專利名稱：金鐵鎖提取物及其制備方法、藥物組合物和用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種金鐵鎖提取物及其制備方法、藥物組合物和用途，屬于藥物
背景技術：
金鐵鎖(Psammosilene tunicoides W.C.Wu et C.Y.Wu)為石竹科植物金鐵鎖的干燥根，是西南地區特有常用藥，具有悠久的藥用歷史。根據苗族民間用藥經驗，其根可藥用，具有解毒、散瘀、止痛、祛風除濕等功能。金鐵鎖既可單用，也可入復方。在苗族民間，金鐵鎖與七葉蓮、透骨香、五花血藤配伍，主治風濕痹阻引起的肌肉酸痛、關節紅腫疼痛、屈伸不利等癥。
目前，金鐵鎖的提取一般采用的是常規的水提醇沉法或醇提法，但對于金鐵鎖提取物的藥理學研究尚未見報道。申請人經過廣泛深入的研究發現，通過將金鐵鎖用有機溶劑、含水有機溶劑或水在一定條件下提取得到的金鐵鎖提取物對實驗性RA關節痛具有顯著的鎮痛、抗炎效應，明顯提高痛閾，降低血清NO/NOS；對小鼠細胞免疫主要形式之一的遲發性超敏反應、T淋巴細胞增殖反應有顯著的免疫抑制作用，并顯示出良好的治療自身免疫性疾病和炎性疾病的作用。
發明內容
本發明的目的在于提供一種金鐵鎖提取物及其制備方法、藥物組合物和用途。本發明金鐵鎖提取物具有顯著的免疫抑制作用和鎮痛、抗炎效應，特別是對類風濕關節炎、腎小球腎炎、腎病綜合癥、橋本氏甲狀腺炎、系統性紅斑狼瘡、特發性血小板減少紫癜、白塞氏病、自身免疫性肝炎、免疫性血管病；風濕性關節炎具有治療作用。
本發明是這樣實現的金鐵鎖提取物的制備方法為將新鮮采集的金鐵鎖根晾干粉碎，得到金鐵鎖粗粉，然后用有機溶劑、含水有機溶劑或水加熱回流或滲濾提取2～4次，提取液濃縮干燥后得到金鐵鎖提取物。
所述的有機溶劑為甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、丙酮、三氯甲烷、二氯甲烷、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙醚、石油醚或汽油。
具體的說，金鐵鎖水提取物的制備方法為取金鐵鎖適量，粉碎成粗粉，加10倍量水煎煮2次，第一次2小時，第二次1.5小時，濾過，合并濾液，濃縮至60℃測相對密度為1.30，放冷，加入乙醇使含醇量為70％，靜置過夜，取上清液減壓濃縮至相對密度為1.25的稠膏，75℃減壓干燥，即得。
金鐵鎖醇提取物的制備方法為取金鐵鎖適量，粉碎成粗粉，加8倍量75％的乙醇回流提取2次，每次2小時，濾過，合并濾液，減壓回收乙醇，余液濃縮至相對密度為1.25的稠膏，減壓干燥，即得。
按上述金鐵鎖提取物制備方法提取得到的金鐵鎖提取物。
由上述金鐵鎖提取物組成的藥物組合物包括作為活性成分的金鐵鎖提取物和一種或多種藥用載體或賦形劑。
本發明金鐵鎖提取物用于制備治療自身免疫性疾病的藥物。
所述的自身免疫性疾病為類風濕關節炎、腎小球腎炎、腎病綜合癥、橋本氏甲狀腺炎、系統性紅斑狼瘡、特發性血小板減少紫癜、白塞氏病、自身免疫性肝炎或免疫性血管病。
本發明金鐵鎖提取物用于制備治療炎性疾病的藥物。
所述的炎性疾病為風濕性關節炎。
本發明金鐵鎖提取物可單獨或以藥物組合物形式使用，因此還涉及含有作為活性成份的有效劑量的金鐵鎖提取物以及常規藥物賦形劑或輔劑的藥物組合物。通常本發明藥物組合物含有0.1-90％重量的金鐵鎖提取物。藥物組合物可根據本領域已知的方法制備。如果需要，可將金鐵鎖提取物與一種或多種固體或液體藥物賦形劑和/或輔劑結合，制成可作為人用的適當的施用形式或劑量形式。
