專利名稱：雙樹脂法制備高質量的銀杏葉活性成分提取物的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種應用現代天然植物藥用成分的提取純化技術制備富含活性成分的銀杏葉提取物的方法。
背景技術：
銀杏葉提取物主要含有黃酮類化合物和銀杏葉萜內酯等多種生理活性成分，對于人體具有比較好的保健和治療功能，尤其是作為治療心腦血管疾病和血小板活化因子拮抗劑，備受國內外患者歡迎。
我國是銀杏葉的故鄉，目前我國銀杏葉資源占全世界的70％。歐美和東亞各國爭先從我國進口銀杏葉，用來提取分離其中有效成分，生產各種制劑。大量銀杏葉資源的出口推動了國外制藥企業的發展，而對于我國來說，銀杏葉資源的大量出口只能賺取少量外匯，不能給銀杏葉種植業帶來更高的效益。這與我國是銀杏葉主產國的地位極不相稱，再加上我國現階段的技術水平有限，導致了銀杏葉產品的收率低、產品質量波動等問題，造成了國有資源的嚴重浪費。近年來，雖然有部分產品面世，但多屬于初級產品。因此，制備富含有效成分的高質量銀杏葉提取物，對于提高我國銀杏葉產品競爭力和經濟發展有著極其重要的意義。
銀杏葉有效成分(黃酮類化合物和銀杏葉內酯)的提取分離直接決定著銀杏葉的藥用價值。目前國際上公認的銀杏葉制劑的含量標準為黃酮類化合物＝24％，銀杏總內酯＝6％。從銀杏葉浸取液中富集分離銀杏葉中活性成分主要為有機溶劑萃取法(如中國專利文獻公開的申請號為02808099.8的技術方案)和單樹脂吸附法。前者殘留溶劑和生產成本高，后者產物純度高，收率高。但是后者因為受到銀杏葉原料、采摘時間和富集分離過程等因素的影響，銀杏葉提取物的質量出現嚴重的不穩定，直接影響到了銀杏葉制劑的療效。為此，尋找一種既能滿足國際標準各種制劑要求，又能有效控制產品質量波動的富含有效成分的高質量銀杏葉提取物已成必然。
發明內容
本發明的目的是提出一種富含活性成分的高質量銀杏葉提取物的制備及制作工藝。
本發明的主旨是應用ADS-17和ADS-F8雙樹脂法制備富含活性成分的高質量銀杏葉提取物，其包含以下連續的步驟(1)取一定量的ADS-17和ADS-F8樹脂，用自來水瓢去懸浮于表面碎小的樹脂，采用濕法裝入層析柱(樹脂中間不能有氣泡)，用無水乙醇浸泡24h，使之充分溶脹，而后用無水乙醇洗至洗出液中加少量蒸餾水(1mL洗滌液中加入4mL蒸餾水)無白色渾濁為止，再用蒸餾水洗滌樹脂至不含乙醇。然后進行鹽酸轉型，即用pH為3.5的蒸餾水過柱，至流出液的pH為3.5為止。
(2)采購的干綠色銀杏葉在55～65℃下進一步烘干、去雜、粉碎，過20或40目篩，然后利用現有技術用50％或60％或70％乙醇在68～72℃分別回流攪拌提取2-3次，每次120～150分鐘，合并提取液。
(3)提取液保溫在38～42℃下，先后加入ZTC-II型天然澄清劑B和A(B是用1％醋酸溶液配制成的質量百分比為1％的溶液，A是用蒸餾水配制成的質量百分比為1％的溶液)。澄清劑B與提取液作用30～50分鐘，再加入澄清劑A與提取液再作用30～50分鐘。其中每升提取液加澄清劑B的量為1.2～1.6g，澄清劑A的量為B的一半。而后過濾或離心，除去沉降物，減壓濃縮，回收乙醇。
(4)濃縮液加2～3倍體積的水，沉淀8～12小時，過濾或離心，得上柱液a。
