型和/或多個基因座酶分型(參見，例如Maiden等，1998,Proc.Natl.Acad.SciUSA95:3140;Pizza等，2000Science287:1816)、多個基因座酶電泳和本領域已知的其它方法確定遺傳學多樣性。本文所用的"血清群"指依靠莢膜多糖免疫學可檢測的差異進行腦膜炎奈瑟球菌分類。已知約有12種血清群A、B、C、X、Y、Z、29-E、W-135、H、I、K和L。任何一種血清群可包括多種血清型和多種血清亞型。本文所用的"血清型"指根據單克隆抗體確定的外膜通道蛋白B的抗原差異進行腦膜炎奈瑟球菌菌株分類。一種血清型可見于多種血清群和多種血清亞型中。本文所用的"血清亞型"指根據用抗體確定的稱為通道蛋白A的外膜蛋白的抗原性差異，或根據DNA測序推導的氨基酸序列的VR分型(Sacchi等，2000,J.Infect.Dis.182:1169;也可參見MultiLocusSequenceTyping(多基因座序列分型)網站)進行腦膜炎奈瑟球菌菌株分類。PorA蛋白之間的大多數變異發生在8種推定的表面暴露環中的兩個(環I和IV)。可變環I和IV分別命名為VR1和VR2。一種血清亞型可見于多種血清群和多種血清亞型中。"富集的"表示經實驗人員或臨床醫師操作，某抗原組合物中的某抗原與獲得該抗原組合物的菌株中該抗原的濃度相比，其濃度以總重量計高至少三倍、通常至少五倍、更優選至少十倍、更常見是至少一百倍。因此，如果某特定抗原的濃度是1微克/克細菌總制品(或細菌總蛋白)，則富集制品含有至少3微克/克細菌總制品(或細菌總蛋白)。術語"異源"指自然界中發現不在一起的兩種生物學組分。所述組分可以是宿主細胞、基因或調節區，例如啟動子。雖然自然界中發現異源組分不在一起，它們可共同起作用，例如當某基因的異源啟動子與之操作性相連時。另一例子是某奈瑟球菌序列對不同菌株的奈瑟球菌宿主為異源。本文在兩種不同細菌菌株表達的蛋白質，例如"異源PorA"或"異源GNA1870"的說明中使用"異源"表明所述二蛋白質的氨基酸序列不同。例如，表達PorA1.5-2，10的第一種奈瑟球菌菌株對表達PorA7-2,4的第二種奈瑟球菌菌株而言稱為具有"異源PorA蛋白"或是"PorA異源"。術語"對于腦膜炎奈瑟球菌為免疫原初是"表示從未接觸過腦膜炎奈瑟球菌(通過感染或給予)或衍生自腦膜炎奈瑟球菌的抗原組合物(其含量足以引發保護性免疫力)，或者如果接觸過，未能引起保護性免疫應答的個體(例如，哺乳動物，如人患者)。(后一情況的例子是接觸時太年幼而未產生保護性免疫應答的個體。Molages等，1994,Infect.Immun.62:4419-4424)。還需要(但不一定)包括"免疫學原初的"個體也未接觸過除腦膜炎奈瑟球菌以外的奈瑟球菌種(或用某奈瑟球菌種制備的抗原組合物)，特別是未接觸過奈瑟球菌種的交叉反應性菌株(或抗原組合物)。已接觸過奈瑟球菌種(通過感染或給予)或衍生自該奈瑟球菌種的抗原組合物(其含量足以引發針對該種細菌所顯示表位的免疫應答)的個體是"致敏的"，從而能對該種細菌所顯示的表位起免疫反應。表達用于制備囊泡的GNA1870的奈瑟球菌菌株本發明總體上包括由天然產生的或遺傳修飾的奈瑟球菌種制備囊泡(微囊泡或外膜囊泡)，其中所述奈瑟球菌種產生的GNA1870蛋白水平足夠用于制備給予對象時能引發血清抗-GNA1870抗體的囊泡。所產生的抗-GNA1870抗體有助于提供抵御l、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多種奈瑟球菌菌株的免疫保護作用，對于例如血清群、血清型、血清亞型(如PorA蛋白所測定的)、序列類型、電泳類型、GNA1870變體和/或GNA1870亞變體，這些菌株可以存在遺傳學多樣性(或"異源的")。本發明方法可利用能產生或經修飾能產生GNA1870，和任選能產生或經修飾能產生感興趣的其它抗原，例如PorA的各種奈瑟球菌屬菌株。適合于產生GNA1870的菌株特征詳述于下文。特別感興趣的是病原性奈瑟球菌屬或源自病原性奈瑟球菌屬的菌株，特別是人的病原性或源自人的病原性或共棲菌株。示范性奈瑟球菌屬包括腦膜炎奈瑟球菌、黃色奈瑟球菌、淋病奈瑟球菌(W.gowofr/zoefle)、乳糖奈瑟球菌(TV./actom/c。)、多糖奈瑟球菌(W.po/;;racc/2。rea)、灰色奈瑟球菌(W.c/朋"a)、粘液奈瑟球菌(W.mwccwa)、微黃奈瑟球菌(A^.si^/7avfl)、干燥奈瑟球菌(TV.s/cca)、長奈瑟球菌(A^.e/owgato)等。細菌菌株說明中的"源自"表示通過親代菌株的體內傳代或體外培養獲得某菌株和/或是通過修飾親代菌株獲得的重組細胞。本發明特別感興趣的腦膜炎奈瑟球菌菌株。可根據能與不同表面抗原相互反應的多克隆(Frasch，C.E.和Chapman,1973，J.Infect.Dis.127:149-154)或單克隆抗體將腦膜炎奈瑟球菌菌株分為血清群、血清型和亞型。根據莢膜多糖中免疫學可檢測的變異進行血清分群(serogrouping)。己知有約12種血清群(A、B、C、X、Y、Z、29-E和W-135)。血清群A、B、C、Y和W-135的菌株可導致幾乎所有的腦膜炎球菌疾病。可根據單克隆抗體確定的稱為通道蛋白B(PorB)的外膜蛋白的抗原性差異區分血清型。目前已知約有21種抗體確定的血清型(Sacchi等，1998,Clin.Diag.Lab.Immunol.5:348)。可根據抗體確定的稱為通道蛋白A(PorA)的外膜蛋白的抗原性差異區分血清亞型(serosubtyping)。目前已知約有18種抗體確定的血清亞型。在免.疫力可能是血清亞型特異性時區分腦膜炎奈瑟球菌菌株血清亞型尤其重要。PorA蛋白之間的大多數變異發生在8個推定的表面暴露環中的兩個(環I和IV)中。可變環I和IV分別命名為VR1和VR2。由于存在用特異性抗體不能確定的多個PorAVR1和VR2序列變體，有人根據從DNA序列推定的氨基酸序列的VR分型提出了替代術語(Sacchi等，2000,JInfect.Dis.182:1169;也參見MultiLocusSequenceTyping(多基因座序列分型)網站)。脂多糖也可用作分型抗原，從而得到所謂的免疫型Ll、L2等。也可采用能直接或間接特征鑒定細菌基因組的各種技術將腦膜炎奈瑟球菌分為克隆組或亞組。這些技術包括根據酶的電泳遷移率不同的多基因座酶電泳法(MLEE)，其變化能反映特定遺傳基因座的潛在多態性。通過特征鑒定許多這種蛋白質的變體，可從錯配比例推斷兩菌株間的遺傳"距離"。類似地，如果兩種分離物的多個基因座具有相同的電泳變化模式，則可推斷該二分離物之間具有克隆性(clonality)。近年來，多基因座序列分型(MLST)替代了MLEE作為特征鑒定微生物選用的方法。采用MLST，可從腦膜炎奈瑟球菌菌株11種持家基因的DNA序列的錯配比例推斷兩種分離物之間的遺傳距離或克隆性(Maiden等，1998,Proc.NatlAcad.SciUSA95:3140)。可根據許多不同的所需特征選擇用于產生囊泡的菌株。例如，除了根據GNA1870的產量水平來選擇外，可根據以下特征選擇菌株所需的PorA類型(如上述的"血清亞型")、血清群、血清型等；莢膜多糖產量低等。例如，生產菌株應能產生任何所需的PorA多肽，可表達一種或多種PorA多肽(天然的或經遺傳改造的)。示范性菌株包括產生以下PorA多肽的那些菌株能賦予血清亞型P1.7,16;Pl.19,15;P1.7，l;P1.5,2;P1.22a,14;P1.14;P1.5,10;P1.7,4;Pl.12,13的PorA多肽；以及保留或未保留與區分血清亞型所用常規血清學試劑反應性的這種PorA多肽變體。根據PorA可變區(VR)分型特征鑒定的PorA多肽也是感興趣的多肽(參見，例如Russell等，EmergingInfectDis200410:674-678;SacchiCT等，ClinDiagnLabImmunol1998，5:845-55;Sacchi等，J.InfectDis2000，182:1169-1176)。已鑒定了許多不同的VR型，這些型可分為VR1和VR2家族"原型"。描述此術語及其與以前分型方案的關系的網絡數據庫見neisseria.org/nm/typing/pora。Russell等(EmergingInfectDis200410:674-678)提供了示范性PorAVR1和VR2型的比對，為方便讀者起見圖9提供了這種比對。通過PorA血清亞型特征鑒定的示范性PorA多肽包括P1.5，2;P1.5a,2a;P1.5a,2c;P1.5a,2c;P1.5a,2c;P1.5b,10;P1.5b,10;Pl,5b,C;P1.7,16;P1.7d,l;P1.7d,l;P1.7d,l;P1.7d,l;P1.7b,3;P1.7b,4;P1.7b,4;Pl.12,16;P1.12a,13a;P1.22,9;P1.23,14;P1.23,14;Pl.19,15;P1,B,1;P1.C,1;P1.E,A;P1.E,A;P1.E，A;;P1.5,2;P1.5,2;P1.5a,10a;P1.5b,10;P1.5b，10;P1.5b,10b;P1.7,16;P1.7，16;P1.7b,l;P1.7b,13e;P1.7b,4;P1.7b,4;P1.7d,l;P1.7d,l;P1.7b,13a;P1.23，3;P1.23,3;P1.23,3;Pl.19,15;P1.19,l;P1.19,15;PU9,15;Pl.19,15;Pl.19,15;Pl.19,15;Pl.19,15;Pl.19,15;P1,E,A;P1，E,A;Pl.E，16a;Pl.E,4a;Pl.E,4a;Pl.Ea,3;Pl.Eb,9;Pl.Eb,9;Pl.Eb,9;Pl.Eb,9;Pl.Eb,9;P1.F，16;P1.7a,l;P1.7b,3;P1.7d,l;Pl.Ea,3;P1.5b,10;P1.5b,10;P1.5b,10;P1.5b,10;P1.5b,10;P1.5b,10;P1.5b,10b;P1.5b,10;P1.22,14a;;P1.F,16;Pl.D,2d;P1.D,2;Pl.D,2d;P1.19c,2c;PlD，10f;PlA,10e;PlA,10g;P1A,10;Pl.19,15;Pl.19,15;Pl.19,15;Pl.19,15;P1.7b，16;P1.7,16b;Pl,7，16;Pl.19,15;Pl.Eb,9;P1.5,2e;P1,E,A;P1.7b,13d;Pl.Ea，3;P1.7,16b;Pl,Ec,l;P1.7b，4;P1.7b,4;P1.7，9;Pl.19,15;Pl.19,15;P1.19,15;P1.19,15a;P1.19a,15b;Pl.19,15;P1.5b,16;Pl,19b,13a;P1.5,16;P1.5,2;P1.5，2b;P1.7b,16;P1.7,16b;P1.7b，3;Pl.Ea，3;P1.5a,2c;P1.F,16;P1.5a,9;P1.7c,10c;P1.7b,13a;P1.7,13a;P1.7a,10;P1.20,9;P1.22,B;P1.5b,del;P1.5b,10;P1.7,13a;P1.12a,13f;P1.12a，13;P1.12a,13a;P1.12a,13a;P1.12a,13;P1.12a,13;Pl.E，13b;P1.7b,13a;P1.7b,13;P1.5，2;P1.5,2;Pl.Ea,3;P1.22,9;P1.5,2;P1.5,2;P1.19,15;Pl,5,2;P1.12b,13a;P1.5c，10a;P1.7e,16e;Pl.B,16d;Pl.F,16e;Pl.F,16e;P1.7b,13e;Pl.B,16d;P1.7e,16e;P1.7b，13g;Pl.B,16f;;P1.7，16c;P1.22,14b;P1.22,14c;Pl.7,14;Pl.7,14禾卩P1.23,14。示范性PorA多肽的氨基酸序列見GenBank登錄號:X57182、X57180、U92941、U92944、U92927、U92931、U92917、U92922、X52995、X57184、U92938、U92920、U92921、U92929、U92925、U92916、X57178、AF051542、X57181、U92919、U92926、X57177、X57179、U92947、U92928、U92915、X57183、U92943、U92942、U92939、U92918、U92946、U92496、U97260、U97259、AF042541、U92923、AF051539、AF051538、U92934、AF029088、U92933、U97263、U97261、U97262、U92945、AF042540、U92935、U92936、U92924、AF02卯86、AF020983、U94958、U97258、U92940、AF029084、U92930、U94959、U92948、AF016863、AF029089、U92937、AF02鄉7、U92932、AF02卯90、AF029085、AF051540、AF051536、AF052743、AF054269、U92495、U92497、U92498、U92499、U92500、U92501、U92502、U92503、AF051541、X12899、Z48493、Z48489、Z48485、Z48494、Z48487、Z48488、Z48495、Z48490、Z48486、Z48491、Z48492、X66478、X66479、X66477、X66480、X81110、X79056、X78467、X81111、X78802、Z14281/82、Z14273/74、Z14275/76、Z14261/62、Z14265/66、Z14277〃8、Z14283/84、Z14271〃2、Z14269"0、Z14263/64、Z14259/60、Z14257/58、Z14293/94、Z14291/92、Z14279/80、Z14289/90、Z14287/88、Z14267/68、Z14285/86、L02929、X77423、X77424、X77433、X77426、X77428、X77430、X77427、X77429、X77425、X77432、X77431、X77422、Z48024/25、Z48032/33、Z48020/21、Z48022/23、Z48028/29、Z48016/17、Z48012/13、Z48014/15、Z48018/19、Z48026/27、U31060、U31061、U31062、U31063、U31064、U31065、U31066、U31067、U93898、U93899、U93900、U93901、U93902、U93903、U93904、U93905、U93906、U93907和U93908。