具有促進血管形成、組織再生及傷口愈合作用的多肽組合制劑的制作方法

專利名稱：具有促進血管形成、組織再生及傷口愈合作用的多肽組合制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一組具有促進新血管形成、組織再生及傷口愈合作用的活性小分子多肽由多種不同e胸腺素組成的組合制劑，其藥物組合物可用于促進皮膚、粘膜損傷的組織再生、 修復及愈合，改善缺血組織的血液供應。本發(fā)明藥物組合物也可用于增進皮膚健康和美容， 使皮膚濕潤、細嫩、柔軟、潔白，減少皮膚組織瘢痕的形成，還可用于促進毛發(fā)再生。背景皮膚是包裹在整個身體表面的一層被膜狀軟組織，是人體最大和最重要的器官之一，具 有感覺、調(diào)節(jié)體溫、吸收、分泌與排泄等重要生理功能，其完整性對機體維持正常生命活動 至關(guān)重要。皮膚充當?shù)钟獠壳趾Φ牡谝坏婪谰€，具有重要的屏障作用，因此也最易遭受各種損傷。常見的損傷因素有機械性如破裂、切割、摩擦；物理及化學性如燒燙傷、凍傷 及強酸、強鹼損傷；手術(shù)刀口；以及各種慢性疾病導致的皮膚損害如褥瘡、皮膚潰瘍等。 機體具有一定的再生修復能力。正常情況下， 一般傷口可以自然修復愈合。但往往受病人身 體素質(zhì)、創(chuàng)傷面積大小及嚴重程度和有無并發(fā)感染等因素的影響，多數(shù)情況下的傷口愈合需 要醫(yī)療干預。糖尿病所致的頑固性皮膚潰瘍就是實例之一。糖尿病是一種常見的疾病，主要 是由于血中胰島素絕對或相對不足，或靶細胞對胰島素敏感性降低，導致血糖過高，出現(xiàn)尿 糖，進而引起脂肪和蛋白質(zhì)代謝障礙。目前糖尿病的發(fā)病率，在我國已經(jīng)高達2%，其中30%_50% 的病人伴有皮膚損害，出現(xiàn)久治不愈的皮膚潰瘍，發(fā)生部位多在血液供應較差的下肢。許多 糖尿病患者因為小小的傷口不能愈合，最后導致截肢，甚至因感染而死亡。代謝障礙引起的 血管病變是造成這一皮膚組織病理性損傷的主要原因，治療的關(guān)鍵是增強機體修復機能，提 高組織的新陳代謝水平，改善微循環(huán)，促進皮膚組織再生愈合。除了皮膚損傷外，胃腸粘膜也容易受到損傷形成潰瘍(組織缺失)。在正常情況下，胃粘 膜表面有上皮細胞分泌的粘液覆蓋，且與互相緊密聯(lián)接的細胞及粘膜上皮有完整的上皮細胞 膜，共同形成粘液-粘膜屏障，保護胃粘膜，使其不被粗糙食物機械磨損，十二指腸上皮細胞 分泌堿性腸液中和胃酸。消化性潰瘍是一種常見疾病，據(jù)報道，消化性潰瘍患者約占全世界 人口的十分之一。全國以12億人口計，則目前我國患消化性潰瘍的人數(shù)己愈一億。由于消化 性潰瘍很高的發(fā)病率，致使治療該病的藥物具有較為廣闊的市場。消化性潰瘍的發(fā)生與前列 腺素生成、遺傳因素、精神緊張、飲食不規(guī)則、吸煙、藥物、環(huán)境等因素有關(guān)，并且大多數(shù) 消化性潰瘍患者的胃竇部粘摸存在幽門螺桿菌。消化性潰瘍多發(fā)生在暴露于酸和胃蛋白酶的 區(qū)域。最常見為十二指腸球部，稱十二指腸球部潰瘍胃小彎，稱胃潰瘍，還有幽門管潰瘍， 球后潰瘍，憩室潰瘍，吻合口潰瘍，空腸潰瘍和食管下的潰瘍等。當免疫防御機能和修復機 能低下時，不僅使其傷口感染率增加和病情加重，而且還造成組織修復的延遲甚至難以愈合， 修復質(zhì)量也較差，復發(fā)率較高，給患者帶來極大的不便和痛苦，嚴重的還會引發(fā)其它并發(fā)癥， 如感染性休克、消化道穿孔、癌變等，可危及生命。因此，增強機體再生修復能力，使其潰 瘍早日愈合是治療消化性潰瘍的一個重要方面。通常情況下，當傷口范圍較小或損傷較輕時，可通過自然愈合過程進行修復。自然愈合 的過程包括封閉傷口以限制血液流失并阻止感染；去除受損的組織及血凝塊；繼之周圍組 織中的成纖維細胞、纖維母細胞及血管內(nèi)皮細胞侵入傷口部位并形成肉芽組織，各種組織細 胞替代肉芽組織并重建組織結(jié)構(gòu)，使傷口完全愈合。