本發明的金鐵鎖提取物或含有它的藥物組合物可以單位劑量形式給藥，給藥途徑可為腸道或非腸道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮膚、腹膜或直腸等。給藥劑型例如片劑、膠囊、滴丸、氣霧劑、丸劑、粉劑、溶液劑、混懸劑、乳劑、顆粒劑、脂質體、透皮劑、口含片、檢劑、膏劑、貼劑、注射劑、凍干粉針劑等。可以是普通制劑、緩釋制劑、控釋制劑及各種微粒給藥系統。為了將單位給藥劑型制成片劑，可以廣泛使用本領域公知的各種載體例如稀釋劑與吸收劑，如淀粉、糊精、硫酸鈣、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化鈉、葡萄糖、尿素、碳酸鈣、白陶土、微晶纖維素、硅酸鋁等；濕潤劑與粘合劑，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉漿、糊精、糖漿、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯膠漿、明膠漿、羧甲基纖維素鈉、紫膠、甲基纖維素、磷酸鉀、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解劑，如干燥淀粉、海藻酸鹽、瓊脂粉、褐藻淀粉、碳酸氫鈉與枸櫞酸、碳酸鈣、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等；崩解抑制劑，如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氫化油等；吸收促進劑，如季銨鹽、十二烷基硫酸鈉等；潤滑劑，如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸鹽、硼酸、液體石蠟、聚乙二醇等。還可以將片劑進一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、腸溶包衣片，或雙層片、多層片。為了將給藥單元制成丸劑，可以廣泛使用本領域公知的各種載體例如稀釋劑與吸收劑，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氮化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、高嶺土、滑石粉等；粘合劑如阿拉伯膠、黃蓍膠、明膠、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解劑，如瓊脂粉、干燥淀粉、海藻酸鹽、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等。為了將給藥單元制成檢劑，可以廣泛使用本領域公知的各種載體例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高級醇、高級醇的酯、明膠、半合成甘油酯等。為了將給藥單元制成膠囊，將有效成分金鐵鎖提取物與上述的各種載體混合，并將由此得到的混合物置于硬的明膠囊或軟膠囊中。也可將有效成分金鐵鎖提取物制成微囊劑，混懸于水性介質中形成混懸劑，亦可裝入硬膠囊中或制成注射劑應用。為了將給藥單元制成注射用制劑，如溶液劑、乳劑、凍干粉針劑和混懸劑，可以使用本領域常用的所有稀釋劑，例如水、乙醇、聚乙二醇、1，3-丙二醇、乙氧基化的異硬脂醇、多氧化的異硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，為了制備等滲注射液，可以向注射用制劑中添加適量的氯化鈉、葡萄糖或甘油，此外，還可以添加常規的助溶劑、緩沖劑、pH調節劑等。