或者，生產菌株可以是莢膜缺陷型菌株。莢膜缺陷型菌株提供的囊泡疫苗給予對象時能降低引發顯著自身抗體應答的風險(例如，因為產生了能與宿主細胞表面的唾液酸交叉反應的抗體)。本文所用的"莢膜缺陷"或"缺乏莢膜多糖"表示細菌表面莢膜多糖水平低于天然產生的菌株，或者菌株經遺傳修飾時，細菌表面莢膜多糖水平低于衍生該莢膜缺陷型菌株的親代菌株。莢膜缺陷型菌株包括表面莢膜多糖產生降低至少10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、75%、80%、85%、90%或以上的菌株，也包括細菌表面莢膜多糖不可檢測(例如，利用抗莢膜多糖抗體的全細胞ELISA)的菌株。莢膜缺陷型菌株包括因天然產生的或重組產生的經遺傳修飾而缺乏莢膜的那些菌株。本領域已知天然產生的莢膜缺陷型菌株(參見，例如Dolan-Livengood等，J.Infect.Dis.(2003)187(10):1616-28)以及鑒定和/或產生莢膜缺陷型菌株的方法(參見，例如Fisseha等，(2005)Infect.Immun.73(7):4070-4080;Stephens等，(1991)InfectImmun59(11):4097-102;Frosch等，(1990)MolMicrobiol.19904(7):1215-1218)。修飾奈瑟球菌宿主細胞以降低莢膜多糖產生可包括修飾參與莢膜合成的一個或多個基因，與修飾前的親代細胞相比，修飾基因能降低莢膜多糖的水平。這種遺傳修飾包括改變一個或多個莢膜生物合成基因的核苷酸和/或氨基酸序列，使得該菌株缺乏莢膜(例如，因為一個或多個莢膜生物合成基因中有一個或多個(核苷酸)插入、缺失、取代等)。莢膜缺陷型菌株可缺乏一個或多個莢膜基因或所述基因無功能。特別感興趣的是唾液酸生物合成有缺陷的菌株。這種菌株產生的囊泡可降低產生引發與人唾液酸抗原起交叉反應的抗-唾液酸抗體的風險，還可改進生產安全性。唾液酸生物合成缺陷(因天然產生的修飾或工程改造的修飾)菌株可以是唾液酸生物合成途徑的許多不同基因有缺陷。特別感興趣的是N-乙酰葡糖胺-6-磷酸2-差向異構酶基因(稱為synXAAF40537.1或siaAAAA20475)編碼的基因產物有缺陷的菌株，尤其感興趣該基因滅活的菌株。例如，一個實施方式通過破壞功能性synX基因產物的產生來獲得莢膜缺陷型菌株(參見，例如Swartley等，(1994)JBacterid.176(5):1530-4)。也可采用非重組技術從天然產生的菌株獲得莢膜缺陷型菌株，例如用殺菌性抗-莢膜抗體來選擇莢膜多糖減少的菌株。當本發明涉及采用兩種以上菌株時(例如，如下文詳述的那樣，為產生不同菌株囊泡的抗原性組合物)，例如，可選擇特征不同的一種或多種菌株來提供PorA類型不同和/或GNA1870變體群的囊泡。奈瑟球菌宿主細胞中GNA1870的產量如上所述，通常可按照本發明利用天然產生或經修飾的非天然奈瑟球菌菌株制備囊泡，所述囊泡含有足夠的GNA1870蛋白，當給予對象時能產生抗-GNA1870抗體。在一個實施方式中，與表達檢測不到或低水平GNA1870的菌株相比，用于制備本發明囊泡的奈瑟球菌菌株可以是表達較高水平GNA1870的天然菌株。RM1090是產生低水平GNA1870菌株的實例。特別感興趣的天然菌株是其產生的GNA1870水平比低GNA1870產生菌株，例如RM1090的GNA1870產量高1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10倍或更高的菌株。表達高水平GNA1870的天然菌株的實例包括ET-5菌株，例如H44/76、Cu385和MC58。表達低水平或檢測不到水平GNA1870、中間水平GNA1870或高水平GNA1870的菌株的討論可參見Masignani等，2003,JExpMed197:789-199。在具體實施方式中，所述菌株產生的GNA1870水平高于RM1090產生的，比RM1090產生的至少高1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或IO倍或更高。在另一實施方式中，通過重組或非重組技術修飾奈瑟球菌菌株來提供足夠高水平的GNA1870產生。與未修飾的親代細胞的GNA1870產量或菌株RM1090的GNA1870產量相比，這種修飾的菌株通常能提高GNA1870產量1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10倍或更高。該實施方式可利用任何合適的菌株，包括修飾前GNA1870產量低或水平檢測不到的菌株，和與GNA1870檢測不到或水平低的菌株相比，能天然產生高水平GNA1870的菌株。可通過非重組技術，例如接觸化學物質、輻射或其它DNA修飾或破壞試劑等產生修飾的菌株。可通過篩選能產生所需GNA1870水平(例如，與未修飾的親代菌株或GNA1870產量低的細菌(如RM1090)相比，GNA1870水平高，或其水平類似于產生可接受高水平GNA1870的菌株的水平)的菌株來鑒定具有所需蛋白質表達水平，特別是GNA1870產量的修飾菌株。或者，更常是采用重組技術，一般通過引入編碼GNA1870多肽的核酸或操縱內源性GNA1870基因來提高內源性GNA1870表達從而產生修飾的菌株。本領域已知測定GNA1870產量水平的方法。這種方法包括，例如利用抗-GNA1870抗體的Western印跡(任選與光密度掃描輔助的分析聯用)、流式細胞術(例如，FACS)分析、檢測GNA1870RNA水平等。本文有時將無論天然或經遺傳修飾導致GNA1870產量水平較高的菌株稱為GNA1870"過量表達菌株"或稱為"過量表達"GNA1870。遺傳修飾的奈瑟球菌菌株的產量如上所述，通過引入編碼GNA1870多肽的核酸或操縱內源性GNA1870基因來提高內源性GNA1870表達。遺傳修飾奈瑟球菌宿主細胞來提高內源性GNA1870的表達可通過原位改變控制GNA1870表達的調控區來提高內源性GNA1870表達。本領域已知提高內源性奈瑟球菌基因表達的方法(參見，例如WO02/09746)。此外，己知編碼基因組GNA1870變體和亞變體的基因核酸序列，從而不難應用這些方法來上調內源性GNA1870表達。內源性GNA1870可以是GNA1870的任何所需變體組(例如，v.l、v.2、v.3等)或亞變體。對菌株MC58的"標準"v.lGNA1870多肽特別感興趣。對菌株NZ98/294的亞變體GNA1870多肽和菌株2996的v.2GNA1870多肽也感興趣。修飾奈瑟球菌宿主細胞來提高內源性GNA1870產量可包括部分或完全取代控制GNA1870表達的所有或部分內源性基因，與未修飾的親代菌株相比，這種修飾能提高轉錄活性。可利用內源性控制區域中的變異(點突變、缺失和/或插入)和天然產生或修飾的異源啟動子或二者組合來提高轉錄活性。遺傳修飾一般能使轉錄活性高于未修飾的內源性轉錄活性(例如，通過引入強啟動子)，從而提高GNA1870表達。可用于提高GNA1870轉錄產量的典型強啟動子可包括，例如porA、porB、lbpB、tbpB、p110、hpuAB、lgtF、Opa、p110、1st和hpuAB啟動子。作為組成型強啟動子，PorA、RMp和PorB是特別感興趣的。PorB啟動子的活性包含在對應于porB起始密碼子上游的核苷酸-1到-250片段中。本領域可采用各種方法將啟動子引入宿主細胞基因組中，使啟動子與內源性GNA1870編碼核酸操作性相連。例如，(可采用)雙跨越同源重組技術將某啟動子引入編碼序列的上游區域，例如引入GNA1870編碼核酸的起始ATG密碼子上游(5，)約1000bp、約30-970bp、約200-600bp、約300-500bp或約400bp，從而上調(轉錄)。可通過本領域可用的常規方法來確定最佳取代的啟動子。例如，在靶基因上游引入高活性啟動子(如PorA、PorB或Rmp啟動子)。例如，按照vanderEnde等，InfectImmun2000，68:6685-90所述可優化PorA啟動子用于表達。可通過以下方法插入啟動子，例如PCR擴增GNA1870靶基因上游區段、將該上游區段克隆入載體中以及在PCR擴增期間插入合適的限制性位點，或利用天然的限制性位點插入PorA啟動子區段。例如，可克隆GNA1870基因的約700bp上游區段。利用位于該克隆區段內GNA1870啟動子上游適當距離(例如，約400bp)的天然限制性酶切位點插入PorA啟動子區段。可將抗生素(例如，紅霉素)抗性盒插入PorA啟動子再上游的區段內，通過同源重組用該構建物替代野生型上游GNA1870區段。另一方法包括將編碼GNA1870多肽的序列引入在宿主細胞基因組中顯示強轉錄活性的內源性啟動子的下游。例如，可用GNA1870多肽的編碼序列取代Rmp基因的編碼區。該方法的優點是利用高活性的組成型Rmp啟動子來驅動表達。遺傳修飾奈瑟球菌宿主細胞來表達內源性GNA1870可通過將編碼GNA1870多肽的構建物引入奈瑟球菌宿主細胞中來遺傳修飾奈瑟球菌菌株，從而過量表達GNA1870。本文將為表達而引入的GNA1870稱為"外源性"GNA1870。宿主細胞產生內源性GNA1870，與該內源性GNA1870相比，外源性GNA1870可具有相同或不同的氨基酸序列。在該實施方式中用作宿主細胞的菌株能產生任何水平的GNA1870(例如，高水平、中間水平或低水平GNA1870產量)。特別感興趣的是利用選擇的GNA1870產量低水平或檢測不到的菌株，或經修飾而GNA1870產量檢測不到或水平低的菌株。例如，可遺傳修飾宿主細胞以破壞其內源性GNA1870基因，從而使細胞被膜中不產生GNA1870或不存在(因此，從這種修飾的細胞制備的囊泡中不存在可檢測水平)。在其它實施方式中，所述宿主細胞能產生中間水平或高水平的GNA1870(例如，與如RM10卯產生的GNA1870水平相比)。GNA1870多肽可遺傳修飾宿主細胞來表達任何合適的GNA1870多肽，包括GNA1870變體或亞變體。如下文所詳述的那樣，已知許多GNA1870多肽的氨基酸序列；這些序列比對指出變體中的保守殘基，從而能指導對氨基酸的修飾(例如，取代、插入、缺失)。因此，本文所用的"GNA1870多肽"包括天然產生與合成(非天然產生)的多肽，所述合成多肽與天然產生的GNA1870多肽在核苷酸或氨基酸水平有至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更高的序列相同性，其引發的抗體能特異性結合奈瑟球菌細菌全細胞上存在的天然GNA1870多肽。"GNA1870多肽"也包括融合蛋白，例如在N-和/或C-末端連有異源多肽的GNA1870多肽。可遺傳修飾宿主細胞以表達至少1種GNA1870多肽，可修飾宿主菌從而在同一宿主細胞中表達2種、3種、4種或更多種GNA1870多肽。例如，可遺傳修飾一種宿主細胞來表達至少一種GNA1870多肽變體1、至少一種GNA1870多肽變體2和至少一種GNA1870多肽變體3。當表達多種GNA1870多肽因對宿主細胞的毒性而遇到困難時，可從不同啟動子表達不同的GNA1870多肽，從而能進行一系列表達。例如，改變PorA啟動子的-10到-35之間區域的堿基組成和堿基數目應能拓寬表達所需重組蛋白的范圍(vanderEnde等，InfectImmun2000，68:6685-90)。本領域已知編碼本發明所用GNA1870多肽的核酸。合適的GNA1870多肽描述于，例如WO2004/048404;Masignani等，2003JExpMed197:789-799;Fletcher等，InfectImmun20042088-2100;Welsch等，JImmunol2004172:5606-5615;和WO99/57280。GNA1870變體和亞變體的核酸(及氨基酸序歹U)在GenBank中也有提供，登錄號為NC—003112，GeneID:904318(NCBIRef.NP_274866)(腦膜炎奈瑟球菌菌株MC58);AY548371(AAT01290.1)(腦膜炎奈瑟球菌菌株CU385);AY548370(AAT01289.1)(腦膜炎奈瑟球菌菌株H44/76);AY548377(AAS56920.1)(腦膜炎奈瑟球菌菌株M4105);AY548376(AAS56919.1)(腦膜炎奈瑟球菌菌株M1390);AY548375(AAS56918.1)(腦膜炎奈瑟球菌菌株N98/254);AY548374(AAS56917.1)(腦膜炎奈瑟球菌菌株M6190);AY548373(AAS56916.1)(腦膜炎奈瑟球菌菌株4243);和AY548372(AAS56915.1)(腦膜炎奈瑟球菌菌株BZ83)。圖7分別是腦膜炎奈瑟球菌菌株MC58、951-5945和M1239的GNA1870變體1、2和3的示范性氨基酸序列的比對(WO2004/048404)。不成熟的GNA1870蛋白包含約19個殘基的前導序列，各變體通常含有共價連接于脂質部分的N-末端半胱氨酸。在天然成熟的蛋白質中該半胱氨酸殘基常脂質化。"