表皮及其組織的再生修復是通過上皮細 胞遷移、細胞分裂和上皮分化三個過程來完成的。上皮受損后，缺損周圍上皮斷端的基底層 細胞向創(chuàng)面移動，上皮細胞分裂活躍，逐漸覆蓋傷口表面，上皮進一步分化，重建失去的組 織結(jié)構(gòu)和功能，如皮膚可以出現(xiàn)上皮的角化等。肉芽組織在傷口愈合過程中起以下幾方面重 要作用(1)抗感染及保護創(chuàng)面；(2)機化血凝快、壞死組織及其他異物；(3)填補傷口或 其他缺損。大約從第三天開始，傷口底部長出肉芽組織，并向傷口內(nèi)深入。肉芽組織的主要 成分是旺盛增生的新生毛細血管以及增生的纖維母細胞，其中還有多少不等的中性白細胞、 巨噬細胞等炎性細胞。最初由血小板發(fā)生聚集反應而分泌許多生長因子和細胞因子，然后由 巨噬細胞對低氧和乳酸中毒反應而分泌，這些因子能夠刺激血管生成。新生的毛細血管即開 始從業(yè)已存在的小靜脈抽芽并向受傷處生長，并相互連接形成毛細血管網(wǎng)。血管生成是組織 損傷修復的一個重要特征。目前臨床用于傷口愈合的新藥主要是各類生長因子，如表皮細胞生長因子，以及調(diào)節(jié)細 胞增殖和分化的蛋白轉(zhuǎn)化因子-B家族(TGF-B)?；蛑亟M牛鹼性成纖維細胞生長因子 (Recombinant bovine bFGF)及基因重組人表皮細胞生長因子(Recombinant human EGF)已 經(jīng)獲得批準用于臨床治療傷口愈合。正在進行臨床三期實驗的還有四種基因重組蛋白，包括 人成纖維細胞生長因子等。在傷口愈合療法中使用的這類治療蛋白存在價格昂貴，療效不確 定，不易儲存，長期使用有可能引發(fā)腫瘤形成等不足。蛋白不穩(wěn)定性(蛋白分解產(chǎn)物)還能引 起宿主意外的有害炎性反應。
我們經(jīng)過研究證明胸腺素ei6能調(diào)節(jié)肌動蛋白聚合，刺激血管內(nèi)皮細胞及皮膚上皮細胞遷移，具有明顯的促進新血管形成、促進上皮細胞角化、組織再生及傷口愈合作用。胸腺 素是存在于人體及動物體內(nèi)的一組小分子多肽，可分成a及P型。a型家族的主要代表是胸 腺素al,具有增強免疫功能的作用，已廣泛應用于臨床治療病毒性肝炎等。e型家族現(xiàn)已有16個成員，氨基酸序列具有高度同源性，其中含量最多、組織分布最廣的是胸腺素e4，其次是胸腺素ei0。胸腺素P4最早由胸腺中分離，具有43個氨基酸，分子量為4.9 KDa， 現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)該蛋白具有多種功能，包括調(diào)節(jié)肌動蛋白聚合、促進細胞分化和遷移、促進血管形 成、促進組織再生及傷口愈合等作用。胸腺素P15最初發(fā)現(xiàn)于前列腺癌細胞，而胸腺素3 16發(fā)現(xiàn)于人神經(jīng)母細胞瘤，各由45個氨基酸組成，分子量為5 KDa。胸腺素0 15和胸腺 素ei6的分布及功能研究甚少。我們通過對人正常皮膚組織進行免疫組化染色研究，觀察到表皮細胞內(nèi)含有大量胸腺素 P4、胸腺素P15及胸腺素ei6表達。已知胸腺素e4及胸腺素ei5均能促進血管生成。體 外刺激細胞運動實驗進一步證明，將胸腺素P4與胸腺素P16組合使用，其促進人臍帶靜脈 內(nèi)皮細胞定向移動的作用明顯增強。因此將幾種P胸腺素多肽按比例組成組合制劑，其增強 血管生成及傷口愈合的功能具有協(xié)同作用，優(yōu)于單獨使用一種e胸腺素。e胸腺素不同于市場上應用的或正在開發(fā)中的治療傷口愈合的藥物。P胸腺素不是生長 因子，與各種生長因子相比在治療傷口愈合上有以下幾方面優(yōu)點1)特異性地刺激上皮細胞 移動，促進上皮細胞角化；2)特異性地刺激血管內(nèi)皮細胞移動，促進血管形成；3)分子量 很小，只有四十幾個氨基酸(生長因子屬大分子蛋白)，易在組織內(nèi)擴散；4)無副作用，可 局部反復應用；5)不易被蛋白水解酶所降解，作用持續(xù)時間長，可減少用藥次數(shù)；6) P胸 腺素能直接作用于細胞骨架系統(tǒng)，具有支持細胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的作用。