此外，如需要，也可以向藥物制劑中添加著色劑、防腐劑、香料、矯味劑、甜味劑或其它材料。
本發明金鐵鎖提取物的給藥劑量取決于許多因素，例如所要預防或治療疾病的性質和嚴重程度，患者或動物的性別、年齡、體重及個體反應，所用的具體化合物，給藥途徑及給藥次數等。上述劑量可以單一劑量形式或分成幾個，例如二、三或四個劑量形式給藥。
為了驗證本發明制備方法的合理性，申請人對金鐵鎖的提取工藝進行了試驗研究和篩選，具體如下一、金鐵鎖水提取工藝的研究影響煎煮的主要因素有藥材粉碎粒度、煎煮次數、加水量及煎煮時間等，申請人經過研究發現通過以下方法優選出的提取工藝可以認為是金鐵鎖的最佳水提取工藝，所得的提取物療效最好。
取金鐵鎖藥材適量，按下表1試驗，以出膏率及金鐵鎖的藥理活性評分作為評價指標進行提取工藝的優選，結果見表2、表3表1金鐵鎖提取工藝研究的因素水平表
表2金鐵鎖提取工藝優選結果表
表3正交試驗方差分析表
注F0.05(2，2)＝19.00研究結果表明各因素對金鐵鎖水提取工藝影響大小的順序為C＞B＞A＞D，其中B、C兩個因素有顯著性差異，B2＞B3＞B1，C2＞C3＞C1，因此，提取次數選2次，加水量選10倍；A、D兩個因素沒有顯著性差異，但考慮到生產實際，選擇粗粉，以方便過濾提取液，煎煮時間第一次定為2小時，第二次定為1.5小時。
因此，金鐵鎖水提取物的最佳提取工藝為取金鐵鎖適量，粉碎成粗粉，加10倍量的水煎煮2次，第一次2小時，第二次1.5小時，濾過，合并濾液。
金鐵鎖藥材經水提濃縮后，除雜相當關鍵，申請人采用不同濃度的乙醇進行醇沉以除去雜質，方法如下
取金鐵鎖粗粉，按優選的水提煎煮條件煎煮提取，減壓濃縮(60-75℃，-0.08Mpa)至相對相密度1.30(60℃)，搖勻，量取一定量濃縮液，加乙醇，使乙醇含量為60％、70％、80％，醇沉24小時，取上清液減壓回收乙醇，揮干，減壓干燥(65-80℃，-0.08Mpa)，稱醇提物重量；醇沉物減壓干燥(65-80℃，-0.08Mpa)，稱雜質重量。測定醇提物的藥理活性，試驗結果見表4。
表4除雜工藝研究結果表
研究結果表明醇沉濃度為70％時，除去的雜質最多，同時藥理活性最高，因此，選用70％的乙醇濃度作為去除雜質的濃度。
濃縮工藝的研究申請人考察了減壓濃縮和常壓濃縮兩種方法，經過優選發現，減壓濃縮和常壓濃縮兩種方法比較，減壓濃縮較常壓濃縮快，節約時間，且藥理活性比常壓濃縮高，因此，選擇減壓濃縮作為本提取物制備的濃縮方法。
干燥工藝申請人研究發現，干燥溫度對提取物的藥理活性有一定的影響，本提取物在75℃減壓干燥的藥理活性最好，因此，選擇75℃減壓干燥作為本提取物的干燥方法。
二、金鐵鎖醇提取工藝的研究影響提取的主要因素有提取次數、溶媒用量、溶媒濃度及提取時間等，申請人經過研究發現通過以下方法優選出的提取工藝可以認為是金鐵鎖的最佳醇提取工藝，所得的提取物療效最好。
取金鐵鎖藥材適量，粉碎成細粉，按表5進行試驗，結果見表6、表7表5金鐵鎖醇提取工藝研究的因素水平表