l"表明成熟蛋白質的第一個氨基酸，負數表示的氨基酸是前導序列的一部分。灰色和黑色背景分別表示保守和相同的氨基酸殘基。GNA1870多肽，包括非天然產生的變體的其它氨基酸序列見圖8A-8H和9。GNA1870可以是脂質化或非脂質化的。通常優選GNA1870是脂質化的，從而能將該多肽安裝在膜中。可通過表達具有N-末端信號肽的GNA1870多肽(該信號肽可通過二酰基甘油基轉移酶直接脂質化)，然后利用脂蛋白特異性(II型)信號肽酶切割來制備脂質化的GNA1870。本發明所用的GNA1870多肽包括氨基酸序列與天然GNA1870多肽不同的非天然產生(人工或突變型)的GNA1870多肽，但這些多肽存在于奈瑟球菌宿主細胞的膜中，因而由該宿主制備的囊泡含有的GNA1870能呈遞感興趣的表位，最好是殺菌表位并能提供抗-GNA1870抗體應答。在一個實施方式中，GNA1870多肽是變體1(v.l)或變體2(v.2)或變體3(v.3)GNA1870多肽，包含感興趣的v.l、v.2和v.3的亞變體，包括v.l的亞變體(參見，例如Welsch等，JImmunol2004172:5606-5615)。在一個實施方式中，GNA1870含有需要疫苗接種(對象)群所在地菌株中最流行的GNA1870的氨基酸序列。本發明所用的GNA1870多肽也包括融合蛋白，所述融合蛋白包含在N-末端或C-末端連有融合伴侶的GNA1870多肽。感興趣的融合伴侶包括，例如谷胱甘肽S轉移酶(GST)、麥芽糖結合蛋白(MBP)、His-標簽等以及其它蛋白質，特別是脂蛋白的前導肽(例如，可用感興趣的另一前導肽替代N-末端半胱氨酸前的氨基酸序列)。可采用本領域熟知的技術鑒定其它GNA1870多肽編碼核酸，其中可根據與己知GNA1870多肽的氨基酸序列相似性來鑒定GNA1870多肽。這些GNA1870多肽通常在核苷酸或氨基酸水平具有至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更高的序列相同性。可采用本領域熟知的核酸或氨基酸序列比對和比較方法來測定序列相同性。比較較長的序列可能需要更精密的方法來最佳比對兩條序列。為對齊比較窗口，可通過以下算法進行序列的最佳比對Smith和Waterman((1981)Adv.Appl.Math.2:482)的局部同源性算法，Needleman和Wunsch((1970)J.MoLBiol.48:443)的同源性比對算法，Pearson和Lipman((1988)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)85:2444)的相似性方法檢索，這些算法的計算機化執行儀器(WisconsinGeneticsSoftwarePackageRelease7.0中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.，Madison,WI)或通過目測，選擇各種方法得到的最佳比對(即，導致比較窗口內序列相似性百分比最高)。兩條或更多條核酸或多肽序列的說明中所用的術語"相同"或"相同性"百分比指當采用以下序列比較算法之一或通過目測檢測來比較和比對兩條或更多條序列或子序列的最大一致性時，所述序列相同或有特定百分比的氨基酸殘基或核苷酸相同。當釆用以下序列比較算法之一或通過目測檢測來比較和比對最大一致性時，感興趣的多肽包括至少有60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多的核苷酸或氨基酸殘基相同的多肽。具有序列相同性的區域最好為序列長度至少約10、20、30、40、50、60、70、80或100個連續殘基的區域。在一最優選的實施方式中，通過參比多肽編碼區全長序列的比較來測定序列相同性。對于序列比較，通常將一條序列用作與測試序列比較的參比序列(例如，天然產生的GNA1870多肽序列)。當采用序列比較算法時，將測試和參比序列輸入計算機，設定子序列坐標(如果需要)，和設定序列算法程序參數。然后序列比較算法根據設定的程序參數計算測試序列與參比序列的序列相同性百分比。為比較，可采用例如以下算法進行序列的最佳比對Smith和Waterman(Adv.Appl.Math.2:482，(1981))的局部同源性算法，Needleman和Wunsch(J.MoLBiol.48:443，(1970))的同源性比對算法，Pearson和Lipman(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)85:2444，(1988))的相似性方法檢索，這些算法的計算機化執行儀器(WisconsinGeneticsSoftwarePackageRelease7.0中的GAP、BESTFIT、FASTA禾口TFASTA，GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.，Madison,WI)，或通過目測(通常可參見CurrentProtocolsinMolecularBiology(《分子生物學最新方法》)，F.M.Ausubel等編，CurrentProtocols,GreenePublishingAssociates,Inc.和JohnWiley&Sons,Inc.的合資公司，(1995增刊)(Ausubel))。適用于測定序列相同性和序列相似性百分比的算法實例是分別描述于Altschul等，(1990)J.Mol.Biol.215:403-410和Altschuel等，(1977)NucleicAcidsRes.25:3389-3402的BLAST和BLAST2.0算法。公眾可通過生物技術信息國家中心(http:〃www.ncbi.nlm,nih.gov/)獲得進行BLAST分析的軟件。該算法包括首先通過在查詢序列中鑒定長度為W的短字符來鑒定高評分序列配對(HSP)，將這些字串與數據庫序列中相同長度的字符比對時符合或滿足某些正閾值評分T。T稱為近鄰字符評分閾值(Altschul等，同上)。這些原始近鄰字符命中(wordhit)作為啟動檢索的種子來找尋含有它們的較長HSP。然后使這些字符命中沿著各序列雙向延伸，以使累積比對評分增加。對于核苷酸序列，用參數M(—對匹配殘基的獎勵評分；恒大于O)和N(錯配殘基的罰分；恒小于O)計算累積評分。對于氨基酸序列，用評分矩陣來計算累積評分。當出現以下情況時各方向的字符選中延伸停止累積比對評分從其達到的最高值下降X;因累積了比對的一個或多個負評分殘基導致累積評分降至0或0以下；或者到達二列之一的末端。BLAST算法參數W、T和X決定比對的靈敏度和速度。BLAST程序(用于核苷酸序列)默認字長(W)為11、期望值(E)為10、M=5、N=-4，并進行雙鏈比較。對于氨基酸序列，BLAST程序默認字長(W)為3、期望值(E)為10并采用BLOSUM62評分矩陣(參見Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89:10915，(1989))。除計算序列相同性百分比外，BLAST算法也可對兩條序列間的相似性進行統計學分析(參見，例如Karlin和Altschul，Proc.Nat，l.Acad.Sci.USA，90:5873-5787，(1993))。BLAST算法提供的相似性測量值之一是最小總概率(P(N))，其指示兩條核苷酸或氨基酸序列間發生隨機匹配的概率。例如，如果在測試核酸與參比核酸的比較中最小總概率小于約0.1，更優選小于約0.01，最優選小于約0.001，則可認為該核酸與參比核酸相似。如下所述，兩條核酸序列或多肽具有序列相同性的另一表現是第一核酸編碼的多肽與第二核酸編碼的多肽能發生免疫學交叉反應。因此，例如當兩條多肽僅因保守性取代而不同時，一條多肽通常與第二條多肽具有序列相同性。兩條核酸序列具有序列相同性的另一表現是該兩分子在在嚴謹條件下能彼此雜交。可按照本領域的標準方法(參見，例如Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual(《分子克隆實驗室手冊》)，第二版，(1989)，冷泉港，紐約)選擇一組具體的雜交條件。嚴謹性雜交條件的實例是在5(TC或更高，用O.lXSSC(15mM氯化鈉/1.5mM檸檬酸鈉)雜交。嚴謹雜交條件的另一實例是42。C在含50%甲酰胺、5XSSC(150mMNaCl，15mM檸檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉(pH7.6)、5XDenhardt溶液，10%硫酸葡聚糖和20mg/ml變性的剪切鮭魚精子DNA的溶液中培育過夜，然后在65'C用0.1XSSC洗滌濾膜。嚴謹性雜交條件是嚴謹性至少與以上代表性條件相同的雜交條件，其中如果所述條件是至少約80%,通常是至少約90%嚴謹，則可認為這些條件至少與上述的具體嚴謹性條件同樣嚴謹。也可采用本領域已知的其它嚴謹性雜交條件來鑒定本發明該具體實施方式的核酸。不同的殘基位置最好是因保守性氨基酸取代而不同。保守性氨基酸取代指具有相似側鏈的殘基的互換。例如，具有脂族側鏈的一組氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；具有脂族-羥基側鏈的一組氨基酸是絲氨酸和蘇氨酸；具有含酰胺側鏈的一組氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳族側鏈的一組氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有堿性側鏈的一組氨基酸是賴氨酸、精氨酸和組氨酸；具有含巰基側鏈的一組氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。優選的保守性氨基酸取代分組是纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、賴氨酸-精氨酸、丙氨酸-纈氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。將遺傳物質引入奈瑟球菌宿主細胞的載體和方法本領域己知不難采納用于提供奈瑟球菌宿主細胞的遺傳修飾來表達外源性GNA1870多肽的方法和組合物。示范性方法和載體見WO02/09746和O'Dwyer等，InfectImmun2004，72:6511-80。將遺傳物質轉移入奈瑟球菌宿主的方法包括，例如綴合、轉化、電穿孔、磷酸鈣方法等。轉移方法應能穩定表達引入的GNA1870編碼核酸。GNA1870編碼核酸可作為可遺傳附加型元件(例如，質粒)提供，或可整合入基因組。根據所進行的重組操作的類型，組合物中合適的載體可以不同。整合性載體可以是條件復制型或自殺性質粒、細菌噬菌體、轉座子或通過限制性水解或PCR擴增獲得的線形DNA片段。可通過可選擇性遺傳標記，例如賦予對抗生素(例如，卡那霉素、紅霉素、氯霉素或慶大霉素)抗性的基因、賦予對重金屬和/或毒性化合物抗性的基因或補充營養缺陷型突變的基因(例如，pur、leu、met、aro)來選擇重組體。在一個實施方式中，載體是以能在大腸桿菌和腦膜炎奈瑟球菌中自發復制的含可選擇藥物抗性標記的附加型質粒為基礎的表達載體。這種"穿梭載體"的一個實例是質粒pFP10(Pagotto等，Gene2000244:13-19)。制備腦膜炎奈瑟球菌囊泡本發明所用的抗原性組合物通常包含由天然或因遺傳修飾(例如，因表達重組GNA1870)而能表達可接受水平GNA1870的奈瑟球菌細胞制備的囊泡。本文所用的"囊泡"包括外膜囊泡以及微囊泡(也稱為細胞泡(bleb))。在一實施方式中，所述抗原性組合物包含由腦膜炎奈瑟球菌屬培養菌株的外膜制備的外膜囊泡(OMV)。可通過以下步驟獲得OMV:將腦膜炎奈瑟球菌培養在肉湯或固體培養基中，最好通過分離細菌細胞與培養基(例如，通過過濾或低速離心來沉淀細胞等)，裂解細胞(例如，通過加入洗滌劑、滲透休克、超聲波處理、空腔化、勻漿等)，分離外膜組分與細胞質分子(例如，通過過濾；或通過差別性沉淀或使外膜和/或外膜囊泡凝聚；或通過利用能特異性識別外膜分子的配體的親和分離方法；或通過高速離心來沉淀外膜和/或外膜囊泡等)，利用外膜組分制備OMV。在另一實施方式中，所述抗原性組合物含有在所述腦膜炎奈瑟球菌屬細菌的培養期間釋放的微囊泡(MV)或細胞泡。可通過以下步驟獲得MV:將腦膜炎奈瑟球菌培養在肉湯培養基中，分離完整的細胞與肉湯培養基(例如，通過過濾或低速離心從而只沉淀細胞但不沉淀較小的細胞泡等)、然后收集不含細胞培養基的MV(例如，通過過濾，差別性沉淀或使MV凝聚，或通過高速離心來沉淀細胞泡等)。通常可以根據培養基中產生的細胞泡含量來選擇用于制備MV的菌株(例如，可培養數量合理的細菌來制備適合于本文所述方法中分離和給予的細胞泡)。能產生高水平細胞泡的示范性菌株描述于PCT公布號WO01/34642。除了根據細胞泡產量，也可根據NspA產量選擇用于MV制備的菌株，優選能產生較高水平NspA的菌株(具有不同NspA產量水平的腦膜炎奈瑟球菌的實例可參見，例如Moe等，1999，Infect.Immun.，67:5664)。在另一實施方式中，所述抗原性組合物含有一種菌株，或2、3、4、5或更多種菌株的囊泡，對于GNA1870或PorA之一或二者，這些菌株彼此可以是同源的或異源的，通常是異源的。一個實施方式用表達l、2、3、4、5、6、7、8、9或10種或更多種GNA1870蛋白的菌株制備所述囊泡，這些蛋白可以是不同的變體(v.l、v.2、v.3)或亞變體(例如，v.l、v.2或v,3的亞變體)。在另一實施方式中，所述抗原性組合物包含相同或不同菌株的OMV和MV混合物。在這種實施方式中，可將不同菌株的囊泡作為混合物給予。此外，可將相同或不同菌株的OMV和MV作為混合物給予。除囊泡(OMV和/或MV)外，本發明抗原性組合物中可包含分離的抗原或抗原的特定組合。