7)以上作用機制完全不 同于生長因子，不是通過直接刺激上皮細胞增殖，所以長期反復使用不會導致腫瘤發(fā)生。因此，由幾種e胸腺素多肽組成的組合制劑在組織再生修復，傷口愈合中作用明顯優(yōu)于生長因子，具有重要和廣泛的臨床應用價值。 本發(fā)明的描述本發(fā)明起始于研究胸腺素ei6對細胞分化及對細胞遷移的影響。離體試驗證明胸腺素P16作為細胞遷移促進因子可剌激人臍帶靜脈內(nèi)皮細胞及表皮細胞的定向移動。用Boyden Chomber方法測試了多種不同類型的細胞，證明胸腺素0 16能夠特異性地刺激人臍帶靜脈內(nèi) 皮細胞及表皮細胞的運動。細胞運動在傷口愈合中起重要作用。新生的毛細血管即開始從業(yè)
已存在的小靜脈抽芽并向傷口處生長，需要細胞運動；缺損周圍上皮斷端的基底層細胞向創(chuàng)面移動覆蓋傷口表面，需要細胞運動。胸腺素ei6能促進細胞遷移，因此具有加速傷口愈合的作用。本發(fā)明研究證明胸腺素e 16還具有調(diào)節(jié)肌動蛋白聚合的功能。肌動蛋白是細胞內(nèi)含量豐 富的蛋白質(zhì)，是細胞骨架蛋白，它能通過單體與聚合體形式的轉(zhuǎn)換參與多種細胞功能活動，如細胞運動、細胞收縮、吸收、分泌、代謝、DNA復制、細胞分裂等等。胸腺素P16能結(jié)合 到肌動蛋白單體上，通過抑制肌動蛋白的聚合來調(diào)節(jié)肌動蛋白的功能狀態(tài)，調(diào)節(jié)細胞的生理 功能，加速細胞運動、細胞分裂等細胞功能活動，增強細胞的抗損傷能力，促進新血管形成、 組織再生及傷口愈合。本發(fā)明確定了胸腺素ei6能夠在體內(nèi)有效地促進血管內(nèi)皮細胞移動，促進血管形成，促 進組織再生及傷口愈合。雞胚絨毛尿囊膜(CAM)血管形成試驗結(jié)果顯示，胸腺素ei6促進血管形成的效果與作為陽性對照的表皮細胞生長因子的效果相當或更好。動物傷口試驗顯示胸 腺素eie具有加速傷口愈合的效應。傷口局部用胸腺素ei6處理后，傷口面積比對照組縮 小一倍，傷口局部有完整的表皮再生，廣泛的新血管形成，膠原合成也明顯增加，傷口愈合 時間比對照組明顯縮短。本發(fā)明進一步通過對人正常皮膚組織進行免疫組化染色研究，觀察到表皮細胞內(nèi)含有大量胸腺素e4、胸腺素ei5及胸腺素ei6表達。多項研究表明胸腺素e4、胸腺素eis均有促進細胞運動及血管形成、促進組織再生及傷口愈合的作用。本發(fā)明用Boyden Chomber方 法測試人臍靜脈內(nèi)皮細胞及表皮細胞遷移，將胸腺素ei6與胸腺素e4按各50%的比例組合使用，其促進細胞運動的能力明顯強于單獨使用胸腺素ei6或胸腺素e4，說明兩種e胸腺素具有協(xié)同作用。如將幾種e胸腺素多肽按比例組成組合制劑，其增強血管生成及傷口愈合的功能會有協(xié)同作用，優(yōu)于單獨使用某一種e胸腺素。因此，本發(fā)明提供一種含有效量的e胸腺素組合制劑，或其可用鹽或其生理功能衍生物， 及可應用的載體配制而成的具有促進新血管形成、組織再生及傷口愈合作用的藥物組合物。本發(fā)明藥物組合物中的e胸腺素組合制劑，可由胸腺素eie與胸腺素e4按各種比例組 成，也可以由胸腺素ei6與胸腺素ei5按各種比例組成，還可以由胸腺素e 16與胸腺素e4及胸腺素ei5按各種比例組成。另外，該組合制劑還可由胸腺素e 16與胸腺素ei6的 多個同種異型體，如胸腺素e4、胸腺素e9、胸腺素eio、胸腺素eii、胸腺素ei2、胸腺素ei3、胸腺素P14、胸腺素P15以及上述同種異型體的氧化型按各種比例組成，也可以由胸腺素ei6與含LKKTET及含LKKTNT序列的不同大小的氨基酸片段及其氧化型按各種比例 組成，還可以由含LKKTET及含LKKTNT序列的不同大小的氨基酸片段及其氧化型按各種比例組成?？