(5)將上柱液a的pH值用鹽酸調至3.5，而后上ADS-17樹脂柱，樹脂柱的高徑比控制在15～30，流出液進行飽和檢驗(取2滴流出液置于白色板上，加乙酸一滴，加入1％硫酸亞鐵一滴，如溶液為深藍色或黑色，則柱已飽和，如不變色，則柱未飽和。)，如飽和則停止上樣，用2～3倍柱床體積的水過柱沖洗，然后用pH為7.0的50％或60％或70％乙醇溶液洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮，回收乙醇，至無懸濁物出現，得上柱液b。
(6)在上柱液b中加入其1～2倍體積的10％或15％的乙醇溶液稀釋后，用鹽酸調其pH為3.5，而后再上ADS-F8樹脂柱，樹脂柱的高徑比控制在10～20，收集流出液，流出液進行飽和檢驗(采用NaNO2-Al(NO)3-NaOH分光光度法進行黃酮飽和吸附檢測)，如有黃酮檢出，則停止上樣，用10％～20％的乙醇過柱沖洗，并收集洗滌液；而后再用pH為9.0左右的70％或80％或90％的乙醇洗脫柱子，收集洗脫液；合并流出液和洗滌液，減壓濃縮，回收乙醇后噴霧干燥或冷凍干燥得銀杏內酯產品。減壓濃縮洗脫液，噴霧干燥或冷凍干燥得銀杏黃酮產品。其中銀杏內酯產品中含35％～45％的銀杏總內酯，銀杏黃酮產品中含70％～85％的銀杏總黃酮。
(7)銀杏內酯產品和銀杏黃酮產品中的銀杏酸經高效液相色譜檢測，其含量均低于5ug/g。
(8)銀杏內酯產品和銀杏黃酮產品可根據成品的不同要求，可按比例配制各種口服或外用劑型的藥品和保健品；也可以進一步的分離純化出單組分產品，制作成注射用針劑。
本發明與現有的有機溶劑萃取和單樹脂吸附技術相比，具有工藝路線合理，提取率高，有效成分含量高，并根據產品的不同要求，可按比例配制各種劑型的產品，不僅有效的控制質量波動問題，而且能配制成療效更明確、服用更方便的銀杏葉制劑，并易于實現工業化生產。使我國銀杏葉資源能得到更充分的利用，在國際上使中藥樹立起不敗的地位。
以下結合實施例對本發明作進一步的說明，但本發明也不僅限于實施例的內容。
實施例一取ADS-17和ADS-F8樹脂各50kg，分別加水浸泡12小時，瓢去懸浮于表面碎小的樹脂，采用濕法裝入層析柱(樹脂中間不能有氣泡)，用無水乙醇浸泡24h，使之充分溶脹，而后用無水乙醇洗至洗出液中加少量蒸餾水(1mL洗滌液中加入4mL蒸餾水)無白色渾濁為止，再用蒸餾水洗滌樹脂至不含乙醇。然后進行鹽酸轉型，即用pH為3.5的蒸餾水過柱，至流出液的pH為3.5為止。
采購的干綠色銀杏葉在55～65℃下進一步烘干、去雜、粉碎，過20目篩，稱取100kg，置于提取罐中，加入1000L50％乙醇溶液，在68～72℃下回流攪拌提取150分鐘，停止攪拌，過濾，再重復提取一次，兩次提取液合并。直接加入已經配制好的ZTC-II型天然澄清劑B組分(其用量為1.2g/L)，在40℃下保溫40分鐘，再加入配制好的A組分(其用量為0.6g/L)在40℃下繼續保溫40分鐘。然后以3500r/min離心15分鐘，倒出上清液，減壓回收乙醇至無味。在濃縮液中加入其2倍體積的水靜置8小時，過濾，適度濃縮即得上柱液a。