降低脂質毒性需要時(例如，用于產生囊泡的菌株伴有內毒素或特別高水平的內毒素)，可任選處理這種囊泡以減少內毒素，例如降低給藥后的毒性。如下文所述，雖然不理想，但可用合適的洗滌劑(例如，BRIJ-96、脫氧膽酸鈉、月桂酰肌氨酸鈉(sodiumlauoylsarcosinate)、EmpigenBB、TritonX-IOO、吐溫20(聚氧乙烯失水山梨糖醇單月桂酸酯(sorbitanmonolauratepolyoxyethylene))、吐溫80，濃度0.1-10%，優選0.5-2%和SDS)萃取來減少內毒素。利用洗滌劑萃取時，最好利用除脫氧膽酸鹽以外的洗滌劑。在一些實施方式中，不利用洗滌劑制備囊泡，例如不用脫氧膽酸鹽或其它洗滌劑。在特別感興趣的實施方式中，不用洗滌劑制備抗原性組合物的囊泡。雖然可用洗滌劑處理除去內毒素活性，但在囊泡制備期間萃取可能消除天然GNA1870脂蛋白。因此，采用無需洗漆劑的技術降低內毒素活性特別理想。一個方法是利用內毒素(脂多糖，LPS)產生較少的菌株，從而無需在用于人體前從最終制品中除去內毒素。例如，可以用脂寡糖或在疫苗中可能有害的其它抗原(例如，Rmp)減少或消除的奈瑟球菌突變株來制備囊泡。例如，可用經遺傳修飾而使脂質A的毒性活性降低或檢測不到的腦膜炎奈瑟球菌菌株制備囊泡。例如，可遺傳修飾這種菌株的脂質A生物合成(Steeghs等，InfectImmun1999，67:4988-93;窗derLey等，InfectImmun2001，69:5981-90;Steeghs等，JEndotoxinRes2004，10:113-9)。突變負責最終修飾步驟的基因導致溫度敏感(htrB)或容許的(msbB)表型。造成這些基因表達降低(或這些基因的產物減少或無活性)的突變可導致脂質A毒性改變。非月桂酰化(htrB突變體)或非肉豆蔻酰化(msbB突變體)的脂質A毒性低于野生型脂質A。脂質A4'-激酶編碼基因(lpxK)的突變也能降低脂質A的毒性活性。也可通過在參與多粘菌素B耐受(這種耐受與脂質A的4'磷酸基上加入氨基阿拉伯糖有關)的基因/基因座中引入突變來改變LPS的毒性活性。這些基因/基因座可以是編碼UDP-葡萄糖脫氫酶的pmrE，或參與氨基阿拉伯糖合成和轉移的許多腸細菌共有的抗菌肽耐受基因的某區域。存在于該區域的基因pmrF編碼多砲醇-流速酯甘露糖基(dolicol-phosphatemanosyl)轉移酶(GunnJ.S,，Kheng，B.L.，KruegerJ.，KimK.，GuoL.，HackettM.，MillerS.I.，1998.Mol.Microbiol.27:1171-1182)。PhoP-PhoQ調節系統中的突變可導致在4'磷酸上加入氨基阿拉伯糖和2-羥基肉豆蔻替代肉豆蔻(肉豆蔻羥基化)，所述系統是磷酸中繼兩組分調節系統(例如，PhoP組成型表型，PhoP。)或低]^§++環境或培養條件(該條件k激活PhoP-PhoQ調節系統)。該修飾的脂質A顯示刺激人內皮細胞表達E-選凝素和人單核細胞分泌TNF-a的能力降低。多粘菌素B耐受菌株也適用于本發明，因為這些菌株顯示LPS毒活性降低(參見，例如vanderLey等，1994，干ll于ProceedingsoftheninthinternationalpathogenicNeisseriaconference(第9屆致病性奈瑟球菌大會論文集)，TheGuildhall,Winchester,英格蘭)。或者，可將能模擬多粘菌素B結合活性的合成肽加入所述抗原性組合物以降低LPS毒性活性(參見，例如Rustici等，1993，Science259:361-365;Porro等，ProgClinBiolRes.，1998，397:315-25)。也可通過選擇培養條件來減少內毒素。例如，將菌株培養在每升含0.1mg-100mg氨基阿拉伯糖的生長培養基中來降低脂質毒性(參見，例如WO02/097646)。制劑用作疫苗的免疫原性組合物含有免疫有效量的抗原，特別是免疫有效量的GNA1870以及任何其它相容組分(如果需要)。"免疫有效量"表示將該用量以單一劑量或連續劑量的一部分給予個體時能有效引發治療作用或預防作用。該用量根據待治療個體的健康和身體狀況、年齡、待治療個體的分類學組(例如，非人靈長類、靈長類、人等)、個體的免疫系統合成抗體的能力、所需的保護程度、疫苗制劑、主治醫師對醫學狀況的評估和其它相關因素而不同。預計該用量范圍較寬，能通過常規試驗測定。劑量方案可以是單劑量方案或在不同時間給予單位劑型的抗原性組合物的多劑量方案(例如，包括加強劑量)。本文所用的術語"單位劑型"指適合人和動物對象的單位劑量的物理上不連續的單位，各單位含有足以產生所需效果的預定含量的本發明抗原性組合物，提供的組合物可與藥學上可接受的賦形劑(例如，藥學上可接受的稀釋劑、載體或運載體)結合。該疫苗可與其它免疫調節劑聯合給予。用藥學上可接受的稀釋劑(例如水溶液，往往是鹽水溶液)、半固體形式(例如，凝膠)或粉末形式配制來提供待給予的抗原性組合物。這種稀釋劑可以是惰性的，雖然本發明組合物也可包含佐劑。可用于人體的已知合適佐劑的實例包括但不一定限于明礬、磷酸鋁、氫氧化鋁、MF59(4.3%w/v角鯊烯、0.5%w/v吐溫80、0.5%w/v司盤85)、含CpG的核酸(其中胞嘧啶未甲基化)、QS21、MPL、3DMPL、Aquilla提取物、ISCOMS、LT/CT突變體、聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)(PLG)微粒、QuilA、白介素等。對于實驗動物，可利用弗氏(佐劑)、N-乙酰基-胞壁酰-L-蘇氨酰-D-異谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-正-胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺(CGP11637，稱為正-MDP)、N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰-0-異谷氨酰基丄-丙氨酸-2-(1'-2'-二棕櫚酰-511-甘油基-3-羥基磷酰氧基)-乙胺(CGP19835A，稱為MTP-PE)和用2%角鯊烯/吐溫80乳液配制的RIBI，其含有提取自細菌的三種組分單磷酰脂質A、海藻糖二霉菌酸酯和細胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)。可通過檢測針對免疫原性抗原的抗體量來測定佐劑的效力。能提高該組合物效力的其它示范性佐劑包括但不限于(1)水包油乳劑(含或不含其它特異性免疫刺激劑，例如胞壁酰肽(見下文)或細菌細胞壁組分)，例如(a)含5%角鯊烯、0.5%吐溫80和0.5%司盤85(任選含有MTP-PE)的MF59(WO90/14837;Vaccinedesign:thesubunitandadjuvantapproach(《疫苗設計亞單位和佐劑方法》)第10章，Powell和Newman編，PlenumPress1995)，利用微流化儀配制為亞微米顆粒，(b)含10。/。角鯊烯、0.4%吐溫80、5%普朗尼克嵌段聚合物L121和thr-MDP的SAF，利用微流化儀配制為亞微米乳液或旋振產生粒徑較大的乳液，和(c)含2%角鯊烯、0.2%吐溫80和一種或多種細菌細胞壁組分，例如單磷脂酰脂質A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和細胞壁骨架(CWS)，優選MPL+CWS(DETOXTM)的RIBI佐劑系統(RAS)，(RibiImmunochem，Hamilton,MT);(2)皂苷佐劑，例如可利用QS21或STIMULON(CambridgeBioscience,Worcester,MA)或由其產生的顆粒，如ISCOM(免疫刺激復合物)，所述ISCOM可不含其它洗滌劑，例如見WO00/07621;(3)完全弗氏佐劑(CFA)和不完全弗氏佐劑(IFA);(4)細胞因子，例如白介素(如，IL國1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12(W099/44636)等)、干擾素(如干擾素力、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、腫瘤壞死因子(TNF)等；(5)單磷酰脂質A(MPL)或3-0-脫酰基MPL(3dMPL)，例如見GB-2220221、EP-A-0689454，當與肺炎球菌糖聯用時任選基本上不含明礬，例如WO00/56358;(6)3dMPL與，例如QS21和/或水包油乳液的混合物，如EP隱A誦0835318、EP-A-0735898、EP-A-0761231;(7)含有CpG基序的寡核苷酸[Krieg;Vaccine2000,19,618-622;Krieg;CurropinMolTher20013:15-24;Roman等，Nat.Med，1997，3，849-854;Weiner等，PNASUSA,1997，94，10833-10837;Davis等，J.Immunol,1998，160，870-876;Chu等，J.Exp.Med，1997，186，1623-1631;Lipford等，Ear,J,Immunol,1997，27，2340-2344;Moldoveami等，Vaccine,1988，16，1216-1224;Krieg等，Nature,1995，374，546-549;Klinman等，PNASUSA，1996，93，2879-2883;Ballas等，J.Immunol,1996，157，1840-1845;Cowdery等，J.Immunol,1996，156，4570-4575;Halpern等，CellImmunol,1996，167，72-78;Yamamoto等，Jpn.J.CancerRes.，1988，79，866-873;Stacey等，J.Immunol,1996，157，2116-2122;Messina等，J.Immunol,1991，147，1759-1764;Yi等，J.Immunol,1996，157，4918-4925;Yi等，J.Immunol,1996，157，5394-5402;Yi等，J,Immunol,1998，160，4755-4761;和Yi等，J.Immunol,1998，160，5898-5906;國際專利申i青WO96/02555、W098/16247、WO98/18810、WO98/40100、W098/55495、W098/37919和W098/52581],即含有至少一個CG二核苷酸，其中胞嘧啶未甲基化；(8)聚氧乙烯醚或聚氧乙烯酯，例如見W099/52549;(9)聚氧乙烯山梨糖醇酯表面活性劑與辛苯聚醇的混合物(WO01/21207)或聚氧乙烯垸基醚或酯表面活性劑與至少一種其它非離子表面活性劑，例如辛苯聚醇的混合物(WO01/21152);(10)皂苷和免疫刺激性寡核苷酸(例如，CpG寡核苷酸)(WO00/62800);(11)免疫刺激劑和金屬鹽顆粒，例如見WO00/23105;(12)皂苷和水包油乳劑，例如見W099/11241;(13)皂苷(例如，QS21)+3dMPL+IM2(任選+類固醇)，例如見W098/57659;(14)用作免疫剌激劑來提高所述組合物效力的其它物質。胞壁酰肽包括N-乙酰基-胞壁酰-L-蘇氨酰-D-異谷氨酰胺(thr-MDP)、N-25乙酰基-正胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺(正-MDP)、N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰基-L-丙氨酸-2-(l'-2'-二棕櫚酰-sn-甘油基-3-羥基磷酰氧基)-乙胺(MIP-PE)等。抗原性組合物可與常規藥學上可接受的賦形劑，例如藥物級的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石粉、纖維素、葡萄糖、蔗糖、碳酸鎂等混合。如果需要，該組合物可含有藥學上可接受的輔助物質來模擬生理條件，例如pH調節和緩沖劑、毒性調節劑等，例如乙酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、乳酸鈉等。這些制劑中抗原的濃度變化很大，基本上按照所選擇的具體給藥方式和患者的需要根據液體體積、粘度、體重等來選擇。得到的組合物可以是溶液、混懸液、片劑、丸劑、膠囊、粉末、凝膠、乳膏、洗劑、軟膏、氣溶膠等形式。該藥物制劑中本發明抗原性組合物的蛋白質濃度變化很大，即以體重計，從小于約0.1%，通常是或至少是約2%到多達20%-50%或更高，基本上按照所選擇的具體給藥方式，根據液體體積、粘度等來選擇。免疫接種總體上，本發明提供將一種或多種本發明抗原性組合物給予哺乳動物對象(例如，人)，從而引發抗奈瑟球菌種細菌多種菌株的保護性免疫應答，進而引發抵御這種細菌所致疾病的保護作用的方法。具體地說，本發明方法能提供抵御1、2、3、4或更多種腦膜炎奈瑟球菌種菌株的免疫保護性免疫應答，所述菌株在血清群、血清型、血清亞型或GNA1870多肽的至少一種中有差異(例如，不同的GNA1870變體和/或亞變體)。特別感興趣的是誘導抵御血清群B腦膜炎奈瑟球菌多種菌株的保護性免疫應答，特別是所述菌株在血清亞型上有差異(例如，含有異源PorA)。就PorA和/或GNA1870而言，誘導抵御彼此異源的菌株的保護性免疫應答也是特別感興趣的。本發明抗原性組合物可含或不含添加的賦形劑，通過口服、鼻部、鼻咽部、胃腸外、腸道、胃部、局部、透皮、皮下、肌肉內，以片劑、固體、粉末、液體、氣溶膠形式局部或全身性給予。本領域技術人員已知或明白的制備可胃腸外給藥的組合物的實際方法更詳細地描述于例如Remington'sPharmaceuticalScience(《雷明頓藥物科學》)，第15版，MackPublishingCompany，Easton，賓夕法尼亞，(1980)的出版物。