傊?，e胸腺素組合制劑可由e胸腺素及其氧化型、含LKKTET序列的氨基酸片段及其氧化型、以及含有LKKTNT序列的氨基酸片段及其氧化型按各種方式、各種比例組合。 以上均屬于本發(fā)明范疇。本發(fā)明可局部用于治療皮膚表層組織的擦傷、創(chuàng)傷、燒傷、燙傷、凍傷及其它形式的表 面損傷，各種皮膚病引起的皮膚損傷，皮膚深層組織的感染性潰瘍、營養(yǎng)障礙性潰瘍、堵塞 性潰瘍，眼角膜損傷、眼角膜潰瘍，也可用于某些疾病造成的胃腸粘膜損傷。另外，還可用 本發(fā)明的組合物處理外科手術(shù)造成的傷口，例如在手術(shù)皮膚傷口上涂布活性藥劑等，以加快 手術(shù)傷口愈合。本發(fā)明可用于治療消化性潰瘍?；加邢詽兊牟∪宋副诜置谡骋毫繙p少，胃酸分泌 量相應增多，過多的胃酸分泌對胃粘膜及對酸抵抗力較弱的十二指腸必然會導致消化與抗消 化的平衡失調(diào)，防御機能減弱，造成組織的自我消化。胃十二指腸潰瘍從粘膜開始并侵及粘膜下層，常深達肌層。e胸腺素組合制劑具有促進損傷局部血管形成，改善血液供應，使胃壁分泌粘液量增加，提高抗消化能力，促進損傷局部肉芽組織生長，填補缺損，促進組織再 生，加速傷口愈合。本發(fā)明可以用來治療由糖尿病引起的皮膚潰瘍。細小血管阻塞及循環(huán)障礙是長期患糖尿 病患者中常見的病理變化。糖尿病患者由于血糖持續(xù)偏高而導致血脂升高，小動脈出現(xiàn)動脈 粥樣硬化及血管阻塞，使得流至下肢的血液量減少。血液的功能是把營養(yǎng)物質(zhì)運送到身體的 各部組織，同時也把各組織中產(chǎn)生的廢物運送出體外，血液循環(huán)功能降低之后，首先受到影 響的便是腳部，因為腳部距離心臟最遠，血液最不容易到達。因此，下肢的皮膚及軟組織容 易缺血壞死，形成難以愈合的皮膚潰瘍。e胸腺素組合制劑可用于下肢皮膚潰瘍處，促進損 傷局部血管形成，改善血液供應，促進傷口愈合。本發(fā)明可以用來治療或預防由大皰性表皮松解癥及其各種原因引起的皮膚和周圍組織
的退化性變、自身免疫性疾病如銀屑病和其它紊亂癥狀。大皰性表皮松解癥是一種罕見的基 因紊亂性疾病，表現(xiàn)為皮膚水泡，進而導致開放性瘡傷、潰瘍和結(jié)疤。這種疾病的程度可從 輕微到嚴重性殘疾，甚至危機生命。P胸腺素組合制劑具有促進損傷組織修復、愈合的能力， 具有誘導末端脫氧核甘酸轉(zhuǎn)移酶、降低炎癥細胞因子或化學因子的水平，作為一種內(nèi)皮細胞 趨化因子和血管生成因子，從而治愈和預防患者的皮膚病變。本發(fā)明可以用來刺激器官組織的再生和修復。例如手術(shù)切除部分結(jié)腸或其它組織后，在 手術(shù)局部或全身給予本發(fā)明藥物組合物以促進器官組織的新生血管形成和組織再生，加快器 官的愈合過程。另一方面，本發(fā)明能減少疤痕組織的形成并促進由各種原因?qū)е碌陌毯劢M織的改建及吸 收。導致疤痕組織的各種因素包括手術(shù)過程，輻射，破傷，化學毒素，病毒及細菌感染或創(chuàng) 傷。本文使用的"疤痕組織"是指傷愈過程中和其它病理過程中形成纖維和膠原組織。例如，將e胸腺素組合制劑制成混合劑并投放在損傷組織附近，進而促進組織再生，血管增生及微循環(huán)系統(tǒng)形成，加速組織的改建，減少疤痕組織的形成。本發(fā)明可用于改善皮膚狀況及抗皮膚衰老作用，促進皮膚組織的代謝更新、增進皮膚健 康，使皮膚濕潤、細嫩、柔軟、潔白。角化是表皮細胞的最重要功能之一?；准毎饾u移 行到角質(zhì)層，由圓椎形細胞演變成無核扁平形的角質(zhì)細胞，這個演變所需的時間為生長周期， 約需3 4周，各層細胞轉(zhuǎn)換時間不同，稱為表皮換新率。皮膚衰老時表皮換新率逐漸降低。胸腺素具有明顯的促進上皮細胞遷移功能，能加速由深層的基底細胞向表面的角質(zhì)層過渡，從而促進上皮細胞角化，維持表皮的不斷代謝更新，因此e胸腺素組合制劑具有美容及抗皮膚衰老等作用。本發(fā)明為血液供應不足的某些組織提供了一種促進新血管增生的方法。