將上柱液a的pH值用3mol/L鹽酸調至3.5，而后上ADS-17樹脂層析柱，樹脂柱的高徑比為15，上柱流速為3BV/小時，流出液進行飽和檢驗(取2滴流出液置于白色板上，加乙酸一滴，加入1％硫酸亞鐵一滴，如溶液為深藍色或黑色，則柱已飽和，如不變色，則柱未飽和。)，如飽和則停止上樣，用3倍柱床體積的水過柱沖洗，水洗流速為5BV/小時，然后用pH為7.0的50％乙醇溶液洗脫，洗脫流速為1.5BV/小時，收集洗脫液，減壓濃縮，回收乙醇，至無懸濁物出現，得上柱液b。
在上柱液b中加入其2倍體積的10％的乙醇溶液稀釋后，用鹽酸調其pH為3.5，而后再上ADS-F8樹脂層析柱，樹脂柱的高徑比為10，收集流出液，上柱流速為3BV/小時，流出液進行飽和檢驗(采用NaNO2-Al(NO)3-NaOH分光光度法進行黃酮飽和吸附檢測)，如有黃酮檢出，則停止上樣，用pH為3.5的20％乙醇溶液過柱沖洗，洗滌流速為4BV/小時，并收集洗滌液；而后再用pH為9.0左右的70％乙醇溶液洗脫層析柱，洗脫流速為1.5BV/小時，收集洗脫液；合并流出液和洗滌液，減壓濃縮，回收乙醇后噴霧干燥得銀杏內酯產品。減壓濃縮洗脫液，噴霧干燥得銀杏黃酮產品。其中銀杏內酯產品中含35.8％的銀杏總內酯，銀杏黃酮產品中含72.3％的銀杏總黃酮。
銀杏內酯產品和銀杏黃酮產品中的銀杏酸經高效液相色譜檢測，其含量分別為4.2ug/g和4.8ug/g。
實施例二取ADS-17和ADS-F8樹脂各50kg，分別加水浸泡12小時，瓢去懸浮于表面碎小的樹脂，采用濕法裝入層析柱(樹脂中間不能有氣泡)，用無水乙醇浸泡24h，使之充分溶脹，而后用無水乙醇洗至洗出液中加少量蒸餾水(1mL洗滌液中加入4mL蒸餾水)無白色渾濁為止，再用蒸餾水洗滌樹脂至不含乙醇。然后進行鹽酸轉型，即用pH為3.5的蒸餾水過柱，至流出液的pH為3.5為止。
采購的干綠色銀杏葉在55～65℃下進一步烘干、去雜、粉碎，過20目篩，稱取100kg，置于提取罐中，加入900L60％乙醇溶液，在68～72℃下回流攪拌提取140分鐘，停止攪拌，過濾，再重復提取一次，兩次提取液合并。直接加入已經配制好的ZTC-II型天然澄清劑B組分(其用量為1.4g/L)，在40℃下保溫50分鐘，再加入配制好的A組分(其用量為0.7g/L)在40℃下繼續保溫50分鐘。然后以3500r/min離心15分鐘，倒出上清液，減壓回收乙醇至無味。在濃縮液中加入其3倍體積的蒸餾水靜置8小時，過濾，適度濃縮即得上柱液a。
將上柱液a的pH值用3mol/L鹽酸調至3.5，而后上ADS-17樹脂層析柱，樹脂柱的高徑比為25，上柱流速為3BV/小時，流出液進行飽和檢驗(取2滴流出液置于白色板上，加乙酸一滴，加入1％硫酸亞鐵一滴，如溶液為深藍色或黑色，則柱已飽和，如不變色，則柱未飽和。)，如飽和則停止上樣，用3倍柱床體積的水過柱沖洗，水洗流速為5BV/小時，然后用pH為7.0的60％乙醇溶液洗脫，洗脫流速為1.5BV/小時，收集洗脫液，減壓濃縮，回收乙醇，至無懸濁物出現，得上柱液b。
在上柱液b中加入其2倍體積的10％的乙醇溶液稀釋后，用鹽酸調其pH為3.5，而后再上ADS-F8樹脂層析柱，樹脂柱的高徑比為15，上柱流速為3BV/小時，收集流出液，流出液進行飽和檢驗(采用NaNO2-Al(NO)3-NaOH分光光度法進行黃酮飽和吸附檢測)，如有黃酮檢出，則停止上樣，用pH為3.5的20％乙醇溶液過柱沖洗，洗滌流速為4BV/小時，并收集洗滌液；而后再用pH為9.0左右的80％乙醇溶液洗脫層析柱，洗脫流速為1.5BV/小時，收集洗脫液；合并流出液和洗滌液，減壓濃縮，回收乙醇后噴霧干燥得銀杏內酯產品。減壓濃縮洗脫液，噴霧干燥得銀杏黃酮產品。其中銀杏內酯產品中含40.4％的銀杏總內酯，銀杏黃酮產品中含78.7％的銀杏總黃酮。