口服給藥可能需要保護組合物以避免(被)消化是公認的。一般通過將組合物與可使其耐受酸和酶水解的物質結合或將其包裝在適當的耐受載體中來實現。本領域熟知避免消化的保護方法。將該組合物給予處于患奈瑟球菌疾病風險的哺乳動物來預防或至少使該疾病的發生及其并發癥部分停止。足以實現此目的的用量定義為"治療有效量"。治療有效量取決于，例如抗原性組合物、給藥的方式、患者的體重和總體健康狀況和處方醫師的判斷。給予單一劑量還是多劑量該抗原組合物取決于患者所需和可能耐受的劑量和頻率以及給藥途徑。本文所述抗原性組合物可含有囊泡(例如，OMV和MV)的混合物，所述囊泡可以來自相同或不同菌株。在另一實施方式中，所述抗原性組合物可包含來自2、3、4、5或更多種菌株的囊泡混合物，所述囊泡可以是OMV、MV或二者。給予有效量的抗原性組合物以在宿主中引發免疫應答，特別是體液免疫應答。所述混合物的免疫接種用量通常為約0.001mg-約1.0mg/70公斤患者，更常見約0.001mg-約0.2mg/70公斤患者。可用的劑量是0.001至約10mg/患者/天，特別是當抗原給予至封閉部位并不進入血流時，例如不進入體腔或不進入器官內腔。口服、鼻部或局部給藥基本上可采用較高劑量(例如，10-100mg或更高)。初次給予混合物后可用相同或不同的混合物進行加強免疫，優選至少加強一次，更常見加強兩次。在一個實施方式中，用含有變體免疫優勢抗原(用已受奈瑟球菌感染的不同宿主動物的抗血清常規檢測到的主要抗原；代表性例子包括通道蛋白A、通道蛋白B、菌毛蛋白、NspA、磷脂、多糖、脂多糖、菌毛蛋白、OmpA、Opa、Opc等)和/或變體GNA1870蛋白的奈瑟球菌菌株制備用于初免和加強免疫的抗原性組合物。這些菌株的莢膜分子也不同，如它們的血清群所反映的那樣。目前可通過檢測已知能特異性識別通道蛋白分子的一組己知單克隆(抗體)中的哪一種能與未知菌株結合來檢測區分血清型和血清亞型(Sacchi等，1998,Clin.Diag.Lab.Immunol.5:348)。也可能將來會鑒定到其它這樣的單克隆。本發明特別考慮了采用任何新單克隆(抗體)測定到任何新的血清型和血清亞型(菌株)的應用。此外，不僅可通過與單克隆抗體相互作用，還可通過缺乏和/或存在所定義的肽殘基和肽表位從結構上定義血清型和血清亞型(Sacchi等，2000，J.Infect.Dis.182:1169)。本發明特別包括根據通道蛋白(已知的或以后發現的)的結構特征區分血清型和血清亞型。在另一實施方式中，所給予的抗原性組合物由2、3、4、5或更多種菌株制備，就GNA1870或PorA之一或二者而言，所述菌株彼此可以是同源或異源，通常是異源的。在一個實施方式中，由表達不同GNA1870蛋白的菌株制備囊泡，所述GNA1870蛋白可以是不同變體(v.1、v.2、v.3)或亞變體(例如，v.l、v.2或v.3的亞變體)產生的。在另一實施方式中，就PorA而言，由彼此異源的菌株制備囊泡。在特別感興趣的實施方式中，由在遺傳學上彼此不同的奈瑟球菌菌株(例如，所述菌株屬于不同血清型和/或血清亞型；表達不同的PorA蛋白；表達不同的GNA1870變體或亞變體；和/或也任選屬于不同的莢膜血清群)制備囊泡。可利用這種囊泡將抗原性組合物制備為至少2、3、4或更多種遺傳學多樣性菌株的囊泡混合物。例如，用于制備和給予抗原性組合物的第二種奈瑟球菌菌株的GNA1870蛋白質和/或PorA不同于用于產生該囊泡的第一種菌株。可任選由與第二種菌株遺傳學不同的奈瑟球菌菌株(例如，所述菌株屬于不同血清型和/或血清亞型；表達不同的GNA1870變體或亞變體；表達不同的PorA蛋白；和/或屬于不同的莢膜血清群)制備第二、第三和其它給予的抗原性組合物。例如，用于制備第三抗原性組合物的第三種菌株可以與用于制備第一和第二抗原性組合物的第一和第二種菌株在遺傳學上不同，但是在一些實施方式中，不必與第一菌株在遺傳學上不同。本發明也考慮了可從奈瑟球菌，特別是腦膜炎奈瑟球菌的一種或多種菌株獲得的抗原性組合物，所述菌株通過已知方法(參見，例如美國專利號6,013,267)經遺傳工程改造能表達編碼GNA1870的一種或多種核酸。宿主細胞可表達內源性GNA1870多肽，或可(經)修飾或選擇，從而不表達任何可檢測的內源性GNA1870多肽。通過重組技術在宿主細胞中表達的GNA1870多肽(即，外源性GNA1870多肽)可以是與內源性GNA1870多肽相同或不同變體類型。可進一步修飾宿主細胞使其表達感興趣的其它抗原，例如通道蛋白A、通道蛋白B、NspA、菌毛蛋白或其它奈瑟球菌蛋白。此外，本發明抗原性組合物可含有其它奈瑟球菌抗原，例如PCT公布號WO99/24578、WO99/36544、WO99/57280、WO00/22430和WO00/66791所例舉的以及這種蛋白的抗原性片段。所述抗原性組合物通常給予未接觸過奈瑟球菌，特別是腦膜炎奈瑟球菌的免疫學原初哺乳動物。在一具體實施方式中，所述哺乳動物是約5歲或更小的人類兒童，優選約兩歲或更小，所述抗原組合物在一個或多個以下時間給予出生后兩周，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11個月，或1年或15、18或21個月，或在2歲、3歲、4歲或5歲時。一般最好在疾病癥狀的首次體征出現前，或在可能或實際接觸奈瑟球菌首次出現體征時給予任何哺乳動物。被動免疫力本發明也考慮了免疫接種本發明抗原性組合物產生的免疫保護性抗體及其應用方法。可將這種抗體給予個體(例如，人患者)來提供抵御奈瑟球菌疾病的被動免疫力，預防感染或疾病發生，或作為改善己患疾病患者的臨床結局(例如，降低并發癥，例如休克的發生率，降低死亡率或降低發病率，例如耳聾)的治療劑。給予除產生抗體的物種以外物種的對象的抗體往往具有免疫原性。因此，例如將鼠源或豬源抗體給予人往往會誘導針對該抗體的免疫應答。可通過將該抗體的一部分或全部改變為人類特征性序列而分別產生嵌合型或人抗體可降低該抗體的免疫原性。嵌合型抗體是含有人和非人部分的免疫球蛋白分子。更具體地說，人源化嵌合抗體的抗原結合區(或可變區)得自非人來源(例如，鼠)，嵌合型抗體的恒定區(賦予免疫球蛋白生物學效應物功能)得自人源。嵌合型抗體應具有非人抗體分子的抗原結合特異性和人抗體分子賦予的效應物功能。本領域技術人員熟知可產生嵌合型抗體的許多方法(參見，例如美國專利號5,502,167;5,500,362;5,491,088;5,482,856;5,472,693;5,354,847;5,292,867;5,231,026;5,204,244;5,202,238;5,169,939;5,081,235;5,075,431和4,975,369)。另一方法是通過重組DNA技術連接非人抗體的CDR區與人(抗體)恒定區來產生人源化抗體。參見Queen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:10029-10033(1989)和WO90/07861。在一個實施方式中，用重組DNA載體轉染細胞系來產生抗本發明肽的抗體。新的重組DNA載體含有替代該細胞系中編碼免疫球蛋白恒定區的全部或一部分基因(例如，替代基因可編碼人免疫球蛋白的全部或一部分恒定區，或編碼特定的免疫球蛋白類型)的"替代基因"，以及可與抗體產生細胞的免疫球蛋白序列靶向同源重組的"靶序列"。在另一實施方式中，用重組DNA載體轉染細胞系來產生具有所需效應物功能的抗體(例如，人免疫球蛋白的恒定區)，在此情況中，該重組載體中所含的替代基因可編碼抗體某區域的全部或一部分，該重組載體中所含的耙序列能在抗體產生細胞內進行同源重組和耙向基因修飾。在任一實施方式中，當只替代可變區或恒定區的一部分時，得到的嵌合型抗體可針對相同的抗原和/或具有相同的效應物功能，但所述功能得到改變或改善，從而使得該嵌合型抗體顯示的抗原特異性更高、親和結合常數更大、效應物功能提高或轉染的抗體產生細胞系的(抗體)分泌和產量增加等。在另一實施方式中，本發明提供完全的人抗體。人抗體完全由特征性人多肽序列構成。可通過各種方法(參見，例如Larrick等，美國專利號5,001,065)產生本發明的人抗體。在一個實施方式中，首先在三重雜交瘤(trioma)細胞(從三種細胞，兩種人和一種小鼠細胞傳下)中產生本發明的人抗體。然后克隆編碼這些抗體的基因和在其它細胞，特別是非人哺乳動物細胞中表達。通過三重雜交瘤技術產生人抗體的通用方法描述于Ostberg，(1983)，Hybridoma2:361-367;Ostberg，美國專利號4,634,664和Engelman等，美國專利號4,634,666。己發現三重雜交瘤產生的抗體比從人細胞制備的常規雜交瘤(產生的抗體)更穩定。本領域熟知制備和配制適合給予對象(例如，人對象)的抗體的方法。例如，可以在含有有效量的抗體和藥物賦形劑(例如，鹽水)的藥物組合物中提供抗體。所述藥物組合物可任選包含其它添加劑(例如，緩沖劑、穩定劑、防腐劑等)。抗體的有效量通常是能在所需時間內(例如至少約2天-10天或1個月-2個月)有效提供抵御奈瑟球菌疾病或癥狀的保護作用的用量。診斷試驗本發明的抗原性組合物或給予這種組合物所產生的抗體也可應用于診斷目的。例如，可利用所述抗原組合物篩選免疫前和免疫血清來確保疫苗接種有效。也可將這些抗體應用于免疫測定來檢測奈瑟球菌疾病有關的特定抗原分子是否存在。實施例應該知道本文所述的實施例和實施方式只是為說明目的，本領域技術人員鑒于這些實施例和實施方式可提出各種改進或變化，這些改進和變化應包括在本申請的構思和權限以及附加的權利要求書的范圍內。本文引用的所有出版物、專利和專利申請出于所有目的全文納入本文作為參考。材料與方法以下方法和材料用于下文實施例中。細菌菌株.表1列出了本項研究所用的9種腦膜炎奈瑟球菌菌株(6種是莢膜血清群B、一種是莢膜血清群A、兩種是莢膜血清群C)。這些菌株是在25年期間從古巴、荷蘭、德國、新西蘭或美國的住院患者中收集的。根據電泳簇分析和/或測序分型，這些菌株具有遺傳學多樣性。表1.腦膜炎奈瑟球菌菌<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>a根據Russell等，EmergInfectDis2004,10:674-8提出的PorAVR類型命名的術語b女B(www.mlst.net)所述以多基因座測序進行ST分型；NT二不可分型；血清學未檢測到莢膜c與菌株MC58的序列相比，氨基酸的相同性百分比d如Welsch等，JImmunol2004,172:5606-15,Hou等，J.InfectDis.(2005年8月15日)192(4):580-90(電子版2005年7月15日)所報道的用人補體檢測的滴度；也參見圖3A和3B。ND，未測定。菌株用作過量表達GNA1870和制備疫苗的宿主利用C群菌株RM1090(C:2a5-l，2)和下文所述得自該菌株的突變體，B群菌株H44/76和下文所述得自該菌株的突變體制備外膜囊泡(OMV)疫苗。菌株RM1090天然表達低水平的GNA1870變體2蛋白。利用GNA1870基因已滅活的RM1090菌株(下文所述的RM1090AGNA1870)過量表達GNA1870變體1。菌株H44/76表達較高水平的GNA1870變體1。其余7種菌株天然表達GNA1870變體1蛋白的亞變體，選擇這些菌株作為測試微生物來測定疫苗誘導的抗-GNA1870變體l保護性免疫力的廣度。如電泳類型和/或多基因座測序類型所測定的，這些菌株在遺傳學上具有多樣性，它們也表達幾種不同類型的PorAVR序列。選擇變體1菌株是因為它們約占致病B群分離物的60。/。(Masignani等，JExpMed2003，197:789-99)。菌株Cu385和菌株H44/76表達GNA1870變體1，其氨基酸序列與菌株MC58相同(Welsch等，JImmunol2004，172:5606-15)，用該基因在大腸桿菌中表達重組GNA1870變體1蛋白，也用于穿梭載體在腦膜炎奈瑟球菌疫苗菌株RM1090中過量表達GNA1870(見下文)。其余7種菌株表達GNA1870變體1的亞變體，其序列與菌株MC58基因編碼的GNA1870蛋白相比略有變異(Masignani等，2003，同上)。在以前的研究中，菌株Cu385在用重組GNA1870蛋白疫苗免疫的小鼠中對所引發抗體的補體介導殺菌活性高度敏感(表1)。相反，選擇腦膜炎奈瑟球菌BZ198、M1390、M6190和NZ98/294是因為它們可耐受重組GNA1870疫苗制備的抗血清殺菌活性(殺菌滴度<1:10)。pFP12-GNA1870穿梭載體的構建物.利用穿梭載體FP12實現了在腦膜炎奈瑟球菌中過量表達GNA1870，所述載體含有在淋病奈瑟球菌中天然產生質粒的復制起點，顯示能穩定轉化大腸桿菌和腦膜炎奈瑟球菌(Pagotto等，Gene2000，244:13-9)。利用以下引物通過PCR從基因組DNA擴增包含腦膜炎奈瑟球菌菌株MC58的推定FUR盒啟動子的變體1GNA1870基因GNA1870FURSphlF5',5"-ATCGGCATGCGCCGTTCGGACGACATTTG-3"和GNA1870FURStUIR3'5"-AAGAAGGCCTTTATTGCTTGGCGGCAAGGC-3"。然后用印W和Sfw/限制性內切核酸酶消化PCR產物，連接入用印W和^w/消化除去了GFP基因的pFP12質粒中。用得到的質粒pFP12-GNA1870轉化大腸桿菌菌株TOP10感受態細胞(Invitrogen)并增殖，該細胞于37'C氯霉素選擇(壓力)(501^g/ml)下土咅養在Luria扁Bertani培養基中。轉化腦膜炎奈瑟球菌.利用紅霉素選擇(5叫/ml)，用質粒pBSUDGNA1870ERM轉化，通過同源重組制備其中GNA1870基因已滅活的RM1090菌株(RM1090AGNA1870)。