各種原因?qū)е碌?毛囊血液供應減少可使毛囊營養(yǎng)不良(但無毛囊結(jié)構(gòu)破壞)，引起脫發(fā)。有效劑量的e胸腺 素組合制劑可以通過促進毛囊組織的血管增生而增加毛囊組織的血流量，改善血液供應，為 缺血的毛囊組織提供營養(yǎng)。此外，e胸腺素組合制劑還可以促進毛囊基底干細胞移行及基底 細胞的新生，促進毛發(fā)再生。所以，本發(fā)明藥物組合物可用于各種原因?qū)е碌拿摪l(fā)治療。本發(fā)明闡述的方法也可以應用于誘導性組織再生工程。目前，醫(yī)療人員在進行創(chuàng)傷性手
術(shù)時采用誘導性組織再生工程技術(shù)來促進和加快傷口愈合。方法是將具有促進組織細胞遷移、 分化的生物活性物質(zhì)殖入傷口處，使形成組織結(jié)構(gòu)的細胞在傷口處大量聚集。本發(fā)明可用于 幫助人或動物肉芽組織的再生。方法是將含有生物可吸收性的多聚體、可溶性的溶劑和e胸腺素組合制劑的復合物放置于人或動物肉牙組織再生處。該復合物通過釋放有效劑量的e胸 腺素組合制劑促進人或其它哺乳動物的肉芽組織再生。本發(fā)明描述的e胸腺素，包括但不限于胸腺素e4、胸腺素ei5及胸腺素ei6，是正常 機體內(nèi)固有的多肽成分。因此，使用高度純化的e胸腺素制劑安全、可靠。本發(fā)明的實施方 案中，e胸腺素可以是從組織細胞中分離提取，可以是直接化學合成，也可以是人工表達。 另外，各種能夠調(diào)節(jié)e胸腺素基因表達，誘發(fā)或刺激機體組織細胞產(chǎn)生e胸腺素的生物活性 物質(zhì)及化合物也可以加進本發(fā)明的藥物組合物中。這類試劑包括但不限于各類生長因子，如胰島素樣生長因子(IGF-1)、血小板來源的生長因子(PDGF)、表皮生長因子(EGF)、轉(zhuǎn)化生長 因子e(TGF-e)、基本成纖維細胞生長因子(BFGF)、胸腺素a 1和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)等。尤其優(yōu)選的試劑為轉(zhuǎn)化生長因子e (tgf-e)或tgf-e家族的其它成員。本發(fā)明的藥物組合物中還可以加入各種甾族、非甾族類抗炎劑及各種抗菌素、具有抗感 染作用的各種化合物，具有抗感染作用的中藥配方，以及具有抗感染作用的其它天然物質(zhì)。在本文中，"有效量"是指e胸腺素組合制劑的需要量。在組織修復過程中這種組合制 劑使用到治療劑量時就會促進組織再生效應。e胸腺素能夠促進及調(diào)理組織修復a程。組織 修復過程常常發(fā)生在損傷性疾病之后。組織修復過程出現(xiàn)障礙往往是由于在傷口處的各種細 胞如成纖維細胞、干細胞、血管內(nèi)皮細胞、組織細胞對生長的反映不足而造成的。因此，加 入能誘導或刺激細胞生長的活性劑會有利于組織的修復。本文使用的"促進"一詞是指對細 胞生長機制或過程具有激活作用，刺激作用，增強作用，起始作用及維持作用。這些細胞生 長機制或發(fā)生過程是組織形成，修復或發(fā)育所必須的。在本文中，"載體"是指含有活性e胸腺素組合制劑的基質(zhì)或輔料，用來充當藥物輸送 系統(tǒng)。在本發(fā)明中，"藥物輸送系統(tǒng)"指當藥物組合物(藥物配制品或劑型)被使用時，可以 將活性me胸腺素組合制劑呈遞給人或動物的機體。因此術(shù)語"藥物輸送系統(tǒng)"包括普通的藥 物組合物所能使用的所有形式的基質(zhì)或輔料，如固體、半固體、和流體組合物。特殊相關(guān)的 組合物是，例如，軟膏、親水軟膏、乳膏、糊齊ij、霜、凝膠、水凝膠、溶液、乳液、懸浮液、