表6金鐵鎖醇提取工藝優選結果表
表7正交試驗方差分析表
注F0.05(2，2)＝19.00研究結果表明各因素對金鐵鎖醇提取工藝影響大小順序為C＞B＞A＞D，通過直觀分析，選擇C2、B2、A2、D2作為最佳提取工藝，即金鐵鎖適量，粉碎成粗粉，加8倍量75％的乙醇回流提取2次，每次2小時，濾過，合并濾液，減壓回收乙醇，余液濃縮至相對密度為1.25的稠膏，減壓干燥，即得金鐵鎖醇提取物。
為了確保本發明的效果，申請人對所述金鐵鎖提取物進行了生物活性實驗，具體如下觀察指標雞蛋清致大白鼠足跖腫脹實驗(抗急性炎癥作用)；小白鼠扭體實驗(鎮痛作用)；環磷酰胺誘導小鼠遲發性超敏反應(免疫抑制作用)；小鼠脾淋巴細胞的增殖反應(體內)。
該生物活性實驗所采用的金鐵鎖提取物均為用乙醇作為提取溶劑得到的提取物。
1.金鐵鎖提取物對雞蛋清致大白鼠后足跖腫脹的影響方法及結果取Wistar大白鼠30只，稱重，用苦味酸標記，分為3組將大鼠右后肢用手固定，在其踝關節處用圓珠筆作一標志，動物的右后肢浸入足容量測量裝置內，浸入深度以標志處為界。從該裝置的刻度吸管處所讀取的數值即為動物右足的正常體積。連續測兩次，求其平均值。給3組動物分別灌胃以下藥物金鐵鎖提取物制得的溶液，氫化可的松，生理鹽水，容量均為1ml/100g。30min后在每鼠右后肢掌心向踝關節方向進針，皮下注射10％雞蛋清液0.1ml/只。其后每0.5小時分別測定鼠右后肢的容積，連續3次。
實驗結果(表8)表明，金鐵鎖提取物具有良好的抗炎作用(比氫化可的松強)。
表8金鐵鎖提取物對雞蛋清致大白鼠后足跖腫脹的影響
注**表示與生理鹽水組比較差異極顯著(P＜0.01)2.金鐵鎖提取物對小白鼠的鎮痛作用(扭體法)方法及結果昆明種小白鼠40只，體重18-22g，♀♂各半，將小白鼠腹部的毛剪掉，隨機分為2組，每組20只。給藥組灌服金鐵鎖提取物0.3g/10g，對照組灌服等量生理鹽水。給藥后30min，各鼠腹腔注射0.6％醋酸溶液0.2ml/只。觀察并記錄注射醋酸溶液后15-30min內出現扭體反應的次數及時間。計算金鐵鎖提取物的鎮痛百分率。結果見表9。
結果表明金鐵鎖提取物對醋酸所致小白鼠扭體反應有明顯的抑制作用。
表9對醋酸所致小白鼠扭體反應的影響(x±s)
3.金鐵鎖提取物對環磷酰胺誘導小鼠遲發性超敏反應的影響方法及結果昆明種小白鼠32只，隨機分為4組，每組8只，即正常對照組(0.5％CMC-Na0.2mL/10g)、陽性對照組(強的松)5mg/kg、金鐵鎖提取物低、高劑量組，劑量分別為5％、10％，各動物均為1次/dig。各組動物按上述劑量連續給藥7d；于實驗的第4天以1％DNCB丙酮麻油液致敏，致敏前1天開始皮下注射給藥，每日1次，連續6d，致敏后第5天用1％二硝基氟苯10μl涂右耳耳郭兩面進行攻擊，24h后，頸椎脫臼處死小鼠，剪下左右耳郭，用直徑8mm不銹鋼銃子沖下耳片，稱重，同時取小鼠胸腺和脾臟，稱重，以左右耳片重量差為腫脹度，計算胸腺指數和脾臟指數。結果見表10。
結果表明金鐵鎖提取物對環磷酰胺誘導小鼠遲發性超敏反應有明顯的抑制作用。
表10對小鼠遲發性超敏反應的影響