為制備能過量表達GNA1870的突變株，從培養過夜的巧克力瓊脂平板上選擇RM10卯AGNA1870敲除菌株的3-4個菌落。將細菌菌落在20plEB緩沖液(Qiagen)中與3叫質粒pFP12-GNA1870混合，接種到巧克力瓊脂平板上，在37'C培養5小時。在含有氯霉素(5pg/ml)的巧克力瓊脂平板上再培養該細菌的連續稀釋液。培養平板在37'C培育過夜，利用小鼠多克隆抗-rGNA1870抗體通過菌落印跡試驗篩選菌落的GNA1870表達情況。選出各陽性克隆，在含有氯霉素的巧克力瓊脂平板上再培養。在2%脫脂奶(重量/體積)中冷凍腦膜炎球菌細菌細胞，-80°(:保存。采用類似方法轉化菌株H44/76及其過量表達GNA1870的突變株。用pBSUDgnal870erm轉化滅活菌株H44/76中的染色體gnal870(Hou等，InfectImmun2003，71:6844-49)。然后用編碼菌株MC58的GNA1870變體1的質粒pFP12-GNA1870轉化該突變株(H44/76△gnal870)。在含有氯霉素(5(ig/ml)的巧克力瓊脂平板上選擇轉化株。膜制品.在巧克力瓊脂平板(Remel,Laztakas，Kans.)上從冷凍儲備物中傳代培養腦膜炎奈瑟球菌。37°C，5%(302培養過夜后，選出幾個菌落，在含5%C02的氣氛中，用含0.25%葡萄糖和0.02mMCMP-NANA的約6mlMueller-Hinton肉湯培育至620nm光密度(0062())為0.1。在5pg/ml氯霉素存在下培養含有引入的pFP12-GNAl870穿梭載體的所有菌株。37'C和5%(302振蕩培養接種的肉湯直至OD62o達至lJ0.6-0.7(2-3小時)。利用6份6-ml初始培養液接種1LMueller-Hinton肉湯。較多的培養液在37。C劇烈振蕩培養至OD620為0.8-1.0。加入苯酚(0.5%重量/體積)，肉湯在4。C靜置過夜以殺死細菌。4。C離心(10,000Xg)30分鐘沉淀細菌細胞，冷凍并保存于-2(TC直至用于制備外膜囊泡疫苗。對于含菌株H44/76及其突變株的培養液，利用6份7ml初始培養液。將細胞轉移至未添加氯霉素的1LMueller-Hinton肉湯中，劇烈振蕩培養至OD620達到0.8-1.0。加入苯酚(0.5%重量/體積)，培養液在37r靜置2小時，4'C培育過夜以殺死細菌。4'C離心(11,000Xg)30分鐘沉淀細胞。如上所述制備用于OMV的腦膜炎奈瑟球菌膜組分，不用洗滌劑以免萃取出GNA1870脂蛋白(Moe等，2002，同上)。簡言之，將冷凍的細菌細胞懸浮在40mlPBS中，在冰上用裝配了微針頭(microtip)的超聲波儀(Bmnson,Danbury,Conn)進行4次15秒超聲處理，該處理足以釋放膜細胞泡，但不導致細菌完全裂解。各次超聲處理之間用冰冷卻細菌懸浮液。5,000Xg離心15分鐘除去細胞碎片，4'C以100,000Xg超離心1小時獲得保持在上清液中的膜組分，將其重懸在5mlPBS中。這些制品稱為OMV。或者，如上所述(Moe等，2002，同上)可用細菌釋放入上清液中的細胞泡獲得的MV;也可參見WO02/09643。對于H44/76(及其突變株)，將冷凍的細菌細胞重懸在20mlPBS緩沖液中，進行4次15秒超聲處理。4°C(16,000Xg)離心30分鐘除去細胞碎片，離心(100,000Xg)2小時收集可溶性組分中富含外膜蛋白的細胞膜。疫苗的特征鑒定.采用DC蛋白質試驗(Bio-Rad,Richmond,加利福尼亞.)和BCA蛋白質試驗試劑盒(Pierce,Rockford，IL)測定蛋白質濃度。如Laemmli(Nature1970，227:680-5)所述，利用Mini-ProteanII電泳裝置(Bio-Rad)和Western印跡通過15%SDS-PAGE(H44/76制品用12.5%SDS-PAGE)分析OMV制品。將樣品懸浮于樣品緩沖液中(0.06MTris*HCl，pH6.8，10。/。(v/v)甘油，2%(w/v)SDS，5%(v/v)2-巰基乙醇，10|ag/ml溴酚藍)，加熱至100°C，5分鐘，然后直接加樣到凝膠上。對于Western印跡，凝膠用緩沖液(48mMTris'HCl，39mM甘氨酸[pH9.0]20。/。(v/v)甲醇)平衡，利用Trans-Blot(Bio-Rad)半干式電泳轉移小室將凝膠轉移至硝酸纖維素膜(Bio-Rad)。用PBS配制的2y。(w/v)脫脂奶封閉硝酸纖維素膜，使其與用含1%(w/v)BSA和1%(w/v)吐溫-20的PBS配制的抗rGNA1870-抗血清的1:20,000稀釋液反應。利用家兔抗小鼠IgG+A+M-偶聯了辣根過氧化物酶的多克隆抗體(Zymed,SouthSanFrancisco,加利福尼亞)和"WesternLightning"化學發光試劑(PerkinElmerLifeSciences,Inc.,波士頓，馬里蘭)檢測結合的抗體。檢測用抗-GNA1870抗血清得自依次注射一劑量重組GNA1870v.l(腦膜炎奈瑟球菌菌株MC58的基因)，然后一劑量重組v.3蛋白(菌株M1239的基因)，再一劑量重組v.2蛋白(菌株2996的基因)各IO嗎的免疫小鼠，各次注射間隔3-4周。免疫接種.如上所述利用編碼6個COOH-末端組氨酸(His標簽)以及不含編碼推定的前導肽的N-末端序列的GNA1870DNA序列在大腸桿菌中表達該重組蛋白質疫苗(Welsch等，JImmunol2004，172:5606-15)。利用該非脂質化的His標簽GNA1870蛋白是因為它比重組脂蛋白更易于制備，早先研究的數據表明與弗氏完全和不完全佐劑一起給予的非脂質化抗原能在小鼠中引發針對大多數測試菌株的強烈殺菌抗體應答。用PBS稀釋OMV制品或重組GNA1870蛋白，用與培育用PBS緩沖液等體積的磷酸鋁佐劑(1%Alhydrogel終濃度[重量/體積；SuperfosBiosector，Frederikssund,Denmark])吸附。腹膜內(IP)免疫接種各組4-6周齡的雌性CD1小鼠(CharlesRiverBreedingLaboratories,Raleigh,NC)(N40/組)。各小鼠接受含有5嗎總蛋白的劑量(對于混合組，OMV和rGNA1870各2.5嗎)。共注射三次，每次間隔3周。給予第三次劑量兩周后，通過心臟穿刺采血處死小鼠。分離血清，-20°0凍存。對于H44〃6制品，各小鼠接受的劑量為OMV中含有1.25|ig總蛋白和170嗎磷酸鋁。三次注射間隔3周。給予第三次劑量三周后，通過心臟穿刺采血。離心分離血清，-70°0凍存待用。吸附抗-GNA1870抗體.為測試抗-GNA1870抗體對抗體功能活性的貢獻，我們吸附合并血清以除去抗-GNA1870抗體。簡言之，將用含10mM咪唑的PBS緩沖液作l:2稀釋的100i!l合并血清加入裝有250plNi-NTA瓊脂糖(Qiagen，Valencia,加利福尼亞)的柱中，所述瓊脂糖與200pg重組GNA1870-His標簽蛋白或作為陰性對照的重組NadA-His標簽蛋白絡合(Comanducci等，JExpMed2002，195:1445-54;Hou等，2005，同上)。4。C培育該柱過夜，用含10mM咪唑的500plPBS緩沖液洗滌。合并流出柱的5組份(每份100pl)，通過膜過濾(MicroconYM-IO，10,000MWCO，MilliporeCorp.,Bedford,MA)濃縮至原先的50|il血清體積。根據ELISA結果，GNA1870柱除去了98-99%以上的抗-GNA1870抗體。抗畫GNA1870抗體.如前所述(Welsch等，JImmunol2004，172:5606畫1)采用ELISA檢測針對GNA1870的血清抗體滴度。固相抗原由rGNA1870v.l或v.2蛋白構成。第二抗體是偶聯堿性磷酸酶的家兔抗-小鼠IgM+G+A(Zymed)的1:2000稀釋液。血清滴度定義為與底物培育30分鐘后004()5為0.5時的稀釋度。補體介導的殺菌抗體活性.如前所述(Moe等，2002，同上)利用在補加了0.25%葡萄糖的MuellerHinton肉湯中培養至對數生長中期的細菌進行殺菌試驗。最終的反應混合物含有不同稀釋度的測試血清、20%(v/v)人補體和含1%BSA的Gey緩沖液。補體來源是檢測不到固有殺菌活性的健康成年人血清(Granoff等，JImmunol1998，160:5028-36;Welsch等，2003，同上)。血清殺菌滴度定義為細菌在反應混合物中培育60分鐘后，與0時的對照CFU/ml相比，造成CFU/ml降低50%時的血清稀釋度。用陰性對照抗體和補體培育的細菌通常顯示培育60分鐘期間CFU/ml增加150-200%。抗體與有被囊的活腦膜炎奈瑟球菌表面結合.如前所述(Granoff等，JImmunol2001，167:3487-3496)，通過流式細胞術間接熒光試驗測定抗-GNA1870抗體與活的腦膜炎奈瑟球菌表面結合的能力。陽性對照包括對C群莢膜多糖(1076.1(Garcia-Ojeda等，InfectImmun2000，68:239-46))、PorAP1.2(Granoff等，JImmunol2001,167:3487-3496)、GNA1870變體1(JAR3)(Welsch等，JImmunol2004，172:5606-15)特異性小鼠單克隆抗體和FITC偶聯的山羊抗-小鼠(Fab')2IgG(H+L)的1:300稀釋液(JacksonImm腦ResearchLaboratories,WestGrove,PA)。激活人補體沉積在有被囊的活腦膜炎球菌表面.如前所述(Welsch等，JInfectDis2003，188:1730-40)，通過流式細胞術測定C3b或iC3b抗-GNA1870抗體依賴性沉積到活腦膜炎奈瑟球菌細菌表面。在含5%(^/"人補體和用veranol緩沖液配制的合適血清稀釋液的反應混合物中培育經洗滌的對數生長期細菌。利用能與C3b和iC3b反應的FITC-偶聯綿羊抗-人補體C3c(BioDesignIntl.,Saco,ME)檢測補體沉積。補體來源于上述殺菌試驗的同一人血清。乳大鼠中的被動保護作用.在用B群菌株NZ98/254腹膜內攻擊的乳大鼠中測試抗血清賦予抵御腦膜炎奈瑟球菌B群菌血癥的被動保護作用的能力(Welsch等，2003，同上；Moe等，InfectImmun1999，67:5664-75;Moe等，InfectImmun2001，69:3762-71)。簡言之，將遠交Wistar大鼠的同窩后代4天乳大鼠隨機分配給哺乳母鼠。在0時，將用含1。/。BSA的PBS稀釋的抗血清或抗體腹膜內給予各組的8只大鼠。兩小時后，用在補加0.25%葡萄糖和10mMCMP隱NANA的Mueller-Hinton肉湯(Sigma,St.Louis,MO)中培養的約6X104CFU個經洗滌的對數生長期細菌腹膜內攻擊大鼠。細菌攻擊后4-6小時，通過心臟穿剌獲得血液樣品，將l、10和100pl等份血液接種到巧克力瓊脂平板上以確定CFU/ml。實施例1:腦膜炎奈瑟球菌菌株RM1090上GNA1870的表面可接近性為測定用pFP12-GNA1870轉化RM1090菌株所表達的GNA1870蛋白是否是外膜的整合部分并暴露在細胞表面上，為測定菌株H44/76中過量表達的GNA1870是否錨定在外膜且表面可接近，通過流式細胞術檢測抗-GNA1870和對照抗體與有被囊活細菌細胞的結合情況(圖1)。如圖1A所示，C群莢膜多糖(列2)或PorA(抗-P1.2，列3)特異性的陽性對照mAb顯示能與親代RM1090菌株(行B)和以下兩個RM1090突變型菌株強烈結合用不含GNA1870基因的穿梭載體轉化的GNA1870敲除(菌株)(行A)和用編碼GNA1870變體1蛋白質的穿梭載體轉化的敲除(菌株)(行C)。所有3種菌株均不與單用磷酸鋁免疫小鼠的陰性對照合并血清1:IO稀釋液顯著結合(列1)。抗-GNA1870單克隆或多克隆抗體與GNA1870敲除菌株也不顯著結合(分別是行A、歹U5和6)。天然表達低水平GNA1870v.2蛋白的野生型RM1090菌株與v.l蛋白的特異性抗-GNA1870mAb沒檢測到結合(行B，列4)，其顯示結合略超過制備的抗重組v.l、2和3GNA1870蛋白(見下文)多克隆小鼠抗血清的背景結合(列5和6)。相反，用編碼GNA1870(變體l)的穿梭載體轉化的菌株顯示能與多克隆和單克隆抗-GNA1870抗體強烈結合。因此，GNA1870暴露于用pFP12-GNA1870穿梭載體轉化的RM1090菌株表面上。如圖1B所示，陽性對照抗莢膜和抗-PorA(P1.16)單克隆抗體能與H44/76野生型菌株和過量表達GNA1870菌株H44/76的突變株結合(均顯示于行1)。陽性對照抗體也能與H44/76AGNA1870結合(示于行2)。與估計的一樣，抗-GNA1870單克隆或多克隆抗體與編碼GNA1870的基因已滅活的突變型菌株H44/76不結合(列D-F)。野生型菌株與抗-GNA1870抗體培育顯示結合良好，該結果反映菌株H4476中天然GNA1870表達水平較高。免疫熒光向右稍許偏移證明與經工程改造而過量表達GNA1870的突變型菌株的結合有適度增加。因此，GNA1870過量表達導致外膜中該蛋白含量稍許增加，而所述蛋白暴露于表面。實施例2.OMV疫苗的分析通過SDS-PAGE分離菌株RM1090及各突變株OMV制品中的主要蛋白質，用考馬斯藍染色目測觀察(圖2A，A圖)。與用腦膜炎奈瑟球菌制備的典型OMV一樣，在表觀質量介于29kDa(Opa/Opc)和43kDa(PorA)之間可分辨的主要蛋白數量有限。野生型菌株(泳道l)和GNA1870敲除菌株(泳道3)制備的OMV顯示這些蛋白每種的各自含量相似。相反，用不含GNA1870編碼基因的pFpl2穿梭載體轉化的菌株的OMV(分別是泳道2和4)顯示遷移至表觀質量介于38-43kDa之間的三種蛋白的相對表達降低。該結果可能部分反映了因生長培養基中存在5lag/ml氯霉素的抗生素選擇(壓力)降低了通道蛋白的表達(Tommassen等，InfectImmun19卯，58:1355-9)。