銀杏內酯產品和銀杏黃酮產品中的銀杏酸經高效液相色譜檢測，其含量分別為4.5ug/g和4.6ug/g。
實施例三取ADS-17和ADS-F8樹脂各50kg，分別加水浸泡12小時，瓢去懸浮于表面碎小的樹脂，采用濕法裝入層析柱(樹脂中間不能有氣泡)，用無水乙醇浸泡24h，使之充分溶脹，而后用無水乙醇洗至洗出液中加少量蒸餾水(1mL洗滌液中加入4mL蒸餾水)無白色渾濁為止，再用蒸餾水洗滌樹脂至不含乙醇。然后進行鹽酸轉型，即用pH為3.5的蒸餾水過柱，至流出液的pH為3.5為止。
采購的干綠色銀杏葉在55～65℃下進一步烘干、去雜、粉碎，過20目篩，稱取100kg，置于提取罐中，加入800L70％乙醇溶液，在68～72℃下回流攪拌提取120分鐘，停止攪拌，過濾，再重復提取一次，兩次提取液合并。直接加入已經配制好的ZTC II型天然澄清劑B組分(其用量為1.6g/L)，在40℃下保溫30分鐘，再加入配制好的A組分(其用量為0.8g/L)在40℃下繼續保溫30分鐘。然后以3500r/min離心15分鐘，倒出上清液，減壓回收乙醇至無味。在濃縮液中加入其2倍體積的水靜置8小時，過濾，適度濃縮即得上柱液a。
將上柱液a的pH值用3mol/L鹽酸調至3.5，而后上ADS-17樹脂層析柱，樹脂柱的高徑比控制在30，上柱流速為3BV/小時，流出液進行飽和檢驗(取2滴流出液置于白色板上，加乙酸一滴，加入1％硫酸亞鐵一滴，如溶液為深藍色或黑色，則柱已飽和，如不變色，則柱未飽和。)，如飽和則停止上樣，用3倍柱床體積的水過柱沖洗，水洗流速為5BV/小時，然后用3倍柱床體積的pH為7.0的70％乙醇溶液洗脫，洗脫流速為1.5BV/小時，收集洗脫液，減壓濃縮，回收乙醇，至無懸濁物出現，得上柱液b。
在上柱液b中加入其一倍體積的15％的乙醇溶液稀釋后，用鹽酸調其pH為3.5，而后再上ADS-F8樹脂層析柱，樹脂柱的高徑比為20，收集流出液，上柱流速為3BV/小時，流出液進行飽和檢驗(采用NaNO2-Al(NO)3-NaOH分光光度法進行黃酮飽和吸附檢測)，如有黃酮檢出，則停止上樣，用pH為3.5的20％乙醇溶液過柱沖洗，洗滌流速為4BV/小時，并收集洗滌液；而后再用pH為9.0左右的70％乙醇溶液洗脫層析柱，洗脫流速為1.5BV/小時，收集洗脫液；合并流出液和洗滌液，減壓濃縮，回收乙醇后噴霧干燥得銀杏內酯產品。減壓濃縮洗脫液，噴霧干燥得銀杏黃酮產品。其中銀杏內酯產品中含43.6％的銀杏總內酯，銀杏黃酮產品中含84.9％的銀杏總黃酮。
銀杏內酯產品和銀杏黃酮產品中的銀杏酸經高效液相色譜檢測，其含量分別為4.1ug/g和4.9ug/g。
權利要求
1.應用ADS-17和ADS-F8雙樹脂法制備富含活性成分的高質量銀杏葉提取物，其包含以下連續的步驟(1)采用水-乙醇-鹽酸法進行樹脂預處理；(2)干綠色銀杏葉在68～72℃下回流攪拌提取；(3)提取液吸附澄清處理；(4)水法去除脂溶物；(5)柱層析除雜處理；(6)柱層析酮酯分離處理；(7)高效液相色譜檢測銀杏酸的含量；(8)配制各種劑型的產品。