4.口服金鐵鎖提取物對小鼠脾細胞增殖反應的影響LACA小鼠，♀，6-8wk，隨機分成3組即對照組、金鐵鎖提取物0.6g/kg和1.2g/kg兩劑量組，每組10只。給藥組每天口服給藥，共5天。對照組用等體積的生理鹽水代替。第六天處死小鼠，無菌取脾制備脾細胞懸液，用RPMI-1640(含10％胎牛血清)培養液調整細胞濃度為5×106/ml，取100μl細胞懸液和等量1640或ConA(終濃度0.5μg/ml)加入96孔培養板內，于5％CO2、37℃溫箱孵育54小時，每孔加入20μl3H-TdR(10μCi/ml)，繼續培養至72小時，以多道細胞收集儀收集細胞于濾紙上，干燥后以液體閃爍記數儀測cpm值。每個樣品10個平行孔，結果用平均cpm值表示。
實驗結果表明口服給予0.6g/kg或1.2g/kg金鐵鎖提取物，對LACA小鼠脾細胞增殖反應有顯著的抑制作用，并有計量依賴關系。結果見表11表11口服金鐵鎖提取物對LACA小鼠脾細胞增殖反應的影響
*p＜0.05，**p＜0.01(與對照組比較)結論上述四個實驗結果表明，金鐵鎖提取物對小鼠脾細胞增殖反應具有明顯的抑制作用；具有明顯的鎮痛、抗炎作用；具有顯著的免疫抑制作用；對遲發性超敏反應具有很好的抑制作用。
具體實施例方式本發明的實施例1金鐵鎖水提取物的制備取金鐵鎖根干品10kg，粉碎成粗粉，加10倍量水煎煮2次，第一次2小時，第二次1.5小時，濾過，合并濾液，濃縮至60℃測相對密度為1.30，放冷，加入乙醇使含醇量為70％，靜置過夜，取上清液減壓濃縮至相對密度為1.25的稠膏，75℃減壓干燥，即得金鐵鎖水提取物510g。
本發明的實施例2金鐵鎖乙醇提取物的制備取金鐵鎖根干品10kg，粉碎成粗粉，加8倍量75％的乙醇回流提取2次，每次2小時，濾過，合并濾液，減壓回收乙醇，余液濃縮至相對密度為1.25的稠膏，減壓干燥，即得金鐵鎖乙醇提取物480g。
本發明的實施例3金鐵鎖石油醚提取物的制備將金鐵鎖根干品10kg粉碎后，用石油醚加熱回流提取，每次用石油醚40L，提取3次，合并提取液，減壓蒸發至干，得到石油醚提取物420g。
本發明的實施例4金鐵鎖乙酸乙酯水溶液提取物的制備將金鐵鎖根干品10kg粉碎后，用乙酸乙酯水溶液加熱回流提取，每次用乙酸乙酯水溶液60L，提取2次，合并提取液，減壓蒸發至干，得到乙酸乙酯水溶液提取物420g。
本發明的實施例5金鐵鎖三氯甲烷提取物的制備將金鐵鎖根干品10kg粉碎后，用三氯甲烷滲濾提取，每次用三氯甲烷30L，提取4次，合并提取液，減壓蒸發至干，得到三氯甲烷提取物380g。
本發明的實施例6含金鐵鎖提取物的藥物組合物1金鐵鎖水提取物200g，土溫-80 4g，植物油196g，以上三味混合，用膠體磨混勻，壓制成1000粒軟膠囊。本制劑口服，每次4粒，每日3次，用于治療自身免疫性疾病如類風濕關節炎、腎小球腎炎、腎病綜合癥、橋本氏甲狀腺炎、系統性紅斑狼瘡、特發性血小板減少紫癜、白塞氏病、自身免疫性肝炎或免疫性血管病。
本發明的實施例7含金鐵鎖提取物的藥物組合物2按下述配比稱取原料金鐵鎖300g、見血飛200g、黑骨藤200g。以上三味，加水煎煮二次，每次2小時，濾過，濾液濃縮至相對密度為1.20(60℃)，加乙醇至濃度為70％，靜置過夜，取上清夜，濃縮，減壓干燥，加入淀粉等輔料適量，粉碎成細粉，裝膠囊，即得膠囊劑。本制劑口服，每次4粒，每日3次，用于治療自身免疫性疾病如類風濕關節炎、腎小球腎炎、腎病綜合癥、橋本氏甲狀腺炎、系統性紅斑狼瘡、特發性血小板減少紫癜、白塞氏病、自身免疫性肝炎或免疫性血管病。