泳道5顯示了用編碼GNA1870的穿梭載體轉化菌株RM1090制備的OMV。為更好地目測觀察蛋白質，該泳道加載的蛋白質是泳道1-4的兩倍以上(約10pg)。與其它OMV制品相比，用含GNA1870基因的穿梭載體轉化菌株制備的OMV顯示29-32kDa之間可分辨的蛋白質表達降低。采用SDSPAGE，在包含過量表達GNA1870的突變型菌株制備的OMV的任何OMV制品中均不易觀察到GNA1870(為比較，泳道6顯示了1嗎重組GNA1870變體蛋白)。在圖2A中，采用抗v.l、2和3GNA1870重組蛋白多克隆抗血清進行Western印跡來評估不同疫苗制品中GNA1870的表達。如B圖所示，與v.l重組蛋白相比，該抗血清與rGNA1870v.2蛋白的反應性略強。即使有這種偏差，Western印跡(檢測到)與從天然表達v.2蛋白的野生型RM1090菌株制備的OMV相比，用pFP12-GNA1870轉化RM1090制備的OMV顯示反應性提高(圖2A，C圖)。相反，GNA1870敲除突變株(RM1090AGNA1870)的陰性對照OMV檢測不到反應活性。光密度測量結果表明在用穿梭載體轉化的菌株中v.lGNA1870蛋白的表達比野生型親代RM1090菌株天然表達的v.2蛋白約高10倍。利用抗GNA1870多克隆抗血清通過Western印跡分析了H44/76OMV制品(圖2B)。根據該制品的總蛋白含量標準化加載到凝膠上的OMV量。與估計的一樣，在野生型菌株的膜制品中有GNA1870表達，其在經工程改造而能過量表達該蛋白的突變株相應制品中表達增加。然而，GNA1870的增加適中(約3倍)。實施例3:血清抗體應答的分析表2和圖5總結了通過ELISA檢測的不同組小鼠的血清抗-GNA1870抗體應答。表2顯示對變體1蛋白的最高抗體應答是在單用重組GNA1870v.1疫苗或用含OMV疫苗的重組GNA1870v.l混合疫苗免疫的小鼠中產生(抗變體1蛋白的滴度分別是1:120,000和1:300,000)。用過量表達變體1GNA1870的菌株RM1090制備的OMV免疫的小鼠抗-GNA1870滴度(l:32,000)低4-10倍。令人感興趣的是，用變體1或2蛋白檢測以野生型RM1090菌株制備的OMV免疫的小鼠，抗-GNA1870抗體應答檢測不到或可忽略。該結果提示不過量表達的話，野生型菌株的OMV中GNA1870的免疫原性不佳。用與磷酸鋁一起給予的H44/76OMV(1.25嗎總蛋白)或5嗎rGNA1870免疫各組小鼠。第三次劑量三周后獲得血清樣品，合并(每個疫苗組2份合并物，4-5只小鼠制備一份合并物)。如圖5所示，單用鋁佐劑免疫的對照小鼠沒有可檢測的抗-GNA1870抗體(GMT<1:10，柱1)，而用rGNA1870免疫的小鼠顯示最高的應答(GMT1:23,500，柱2)。用過量表達GNA1870的H44/76制備的OMV免疫小鼠的抗-GNA1870抗體應答比用野生型菌株OMV免疫的各組約高10倍(比較柱5和3)。用H44/76AGNA1870制備的OMV免疫小鼠的抗體應答可忽略(GMT<1:10，柱4)。表2.ELISA檢測到的小鼠抗-GNA1870抗體應答<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>圖3A總結了對4株測試菌檢測到的不同組小鼠的血清殺菌抗體應答。單用重組GNA1870蛋白疫苗、或聯用重組GNA1870疫苗和OMV疫苗，或用過量表達GNA1870的OMV免疫的小鼠產生了彼此差異不顯著的抗菌株Cu385高殺菌滴度(比較上圖的柱4、5和6)。相反，用野生型RM1090或GNA1870敲除菌株制備的OMV疫苗免疫的對照小鼠血清中未檢測到抗菌株Cu385的殺菌活性。(分別是柱2和3;滴度<1:10)。注意菌株Cu385表達典型的GNA1870v.l蛋白(與菌株MC58的氨基酸序列相同，用該基因表達重組GNA1870蛋白)，我們以前的研究已知該菌株對重組GNA1870疫苗所引發的小鼠抗體的殺菌活性高度敏感(表1)。另外，Cu385具有對疫苗菌株RM1090的PorA血清亞型(P1.5,2)為異源的PorA血清亞型(Pl.19,15)，因此估計菌株Cu385能耐受不過量表達GNA1870變體1的對照OMV疫苗所產生抗體的殺菌活性(Tappero等，JAMA1999，281:1520-7;Moe等，2002，同上)。圖3A也顯示與工程改造的疫苗菌株的血清殺菌滴度相比，兩側到對表達v.lGNA1870蛋白亞變體菌株M6190(從上往下第二幅圖)的相應血清殺菌滴度。在用重組GNA1870變體1蛋白免疫的小鼠血清中未檢測到殺菌活性(柱6，幾何平均滴度<1:10)，該結果與我們以前研究的結果(表l)一致。然而，由于菌株M6190的PorA血清亞型(P1.5,2)與RM1090疫苗菌株的同源，用任何含OMV疫苗免疫的小鼠血清有高度殺菌活性(柱2、3、4或5)。圖3A(從上往下第三和第四幅圖)分別顯示了抗菌株Z1092和NZ98/254的相應殺菌應答。這兩種菌株均表達對RM1090疫苗菌株的PorA分子為異源的PorA分子(表1)，用RM1090野生型或GNA1870敲除菌株制備的OMV疫苗免疫的小鼠血清不能殺傷二者(柱2和3，幾何平均滴度<1:10)。然而，用過量表達GNA1870的菌株RM1090制備的OMV疫苗免疫的小鼠(柱5)抗菌株Z1092的幾何平均血清殺菌抗體滴度明顯高于用重組GNA1870(柱6，P<0.02)或用重組GNA1870蛋白和OMV混合疫苗(柱4，P<0.04)免疫的小鼠。分別觀察到菌株NZ98/254(下圖)或對菌株BZ198和M1390(數據未顯示)有血清殺菌應答的類似傾向。然而，對于后三種菌株，用過量表達GNA1870的OMV疫苗免疫的小鼠血清殺菌應答的強度低于檢測到的對菌株Z1092的應答。與其它疫苗接種組小鼠的各幾何平均滴度相比，用過量表達GNA1870的OMV免疫小鼠的抗菌株NZ98/294、BZ198和M1390的幾何平均血清殺菌滴度沒有統計學顯著差異(P>0.10)。圖3B總結了抵御制備OMV疫苗所用的6種菌株(包括H44/76)的血清殺菌抗體應答。6種菌株中5種的PorA血清亞型對H44/76的PorA為異源性。菌株H44/76表達的GNA1870變體1蛋白序列也與菌株MC58相同，該菌株含有用于克隆和表達重組GNA1870蛋白疫苗的基因。當用H44/76疫苗菌株檢測時，除陰性對照鋁佐劑外，所有疫苗制品均引發高血清殺菌抗體應答(圖3B，圖A)。相反，當用異源菌株4243(圖B)，Z1092、NZ98/254和BZ198(圖C)或M61卯(圖D)檢測時，用rGNA1870疫苗或H44/76野生型或H4476AGNA1870菌株制備的OMV疫苗免疫的小鼠血清殺菌滴度低或檢測不到(分別見柱2、3和4)。用過量表達GNA1870的OMV疫苗免疫小鼠抗菌株4243的殺菌抗體應答高，抗NZ98/254、BZ198和Z1092菌株的殺菌應答低但可檢測，抗M6190的殺菌活性檢測不到(滴度<1:10)。雖然未在圖3B上顯示，但是用補體和分別針對PorA和/或多糖莢膜的陽性對照抗體不難殺死所有菌株。實施例4:激活的C3b補體沉積在有被囊腦膜炎奈瑟球菌活細胞表面在以前的研究中，我們發現缺乏殺菌活性的某些小鼠抗腦膜炎球菌抗體沒有殺菌活性但能賦予抵御腦膜炎球菌性菌血癥的被動保護作用(Welsch等，JImmunol2004，172:5606-15;Welsch等，2003，同上)。通過流式細胞術檢測到這種保護作用與這些抗體激活C3補體組分沉積到有被囊活腦膜炎球菌表面上的能力相關。存在C3b為調理作用提供配體，該作用是沒有殺菌活性但能賦予保護作用最可能的機制。因此，研究了用不同OMV疫苗免疫的小鼠抗血清能否激活人C3b沉積(圖4)。這些實驗利用了兩種測試的腦膜炎奈瑟球菌菌株NZ98/254(圖4A，行A)和M1390(圖4A，含B)，及四種測試的腦膜炎奈瑟球菌菌株NZ98/254、BZ198、Z1092和M6190(圖4B)。對于這些菌株，用過量表達GNA1870的OMV疫苗免疫的小鼠抗血清顯示殺菌滴度不高于其它疫苗菌株沒有統計學意義。當將兩種測試菌株的細菌細胞與人源補體以及單用磷酸鋁免疫小鼠的陰性對照合并血清的1:40稀釋液一起培育時，未見補體沉積的證據(圖4A中的封閉區域，列1)。類似地，熱滅活補體加上5ng/ml抗GNA1870的小鼠單克隆抗體(JAR3)沒檢測到C3b沉積(圖4A中的封閉區，列2)。相反，用能識別C3b和iC3bi二者的抗-C3c抗體(檢測)顯示強免疫熒光的細菌百分比增加證明，在25叫/ml陽性對照B群單克隆抗莢膜抗體中(圖4A中的開放區，列l)，或l嗎/ml抗-GNA1870單克隆抗體中(圖4A中的開放區，列2)加入活化補體引發C3b強烈沉積在兩種測試菌株的細菌表面。圖4A列3-6中的圖顯示了將補體加入用不同疫苗免疫小鼠組所獲得的合并血清稀釋液后的作用。將補體加入用重組GNA1870(列3)、或用RM1090野生型菌株制備的OMV(列4)或重組GNA1870與OMV(列5)化合物疫苗免疫的小鼠血清1:100稀釋液中未能激活C3b沉積在各測試菌株上。相反，用過量表達GNA1870菌株RM1090制備的OMV免疫小鼠的合并血清1:100或1:400稀釋液激發C3b強烈沉積在兩種測試菌株表面(列6)。如圖4B所示，陽性對照抗莢膜mAb引發補體沉積在每種菌株上(列A的開放區)，而單用鋁佐劑免疫小鼠的陰性對照抗血清1:IOO稀釋液為陰性(列A的封閉區)。用rGNA1870疫苗(列B中的封閉區)、或用野生型菌株H44/76制備的OMV疫苗(列C中的封閉區)免疫的小鼠血清1:100稀釋液也未引發補體明顯沉積到任何菌株上。相反，抗-rGNA1870mAb能引發補體沉積到菌株NZ98/254、BZ198和Z1092上，但不沉積到菌株M6190上(列B的開放區)。類似地，用含過量表達GNA1870的H44/76疫苗免疫的小鼠抗血清1:100稀釋液激活C3沉積到菌株Z1092、NZ98/254和BZ198上(列D的開放區)，但不沉積到菌株M6190上。實施例5.確定能殺菌或激活C3b沉積到異源菌株上的抗體的靶抗原利用加載了His-標簽重組GNA1870的Ni-NTA親和柱來吸附用H44/76OMV(含過量表達的GNA1870)免疫小鼠制備的合并血清中的抗-GNA1870抗體。如表3所示，與用只含Ni-NTA基質的陰性對照柱吸附血清中的抗體相比，ELISA(檢測到)該柱除去了98。/o的抗-GNA1870抗體。吸附到陰性對照柱上后，抗菌株4243的殺菌活性與原先未吸附的合并血清的殺菌活性相似，而抗-GNA1870抗體被吸附導致殺菌活性完全喪失。利用菌株Z1092、NZ98/254、BZ198和M6190分析了吸附抗-GNA1870抗體后對C3沉積的作用(表3和圖4B，行4)。如圖4B，列D所示，用H44/76OMV(含過量表達的GNA1870)免疫的小鼠血清中除去抗-GNA1870抗體后導致抗血清在對iC3b/c3b激活和沉積敏感的三種菌株中完全喪失激活補體沉積的能力(圖4B的封閉區)。以上總結的這些結果以及吸附后血清的殺菌數據表明對于所含PorA蛋白對H44/76疫苗菌株是異源蛋白的菌株，用H44/76OMV(含過量表達的GNA1870)制備的抗血清激活C3沉積和殺菌活性受抗-GNA1870抗體所介導。表3:含過量表達GNA1870的OMV免疫的小鼠抗血清經抗-GNA1870抗<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>用H44/76OMV(含過量表達的GNA1870)免疫制備的的小鼠合并血清吸附到含Ni-NTA基質(Qiagen)的柱上，該基質與50|ig/ml重組His-標簽GNA1870培育過夜。收集流出液，濃縮至初始體積。對照柱含有Ni-NTA，但不含His-標簽蛋白。實施例6.抗-GNA1870抗體的功能活性作用與用野生型疫苗RM1090菌株或RM1090AGNA1870敲除菌株制備的OMV中各蛋白質相比(圖2A，A圖)，經工程改造而過量表達GNA1870的RM1090腦膜炎奈瑟球菌菌株制備的OMV疫苗顯示其它幾種細胞包膜蛋白的表達降低。因此，除GNA1870以外的抗原所引發的抗體可能導致用過量表達GNA1870的OMV免疫的小鼠抗血清的功能活性較高。為研究這種可能性，利用抗-GNA1870親和柱吸附用過量表達GNA1870的RM1090OMV免疫的小鼠合并血清。ELISA(檢測至lj)除去了99。/。的抗-GNA1870抗體。得到的吸附后抗血清也喪失了激活人C3b沉積到腦膜炎奈瑟球菌菌株NZ98/294上的所有能力(表4)。相反，用作為陰性對照的抗-NadA親和柱吸附合并血清對C3b沉積沒有作用(表4)。表4.<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>a用菌株RM1090(經工程改造而過量表達GNA1870)的OMV疫苗免疫的5只小鼠制備的合并血清。抗血清經重組GNA1870親和柱或作為陰性對照的含重組NadA的親和柱吸附(參見方法)。合并流出組分，通過膜過濾濃縮至它們初始的血清體積(參見方法)。b與陰性對照血清相比，流式細胞術補體激活試驗中能引發免疫熒光增加IO倍的血清稀釋度(參見圖4)。_表4也總結了用菌株Cu385和M6190檢測的經吸附合并血清的殺菌滴度。抗-GNA1870抗體吸附后完全消除了抗菌株Cu385的殺菌活性，但對菌株M6190的滴度沒有明顯作用。此后一結果估計是因為菌株M6190表達的PorA與RM1090疫苗菌株表達的PorA為同源血清亞型，故GNA1870或NadA親和柱未除去殺菌的抗-PorA抗體。實施例8.乳大鼠腦膜炎球菌菌血癥模型中的被動保護作用用不同組小鼠的合并血清預先處理乳大鼠，2小時后用腦膜炎奈瑟球菌菌株NZ98/254攻擊。圖6顯示攻擊4-6小時后獲得的血液中CFU/ml的幾何平均值。