2.根據權利要求1的方法，其特征在于第一次使用ADS-17和ADS-F8雙樹脂聯合法制備富含活性成分的高質量銀杏葉提取物。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于步驟(1)中進行了鹽酸轉型，且兩種層析柱的樹脂環境為pH＝3.5。
4.根據權利要求1至3所述的方法，其特征在于步驟(3)中首次使用了ZTC-II型天然澄清劑B和A對銀杏葉提取液進行了吸附澄清處理。澄清劑B與提取液作用30～50分鐘，再加入澄清劑A與提取液再作用30～50分鐘。其中每升提取液加澄清劑B的量為1.2～1.6g，澄清劑A的量為B的一半；作用溫度控制在38～42℃。
5.根據權利要求1至4的其中一項所述的方法，其特征在于步驟(4)中使用了水法去除脂溶物，所加水體積是濃縮提取液的2～3倍，靜置作用8～12小時。
6.根據權利要求1至5的其中一項所述的方法，其特征在于步驟(5)中首次使用ADS-17樹脂柱進行銀杏葉提取液第一步除雜處理。其中樹脂柱的高徑比控制在15～30，上柱流速為3BV/小時；用3倍柱床體積的水過柱沖洗，水洗流速為5BV/小時；用pH為7.0的50％或60％或70％乙醇溶液洗脫，洗脫流速為1.5BV/小時。
7.根據權利要求1至6的其中一項所述的方法，其特征在于步驟(6)中首次使用ADS-F8樹脂柱進行銀杏葉提取液第二步酮酯分離處理。其中上柱液中加入其2倍體積的10％的乙醇溶液稀釋后再上柱處理；樹脂柱的高徑比控制在10～20，上柱流速為3BV/小時；用20％乙醇溶液過柱沖洗，洗滌流速為4BV/小時；用pH為9.0的50％或60％或70％乙醇溶液洗脫層析柱，洗脫流速為1.5BV/小時。
8.根據權利要求1至7所述的方法，其特征在于步驟(6)和(7)中上柱液的pH值均為3.5。
9.銀杏內酯產品和銀杏黃酮產品，其可以按照權利要求1至8的其中一項所述的制備方法獲得。
10.權利要求9的銀杏內酯產品和銀杏黃酮產品，其特征在于銀杏內酯產品中含35％～45％的銀杏總內酯，銀杏黃酮產品中含70％～85％的銀杏總黃酮。
11.根據權利要求1的方法，其特征在于無需額外去除銀杏酸的工藝，銀杏內酯產品和銀杏黃酮產品中的銀杏酸的含量均低于5ug/g，達到了國際公認的EGb質量指標(銀杏酸含量須小于5ug/g)。
12.權利要求9的銀杏內酯產品和銀杏黃酮產品，其特征在于所述的方法是從干綠色銀杏葉的碎末開始進行的。
全文摘要
本發明涉及一種應用現代天然植物藥用成分的提取純化技術制備富含活性成分的銀杏葉提取物的方法。其方法與現有的有機溶劑萃取和單樹脂吸附技術相比，具有工藝路線合理，提取率高，有效成分含量高，并根據產品的不同要求，可按比例配制各種劑型的產品，不僅有效的控制質量波動問題，而且能配制成療效更明確、服用更方便的銀杏葉制劑，并易于實現工業化生產。
文檔編號A61K127/00GK1931199SQ200610200908
公開日2007年3月21日 申請日期2006年9月25日 優先權日2006年9月25日
發明者張黎明, 陸福平, 王艷 申請人:遼寧大生藥業有限公司