洗液、擦劑、洗發(fā)劑、皂劑、粘貼物、噴霧劑、粉末、薄膜、墊料、敷劑、繃帶、膏藥等。傷口局部應用本發(fā)明藥物組合物優(yōu)選是含有活性成分的軟膏或霜。當制成軟膏時，活性 成分可以使用石蠟基或水混溶性軟膏基，或者，制成活性成分含水相油霜基的霜劑。制備涂 液、軟膏等外用型組合物的例子，包括將有效劑量的和所需量的添加劑混合而成。這些添加 劑通常選自外用藥物或化妝品的常用基質(zhì)或輔料，例如凡士林、液體石蠟、羊毛脂、硬脂酸 單甘油脂、聚乙二醇、十六醇、甘油、乙醇和水等。如果需要，霜的水相可以包括，例如，至少30%W/W的多元醇，即含有兩個或多個基的 醇，如丙二醇、3-二醇、甘露醇、山梨醇、甘油和聚乙二醇以及它們的混合物。局部 用制劑可以根據(jù)需要而增加或減少所含活性成分。本發(fā)明的藥物組合物還可以是注射液組合物，用于靜脈內(nèi)、膚膜內(nèi)、肌內(nèi)或皮下注射。制備注射液組合物的例子包括將有效劑量的e胸腺素組合制劑或其衍生物和所需量的液體基 質(zhì)混合制作而成，該基質(zhì)的例子包括水或生理鹽水，其中還可添加其它有益成分或輔料。本發(fā)明的藥物組合物可以是口服膠囊、片劑、粉劑等固體劑型組合物，包括將有效劑量 的e胸腺素組合制劑或其衍生物干粉和所需量的藥用輔料混合制作而成。本發(fā)明的藥物組合 物還可以是口服液組合物。制備口服液組合物的例子包括將有效劑量的e胸腺素組合制劑或 其衍生物和所需量的液體基質(zhì)混合制作而成，該基質(zhì)的例子包括水或生理鹽水，其中還可添 加其它有益成分或輔料。本發(fā)明還可以用可控制釋放混合劑的方式使用。本文中的"可控制釋放混合劑"是指任 何一種復合物。這種復合物可以用來緩慢釋放包含其中的有效e胸腺素組合制劑。這種復合 物含有生物有效成分可以是固狀的，滲透性的，半固狀的，膠性的或液狀的。本發(fā)明的e胸腺素組合制劑還可用于化妝品或其它皮膚護理產(chǎn)品的組合物中。這些組合 物包括但不限于清潔劑、眼霜、眼影、面霜、牛奶狀洗劑、皮膚洗劑、香水、香粉、化妝用 油、糊狀香水、粉末、護膚膏、護膚凝膠、潤膚膏、剃須用膏、剃須用洗劑、防曬油、抗曬 油、防曬洗劑、抗曬洗劑、指甲膏、潔膚洗液、清潔霜、清潔露、潔膚奶、清潔乳、化妝基 料、面膜、含鋅化妝水、潤手香脂、香粉、增白粉、粉底霜、化妝底粉、沐浴化妝品、胭脂、
染眉毛油、唇膏、唇霜、眼線膏、生發(fā)油、美發(fā)液、發(fā)乳、發(fā)用凝膠、滋發(fā)劑、頭發(fā)滋潤劑、香波、護發(fā)素、除臭、科隆香水等。


圖i顯示的是胸腺素ei5及胸腺素eie染色結(jié)果人-正常皮膚組織中胸腺素3 15及P 16的免疫組化染色。表皮中間層及真皮小汗腺的腺體細胞內(nèi)亦可 見大內(nèi)可見大量胸腺素ei5 (圖1A、 C)及6 16 (圖1C、 D)染色。實施例 實施例1細胞培養(yǎng)入臍靜脈內(nèi)皮細胞用RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)基內(nèi)含有5%牛血清，100單位/毫 升青/鏈酶素，50微克/毫升慶大酶素，2-7微克/毫升兩性酶素B，5單位/毫升肝素及200 單位/毫升血管內(nèi)皮細胞生長因子等補充劑。人表皮角化細胞及前額纖維母細胞用DMEM及 10%小牛血清培養(yǎng)。實施例2促進血管增生實驗胸腺素P16對血管生成的促進作用采用雞胚絨毛尿囊膜(CAM)實驗檢測，在孵育7天的 受精雞胚蛋殼上開一 1 cm2左右窗口，將不同濃度的化學合成胸腺素e 16蛋白加樣于滅菌濾紙片上，并放置于CAM ，然后在恒溫恒濕培養(yǎng)箱370C下繼續(xù)培養(yǎng)48小時，觀察血管生長情況。本實驗以生理鹽水為測試對照，phorbol myristate acetate (PMA) 0.5微克/10微 升為陽性對照。實驗測定結(jié)果表明胸腺素ei6蛋白加樣組雞胚絨毛尿囊膜血管生長明顯旺 盛，管徑粗且分支多，呈葉狀分布。以生理鹽水組血管生長程度作為對照，胸腺素e 16 5微 克/10微升的血管增生程度比生理鹽水組顯著增多，10微克/10微升的血管增生程度與 PMA陽性對照組血管增生程度相當或略多。這一實驗結(jié)果表明胸腺素ei6具有明顯促進血管 增生作用。