單用磷酸鋁免疫的陰性對照小鼠合并血清的1:15稀釋液處理的所有10只大鼠患上菌血癥，CFU/ml的幾何平均值約為10、A圖，柱1)。相反，用10pg/大鼠的陽性對照B群抗莢膜抗體(柱2)或抗-GNA1870單克隆抗體(柱3)預處理導致CFU/ml幾何平均值降低3-4-log(P<0.0001)。與用陰性對照血清處理的動物相比，用RM1090AGNA1870敲除菌株制備的OMV疫苗(柱4)或用重組GNA1870與OMV的混合疫苗(柱5)免疫的小鼠合并血清沒有明顯的被動保護作用。相反，用過量表達GNA1870的OMV疫苗(柱6)免疫的小鼠合并血清能賦予保護作用(CFU/ml幾何平均值降低4-log，P<0.0001))。單用重組GNA1870疫苗免疫的小鼠合并血清(柱7)能賦予適中的保護作用(降低約2log,P<0.0001)，但其保護活性低于用過量表達GNA1870的OMV免疫的小鼠合并血清(PO.OOOl，比較CFU/ml的各幾何平均值)。圖6，B圖顯示了用合并血清的l:60稀釋液預處理大鼠的相應CFU/ml幾何平均值。在此較高稀釋度，用過量表達GNA1870的OMV疫苗免疫的小鼠合并血清(柱6)能賦予保護作用(PO.0002，與用陰性對照血清的1:15稀釋液處理大鼠的幾何平均值相比)，但用測試的其它3種疫苗組免疫的小鼠合并血清，包括重組GNA1870疫苗免疫的小鼠血清(柱7，P>O.IO)在此較高稀釋度時沒有明顯的保護活性。實施例9.用過量表達奈瑟球菌表面蛋白A(NspA)的菌株RM1090制備的囊泡疫苗免疫小鼠與血清殺菌抗體應答提髙無關測定用經工程改造而過量表達GNA1870的RM1090菌株制備的囊泡疫苗能誘導保護作用提高是GNA1870特異性的，還是用經工程改造而過量表達另一種疫苗靶標的菌株制備的囊泡疫苗也可能如此令人感興趣。因此，由野生型菌株的NspA基因已滅活的菌株RM1090制備微囊泡疫苗。用穿梭載體pFP12(含有菌株8047的NspA基因)轉化RM1090NspA-敲除菌株制備第二囊泡疫苗。SDSPAGE(顯示)，與RM10卯野生型菌株相比，用該穿梭載體轉化菌株得到的囊泡所含NspA蛋白的表達增加IO倍(數據未顯示)。用3次劑量的囊泡疫苗和磷酸鋁一起免疫各組小鼠，最后一次免疫3周后收集血清。ELISA檢測到過量表達NspA的疫苗能引發滴度高抗-NspA抗體(與用NspA敲除菌株制備的囊泡疫苗免疫的小鼠1:700滴度和單用磷酸鋁免疫小鼠<1:50滴度相比，滴度是1:19,000)。表5總結了用4種測試菌株BZ198、NZ98/254、Cu385和Z10卯檢測的血清殺菌抗體應答。表5.用經遺傳工程改造而過量表達奈瑟球菌表面蛋白A(NspA)的突變型菌株RM10卯制備的囊泡疫苗免疫小鼠<table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table>a如Moe等(InfectionImmunity2002，70:6021-6031)所述，用穿梭載體pFP12(含有菌株8047的NspA基因)轉化NspA-敲除菌株制備微囊泡疫苗。注射三次來免疫小鼠，最后一次注射約3周后放血。所示的滴度是各疫苗組9-10只小鼠的合并血清。ELISA檢測的各抗-NspA抗體滴度是〈l:50(磷酸鋁組)、1:700(RM1090NspA敲除菌株的囊泡)和1:19,000(過量表達NspA的RM1090菌株的囊泡)。b與人補體培育1小時后殺傷50%細菌的最低濃度。e與人補體培育1小時后殺傷50%細菌的血清最高稀釋度。d在NspA敲除背景中表達的。與疫苗菌株RM1090的PorA相比，所有4種菌株表達異源PorA。以前的數據顯示了對大腸桿菌囊泡中表達的重組NspA制備的抗-NspA抗血清殺菌活性高度敏感(Moe等，InfectionandImmunity1999，67:5664-5675)，根據該數據選擇菌株BZ198用于本實驗來測試殺菌活性，有證據表明用源自過量表達NspA的菌株囊泡疫苗免疫的小鼠抗血清殺菌活性提高。然而，對于菌株NZ298/254，殺菌活性沒提高，對于菌株Cu385和Z1090,有證據表明用過量表達NspA的囊泡疫苗免疫誘導的血清殺菌抗體應答比用相應的NspA敲除菌株制備的對照囊泡疫苗誘導的低3-10倍。因此，與過量表達GNA1870的囊泡疫苗相反，過量表達NspA的囊泡疫苗未能始終如一地提高殺菌抗體應答，而且看來抑制了對某些菌株的殺菌抗體應答。權利要求1.一種組合物，所示組合物包含由第一種奈瑟球菌制備的分離的抗原性囊泡，其中所述奈瑟球菌產生的GNA1870多肽的水平足夠制備給予對象時引發抗-GNA1870抗體的囊泡；和藥學上可接受的載體。2.如權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述囊泡是外膜囊泡(OMV)、微囊泡(MV)或OMV與MV的混合物。3.如權利要求l所述的組合物，其特征在于，所述奈瑟球菌是天然產生的。4.如權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述GNA1870多肽對所述奈瑟球菌是內源性的。5.如權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述奈瑟球菌就GNA1870多肽的產生進行了遺傳修飾。6.如權利要求5所述的組合物，其特征在于，所述奈瑟球菌經遺傳修飾而由異源啟動子表達GNA1870多肽。7.如權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述奈瑟球菌經遺傳修飾而含有編碼外源性GNA1870多肽的核酸。8.如權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述奈瑟球菌經遺傳修飾而破壞了內源性GNA1870多肽的產生。9.如權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述奈瑟球菌缺乏莢膜多糖。10.如權利要求l所述的組合物，其特征在于，所述組合物還包含由第二種奈瑟球菌制備的分離的抗原性囊泡，其中所述第二種奈瑟球菌產生的GNA1870多肽水平足夠制備給予對象時引發抗-GNA1870抗體的囊泡，其中所述第二種奈瑟球菌與所述第一種奈瑟球菌在遺傳學上不同。11.如權利要求IO所述的組合物，其特征在于，所述第一和第二種奈瑟球菌遺傳學上不同在于它們所屬的血清群、血清型或血清亞型中至少有一個不同。12.如權利要求10所述的組合物，其特征在于，所述第二種奈瑟球菌的GNA1870多肽不同于所述第一種奈瑟球菌的GNA1870多肽。13.如權利要求IO所述的組合物，其特征在于，所述組合物還包含由第三種奈瑟球菌制備的分離的抗原性囊泡，其中所述第二種奈瑟球菌產生的GNA1870多肽水平足夠制備給予對象時引發抗-GNA1870抗體的囊泡，其中所述第三種奈瑟球菌與所述第一種奈瑟球菌在遺傳學上不同。14.如權利要求13所述的組合物，其特征在于，所述第一、第二和第三種奈瑟球菌遺傳學上不同在于它們所屬的血清群、血清型或血清亞型中至少有一個不同。15.如權利要求12所述的組合物，其特征在于，所述第一、第二和第三種奈瑟球菌的GNA1870多肽不相同。16.如權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述第一種奈瑟球菌經遺傳修飾而產生至少兩種不同的GNA1870多肽。17.如權利要求16所述的組合物，其特征在于，所述GNA1870多肽屬于不同的GNA1870多肽變體組，其中所述變體組是v.l、v.2和v.3。18.—種產生抗原性組合物的方法，所述方法包括培養產生GNA1870多肽的奈瑟球菌，其中所述GNA1870多肽產生的水平足夠制備給予對象時引發抗-GNA1870抗體的囊泡；從培養的細菌制備囊泡；和混合所述囊泡與藥學上可接受的載體來產生適合給予對象的抗原性組合物。19.如權利要求18所述的方法，其特征在于，所述囊泡是外膜囊泡(OMV)或微囊泡(MV)。20.如權利要求18所述的方法，其特征在于，所述奈瑟球菌是天然產生的。21.如權利要求18所述的方法，其特征在于，所述GNA1870多肽對所述奈瑟球菌是內源性的。22.如權利要求18所述的方法，其特征在于，所述奈瑟球菌就GNA1870多肽的產生進行了遺傳修飾。23.如權利要求22所述的方法，其特征在于，所述奈瑟球菌經遺傳修飾而由異源啟動子表達GNA1870多肽。24.如權利要求21所述的方法，其特征在于，所述奈瑟球菌經遺傳修飾而含有編碼外源性GNA1870多肽的核酸。25.如權利要求22所述的方法，其特征在于，所述奈瑟球菌經遺傳修飾而破壞了內源性全長GNA1870多肽的產生。26.如權利要求18所述的方法，其特征在于，所述奈瑟球菌經遺傳修飾而產生至少兩種不同的GNA1870多肽。27.如權利要求26所述的方法，其特征在于，所述GNA1870多肽屬于不同的GNA1870多肽變體組，其中所述變體組是v.l、v.2和v.3。28.如權利要求18所述的方法，其特征在于，所述奈瑟球菌缺乏莢膜多糖。29.—種引發抗奈瑟球菌的免疫應答的方法，所述方法包括以下步驟給予哺乳動物免疫有效量的含第一抗原性制品的組合物來引發抗GNA1870抗體，所述制品含有由第一種奈瑟球菌制備的囊泡，其中所述奈瑟球菌產生的GNA1870多肽水平足夠用于制備給予對象時引發抗-GNA1870抗體的囊泡；其中所述給予足以引發針對囊泡中存在的GNA1870多肽的免疫應答。30.如權利要求29所述的方法，其特征在于，所述囊泡是外膜囊泡(OMV)、微囊泡(MV)或OMV與MV的混合物。31.如權利要求29所述的方法，其特征在于，所述奈瑟球菌是天然產生的或對GNA1870多肽的產生進行了遺傳修飾。32.如權利要求29所述的方法，其特征在于，所述GNA1870多肽對所述奈瑟球菌是內源性的。33.如權利要求29所述的方法，其特征在于，所述奈瑟球菌經遺傳修飾而由異源啟動子表達GNA1870多肽。34.如權利要求29所述的方法，其特征在于，所述奈瑟球菌經遺傳修飾而含有編碼外源性GNA1870多肽的核酸。35.如權利要求29所述的方法，其特征在于，所述奈瑟球菌經遺傳修飾而破壞了內源性GNA1870多肽的產生。36.如權利要求29所述的方法，其特征在于，所述組合物還包含免疫有效量的第二抗原性制品，所述制品含有由第二種奈瑟球菌制備的囊泡，其中所述第二種奈瑟球菌產生的GNA1870多肽水平足夠用于制備給予對象時引發抗-GNA1870抗體的囊泡，其中所述第二種奈瑟球菌與所述第一種奈瑟球菌在遺傳學上不同。37.如權利要求36所述的方法，其特征在于，所述第二種奈瑟球菌的GNA1870多肽不同于所述第一種奈瑟球菌的GNA1870多肽。38.如權利要求36所述的方法，其特征在于，所述組合物還包含由第三種奈瑟球菌制備的分離的抗原性制品，其中所述第二種奈瑟球菌產生的GNA1870多肽水平足夠用于制備給予對象時引發抗-GNA1870抗體的囊泡，其中所述第三種奈瑟球菌在遺傳學上不同于所述第一或第二種奈瑟球菌。39.如權利要求38所述的方法，其特征在于，所述第一、第二和第三種奈瑟球菌的遺傳學上不同在于它們所屬的血清群、血清型或血清亞型中至少有一個不同。40.如權利要求38所述的方法，其特征在于，所述第一、第二和第三種奈瑟球菌的GNA1870多肽不相同。41.如權利要求29所述的方法，其特征在于，所述第一種奈瑟球菌經遺傳修飾而產生至少兩種不同的GNA1870多肽。42.如權利要求41所述的組合物，其特征在于，所述GNA1870多肽屬于不同的GNA1870多肽變體組，其中所述變體組是v.l、v.2和v.3。43.如權利要求29所述的方法，其特征在于，所述給予在對象中引發抗腦膜炎奈瑟球菌多種菌株的保護性免疫應答。44.如權利要求29所述的方法，其特征在于，所述奈瑟球菌是B群腦膜炎奈瑟球菌。45.—種引發抗奈瑟球菌免疫應答的方法，所述方法包括給予哺乳動物免疫有效量的含制品的組合物，所述制品含有由天然表達高含量GNA1870或經工程改造而過量表達GNA1870的奈瑟球菌的菌株制備的囊泡；其中所述給予足以引發針對囊泡中存在的GNA1870多肽的免疫應答。46.如權利要求45所述的方法，其特征在于，所述囊泡是外膜囊泡(OMV)、微囊泡(MV)或OMV與MV的混合物。47.如權利要求45所述的方法，其特征在于，所述奈瑟球菌的菌株是H44/76。48.—種組合物，所述組合物包含由天然表達高含量GNA1870或經工程改造而過量表達GNA1870的奈瑟球菌的菌株制備的抗原性囊泡;和藥學上可接受的載體。49.如權利要求48所述的組合物，其特征在于，所述奈瑟球菌的菌株是H44/76。50.—種組合物，其包含由經遺傳修飾而過量表達GNA1870多肽的第一種腦膜炎奈瑟球菌細菌制備的第一抗原性囊泡；由經遺傳修飾而過量表達GNA1870多肽的第二種腦膜炎奈瑟球菌細菌制備的第二抗原性囊泡；和藥學上可接受的載體；其中所述第一和第二種細菌的GNA1870多肽是不同的GNA1870變體組，所述第一和第二種細菌產生不同的PorA多肽。51.如權利要求50所述的組合物，其特征在于，所述組合物還包含由經遺傳修飾而過量表達GNA1870多肽的第三種腦膜炎奈瑟球菌細菌制備的第三抗原性囊泡，其中所述第三種細菌的GNA1870多肽的GNA1870變體組不同于所述第一和第二種細菌的，其中所述第三種細菌產生的PorA多肽不同所述第一和第二種細菌的PorA多肽。52.如權利要求50所述的組合物，其特征在于，不用洗滌劑制備所述第一和第二抗原性囊泡。全文摘要本發明總體上提供在對象中引發抗奈瑟球菌屬細菌，具體地說抗腦膜炎奈瑟球菌B血清群菌株的免疫應答的方法和組合物。文檔編號A61K38/00GK101107007SQ200680002931公開日2008年1月16日申請日期2006年1月23日優先權日2005年1月27日發明者D·M·格拉諾夫,V·侯申請人:奧克蘭兒童醫院及研究中心