本發明的實施例8含金鐵鎖提取物的藥物組合物3按下述配比稱取原料金鐵鎖300g、獨活150g、羌活150g、川芎150g、乳香100g、紅花100g、杜仲50g、黃芪50g。以上八味，加10倍量水煎煮二次，第一次2小時，第二次1.5小時，濾過，合并濾液，濃縮至相對密度為1.20(60℃)，加乙醇至濃度為70％，靜置過夜，取上清夜，濃縮，減壓干燥，加入淀粉等輔料適量，按照常規工藝壓制成1000片。本制劑口服，每次3片，每日3次，用于炎性疾病如風濕性關節炎的治療。
本發明的實施例9金鐵鎖提取物單方制劑取金鐵鎖提取物150g、植物油117.6g、蜂蠟2.4g混勻，用膠體研磨機研磨均勻，用壓制法罐裝成軟膠囊，制成1000粒，每粒0.3g。本制劑口服，一次3粒，一日3次。用于治療跌打損傷、創傷出血、風濕疼痛等。
權利要求
1.金鐵鎖提取物的制備方法，其特征在于將新鮮采集的金鐵鎖根晾干粉碎，得到金鐵鎖粗粉，然后用有機溶劑、含水有機溶劑或水加熱回流或滲濾提取2～4次，提取液濃縮干燥后得到金鐵鎖提取物。
2.按照權利要求1所述金鐵鎖提取物的制備方法，其特征在于所述的有機溶劑為甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、丙酮、三氯甲烷、二氯甲烷、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙醚、石油醚或汽油。
3.按照權利要求1或2所述金鐵鎖提取物的制備方法，其特征在于取金鐵鎖適量，粉碎成粗粉，加10倍量水煎煮2次，第一次2小時，第二次1.5小時，濾過，合并濾液，濃縮至60℃測相對密度為1.30，放冷，加入乙醇使含醇量為70％，靜置過夜，取上清液減壓濃縮至相對密度為1.25的稠膏，75℃減壓干燥，即得金鐵鎖水提取物。
4.按照權利要求1或2所述金鐵鎖提取物的制備方法，其特征在于取金鐵鎖適量，粉碎成粗粉，加8倍量75％的乙醇回流提取2次，每次2小時，濾過，合并濾液，減壓回收乙醇，余液濃縮至相對密度為1.25的稠膏，減壓干燥，即得金鐵鎖醇提取物。
5.如權利要求1所述金鐵鎖提取物制備方法提取得到的金鐵鎖提取物。
6.如權利要求5所述的金鐵鎖提取物組成的藥物組合物，其特征在于包括作為活性成分的金鐵鎖提取物和一種或多種藥用載體或賦形劑。
7.如權利要求5所述的金鐵鎖提取物用于制備治療自身免疫性疾病的藥物。
8.按照權利要求7所述金鐵鎖提取物的用途，其特征在于所述的自身免疫性疾病為類風濕關節炎、腎小球腎炎、腎病綜合癥、橋本氏甲狀腺炎、系統性紅斑狼瘡、特發性血小板減少紫癜、白塞氏病、自身免疫性肝炎或免疫性血管病。
9.如權利要求5所述的金鐵鎖提取物用于制備治療炎性疾病的藥物。
10.按照權利要求9所述金鐵鎖提取物的用途，其特征在于所述的炎性疾病為風濕性關節炎。
全文摘要
本發明提供了一種金鐵鎖提取物及其制備方法、藥物組合物和用途。金鐵鎖提取物是將新鮮采集的金鐵鎖根晾干粉碎，得到金鐵鎖粗粉，然后用有機溶劑、含水有機溶劑或水加熱回流或滲濾提取2～4次，提取液濃縮干燥后得到的。本發明金鐵鎖提取物具有顯著的免疫抑制作用和鎮痛、抗炎效應，特別是對自身免疫性疾病，如類風濕關節炎、腎小球腎炎、腎病綜合癥、橋本氏甲狀腺炎、系統性紅斑狼瘡、特發性血小板減少紫癜、白塞氏病、自身免疫性肝炎、免疫性血管病；炎性疾病，如風濕性關節炎具有治療作用。
文檔編號A61P29/00GK1931213SQ200610200929
公開日2007年3月21日 申請日期2006年9月27日 優先權日2006年9月27日
發明者陳華國, 周欣, 趙超 申請人:貴州師范大學