實施例3傷口愈合實驗小鼠麻醉后，用4毫米的組織取樣器除去小鼠背部的皮膚，造成直徑約為4毫米大小 的傷口，隨后隨機將動物分成胸腺素e 16治療組和對照組(每組8只動物)。50微升(含有5 微克胸腺素ei6)的藥液滴于傷口上，對照組使用生理鹽水。動物每隔一天接收一次治療， 連續(xù)觀察7天后處死小鼠。傷口面積用于評估胸腺素ei6的療效。傷口皮膚固定于10%福 爾馬林溶液內(nèi)。H & E和膠原染色法用于觀察皮膚的病理學變化。重復實驗結(jié)果相同。結(jié)果顯示，胸腺素ei6處理組的傷口面積比對照組縮小一倍，傷口局部有完整的表皮再生，廣泛 的新血管形成，膠原合成也明顯增加。傷口愈合時間比對照組明顯縮短，統(tǒng)計學具有極其顯 著性差異(p < o.ooi)。這些結(jié)果表明胸腺素eie具有明顯的促進傷口愈合作用。實施例4人皮膚組織免疫組化染色研究人皮膚組織標本經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟切片脫蠟、水洗，切片作HE染色及e胸腺素免疫組化染色。結(jié)果顯示，表皮細胞內(nèi)含有大量胸腺素e4、胸腺素ei5及 胸腺素eie表達。圖中顯示的是胸腺素ei5及胸腺素eie染色結(jié)果。表皮中間層內(nèi)可 見大量胸腺素ei5(圖ia)及eie (圖ic)染色，陽性表達者主要是棘層里的棘細胞， 胞膜及胞漿呈大量深棕黃著色，部分細胞的胞核中亦可見到少量顆粒狀的棕黃色陽性信 號。顆粒層及透明層內(nèi)也有少量的陽性反應。另外，真皮小汗腺的腺體細胞及導管上皮細胞內(nèi)亦可見大量胸腺素ei5 (圖1B)及0 16 (圖1D)。另外，真皮毛囊組織也有胸腺素ei5及胸腺素eie表達。以pbs代替一抗的陰性對照中，細胞的胞核和胞漿區(qū)均無陽 性信號。實施例5細胞遷移實驗為了測試胸腺素P16與胸腺素P4的組合制劑對刺激細胞游走是否有協(xié)同作用，我們使 用Boyden Chomber方法對人臍帶靜脈內(nèi)皮細胞進行了測試。先將Boyden Chamber兩室間 隔的硝膜(孔徑0.8鵬)兩側(cè)均覆蓋Fibronection，濃度為15微克/毫升，37 "C下放置 60分鐘。上室加入細胞懸液，下室為完全培養(yǎng)液，5% C02孵箱內(nèi)靜置4小時，取出濾膜， 將上室面細胞刮除，經(jīng)固定染色后，在顯微鏡下細胞計數(shù)。每組3張膜。統(tǒng)計變量以均數(shù)標 準差表示。結(jié)果表明將胸腺素0 16與胸腺素e4按各50%的比例組合使用，游走細胞的數(shù)量 與單獨使用胸腺素P16或胸腺素P4相比明顯增多(結(jié)果見表l)。其促進細胞運動的能力明 顯加強，說明兩種e胸腺素具有協(xié)同作用。
表1 胸腺素刺激人臍帶靜脈內(nèi)皮細胞細胞游走胸腺素種類 胸腺素濃度(毫微克/毫升)讓100 10 1 0胸腺素16 164土8.4133土8.587土3.263土5.926丄1.5胸腺素4 157土7. 1 121土4.579土7.061土7,527±3. 1胸腺素16 +4 232土7.8188土8.0112土7. 1 79土3.528土3.7注將胸腺素P16與胸腺素P4按各50%的比例組合使用，表中例出的數(shù)據(jù)是三次實驗中細胞游走數(shù)的平 均值。
權(quán)利要求
1.一種具有促進組織再生及傷口愈合作用的藥物組合物，含幾種不同有效量的β胸腺素組合制劑，其生物活性變體或鹽、和其可接受的藥用載體。
2. 按照權(quán)力要求i所述，其藥物組合物中的e胸腺素組合制劑，可由多種不同e胸腺素組成。例如， 由胸腺素fM6與胸腺素e4按各種比例組成，也可以由胸腺素ei6與胸腺素ei5按各種比例組成，還 可以由胸腺素e 16與胸腺素e4及胸腺素e 15按各種比例組成。另外，該組合制劑還可由胸腺素e i6與 胸腺素ei6的多個同種異型體，如胸腺素e4、胸腺素P9、胸腺素pio、胸腺素eu、胸腺素ei2、胸 腺素fM3、胸腺素ei4、胸腺素ei5以及上述同種異型體的氧化型按各種比例組成，也可以由胸腺素e16與含LKKTET和/或含LKKTNT序列的不同大小的氨基酸片段及其氧化型按各種比例組成，還可以 由含LKKTET序列的不同大小的氨基酸片段及其氧化型及含LKKTNT序列的不同大小的氨基酸片段及 其氧化型按各種比例組成?？傊?，e胸腺素組合制劑可由e胸腺素及其氧化型、含LKKTET序列的氨基 酸片段及其氧化型、以及含LKKTNT序列的氨基酸片段及其氧化型按各種方式、各種比例組合。以上均 屬于本發(fā)明范疇。
3. 按照權(quán)力要求2所述，組合制劑中的e胸腺素、含LKKTET序列的氨基酸片段、以及含LKKTNT 序列的氨基酸片段及其氧化型可以是自然提取、化學合成或人工表達。
4. 按照權(quán)力要求1所述，本發(fā)明可用于治療各種原因引起的皮膚、粘膜損傷，如創(chuàng)傷、燒傷、燙傷、 凍傷、褥瘡、其它形式的表皮損傷、皮膚深層組織的感染性潰瘍、糖尿病引起的皮膚潰瘍、堵塞性潰瘍、 外科手術(shù)造成的傷口、眼角膜損傷、眼角膜潰瘍、胃腸粘膜損傷、消化性潰瘍等。
5. 按照權(quán)力要求1所述，本發(fā)明還可用于預防及治療各種皮膚病、0身免疫性疾病如銀屑病、大皰性 表皮松解癥、皮膚及周圍組織的退行性病變等。
6. 按照權(quán)力要求1所述，本發(fā)明藥物組合物也可用于增進皮膚健康和美容，使皮膚濕潤、細嫩、柔軟、 潔白，用于抗皮膚衰老，治療皮膚干燥、痤瘡、皮膚皺紋、老年斑和/或老化皮膚，增加皮膚彈性，減少皮 膚組織瘢痕的形成，改善皮膚營養(yǎng)。
7. 按照權(quán)力要求1所述，本發(fā)明還可用于促進毛發(fā)再生，預防及治療各種原因?qū)е碌拿摪l(fā)。
8. 按照權(quán)力要求1所述，其藥物組合物中還可添加其他神經(jīng)保護性藥物，如神經(jīng)生長因子(NGF)、神 經(jīng)營養(yǎng)蛋白(NT)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)及成纖維細胞生長因子(FGF)，以及其它具有調(diào)節(jié)胸腺素e 16生成的各種生長因子、細胞因子及各種化合物。
9. 按照權(quán)力要求1所述，其藥物組合物中還可以加入各種甾族、非甾類族抗炎劑及各種抗菌素，具釘 抗感染作用的中藥配方及其它天然物質(zhì)。
10. 按照權(quán)力要求1所述，其藥物組合物中可藥用的載體包括普通的藥物組合物所能使用的所有形式 的基質(zhì)或輔料，如固體、半固體、和流體組合物。例如，軟膏、親水軟膏、乳膏、糊劑、霜、凝膠、水凝 膠、溶液、乳液、懸浮液、洗液、擦劑、洗發(fā)劑、皇劑、粘貼物、噴霧劑、粉末、薄膜、墊料、敷劑、繃 帶、膏藥、注射液、口服膠囊、片劑、粉劑等。
全文摘要
本發(fā)明涉及一組具有促進新血管形成、組織再生及傷口愈合作用的活性小分子多肽由多種不同β胸腺素組成的組合制劑，其藥物組合物可用于改善缺血組織的血液供應、促進皮膚、粘膜損傷的組織再生、修復及愈合。本發(fā)明藥物組合物還可用于增進皮膚健康和美容，使皮膚濕潤、細嫩、柔軟、潔白，并用于促進毛發(fā)再生。本發(fā)明藥物組合物中的有效成分，β胸腺素組合制劑，首選胸腺素β16與胸腺素β4的組合，還可以選胸腺素β16與胸腺素β4及胸腺素β15的組合。然而，由β胸腺素及其氧化型、含LKKTET序列的氨基酸片段及其氧化型、以及含LKKTNT序列的氨基酸片段及其氧化型按各種方式、各種比例組合成的β胸腺素組合制劑均屬于本發(fā)明范疇。
文檔編號A61K38/32GK101152568SQ20061015268
公開日2008年4月2日 申請日期2006年9月25日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月25日
發(fā)明者寶勒日, 干春玉, 王大公 申請人:寶勒日;干春玉